Importancia del Antígeno D Sujetos Rh Negativo productores de Anti-D:

 80%

de los receptores de grandes volúmenes de sangre D positivo

 20%

de los transfundidos con plaquetas provenientes de dadores D positivo

 10%

de las pacientes que han tenido hijos D positivo y ABO compatibles

Variaciones Cuantitativas del Antígeno D Antígenos D Débil El término Du es amplio e impreciso Los G.R. eran aglutinados por un anti-D pero no por otro Incluía Ags. D débil y D parcial No existe un anticuerpo Anti-Du La identificación de Du depende de los reactivos y los métodos empleados

Variaciones Cualitativas del Antígeno D 

Corresponden a Fenotipos D Parcial, con o sin variaciones cuantitativas asociadas

 

Antígenos D Parcial Antígenos D Parcial Débil

Eritrocito con Antígenos

Ag. constituido por Epitopes Anticuerpos dirigidos hacia sus correspondientes Epitopes

Eritrocito con Antígenos

Ag. constituido por Epitopes Anticuerpos dirigidos hacia sus correspondientes Epitopes

Eritrocito con Antígenos

Ag. constituido por Epitopes Anticuerpos dirigidos hacia sus correspondientes Epitopes

Eritrocito con Antígenos

Ag. constituido por Epitopes Anticuerpos dirigidos hacia sus correspondientes Epitopes

Eritrocito con Antígenos

Ag. constituido por Epitopes Anticuerpos dirigidos hacia sus correspondientes Epitopes

Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes

Antígeno D Normal

Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes

Antígeno D Normal Epitope:

Normal

Cantidad de Ag:

Normal

Epitope

Antígeno

Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes

Antígeno D Normal Epitope:

Normal

Cantidad de Ag:

Normal

Epitope

Antígeno

Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes

Antígeno D Normal

D Débil

Epitope:

Normal

Normal

Cantidad de Ag:

Normal

Reducido

Epitope

Antígeno

Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes

Antígeno D Normal

D Débil

Variante D

Epitope:

Normal

Normal

Mutados

Cantidad de Ag:

Normal

Reducida

Normal o Reducida

Epitope

Antígeno

Fenotipos D Parcial originados comúnmente por genes “híbridos”

Exones de Gen D

Exones de Gen D

Exones de Gen CE

Exones de Gen CE

Exones de Gen CE

Exón de Gen D

Ausencia de epitopes asociados con una expresión normal de antígeno D

D Parcial como resultado de la inserción de un exón D dentro de un gen CE

Vistazo de Variantes D

Tipos de D Parcial de la Categoría DVI Gen RHD DVIcE ccDVI.Ee = Tipo I

Raro

600 Ag/GR Caucásicos

Gen RHD DVICe BARC = Tipo II CcDVI.ee Más frecuente 2400 Ag/GR Caucásicos y Japoneses

Gen RHD DVICe BARC = Tipo III CcDVIee Muy raro 12000 Ag/GR Caucásicos

Serología para Ag. D • El estado D puede ser determinado empleando sueros Policlonales o Monoclonales. Ambos, no arrojan exactamente las mismas divisiones. • El uso de Monoclonales permitió apreciar la diversidad y complejidad de los epitopes D.

Anticuerpos Policlonales

Anticuerpos Policlonales

G.R. Transfundidos con Ag. extraño (p.ej. D)

Ag. extraño D Epitopes diferentes

Las células plasmáticas producen anticuerpos heterogéneos

Anticuerpos con Paratopes diferentes

Anticuerpos Monoclonales Anticuerpos Policlonales

Anticuerpos Monoclonales

Anticuerpos con Paratopes diferentes

Producción de siempre el mismo clon (mismo paratope)

Produce una variedad de anticuerpos

Ag. extraño D Epitopes diferentes

Selección de un anticuerpo específico

Tipos de Reactivos Anti-D Policlonal c/ Alta Concentración Proteica Policlonal c/ Modificación Química Monoclonal Mezcla Policlonal/Monoclonal Mezcla Monoclonal/Monoclonal

PRESENTACIONES COMERCIALES DE SUEROS HEMOTIPIFICADORES

Sistema RH Policlonal Humano

Anti-D

Monoclonal Humano

Mezclas (Blends)

IgG – IgM

Polic –Monoc Monoc-Monoc

Anti-C Anti-E Anti-c

IgG IgG Qca. Modif IgM Salino

Monoclonal IgM

Anti-e Anti-CDE Anti-Cw

IgG – IgM Sal.

-

Criterios y Alcances del Uso Reactivos que detectan DVI y D débil

Ideales para la clasificación de: donantes recién nacidos de madre Rh Negativo Es importante tipificar todas las presentaciones de Ag. D que puedan causar inmunización en sujetos Rh Negativo

Criterios y Alcances del Uso Reactivos que NO detectan DVI y D débil Ideal para la tipificación de pacientes: receptores transfusionales obstétricas Esta es la política transfusional segura, ya que serán transfundidos con sangre Rh Negativo aunque pertenezcan a una clasificación de D muy débil.

Anti-D Monoclonales según procedencia comercial Líneas celulares IgM IgG BS226 BS221 BS232 H4111B7 BAC-9 P3x 61 HM 10 P3x 21223 B10 P3x 212 11F1 HM16 P3x 290 P3x 35 P3x 241 P3x 249 P3x 290 TH-28 175-2 MS-201 Rs-1126

Marcas Comerciales (*) Biotest Biotest Biotest Biotest CNTS Diagast, Grifols Diagast Diagast, Grifols Diagast Diagast Diagast, Grifols Diagast, Grifols Diagast Diagast Diagast DiaMed, Immucor DiaMed, Immucor DiaMed, Immucor, Lorne DiaMed, Lorne

Líneas celulares IgM IgG LDG169 LDG59 LDG70 LDG76 LDG77 LDMI MS-26 LHM50/3 (LDM1) LHM59/19 LHM 59/20 (LDM3) ESD1 ESD-1M HUMAN GAMA401 NELP-3 F8D8 Na TH 28-3 C 11 LORI MAD2

Marcas Comerciales (*) DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed, Immucor, Lorne DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed Gamma, Immucor, Ortho Gamma Gamma, Immucor Gamma Jacques Boy Jacques Boy Ortho

ANTES

AHORA

Diferentes proveedores = Sin alternativa en la capacidad de elección

Los diferentes productores de Clones ofrecen una variada gama o rango de especificidades hacia distintos epitopes

ANTES

AHORA

Diferentes proveedores = Sin alternativa en la capacidad de elección

Los diferentes productores de Clones ofrecen una variada gama o rango de especificidades hacia distintos epitopes

Caracterización del tipo de D Parcial mediante Test en Gel

Principle of gel technique Técnica en Gel

Aglutinación

Tarjeta de Gel para determinación de grupos sanguíneos

Microtubo

Caracterización del tipo de D Parcial mediante Test en Gel

FORMAS DE ESTUDIAR LOS GRUPOS SANGUÍNEOS AGLUTINACIÓN

RIA

HEMÓLISIS

ELISA

INHIBICIÓN

ABSORCIÓN Y ELUCIÓN

PRECIPITACIÓN

AGLUTINACIÓN y HEMÓLISIS.

PRIMERA ETAPA Está influenciada por las siguientes variables:  Temperatura: IgM reaccionan a 4ºC, IgG a37ºC  Afinidad entre Ag y Ac  PH optimo :6.5 y 7.6  Concentraciòn relativa del Ag y Ac.puede ocurrir disminuciòn de la aglutinaciòn cuando hay exceso de Ac(prozona) o exceso de Ag (postzona)  Fuerza iónica del medio : al disminuir ,disminuye la nube de cationes que rodea lo GR favoreciendo la uniòn Ag- Ac  Medios de potenciaciòn: *Soluciones de baja fuerza iònica :LISS: reduce la neutralizaciòn de cargas opuestas aumentando la velocidad de reacciòn y tambien la cantidad de Ac unido al hematíe. 

Tiempo de incubación: Las diferentes reacciones Ag-Ac alcanzan el equilibrio en tiempos diferentes.

SEGUNDA ETAPA 

Potencial Z



Densidad del Ag



Clase de Ig involucrada



Para potenciar las reacciones de aglutinaciòn se emplean diversos métodos: centrifugación controlada, adición de medios macromoleculares, de Enzimas proteolìticas y el uso del test de Coombs permite detectar la sesibilizaciòn de los GR por IgG que generalmente no producen aglutinaciòn

ETAPAS DE LA AGLUTINACIÒN

La aglutinación se produce en dos etapas:  La

primera es la unión Ag-Ac  La segunda la formación de puentes intercelulares que producen el fenómeno visible de la aglutinación.

Potencial Z

Enzimas proteolíticas que eliminan las cargas (-) de la superfície celular    

Papaína Bromelina Tripsina

Eliminan el Acido Sálico

Otras sustancias: ● Albúmina bovina ● Dextrán



GR con menos cargas negativas en su superficie, lo que permite que se aproximen lo suficiente para que se establezcan los puentes de unión por moléculas de IgG.



Soluciòn salina de baja fuerza iónica :LISS



Permite aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Ag y Ac. Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs. Permite detectar Ac en baja concentración y de baja afinidad Permite reducir el Tiempo de incubaciòn de la Coombs de 30´ a 10´ Por esta razòn el TCI en LlSS es la prueba de elecciòn para la detecciòn e identificaciòn de Ac de tipo IgG Se la utiliza : Prueba de compatibilidad pretransfusional y detección de Ac irregulares en donantes y receptores, detección de Ac irregulares en embarazadas y tipificación de Ag eritrocitarios.

  



PRUEBA ANTIGLOBULINICA ( Coombs) Detecta Acs de tipo IgG o fracciones del C`adheridos a los GR. Existen dos técnicas: a) Directa: Detecta Acs adheridos a los GR “in vivo”. b) Indirecta: Determina Acs existentes en el suero o plasma del paciente, previa incubación del suero con GR apropiados.





DIRECTA: TCD ● Diagnostico de AH y EHRN. ● Investigación de reacciones dudosas en una transfusión. ● Investigación de enfermedades autoinmunes. INDIRECTA: TCI ● Screening de sueros de donantes y pacientes para Acs. ● Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión. ●Identificación y titulación de Acs encontrados en sueros.



LAVADO INADECUADO DE ERITROCITOS



MALA INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS DÉBILMENTE (+)



PÉRDIDA DE ACTIVIDAD DE LOS REACTIVOS



CENTRIFUGACIÓN INADECUADA.

FALSOS POSITIVOS



TUBOS DE VIDRIO MAL LAVADOS



SOBRECENTRIFUGACIÓN



QUE LOS ERITOCITOS AGLUTINEN ANTES DEL AGREGADO DEL SUERO DE COOMBS

DETECCIÓN DE ACS IRREGULARES MUESTRA

• SUERO FRESCO

REACTIVO

• PANEL SELECTOR

TECNICA

• LECTURA EN MEDIO SALINO Y TCI TITULACIÓN • SUERO PACIENTE

MUESTRA

• HEMATIES QUE EXPRESEN EL AG CORRESPONDIENTE AL AC • A TITULAR EN SUSP ENTRE 3—5 % REACTIVO • S F

• VER CUADRO TECNICA

TUBO

SF

1 -

2 10 µL

3 10 µL

4 10 µL

5 10 µL

6 10 µL

7 10 µL

8 10 µL

9 10 µL

100 µL 100 µL 100 µL 100 µL SUEROS 100 µL 100 µL

100 µL 100 µL

DEL TUBO 2 SE TOMA 100 µL Y SE LO PASA A LOS DEMAS EN FORMA SUCECIVA RESERVAR 100 µL DEL TUBO 10

100 µL 100 µL GR DILUCION

100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL

1

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128 1/256

EL TÍTULO ES LA INVERSA DE LA MAYOR DILUCIÓN DE SUERO QUE PRODUCE AGLUTINACIÓN VISIBLE

E H F N

Conjunto de manifestaciones patológicas causadas por aloimunización materna a Ag celulares presentes en el feto heredados del padre que producen una respuesta inmune (Ac) en la madre

Causas de inmunización Embarazo (parto 0,25 ml hasta 25 ml - 3er trimestre?) Transfusión Inyecciones de sangre (intramuscular) Puede afectar 1er emb

Transplantes Drogadicción

CLASIFICACIÓN Según la especificidad del Ac EHFN:

por acs contra ags del sistema RH ( más severa ) Madres RH ( neg) sensibilizadas con anti-D

EHFN: por acs contra ags del sistema ABO ( menos severa ) Madres de grupo “ 0 “ EHFN : por acs contra ags de otros sistemas

ENFERMEDED HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN) * Ictericia 

Signos



Causas + común ( Incompatibilidad sanguínea materno-fetal)

* Anemia * Esplenomegalia * Hepatomegalia



ESTUDIOS EN LA MUJER EMBARAZADA

•Acs irregulares : título e identificación 16 / 18 sem Si es ( - ) repetir 28 / 32 sem Si es ( + ) repetir 20 / 22 sem ó c/ 15 dias si aumenta

Estudios de LA ( mujeres con título > 16 + historia obstetrica * Genotipificación R H D fetal * Feto – Ultrasonido -----EC ( hígado- bazo ) _ Muestra sangre fetal ( 18 sem )

PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN 

*A

la madre : Tipificación ABO Y RH ( VARIANTES DU ) Panel selector ( aloanticuerpos maternos )

* En el niño : Tipificación A B O y R H PCD H b , Hto cordón , BRR I de cordón Reticulocitos

Determinación prenatal del genotipo RHD Protocolo de estudio  Estudios inmunohematológicos en sangre materna: RhD y Anticuerpos Irregulares.  Extracción de ADN de sangre periférica materna y 4.TRANSFUSION.ppt líquido amniótico.  Genotipificación RHD en ADN fetal.  Determinación del origen fetal del ADN obtenido del líquido amniótico.  Determinación de la cigosidad RHD paterna.

E H F N ----A B O 

Caso más frecuente Madre “ O “ Y feto “ A “ Frecuentemente sin significado clínico Se puede presentar en el primer embarazo



ESTUDIOS A REALIZAR



Prenatal (embarazadas):

Podría investigarse en embarazada de grupo O y esposo A/B los Ac anti-A/B de clase IgG (2-ME) pero solamente 1 de 3000 incompatibilidades ABO potenciales necesita exanguinotransfusión. Imposibilidad e inutilidad de un despitaje prenatal 

Posnatal

Recién nacido: Grupo ABO y RhD TCD, TCD potenciado Medios macromoleculares Elución e identificación del Ac Madre Estudio de Ac anti-A y/o anti-B de origen inmune y titulación.

ESTUDIOS A REALIZAR  PRENATAL

: ( embarazada ) madre “ O “ – esposo A / B Determinar título de Ig G

_ POS NATAL : recien nacido grupo A B O y R H P C D ( +, - débil )

HALLAZGOS HEMATOLÓGICOS EN EL RECIEN NACIDO



* Aumento de reticulocitos . 10- 30 %

evidencia de proceso hemolítico compensado * Eritroblastos en sangre periférica 8---15 % * Microesferocitos 80 %