Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología, Parasitología e Inmunología
Gérmenes Anaerobios no Esporulados
Luis A. Merino Cristina C. Ronconi
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Se denomina anaerobia a una bacteria incapaz de desarrollar en contacto con el oxígeno ambiental, aún siendo favorables para su desarrollo las otras condiciones de cultivo. Las bacterias anaerobias estrictas son aquellas a las cuales cualquier tensión de oxígeno las afecta mientras que bacterias anaerobias aerotolerantes son aquellas que pueden sobrevivir en presencia de bajas tensiones de oxígeno pero no desarrollan en esas condiciones. Las bacterias anaerobias forman parte de la flora normal del hombre y de los animales y pueden producir infecciones en cualquier tejido u órgano, siempre que encuentren las condiciones favorables ya que siempre se comportan como oportunistas. Se postula que la sensibilidad de estas bacterias frente al oxígeno podría deberse a uno o más de los siguientes mecanismos: * Efecto tóxico directo.
* Formación de mediadores como O2 (anión superóxido) y/o H2O2. * Imposibilidad para alcanzar potenciales redox (Eh) bajos necesarios para cumplir sus funciones metabólicas * Oxidación de enzimas esenciales que contengan grupos -SH. * Inhibición del metabolismo con flavoproteínas y NADH oxidasa. * Déficit o ausencia de catalasa y/o superóxido dismutasa presentes en (especies aerotolerantes).
Si la exposición al oxígeno es breve, en una etapa reversible, el microorganismo puede reiniciar su desarrollo cuando el nivel del mismo disminuye; pero cuando el potencial redox se mantiene alto en forma prolongada, los compuestos tóxicos acumulados producen la muerte bacteriana. CLASIFICACION DE LAS BACTERIAS ANAEROBIAS Debido a que constituyen un grupo muy heterogéneo, se las clasifica teniendo en cuenta su morfología, tinción de Gram (Figuras 1 y 2) y presencia o no de esporas.
Figura 1. Bacilos grampositivos ramificados, no esporulados, pertenecientes al Género Actinomyces.
Figura 2. Cocos grampositivos agrupados en largas cadenas, pertenecientes al Género Peptostreptococcus.
En la siguiente tabla se enumeran los géneros y especies de anaerobios de mayor importancia médica. Cocos Gram Positivos Cocos Gram negativos Género Peptostreptococcus Género Veillonella P. anaerobius V. parvula P. magnus P. micros Bacilos Gram Positivos no esporulados Género Actinomyces Género Bifidobacterium Género Propionibacterium A. israelii B. dansium P. acnes A. naeslundi P. granulosum A. odontolyticus Género Eubacterium P. avidum A. viscosus E. aerofaciens P. propionicum E. lentum
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Género Mobiluncus M. curtisii M. mullieris
Género Lactobacillus
Bacilos Gram Positivos Esporulados Género Clostridium C. tetani C. botulinum C. perfringens C. difficile C. rammosum C. novyi Bacilos Gram Negativos Género Bacteroides Género Porphyromonas B. fragilis P. asaccharolytica B. thetaiotaomicron P. endodontalis P.gingivalis P. oralis
Género Fusobacterium F. nucleatum F. necrophorum F. varium F. mortiferum
Género Prevotella P. melaninogenica P. bivia P. corporis P. disiens P. intermedia
Género Leptotrichia L. buccalis Género Bilophila B. wadsworthia
FLORA NORMAL ANAEROBIA Los anaerobios se encuentran ampliamente distribuidos en superficies mucosas y cutáneas del hombre formando parte de un equilibrado ecosistema, predominando notoriamente sobre las bacterias aerobias que se hallan en el mismo sitio anatómico. El conocimiento de la flora anaerobia habitual es muy importante para sospechar el foco primario o el sitio de inicio de una infección por éstos gérmenes. Piel: la flora anaerobia se limita a los folículos pilosos y se encuentra casi exclusivamente Propionibacterium acnes. Boca y faringe: la flora anaerobia llega a 107-1012 gérmenes/ml de saliva, siendo las encías otro nicho muy importante. Predominan Bifidobacterium, Actinomyces, Peptostreptococcus, Veillonella, Prevotella pigmentadas y Fusobacterium. Estos gérmenes se asocian con infecciones de cabeza y cuello y con neumonías por aspiración. 11
Intestino: existen alrededor de 10 bacterias/g de heces en colon y hay 1000 veces más anaerobios que aerobios predominando Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium y Clostridium. Degradan sales biliares, sintetizan vitaminas y se oponen a la colonización por otras bacterias que podrían resultar patógenas. Se relaciona con infecciones intraabdominales. Vagina: hay entre 107 y 109 bacterias/ml sobre todo Peptostreptococcus, Lactobacillus, Bífidobacterium, Mobiluncus, Propionibacterium y Prevotella. El sobrecrecimiento anaerobio está frenado por la presencia de lactobacilos de Döderlein productores de H2O2.. Se asocian con vaginosis bacteriana y aborto séptico. PATOGENIA DE LAS INFECCIONES POR GÉRMENES ANAEROBIOS En general, las infecciones provocadas por gérmenes anaerobios son de origen endógeno, es decir con punto de partida en la flora normal del huésped. Las excepciones estarían dadas por síndromes histotóxicos provocados Clostridium perfringens que puede adquirirse de la flora ambiental.
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Dado que las bacterias anaerobias se comportan como oportunistas, su patogenicidad depende de factores bacterianos propios y del huésped. Factores del huésped: el desarrollo de infecciones por anaerobios se ve favorecido por la disminución del potencial redox local (120 mV) debido a isquemia o necrosis (arterioesclerosis, diabetes, traumatismos), por alteración de la integridad de las mucosas que les sirven de barrera (neumonía por aspiración), por caída de las defensas locales o generales y por desequilibrio de la flora normal por causas diversas (hormonales, iatrogénicas, etc.). Factores de virulencia: los factores de virulencia más importantes en gérmenes anaerobios son aquellos que también se encuentran en bacterias aerobias. En primer lugar, la capacidad de adherirse e invadir superficies epiteliales como en Prevotella y Fusobacterium. En segundo lugar, la producción de toxinas y enzimas que favorecen la necrosis tisular. Bacteroides, Prevotella, Peptostreptococcus poseen fibrinolisina, lipasa, heparinasa, proteasas, hialuronidasa y coagulasa. Cocos y bacilos grampositivos liberan fosfatasas y DNAsas. Las especies más aerotolerantes producen catalasa y superóxidodismutasa que aumentan la sobrevida hasta la instauración de una atmósfera anaerobia. Por último, cabe citar a las endotoxinas tipo lipopolisacárido presentes en Veillonella y Fusobacterium y el polisacárido capsular de B. fragilis que ha sido estudiado en relación con la formación de abscesos y a su propiedad inmunogénica que implica una inmunidad mediada por células más que por inmunoglobulinas. Sinergismo bacteriano: en muchos casos, la acción patógena de estos gérmenes sólo se puede justificar si se los considera como un modelo polimicrobiano, donde el anaerobio se asocia sinérgicamente a un aerobio o a otro anaerobio. Tal es el caso de la denominada gangrena sinérgica de Meleney, una infección cutánea destructiva e insidiosa en la cual se ven involucrados S. aureus y un estreptococo microaerófilo, habiéndose comprobado que cada uno por separado en animales de laboratorios, no producen esta lesión, pero sí su combinación. Los mecanismos involucrados serían: - Disminución del potencial redox por consumo de oxígeno por parte del otro germen presente. - Síntesis de sustancias necesarias para el crecimiento de anaerobios como ser vitamina K. - Producción de enzimas tóxicas para el huésped o sus defensas y competencia con opsoninas. LOCALIZACIONES MAS FRECUENTES Ginecológicas: Participan P. bivia y cocos grampositivos principalmente, son secundarias a abortos y cirugías locales. Se originan con flora bacteriana y se presentan como endometritis o enfermedad inflamatoria pélvica. La vaginitis inespecífica o vaginosis se considera provocada por un sobrecrecimiento de Mobiluncus asociado a Gardnerella vaginalis y Mycoplasmas. Está descripta la endometritis por Actinomyces en pacientes portadores de dispositivo intrauterino. Bacteriemias: generalmente son causadas por B. fragilis, Peptostreptococcus y Fusobacterium, secundarias a cirugías abdominales, procedimientos odontológicos o a partir de una infección pulmonar. Con menor frecuencia se ven implicados como agentes etiológicos de endocarditis subaguda. Sistema nervioso central: se manifiestan como abscesos cerebrales y meningitis, generalmente debidas a Fusobacterium secundarias a bacteriemias, neurocirugías, otitis media y sinusitis crónica. Otorrinolaringológicas: P. melaninogenica y cocos grampositivos están involucrados en otitis media, mastoiditis, amigdalitis y sinusitis. La Angina de Vincent, una lesión úlceronecrótica unilateral asociada a disfagia, dolor intenso y formación de pseudomembrana, es producida por una asociación entre F. necrophorum y Borrelia vincentii.
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Pleuropulmonares: son muy frecuentes y se manifiestan como neumopatía por aspiración seguida o no de complicaciones supurativas como abscesos pulmonares o fístula broncopleural que dan como resultado un empiema. Están implicados en estos procesos F. nucleatum, P. melaninogenica, Porphyromonas y cocos grampositivos. Predisponen a la aspiración el compromiso del estado de conciencia (alcoholismo, drogadicción, enfermedades neurológicas) o disfagia. Intraabdominales: Se manifiestan como peritonitis, abscesos abdominales y colecistitis y aparecen como consecuencia de perforaciones intestinales, apendicitis o cirugías abdominales. Involucran flora normal del tracto gastrointestinal como Fusobacterium, B. fragilis, Clostridium, cocos grampositivos y enterobacterias. Tejidos blandos: se pueden mencionar abscesos cutáneos, quistes sebáceos infectados, abscesos de mama, infecciones por mordeduras, úlceras de decúbito, celulitis crepitante, celulitis sinérgica, fascitis necrotizante, gangrena gaseosa y heridas infectadas asociadas con procedimientos quirúrgicos. Son responsables Clostridium, Peptostreptococcus y P. melaninogenica. DIAGNOSTICO DE LAS INFECCIONES POR ANAEROBIOS Se puede dividir al proceso diagnóstico de infecciones por anaerobios en cuatro pasos: 1. Sospecha clínica: generalmente, los procesos provocados por anaerobios suelen ser poco característicos y no difieren demasiado de otros cuadros infecciosos. No obstante, existen algunos indicios que podrían inclinar al médico a pensar en un cuadro producido por estos gérmenes y son los que se exponen en la tabla siguiente: a. Olor pútrido de las secreciones purulentas. b. Proximidad a mucosas. c. Necrosis tisular, gangrenas o pseudomembranas. d. Gas en el sitio de infección. e. Terapéutica previa con aminoglucósidos. f. Tromboflebitis séptica. g. Evolución lenta de la enfermedad h. Infección posterior a mordeduras de animales y humanas. i. Coloración negra de la herida o fluorescencia roja con lámpara de Wood. j. Maniobras comprometedoras como cirugía abdominal o aborto séptico. k. Paciente portadora de DIU.
2. Toma de muestra: en todos los casos las muestras deberán ser recolectadas evitando la contaminación con flora indígena de piel y mucosas y la exposición prolongada al oxígeno atmosférico, es por ello que las muestras más apropiadas son aquellas a partir de cavidades cerradas a través de tejidos no contaminados y que en general se obtienen por punción (figura 3).
Figura 3: Punción de una herida a partir de la piel sana previa asepsia con alcohol iodado.
Figura 4: inoculación de un frasco para transporte de muestra para estudio de gérmenes anaerobios.
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En la siguiente tabla se mencionan los métodos recomendados para la toma de muestras según la localización de la infección: LOCALIZACION Cabeza, cuello y SNC
METODO/MUESTRA Punción/aspiración de colección purulenta. Biopsia
Periodontal
Raspado y absorción con conos de papel estéril de la colección profunda del surco gingival.
Oído medio
Punción/aspiración de la secreción
Senos paranasales
Punción/aspiración a través del ostium.
Pulmonar
Punción percutánea de abscesos. Biopsia de tejidos. Secreción broncoalveolar por aspiración transtraqueal o con cepillo protegido. Punción/aspiración de líquido pleural
Articulaciones
Punción percutánea del líquido articular.
Abdominal
Punción percutánea del líquido peritoneal. Aspirado de abscesos. Punción vesicular. Biopsia.
Tracto genital femenino . Hueso
Aspirado endometrial con catéter protegido. Biopsia. Punción de abscesos. Extracción de D.I.U Biopsia.
Partes blandas
Biopsia. Punción/aspiración por piel sana de material purulento
3. Transporte de las muestras: Las muestras deberán ser remitidas rápidamente y en medios de transporte apropiados con el fin de evitar el efecto nocivo del oxígeno. Cualquier demora en el procesamiento disminuiría la recuperación de estos microorganismos. También el tamaño de la muestra o el volumen de los líquidos de punción influyen de manera directa en la sobrevida de los anaerobios. Las muestras deberán ser mantenidas a temperatura ambiente. Los procedimientos recomendados para transportar muestras son los siguientes: Minijarra: es un recipiente de fondo plano y cierre hermético con un generador de anaerobiosis en su interior. Es útil para transportar trozos de tejido obtenidos por biopsia. Frascos de hemocultivo: se utilizan para transportar líquidos de punción. Debe evitarse la introducción de burbujas de aire inoculando el material con el frasco invertido. Permiten que la muestra comience a cultivarse hasta el momento del procesamiento en el laboratorio. Siempre acompañar de una porción de la muestra en otro frasco estéril para coloración de Gram y cultivo de gérmenes aerobios. Jeringa: no es la más conveniente, constituye una práctica sumamente riesgosa. En caso de utilizarla, se debe extraer el aire de la misma evitando los aerosoles que pudieran formarse, se colocará un tapón de goma en el extremo de la aguja y se la transportará en un recipiente rígido. Frascos con medios prerreducidos: sirven para inocular hasta 5 ml de muestras líquidas, y son los más prácticos ya que las mismas no se diluyen tanto como en los frascos de hemocultivos. Sólo sirven para transportar la muestra (figura 4). Debido a que los gérmenes anaerobios se encuentran en gran cantidad como flora normal, no resultan aptas para el cultivo de anaerobios las muestras que se mencionan a continuación: - Hisopados (fauces, ótico, vaginal, etc). - Esputo (expectoración espontánea). - Aspiraciones nasotraqueales o transtraqueales. - Lavados bronquiales obtenidos con fibroscopio - Lavado gástrico. - Contenido intestinal, secreciones de ileostomía y colostomía. - Materia fecal (salvo investigación de C. difficile). - Orina de micción espontánea o por cateterismo. - Material endometrial obtenido por vía transvaginal sin catéteres o dispositivos protegidos.
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4. Diagnóstico de laboratorio: se sospechará la presencia de un germen anaerobio en una muestra clínica frente a algunas de las situaciones que se mencionan en la tabla siguiente: -
Pleomorfismo bacteriano y palidez en tinción de Gram. Cultivos negativos con gérmenes en la coloración de Gram. Crecimiento en zonas profundas de medios líquidos o semisólidos. Hemocultivos negativos en endocarditis subagudas. Crecimiento en medios con kanamicina o vancomicina. Presencia de "gránulos de azufre"
Las muestras serán observadas con la coloración de Gram a fin de orientarse en cuanto a la morfología y número relativo de microorganismos, presencia de reacción inflamatoria, controlar la calidad del estudio determinando fallas ante la falta de recuperación de algunos de los gérmenes observados, además de orientar el tratamiento empírico. La siembra de los materiales se realizará en medios no selectivos (como agar sangre suplementado con vitamina K y Hemina), en medios selectivos (agar sangre suplementados con antibiótico como colistina, ácido nalidíxico, kanamicina y vancomicina), en un medio líquido utilizado como reserva (caldo Tioglicolato suplementado con vitamina K y Hemina) y en medios para bacterias aerobias. Los medios para cultivo de gérmenes anaerobios serán incubados en atmósfera libre de oxígeno a 3537°C durante 48 hs. como mínimo, pudiéndose utilizar los siguientes sistemas para la obtención de anaerobiosis: •
Jarras anaerobias: son útiles para el trabajo de rutina en un laboratorio común, permiten colocar dentro de ella varias placas de Petri. La atmósfera anaerobia se obtiene por el agregado de agua a un sobre generador de CO2 e H2; el Hidrógeno liberado se une al oxígeno del aire con la formación de agua, gracias a la acción de un catalizador. Todo el conjunto se coloca en la estufa de cultivo y cada vez que la jarra se abre, debe reemplazarse el sobre generador de gas. Debe incluirse además un indicador de anaerobiosis (Figura 5).
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Cámara anaerobia: constituye un equipamiento especial con el que cuentan muy pocos laboratorios en nuestro país. Permiten que todo el trabajo, desde la observación microscópica hasta la incubación de los medios de cultivo, se realice en una atmósfera anaerobia, la cual es provista por tubos de gases libres de oxígeno (Figura 6).
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Bolsas anaerobias: son muy prácticas para laboratorios con pocas muestras. Son de polietileno impermeable al oxígeno, dentro de ellas se coloca una placa de Petri, un indicador de anaerobiosis, un sobre generador de gases embebido en agua y se la sella.
En todos los casos se obtiene una atmósfera libre de oxígeno con 5% de CO2, 85% de N2 y 10% de H2. La identificación de los gérmenes que desarrollan en los medios para anaerobios se basa en la morfología de las colonias, fluorescencia, pigmento, hemólisis, coloración de Gram, confirmación del carácter anaerobio por resiembra en aerobiosis y anaerobiosis de cada colonia y pruebas bioquímicas. TRATAMIENTO DE LAS INFECCIONES POR ANAEROBIOS Frente a una infección por gérmenes anaerobios deberá iniciarse el tratamiento antibiótico antes de conocer los resultados del laboratorio. La terapéutica será seleccionada de acuerdo con la presentación clínica, el sitio de infección y las bacterias involucradas. En todos los casos deberá ser acompañado del drenaje de abscesos y el desbridamiento del tejido necrótico. En general, se puede afirmar que los fármacos útiles para instaurar un tratamiento empírico, incluyen: metronidazol, imipenem, cloramfenicol y la combinación de un agente betalactámico con un inhibidor de las betalactamasas (ampicilina/sulbactama o amoxicilina/ácido clavulánico). 7
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Figura 5: Jarra de GasPak. Para la obtención de atmósfera anaerobia se utiliza un sobre generador de CO2 e H2.
Figura 6 : Cámara anaerobia. permite al bacteriólogo trabajar dentro de ella con una atmósfera anaerobia proporcionada por una mezcla de gases que fluye constantemente.
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