Reproducción Animal Laboratorio 9 Evaluación del semen: Prueba del Azul de Metileno Objetivos: Familiarizarse con la Prueba de Reducción del Azul de Metileno para la evaluación de la calidad del semen y comprender los principios de este test de calidad. Asignación: En el semen que contiene una alta concentración de espermatozoides activos, el oxígeno es usado a una más alta tasa que en el semen de pobre calidad. Esto causa un exceso de hidrógeno, el cual combinado con el azul de metileno, forma una leuco base de azul de metileno. El cambio relativamente lento del color azul, sirve como indicador del número y actividad de espermatozoides en el semen. El azul de metileno es un colorante quinoide el cual puede ser hidrogenado para formar una base incolora. Ciertas enzimas reductoras son necesarias para activar la hidrogenación, ya que el hidrógeno no causa la reducción del color. Algunas sustancias biológicas como el semen, pueden contener estas enzimas o el azul de metileno puede actuar como un catalizador para activar la hidrogenación. El semen contiene oxígeno libre o combinado, el cual, debido a las bacterias o enzimas, es usado para cambiar el material desde una sustancia ligeramente oxidada a ligeramente reducida. La tasa de esta reducción en el semen, depende ampliamente de la concentración y actividad de los espermatozoides; sin embargo, otros factores como bacterias, enzimas, luz y otras características pueden influenciar en algún grado variando la tasa de reducción. Procedimiento Un procedimiento recomendado para la prueba del azul de metileno consiste en: 1.

Prepare una solución de azul de metileno disolviendo 50 mg. de azul de metileno en 100 ml de citrato de sodio di-hidratado al 3,6% (Na6C6H5O7.2H2O).

2.

Diluir 0,2 ml de semen en 0,8 ml de diluyente citrato-yema, colocados en un tubo de 10 ml y mezclar meticulosamente (dilución 1:4).

3.

Adicionar 0,1 ml de solución de azul de metileno (preparada según punto 1) y mezclar.

4.

Cubrir con una capa de 1 cm. de aceite mineral.

5.

Colocar en baño de María a 37 ºC.

6.

Observar el tiempo requerido para la decoloración de la mezcla (pérdida del color azul).

El color azul se perderá (por reducción) entre 3 y 6 minutos en el semen de buena calidad. El semen que retenga el color por 9 minutos o más, no debería ser utilizado con propósitos de inseminación, porque una muestra de esta naturaleza contiene pocos espermatozoides vivos, o espermatozoides totalmente muertos. Aparte de los espermatozoides, alguna decoloración puede ser causada por sustancias reductoras (enzimas, bacterias, etc.), por lo que no hay una puntuación estándar para distintos tiempos de decoloración. Preguntas 1. 2. 3.

Cuales son las principales ventajas y desventajas de la prueba del azul de metileno. Cual es la correlación entre esta prueba de laboratorio y la tasa de concepción o tiempo de almacenaje del semen. Explique (en términos generales) la causa de la reducción del color azul, y los cambios que ocurren durante esta prueba.