Reproducción Animal Laboratorio 6 Evaluación del Semen: espermático

concentración o recuento

Objetivos: Familiarizar al estudiante con las técnicas de recuento espermático mediante el uso del hemocitómetro y comprender otros métodos usados en la estimación del recuento espermático. Asignación: Revisión de los capítulos asignados en el libro de texto y revisar las notas sobre espermatogénesis, producción del semen, preservación y diluyentes. El número de espermatozoides por unidad de volumen de semen, es una importante consideración para determinar la tasa óptima de dilución para los trabajos de inseminación artificial. También ayuda para determinar la fertilidad de un reproductor. El número de espermatozoides, el porcentaje de vivos-muertos y el grado de motilidad progresiva, son todas características importantes a considerar en la estimación de la calidad del semen. Hay una amplia variación en el número de espermatozoides por unidad de volumen de semen producido por diferentes reproductores y diferentes eyaculados dentro del mismo reproductor. La concentración espermática está influenciada en extremo por el volumen del eyaculado. El volumen varía con la edad, peso, raza, salud, nutrición, frecuencia de colección, temperamento del reproductor, estimulación sexual, manejo. Los toros jóvenes producen de 2 a 5 ml, frecuentemente la consistencia es fina o acuosa por masturbación si excesiva. Los toros maduros producen volúmenes entre 6 a 12 ml por eyaculado con un promedio de 8 ml. El número de espermatozoides por ml de semen fresco varía entre 1.000 x 106 Y 3.000 x 106. Es necesario determinar la concentración celular para guiar la tasa de dilución a emplear. Si se usan fotómetros o espectrofotómetros (Centros comerciales), se requiere del hemocitómetro para calibrar los aparatos.

Hemocitómetro Un hemocitómetro es un portaobjetos especial desarrollado para contar células de la sangre, pero también puede ser utilizado para contar espermatozoides.

Figura 1: Hemocitómetro El hemocitómetro tiene una grilla central de 1 mm x 1 mm grabada en el centro de otra grilla más grande (Figura 2). Este reticulado de 1 mm x 1 mm está dividido en 25 cuadros con 3 líneas en cada lado. Cada de uno de estos 25 cuadros tiene 16 cuadrados más pequeños demarcados por una sola línea. La reja está en la parte central glaseada (como espejo) del portaobjetos y tiene exactamente 0.1 mm de profundidad respecto a dos costillas levantadas en cada lado. Cuando se pone un cubreobjetos sobre ellas, el volumen de fluido encima de la reja central es exactamente 1 mm X 1 mm X 0.1 mm = 1 milímetro cúbico.

Figura 2: Grilla central del Hemocitómetro

Procedimiento 1. Para poder realizar el recuento, el semen diluido y los espermatozoides deberían ser muertos para prevenir el movimiento antes que la muestra sea colocada en el hemocitómetro. Esto puede realizarse diluyendo una muestra de semen en un buffer contenido una pequeña cantidad de formaldehído. El factor de dilución debe ser medido para permitir el cálculo de la concentración. Una muestra apropiadamente diluida (1:200) no debería tener mas de 20 a 25 células por cuadro grande

FACTOR DE DILUCIÓN = 200 o 100, depende de concentración inicial

2. Carga del Hemocitómetro: para cargar la muestra en la cámara (aproximadamente 15 microlitros), la punta de la pipeta se pone en la ranura en forma de V del Hemocitómetro (Figura 3). Por capilaridad, el fluido será distribuido en la cámara. Es importante no cargar excesivamente la cámara, ya que podría dar una cuenta inexacta. Lo mismo ocurrirá si el cubre se desplaza después de que la muestra está cargada.

Figura 3: carga del Hemocitómetro

Debe dejarse reposar a la muestra durante 2 o 3 minutos para que los espermatozoides dejen de flotar alrededor de la cámara y la mayoría se encuentren en el mismo plano focal. Es importante no tardar demasiado en realizar la lectura, ya que la muestra podría secarse concentrándose las células encima de la grilla. Para evitar el secado, los hemocitómetros pueden colocarse sobre dos pajuelas dentro de una caja de Petri conteniendo un papel del filtro humedecido (Figura 4).

Figura 4: Hemocitómetro dentro de una caja de Petri para evitar la desecación.

3. Cuente el número total de espermatozoides en sólo 5 de los 25 cuadrados separados por tres líneas. Haga una distribución uniforme, cuente las 4 esquinas más el cuadrado del medio o cuente los 5 cuadrados de la diagonal (Figura 5).

Figura 5: Que cuadros contar de la grilla.

Figura 6: forma de contar los espermatozoides que se encuentran sobre la línea de los bordes.

El ejemplo de la Figura 6 muestra líneas rojas dónde se contarían células que se encuentran sobre la línea. Si los puntos rojos representan espermatozoides, uno debería contar 3 células en el cuadrado superior central grande. FACTOR DE CUENTA = 5 (desde que contó 5 de 25 cuadros)

4. Desde que el volumen del área es de 0.1 mm, necesita corregir por un factor de 10 para convertir el número a espermatozoides por milímetro cúbico. FACTOR DE VOLUMEN = 10

5. Normalmente el recuento de espermatozoides se expresa en términos de espermatozoides por ml o centímetro cúbico. Para convertirla de milímetros cúbicos a centímetros cúbicos o mililitros, debe multiplicar por 1000. FACTOR DE CONVERSIÓN = 1000

Si multiplica todos estos factores juntos, hace lo siguiente: 200 X 5 X 10 X 1000= 10, 000,000 (10 millones)

¡Así sólo tiene que contar los espermatozoides contenidos únicamente en 5 cuadros (se evita contar los 25 lo que demoraría el procedimiento) y agregando 7 ceros! Preguntas 1. ¿Qué factores influencian el volumen del semen y la concentración de espermatozoides en cualquier colecta de semen? 2. ¿Cuál es la razón más importante para determinar la concentración espermática? 3. ¿La concentración de espermatozoides influencia la fertilidad del semen? Influencia posteriormente la capacidad de almacenaje del semen? 4. ¿Puede ser estimada groseramente la concentración espermática por inspección visual al momento de la recolección? ¿Como? 5. ¿Cuáles son las causas para la gran variación del número de espermatozoides de diferentes eyaculados de un mismo reproductor? 6. ¿Cuáles son algunas de las causas para la baja concentración espermática en el semen?