Biotecnología vegetal

Dra María Inés Isla 2012- Asignatura Fitoquímica

La Biotecnología es el conjunto de técnicas que utilizan organismos vivos o partes de ellos para obtener productos o modificarlos, para mejorar plantas o animales, o para desarrollar microorganismos con fines bien determinados, es decir, para la obtención de bienes y servicios. La biotecnología vegetal es la específica de las plantas Según el Convenio sobre la Biodiversidad Biológica CDB de 1992: toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos y sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos, para usos específicos.

Los objetivos que se persigue son Que el alumno conozca las herramientas biotecnológicas que se pueden utilizar para a) aumentar el rendimiento de la planta, b) mejorar su calidad nutritiva y funcional modificando rutas metabólicas c) Producir plantas resistente a plagas y enfermedades d) Producir plantas resistentes a diferentes situaciones de estrés abiótico (condiciones difíciles o no adecuadas del suelo y el clima.)

Cultivo in vitro • El término cultivo in vitro es un término muy genérico que se refiere más bien a la metodología usada que al propio objetivo de ese método. En sentido estricto, in vitro quiere decir "dentro de vidrio", es decir, el cultivo de plantas o de alguna de sus partes dentro de recipientes de vidrio en condiciones de ambiente controlado. Presupone colocar un explante en condiciones asépticas en un medio apropiado para que las células expresen su totipotencialidad

Fundamentos • La teoría de la totipotencialidad celular, enunciada teóricos y por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda prácticos del célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciación cultivo de alcanzado. Todo proceso de diferenciación está regulado por el tejidos balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, vegetales fundamentalmente de auxinas y citocininas. Para lograr la diferenciación se requieren además condiciones específicas referidas al medio del cultivo, temperatura, fotoperíodo, etc.

•

Existen dos • Tipos de morfogénesis: posibles vías morfogenéticas - Organogénesis en respuesta a un estímulo - Embriogénesis • Diferencias entre las dos posibles vías: -La organogénesis (ES DE ORIGEN PLURICELULAR) . Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal (raíz, brote). -La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la redifereciación de las células previamente desdiferenciadas.

Cultivo de tejidos vegetales

- La embriogénesis (ORIGEN UNICELULAR). Una célula del explanto se aísla y constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas una en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es planta completa.

Cultivos diferenciados : raíces, tallos, embriones

Cultivos indiferenciados: callos, suspensiones de células, protoplastos

Factores que afectan los procesos morfogenéticos a) El explante Tejidos somáticos: de tallo, raíz, hoja, meristemos Tejidos reproductores: anteras, polen, microesporas, óvulos, semillas Las condiciones de cultivo pueden pretender la proliferación desorganizada de las células del explanto hasta dar lugar a un callo o incluso a un cultivo de células cuando se separan éstas del callo. Si se elimina la pared celular de las células se obtiene un cultivo de protoplastos.

b) Condiciones químicas seleccionadas para realizar el cultivo b) Condiciones físicas seleccionadas para realizar el cultivo

Estudios básicos Objetivo del cultivo Selección del explanto

Obtención de plantas con sanidad controlada Micropropagación

Capacidad regenerativa

Genotipo

Obtención de plantas de semillas con embrión rudimentario

Tamaño Obtención de plantas haploides

Edad Fisiologica

Época del año

•la capacidad de regeneración es mayor en estado embrionario y en el juvenil, y disminuye al envejecer. Genotipo :Dicotiledóneas mejor que monocotiledóneas,

Conservación de germoplasma Producción de metabolítos secundarios por cultivo de células

Preparación de la planta madre dadora del explanto

Asepsia del explanto

Desinfección superficial • •

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia recibida

Obtención de explanto y desinfección

En laboratorio Agua corriente Se retiran hojas Soluciones desinfectantes (etanolhipoclorito de sodio) Enjuagues con agua estéril en cabina de flujo laminar Antibióticos y/o fungicidas

Desinfectante

Concentración % Exposición (min)

Calcium hypochlorite

9-10

5-30

Sodium hypochlorite*

0,5-5

5-30

Hydrogen peroxide Ethyl alcohol

3-12

5-15

70-95

0,1-5

Silver nitrate

1

5-30

Mercuric chloride Benzalkonium chloride

0,1-1

2-10

0,01-0,1

5-20

Formulación de un Medios de cultivo: composición general Compuestos inorgánicos Macronutrientes: NO4- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, ICarbohidratos Sacarosa (2-5%), glucosa, galactosa, maltosa mio-inositol (100 mg/L) Vitaminas Clorhidrato de Tiamina (B1) Clorhidrato de Piridoxina Acido nicotínico Biotina Aminoácidos Glicina

Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semisólidos) Agar (0,7 a 1%) Agarosa pH 5,6 – 5,8 Esterilización 1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave

Agua de coco (5-10%): Mg, fosfato, aa, azúcares, vitaminas, compuestos nitrogenados , proteínas, leucoantocianidinas Comp. Orgánicos opcionales:Hidrolizado de caseína, extracto de levadura, ácidos orgánicos Antioxidantes: ácido ascorbico, glutatión, PVP, L cisteina

Reguladores del crecimiento

• Grupos básicos de reguladores del crecimiento: - Auxinas - Citoquininas - Giberelinas - Acido abscísico - Etileno • Generalidades: - Actúan a bajas concentraciones - Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas). - Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.

Cultivo de tejidos vegetales

- Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.

Auxinas: estos compuestos se emplean básicamente como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis

O

OH

Acido indol acético (AIA) (auxina endógena)

N

• Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleoptile de gramíneas. - Alargamiento y división celular - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formación de raíces adventícias - Dominancia apical - Acción herbicida - Estimulación de la producción de etileno • Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg. • Su transporte es polar

Cultivo de tejidos vegetales

• Auxinas sintéticas: - Acido indol butírico (IBA) - Acido naftalen acético (ANA) - 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

Citoquininas: en combinación con las auxinas, determinan diferentes respuestas morfogenéticas

• Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro. • Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas: - Promoción de la división celular - Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citoquininas) - Retardo de la senescencia - Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos • Citoquininas endógenas: - Zeatina (Zea) - Isopenteniladenina (2iP) • Citoquininas sintéticas: - Kinetina (Kin) - Benziladenina (BAP)

Cultivo de tejidos vegetales

• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran en todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 µg/Kg. • Su transporte es no polar.

Estructura química de las principales citoquininas CH3 H

N

CH2 CH

C CH2OH

Zeatina

CH3 H

N

CH2 CH

C

N

CH3 Isopenteniladenina (IP)

H H

N

N

C H

N

N

6-bencilaminopurina

N

N

Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo

O Acido giberélico (GA3) C

HO

O

H

OH

H CH3

H COOH CH3

• Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. • El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas. • Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

Cultivo de tejidos vegetales

- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales - Crecimiento de yemas latentes - Germinación de semillas en dormición - Floración - Movilización de reservas en la semilla.

• Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión. • Su transporte no es polar.

Reglas generales para la acción hormonal: • Auxina : Citoquinina = ~1 Callo • Auxina : Citoquinina < 1 Tallo • Auxina : Citoquinina > 1 Raíces Antibióticos Carbón activado

In vivo 78%N 21%O 0,035% CO2

Temperatura : 25°C Luz: Tipo, cantidad y foto periodo:luz: luz: Ciclos luz/oscuridad de 16/8 hs. Luz día con una irradiancia entre 50 y 200 µmol.m2 s-1 PAR 400400-700 nm HUMEDAD

Cámara de lujo laminar

Esquema de una cámara de flujo laminar horizontal

Una cámara de cultivo es un receptáculo diseñado para permitir el control de algunas variables del ambiente físico. Habitualmente se pueden controlar la temperatura, la iluminación y el fotoperíodo y en algunos casos, menos frecuentes, la humedad del aire y su composición. Existen muchos modelos de cámaras de cultivo, en unos casos se trata de espacios reducidos, frecuentemente móviles, mientras que en otros casos son verdaderos recintos acondicionados para permitir el control del ambiente interior.

Cámaras de Cultivo

Control lumínico • La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los cultivos in vitro. • Los aspectos relacionados con la luz que son importantes en los cultivos in vitro son: • La cantidad de luz: LA IRRADIACIÓN . La irradiancia puede ser expresada en función de la energía por unidad de superficie W/m2 • La calidad de la luz: EL ESPECTRO Los tubos fluorescentes son las fuente de luz más usada en las cámaras de cultivo. • La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO. Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, floración, tuberización,...) pueden ser activados por el número de horas diarias de luz que recibe la planta. De forma análoga, el número de horas de luz que recibe el explanto cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo será también el mejor fotoperiodo in vitro.

Principales aplicaciones de esta herramienta de la biotecnología Clonal: Organogénesis directa

Micropropagación Organogénesis indirecta Embriogénesis somatica

Cultivo de embriones cigóticosrescate de embriones Conservación de germoplasma Cultivo de protoplastos Producción de MS

Segmentos uninodales

•

FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES Los nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar

FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS • • •

• •

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos métodos: ENRAIZAMIENTO IN VITRO Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar y como la fuente de energía para enraizar está en el medio de cultivo no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis. ENRAIZAMIENTO EX VITRO Los explantos se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse. Los explantos deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un área sombreada.

FASE IV: ACLIMATACIÓN O RUSTICACION DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS -

-

Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo. El retraso en el desarrollo de la cutícula y la escasa funcionalidad del aparato estomático que presentan las hojas de la mayoría de las especies cultivadas in vitro , determina una alta tasa de transpiración que pueden ocasionar la muerte por deshidratación. Por lo que el equipamiento necesario para evitar que esto ocurra está sujeto a la especie, pudiendo utilizar desde túneles de polietileno o cámaras climatizadas equipadas con sensores que permitan una disminución paulatina de la humedad relativa. En algunos casos es necesaria la aplicación exógena de ABA para controlar el cierre estomático, o el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa semipermeable en la hoja. Luz: natural + mallas sombreadoras (saram) o lámparas de sodio de alta presión presentan una distribución espectral de la energía adecuada para estimular la fotosíntesis. Sustrato: arena, perlita, turba, vermiculita o mezcla de ellos con fertilizantes de liberación controlada (NPK:9:45:15 o 4-25-35)

• ,

Alcances de la micropropagación vegetal

• Propagación vegetativa rápida y a gran escala • Uniformidad seleccionada del material clonado • Multiplicación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales • Reducción en el tiempo de multiplicación y en el espacio requerido para tal fin • Mayor control sobre la sanidad del material propagado • Introducción rápida de nuevos cultivares • Conservación de germoplasma

Cultivo de tejidos vegetales

• Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal

Morfogénesis indirecta Regeneración a partir de callos

Sección Entrenudo

Inducir callo organogénico

Inducir brote

Inducir raíz

Genotypic Effects on Callus Morphology

Compact Callus 0.1 mg/L kinetin 3 0 /2 4 D

Friable Callus 2.0 mg/L IAA

Embriogénesis somática (formación de embriones) Proceso mediante el cual se desarrolla un embrión a partir de una célula somática (embriogénesis somática).

Factores que afectan la embriogénesis somática:

1- Explanto: En plantas leñosas: nucelas, En plantas herbáceas: tejidos localizados dentro del ovario (endosperma), cigoto, ápices de hojas, ápice radical, etc 2- Factores químicos mas importantes para la embriogénesis somática: Auxinas exógenas, fuente y concentración de Nitrógeno y sacarosa, Fe, carbón activado

Inducción de callos embriogénicos: Auxina (2,4 D) y nitrógeno (nitrato o amonio y glutamina o alanina, caseína hidrolizada) Hierro Altas concentraciones de sacarosa Maduración y germinación de los embriones: Nitrógeno reducido, disminuir 2,4 D 3- Condiciones físicas: alta intensidad lumínica

Sección entrenudo Establecer e inducir callo embriogénico

Mantener y Multiplicar

. Desarrollar 2. Madurar y 3. Germinar embriones

proembrión globular, trapezoidal, embrión cordiforme y torpedo.

El desarrollo de los embriones somáticos pasa por los mismos estados morfológicos de desarrollo que un embrión cigótico:

• • • • • •

Procedimiento para la regeneración vía embriogénesis somática 1. Iniciación: callos embriogénicos 2. Proliferación: callos embriogénicos, masas proembriogénicas (PEM) 3. Desarrollo y maduración de embriones : embriones 4. Germinación de embriones (Regeneración) Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas: – – – –

Masas proembriogénicas Estadío globular Torpedo Embrión somático

Estas estructuras pueden ser denominadas proembriones globulares (A y B). En una etapa posterior desarrollan epidermis, tejido provascular, acumulan material de reserva y sufren polarización. Producen cotiledones y se transforman en embriones somáticos con formación de ápices de tallo y raíz. En las dicotiledóneas la etapa globular es seguida por la etapa de corazón que se corresponde con la adquisición de la simetría bilateral: desarrollo de la epidermis, de los estratos procambiales y sucesivamente el ápice radical. Luego en la etapa cotiledonar se desarrolla el ápice del tallo

Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por encapsulación en alginato

1- Las anteras inmaduras que contienen polen inmaduro (microespora) u óvulos se colocan en medios que promueven la división celular y la formación de embriones o callos. 2-Transferidos a un medio de regeneración se forman plantas haploides 3- En la mayoría de los casos se forman plantas haploides estériles pero en algunas especies ocurre una duplicación espontánea de cromosomas en la etapa de desarrollo de callo y de regeneración de la planta (arroz, cebada, trigo, papa, maíz) Cebada: 3x103 granos de polen por antera y 60 anteras por espiga Cruzamiento A X B

Plantas F1

Cultivo de anteras

Selección de Líneas haploides

Condiciones que afectan el cultivo de las anteras Genotipo de la planta donante Fisiología de la planta donante: Solo el grano de polen que carece de la mayoría de los elementos estructurales, que dá tinción suave y que es pequeño será idóneo Desarrollo del polen: La mejor respuesta se obtiene cuando las anteras se cultivan en etapa del desarrollo del polen comprendida entre la microspora tardía y el polen temprano. El punto de divergencia hacia una vía androgenética está marcado por una división mitótica ecuatorial de las microsporas Pretratamiento de las anteras: alta o baja temperatura, choque osmótico 2 a 3 semanas a 4 grados Tratamiento de las anteras en manitol (0,3M) Efecto: aumenta la frecuencia de granos de polen vivos, estimula la división simétrica ecuatorial de microesporas androgénicas y sincroniza el ciclo celular

Medio de Cultivo para obtener mayor tasa de regeneración de plantas androgénicas: Medio líquido+ extracto de papa Sacarosa (niveles altos para inducir callo y bajos para la regeneración de plantas) y Reg de crec. (inducción de embrión y callo mayor conc auxina que para la regeneración de plantas) Fuente de carbono: sustituir sacarosa por maltosa ya que aumenta la estabilidad osmótica y es mas facilmente metabolizable La sacarosa se hidroliza y produce fructosa la que puede resultar tóxica Baja concentración de nitrógeno. Sustituir nitrato por sulfato de amonio y aumentar la concentración de potasio N orgánico: glutamina Fitoreguladores: ANA e IAA: inducen embriogénesis somática; 2,4D callos

Cultivo de embriones cigóticos Para qué se usa? Superar dormición Inhibidores en el endosperma Estudios fisiológicos y nutricionales Rescatar híbridos de cruzamientos Duraznero X Almendro

Rescate de embriones

Parental Maculino

Extracción y tamizado del polen

Polinización

Rescate y germinación de embriones

In vitro

Sustrato

Cultivo de tejidos: Rescate de embriones

Visualización de la Pared Celular: Microscópio óptico, invertido, de fluorescencia (Tinapol /fluorescencia verde), calcofluor White/fluorescencia azul) Recuento y determinación de la viabilidad (colorantes que se incorporan: rojo neutro, diacetato de fluoresceina; colorantes que se excluyen: azul de Evans; actividad fotosintética: emisión de fluorescencia; actividad respiratoria: consumo de oxigeno

Recuento de protoplastos

1.

Los protoplastos regeneran la pared celular luego de cuatro días de cultivo

2.

Luego de 2 a 3 semanas de activa división mitótica se forman microcolonias derivadas cada una de una célula que se pueden ver a simple vista

3.

Estos callos son transferidos a un medio de cultivo y en condiciones apropiadas para regenerar plántulas

Factores que afectan la división y la regeneración de los protoplastos 1.

El medio de cultivo: líquido, semisólido, perlas de agarosa en medio liquido

2.

El ambiente físico:

•

Requerimientos nutricionales

•

Potencial osmotico del medio de cultivo

•

La densidad de protoplastos

En general debe ser baja 100-500 protoplastos/ ml En aquellas especies que necesitan una gran densidad de protoplastos se desarrolló el sistema de células nodrizas o alimentadoras. Se exponen 106 protoplastos/ml a rayos X a dosis que inhiben la división celular pero que quedan metabólicamente activas. Estas células se plaquean en un medio agarificado y luego se colocan sobre estas los protoplastos sin irradiar, de los que se formarán colonias. Técnica de la microgota (0,25-25 µl de medio de cultivo) •

temperatura y luz

3.

El genotipo

Producción de metabolitos secundarios

Cultivos celulares

Cultivo de tejidos y metabolismo secundario

Concepto general

El metabolismo secundario regula muchas de las relaciones de la planta con el medio circundante

• La producción de metabolitos secundarios está estrechamente relacionada con el proceso de desarrollo de la planta. - Generalmente no está asociada al crecimiento. - Depende de condiciones determinadas de control hormonal. - Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y órganos (raíces, tallos, hojas y glándulas). - La biosíntesis y acumulación suele estar fuertemente compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidos y de órganos.

• Los metabolitos secundarios se producen ante situaciones de estrés o enfermedad. Cultivos celulares

- Factores bióticos - Factores abióticos

Las plantas como fuente de metabolitos secundarios y Primarios de interés comercial

- Insecticidas - Saborizantes

- Fragancias - Antimicrobianos - Enzimas

- Medicinas - Herbicidas - Proteasas

- Colorantes

• Potencial - 75 % de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las plantas. - Sólo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000 especies vegetales que se creen existentes en el planeta. - 25 % de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de origen vegetal.

Cultivos celulares

- 75 % de la población mundial utiliza la medicina tradicional que consiste principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas.

Producción de metabolitos secundarios por cultivo in vitro de células y órganos vegetales: ¿por qué?

- Independizarse de factores externos tales como: cambios de temperatura, sequías, plagas, variabilidad de la producción, factores políticos y sociales, etc. - Evitar la extinción de especies vegetales. - Disponer de condiciones controladas en el proceso de producción y extracción. - Posibilitar el mejoramiento vegetal en tiempos mas cortos. - Hacer viable la producción de compuestos complejos con uno o más C quirales en forma más económica respecto de la síntesis química - Posibilitar la obtención de nuevos compuestos no presentes en la planta madre.

Cultivos celulares

- Establecer procesos de biotransformación sólo realizables por enzimas provenientes de plantas.

Procesos industriales

Tipo de compuesto

Producto

Compañía

Farmacéuticos

Shikonina

Mitsui Petrochemical Ind.

Berberina

Mitsui Petrochemical Ind.

Sanguinarina

Vigont Researol Lab.

Gingenósidos

Nitto Denko Co.

Taxol

Phyton USA

Pigmentos

Cartamina

Kibun Kyoto University

Fragancias

Geraniol

Kanedo Co.

Citronerol

Kanedo Co.

Saborizantes

Vanillina

Kanedo Co.

Depigmentadores

Arbutina

Mitsui Petrochemical Ind.

Viabilidad de un proceso para su escalado a nivel industrial

• Condiciones económicas: - Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg) - Alto rendimiento y productividad del cultivo comparado con la planta entera - Buen crecimiento en biorreactores - Crecimiento lento de la planta entera como fuente alternativa

• Parámetros principales: - Productividad: g de producto/L/día

Cultivos celulares

- Concentración máxima de producto: g de producto/L - Rendimiento: g producto/g sustrato

Estrategias para incrementar u optimizar la producción de metabolitos secundarios

Cultivos celulares

• Selección de especies vegetales apropiadas • Selección de líneas celulares mejoradas • Optimización de las condiciones de cultivo • Agregado de precursores • Tipo de cultivo: suspensiones celulares, órganos (medio líquido) o células inmovilizadas • Uso de elicitores microbianos y estrés abiótico • Permeabilización y remoción in situ Cultivos celulares

Metodologías utilizadas para optimizar la producción de metabolitos secundarios

• Screening y selección de líneas sobreproductoras - Se facilita cuando el metabolito de interés es un pigmento, ya que puede hacerse una selección visual. - Es importante contar con un método rápido y sencillo para seleccionar líneas más productoras (por ejemplo, ELISA).

• Optimización del medio de cultivo (variables más ensayadas) - Fuente de carbono - Limitación en nitrógeno - Limitación en fosfato - Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas) - Relación C/N

• Agregado de precursores Cultivos celulares

- Bajo costo - Baja toxicidad - No muy alejado del producto final en la ruta metabólica

Diferencias entre suspensiones de células vegetales y de células microbianas Caracterización

Células microbianas

Células vegetales

Consecuencias para cultivos a gran escala

Células Individuales 2-10 µm

Agregados de 10-200 µm y de hasta 2 mm de diámetro

Sedimentación rápida; sensibilidad a fuerzas de corte; formación de gradientes; dificultad para tomar muestras

Velocidad de crecimiento

Rápida; td ~ 1-2 h

Lenta; td ~ 2-5 días

Largos tiempos de proceso; baja productividad

Densidad de inoculación

Pequeña

5-20%

Necesidad de grandes cantidades de inóculo; escalado más largo

Sensibilidad a fuerzas de corte

Insensible

Sensible / Tolerante

Bajas velocidades de agitación

Alta

Baja

Baja demanda de oxígeno: fermentadores con baja transferencia de oxígeno

Extracelular

Intracelular / a veces extracelular

Permeabilización; remoción in situ

Tamaño y morfología

Aireación

Acumulación del producto

Tomado de: Scraag.. Plant Biotechnology, 1992.

Cultivos en suspensión

• Problemas a considerar: - Tasa de crecimiento - Volumen del inóculo - Tamaño y agregación de las células - Oxigenación - Agitación

Cultivos celulares

Cultivo de órganos: raíces Propiedad Forma de crecimiento Patrón de crecimiento

Tiempo de duplicación Biomasa final (peso seco/L) Background genético Formación inicial de producto Medio de crecimiento Localización del producto Tipo de proceso

Suspensiones

Raíces transformadas

Células simples-agregados Desorganizado; cada célula puede dividirse y expandirse

Red de ramificaciones División celular localizada; crecimiento lineal con ramificaciones laterales 36 h-días 30-60 g

15 h-días 30-60 g Heterogéneo Usualmente bajo Complejo; hormonas y vitaminas Intracelular- extracelular Batch; continuo, deben ser inmovilizadas

Euploide Similares a la planta madre Simple, sales y azúcar Intracelular- extracelular Batch o continuo, no hay necesidad de inmovilizar

Algunos metabolitos secundarios producidos por raíces transformadas

Metabolito

Género

Alcaloide Alcaloides piridínicos Indoles

Nicotiana Catharanthus Cinchona Duboisia Datura

Tropano

Otros Betalaina Sesquiterpenos

Lippia Artemisia Coreopsis, Bidens Tagetes

Poliacetilenos Tiofenos Glicósidos cardiotónicos Antraquinonas Saponinas Lignanos

Cultivos celulares

Naftoquinonas Esteroides

Digitalis Cassia Panax Chaenactis Podophyllum Linum Lithospermum Solanum

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Patrón de flujo de dos diseños de propulsor Agitador de paletas planas o Rushton

Agitador de paletas inclinadas

Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.

Biorreactores para el cultivo de raíces Bioreactor de lecho de goteo con malla para inmovilizar a las raíces

Bioreactor de lecho de niebla (nutrient mist reactor)

Inóculo Salida de aire Malla de inmovilización

Bomba peristáltica

Adición de nutrientes Filtro de aire

Bomba de aire

Generador de niebla Aire

Aire

Bomba

Reservorio

Intensidad On

Condensador de niebla

Off Controlador

Cámara de cultivo

Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Elicitación • Agentes bióticos - Extractos de paredes de hongos o bacterias - Acido araquidónico - Quitosano - Metil jasmonato

• Agentes abióticos - Metales pesados - Radiación UV - Presión osmótica - Ultrasonido Cultivos celulares

Liberación del producto al medio

- DMSO - Shock térmico - Cambios de pH - Detergentes y aceites de siliconas - Electropermeabilización

Cultivos celulares

Esquema de un proceso completo para la producción de un metabolito secundario por cultivo in vitro de células y órganos vegetales

Producción de shikonina por suspensiones celulares de Lithospermum erythrorhizon

Shikonina Yamasaki Plant Photo Gallery

• Planta entera - La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 3 años.

• Suspensiones celulares - 2,4-D estimula el crecimiento pero no la producción. - Las bajas concentraciones de nitrógeno y la elicitación inducen la producción de shikonina. - Se utilizan fermentadores de agitación mecánica y tambor rotatorio. - La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.

Proceso para la producción de shikonina a partir de células de Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.

Masa celular

Producción Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Producción de taxol por Taxus spp

Schoepke Plant Image Gallery

Taxol®

• Planta entera - La edad de los árboles para extraer el producto es de 50-100 años. - La concentración de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco. - Este método de producción podría llevar a la extinción de la especie.

• Semisíntesis - El material vegetal empleado presenta variación en la concentración de precursores. - Las plantas empleadas crecen lentamente. - Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difícil la purificación del taxol.

Muy importante Considerar

• Aspectos bioingenieriles - Diseño de bioreactores especiales para cultivos de tejidos vegetales - Instrumentación y control de los bioprocesos - Diseño de bioreactores más económicos - Métodos no letales para liberación de los metabolitos secundarios - Método adecuado para la remoción in situ

• Aspectos Biológicos

Cultivos celulares

- Conocimiento de la regulación de las rutas biosintéticas: enzimas y factores de transcripción - Conocimiento de la regulación del transporte y acumulación de los metabolitos secundarios - Conocimientos de los mecanismos de degradación del producto

Otra herramienta de la biotecnología son los Sistemas de transformación genética: Ingeniería genética

Sistemas de transformación vegetal: Agrobacterium tumefaciens

Sistemas de transformación genética en plantas

METODOS PARA HACER INGENIERÍA GENÉTICA

• Sistemas de transferencia indirecta de ADN (basados en vectores biológicos) - Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes. - Sistemas basados en virus vegetales.

• Sistemas de transferencia directa de ADN - Transferencia por biobalística. - Transferencia mediada por cationes divalentes y/o electroporación

-

Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

Tumor de tallo provocado por Agrobacterium tumefaciens

En raíz de arándano Agalla en tallo de vid

Planta de olivo con corteza agrietada y agallas en la región del cuello

Mapa genético del plásmido Ti de octopina

BI

Megaplásmido 150-200 kb

BD

TDNA Re gión oncogé nica

Tms1: triptofa no mono ox ige na sa Tms2 : indol-3-a ce ta mida hidrola sa Tmr : DMA tra nsfe ra sa

a ux ina s a ux ina s citoquinina s

Sínte sis opina s

Ocs: octopina sinte ta sa Nos: nopa lina sinte ta sa

opina s

Promotores

eucariotas

Genes Vir Vir Vir Vir Vir Vir Vir Vir

A G C D B E H

Regulación de la infección Formación y procesamiento de una copia del TDNA Estructurales, facilitan el movimiento del T-DNA No es escencial. Facilita la supervivencia del Agrobacterium durante la infección

Localizados en el cromosoma de Agrobacterium : constitutivos Median la interacción entre la bacteria y la célula vegetal

Síntesis de fibrillas de celulosa por Agrobacterium para cubrir la superficie de la célula vegetal (irreversible). Clusters de Agrobacterium son entrampadas en la red de fibrillas de celulosa.

Cromosoma bacteriano chv A chv B psc A a tt

Síntesis y excre sión de compuestos de superficie 1,2 glucanos Síntesis de compue stos de supe rficie 1,2 gluca nos Interacción e ntre el agroba cterium y la célula vegetal Afectan la síntesis de cicloglicanos y de succinilglicanos Afectan las prote ína s de superficie

cel chv E

síntesis de fibrillas de ce lulosa Prote ína de afinida d con azúcare s

Mecanismos moleculares implicados en la transformación por Agrobacterium tumefaciens

La preparación del linaje de Agrobacterium para ser utilizado como vector para la transformación de plantas incluye dos etapas:

Primera etapa: Obtener un linaje desarmado, en el cual el TDNA con sus oncogenes fue eliminado Segunda etapa: preparación de un vector conteniendo las extremidades del T-DNA entre los cuales se clonan los genes de interés

Marcadores Seleccionables (Agente selectivo) Visualizables (Fenótipos asociados) npt II (kanamicina) gus A (color azul indigo) hph (higromicina) luciferasa (luminiscencia) pat o bar (Phosphinotricina, bialaphos) gfp (fluorescencia verde) CP 4 (glifosato) man A (manosa 6 fosfato)

Finalmente una vez obtenido el vector, este debe ser transferido al Agrobacterium (transformación). Los métodos a utilizar para transformar son tres: Conjugación Electroporación Shock térmico

Métodos para la transformación ETAPAS: 1- Transformación: Infección de la planta o partes de la planta con Agrobacterium (cocultivo) 2- Selección de las células infectadas mediante crecimiento en medios selectivos 3- Eliminación de Agrobacterium utilizando antibióticos que no afecten el crecimiento de la planta 4- Regeneración: Inducción del crecimiento y multiplicación de las células transformadas, mediante la utilización de auxinas y citoquininas que estimulan la producción de callos y brote 5- Análisis histoquímico y molecular (a nivel transcripcional y transduccional) para comprobar la integración y expresión del gen de interés Southern blot- Northem Blot ELISAWestern blot

Cocultivo : Explanto +

Electroporación: - Descargas de capacitores, para producir descargas de voltaje

- Bombardeo de micropartículas (Transformación por biobalistica biobalistica))

1- Preparación del protoplasto, meristema o tejido 2- Preparación del DNA transformante 3- Recubrimiento de partículas de oro o tungsteno: DNA transformante, Cloruro de calcio 0,5 M, espermidina 2,5 M , etanol absoluto 4- Ajustar condiciones de trabajo: Presión de Helio 5- Estabilización y regeneración 6- Detección de transformantes

Especies a transformar

Agrobacterium Dicotiledóneas y algunas monocotiledóneas

Método biobalístico Sin limitaciones

Eficiencia de transformaciónalta

baja

Construcción de vectores Dependencia del genotipo

compleja

simple

mayor

menor

infección selección enraizamiento rusticación análisis molecular: Northern blot, Southerm blot, Western blot, etc Estudios genéticos: para demostrar la estabilidad de la integración

Hibridización somática: Fusógenos químicos: pH y Ca elevado, PEG, PEG+Ca y pH elevado, PEG+DMSO, policationes

Electrofusión

Aplicaciones: Obtención de Metabolítos secundarios Ingeniería metabólica del metabolismo secundario Especie

Enzima

Producto

Observaciones

Peganum harmala (suspensiones y raíces)

Triptofano decarboxilasa (TDC)

Serotonina

Incremento de 10-20 veces en producto

Hyosciamus muticus (raíces transformadas)

Hiosciamina-6-hidroxilasa (H6H)

Escopolamina

Contenido de producto 4 veces superior a planta control

Catharanthus roseus (suspensiones)

Triptofano decarboxilasa (TDC) y estrictosidina sintasa (STR)

Alcaloides indólicos (TIAs)

Contenido de TIAs de 300 mg/L comparado con control 50mg/L. Líneas inestables

Catharanthus roseus (suspensiones)

ORCA3 (factor De transcripción)

Alcaloides indólicos (TIAs)

Incremento de la concentración de TIAs de 3 veces después de agregar el precursor secologanina

Coptis japonica (suspensiones)

(S)-esculerina 9-Ometiltransferasa (SMT)

Berberina

Incremento del flujo hacia la producción de berberina de 15%

Mentha spp. (planta)

Desoxixilulosa fosfato reductoisomerasa (DXR)

Aceites esenciales

Incremento del 50% en el contenido de aceites esenciales

Zea mays (callos)

C1 y R (factores de transcripción)

Antocianinas

Producción de antocianinas y fenoles que no se producían en los callos sin transformar.

Aplicaciones

Ejemplos de Ingeniería metabólica en el metabolismo secundario

• Problemas - Clonado de genes - Estabilidad - Compartimentalización - Transporte - Limitaciones y arquitectura de la ruta metabólica - Canales metabólicos

Cultivos celulares

Obtención de plantas de interés agronómico • Resistencia a herbicidas: 1- Alteración de la cantidad o de la sensibilidad de la proteína blanco del herbicida 2- Producción de una enzima que detoxifica al herbicida Bloquean la síntesis de aminoacidos: • Fosfinotricina : (-) glutamino sintetasa • Glifosato: (-) PEP-Shiquimato 3-P-sintetasa

Resistencia a Bacterias y Hongos Patógeno Funciones de virulnecia virulencia Enzimas: cutinasas celulasas pectinasas proteasas xilanasas Toxinas Funciones de avirulencia elicitores

Planta Reacciones de defensa Generacion de señales ROS ácido salicílico jasmonatos elicitores Barreras estructurales calosa proteínas de pared lignina y fenoles en general Inhibidores del crecimiento del patógeno Fitoalexinas PRP Quitinasas y glucanasas Tioninas Inhibidores del proteasas crecimiento del patógeno Inhibidores de poligalacturonasas

Resistencia a bacterias A)

Producción de proteínas antibacterianas: Péptidos líticos, Lisozimas

B)

Inhibición de la patogenicidad de la bacteria o eliminación de los factores de virulencia: Enzimas detoxificantes de toxinas, inactivadoras de toxinas

C) Incremento de las defensas naturales de la planta: proteínas de defensa

• Resistencia a Hongos • • • •

RIP : proteínas inactivadoras de ribosomas PR (quitinasas, glucanasas) Péptidos antifúngicos: defensinas Proteínas antifúngicas: tioninas

Resistencia a Insectos Resistencia conferida mediante la acción de inhibidores de proteasas plantas resistentes a insectos: maíz, batata y soja transgénicos Insecticidas biológicos seguros

Incremento de la tolerancia al estrés • • • • • •

Producción de compuestos osmoprotectores (prolina, sacarosa, fructano, glicina betaína, manitol) Incremento de la Producción de proteínas producidas por estrés (proteínas anticongelamiento, LEA3 en salinidad, sequía) Producción de enzimas antioxidantes (SOD) Producción de proteínas que reduzcan la hipoxia (hemoglobina) Genes que incrementan la extensibilidad de la membrana (desaturasas) Genes que permiten el transporte de sodio al interior de la vacuola (Na/H antiport)

Obtención de nuevos alimentos y alteración de la calidad nutricional ARROZ GM que produce beta caroteno de genes de narciso y de Erwinia uredovora. ARROZ fortificado con un gen de la ferritina del poroto de soja. TOMATE Flavr Savr (ADN antisentido en gen de la poligalacturonasa que degrada las pectinas en la maduración). TOMATE con tres veces y medio de beta caroteno. La empresa Calgene produjo aceites ricos en ácido esteárico. Se alteró la composición en hidratos de carbono con vistas a la producción de tubérculos de papa, aumento del contenido de almidón y reducción de amilosa

APLICACIONES MÉDICAS Frutas y vegetales, bananos (Musa paradisiaca) y papa, para producir vacunas comestibles orales: . • Antígenos de virus de hepatitis B y tóxina del cólera, para inmunización oral. • Expresión de proteína de cápside del virus Norwalk, contra la gastroenteritis viral. • Expresión de las porinas (proteínas de membranas externas) de S. typhimurium para inmunizar contra estas bacterias.

APLICACIONES MÉDICAS

Anticuerpos recombinantes en vegetales 1-Papa con la vacuna que previene la insulina dependencia de la diabetes mellitus. 2- Papa con la sub-unidad B antigénica de la enterotoxina del Vibrio cholerae . 3-Soja con anticuerpos que protegen contra el virus 2 de Herpes simplex (HSV). 4-Tabaco con anticuerpos que previenen la caries dental producida por Streptococcus mutans.

Ventajas de los vegetales como bioreactores • Las plantas son los productores más eficientes de proteínas – son bioreactores escalables – presentas ventajas en cuanto a costos • Las células vegetales son similares a las humanas en cuanto a: – Maquinaria para síntesis proteica – Pauta de lectura del código genético – Ensamble, plegamiento y secreción de proteínas complejas