1 FITOQUIMICA TP N 1: CÉLULA VEGETAL INTRODUCCIÓN Las células vegetales presentan una pared celular celulósica, rígida que evita cambios de forma y posición que las diferencian de las células animales; contienen plastidios, estructuras que sintetizan y almacenan alimentos siendo los más comunes los cloroplastos y casi todas las células vegetales poseen vacuolas, que tienen la función de transportar y almacenar nutrientes, agua y productos de desecho. La célula vegetal típica presenta, por fuera de la membrana plasmática, la pared celular, compuesta fundamentalmente por celulosa (polímero compuesto por moléculas de glucosa). Las moléculas de celulosa se unen en fibrillas, que constituyen el bastidor estructural de la pared. Muchas células vegetales forman una pared celular primaria mientras crece la célula, y otra secundaria formada en el interior de la primaria al final del crecimiento. Ambas paredes, primaria y secundaria son atravesadas por las vías de transporte de sustancia llamadas plasmodesmos. La pared celular encierra el contenido vivo de la célula, llamado protoplasto. Con el paso del tiempo esta pared puede sufrir una serie de cambios producto del metabolismo y el envejecimiento, manifestándose con deposiciones de diversas sustancias tales como lignina, grasas (suberina, cutina, ceras), taninos, etc., que pueden ser reconocidas mediante pruebas químicas. La pared celular delimita a la célula vegetal, determina su forma y confina al protoplasto. Este está formado por citoplasma, que a su vez contiene orgánulos, vacuolas y núcleo. Otra característica típica de la célula vegetal es la presencia de plastidios, los cuales pueden ser pigmentados (cloroplastos y cromoplastos) o no pigmentados (leucoplastos). La clorofila es el pigmento fundamental de los cloroplastos, mientras que los carotenos dan la coloración rojiza o anarajada de los cromoplastos; dentro de los plastidios no pigmentados se encuentran los elaioplastos, que almacenan grasas (lípidos) y los amiloplastos, que almacenan almidón; éstos últimos pueden tener formas diversas e incluso pueden tener valor taxonómico. También las paredes celulares estas compuestas por ligninas, que aumentan la rigidez, y las ceras que reducen la pérdida de agua. Las vacuolas, son muy importantes en la célula vegetal; su contenido acuoso se denomina jugo celular, y es variable de una célula a otra. El jugo vacuolar puede contener ácidos orgánicos tales como oxálico, málico, cítrico, algunas veces en forma de sales de diversos tipos. El oxalato de calcio puede precipitar en forma de estrellas (drusas) o en forma de agujas (rafidios) que constituyen sustancias ergásticas. Las vacuolas pueden contener también taninos, mucílagos, proteínas, aceites, pigmentos (antocianinas), etc., estos materiales pueden ser sustancias de reserva o residuos metabólicos.

En el caso de las plantas, la remoción de la pared celular es el primer paso, y crucial, requerido antes de la introducción del ADN directamente a través de la membrana plasmática. Los biólogos moleculares producen protoplastos cuando preparan para la transformación a diversos tipos vegetales. A continuación de la producción de protoplastos,

2 la membrana celular puede hacerse permeable al ADN usando electroporación (mediante un campo eléctrico) o polietilenglicol. Los protoplastos fueron asimismo empleados (con un éxito mucho más limitado) para hacer fusión de protoplastos, en la cual los protoplastos de distintas especies vegetales son tratadas de tal manera que ambas se fusionan, resultando en células híbridas de especies cruzadas. OBJETIVOS:  Obtener protoplastos a partir de diferentes órganos de diversas especies vegetales mediante degradación enzimática de los distintos componentes de la pared celular.  Evaluar el rendimiento de protoplastos viables.  Distinguir diferentes tipos de paredes celulares mediante técnicas histoquímicas.  Observar plastidos y sustancias ergásticas de muestras vegetales.

PROCEDIMIENTO A. Preparar 100 ml de una solución 0,5 M de sorbitol (solución isotónica). Llevar a pH de 6-7 con gotas de NaOH 0,1 N. B. Pesar 0,1 g de pectinasa (Macerozyme R-10 de Rizopus sp, Yakult, 400-800 U/g1) y 0,2 g de celulasa (Celulasa “Onozuka” RS, de Trichoderma viride, 2 U/mg)2. Colocar ambas enzimas en el mismo recipiente. C. Agregar 10 ml de la solución de sorbitol 0,5 M, pH 6-7 a la mezcla enzimática inmediatamente antes de usar ya que las enzimas son inestables y pierden actividad con la temperatura y el tiempo. Concentraciones finales de enzima: pectinasa 1% y celulasa 2%. D. Proseguir la técnica de acuerdo al Protocolo para la obtención de protoplastos que se detalla a continuación: 1) Lavarse las manos. Tomar el material vegetal (una o dos hojas, o bien láminas de raíces o tubérculos) de las especies de partida y enjuagarlas abundantemente con agua corriente y luego secarlas. Raspar ligeramente la cara abaxial de las hojas con aguja, bisturí u hoja de afeitar. Cortar las hojas o láminas en cuadrados de aproximadamente 1 cm de lado y ubicarlos en la tapa de una caja de Petri en cantidad suficiente para cubrirla. 2) Agregar 10 ml de la solución enzimática recientemente preparada en la caja de Petri y con la ayuda de pinzas, poner a flotar los fragmentos de la muestra en la superficie de la solución enzimática. En el caso de las hojas, ubicar la epidermis abaxial

Unidades definidas como: una unidad libera 1.0 mol de ácido galacturónico a partir de ácido poligalacturónico por min a pH4.0 a 25ºC. 2 Unidades definidas como: una unidad libera 1.0 mol de glucosa a partidr de carboximetilcelulosa sódica por min a 40ºC, pH 4.5. 1

3 (inferior) en contacto con la solución digestiva. Los pedacitos del tejido vegetal pueden superponerse un poco. 3) Sellar la caja de Petri con parafilm o cinta y llevarla a estufa (37 ºC) mantener con agitación suave durante 30 minutos. 4) Preparar una muestra control con el material vegetal y 10 ml de sorbitol 0,5 M sin las enzimas. 5) Realizar observaciones microscópicas de las muestras con y sin digestión enzimática: tomar un pequeño volumen de la suspensión de la caja de Petri y colocarla entre porta y cubreobjetos y buscar protoplastos en todos los campos microscópicos. 6) Para limpiar los protoplastos de restos celulares y de otras impurezas, una vez obtenidos filtrar el preparado por gasa y centrifugar a baja velocidad (500 – 1000 rpm). Descartar el sobrenadante y resuspender los protoplastos en 2 ml de sorbitol 0,5 M (sin enzimas). Repetir el lavado 2 veces y resuspender finalmente en 1 ml de la solución isotónica. E. Evaluar el rendimiento de protoplastos viables. A un pequeño volumen de la suspensión agregar gotas de solución acuosa de Rojo Neutro 0,1 %. El rojo neutro es útil para coloraciones vitales ya que es captado por las células (específicamente por los lisosomas y endosomas) y solo las células viables son capaces de retener el colorante. Luego de algunos minutos realizar un recuento de células viables y noviables en cámara cuentaglóbulos y calcular el porcentaje. F. Realizar cortes a mano alzada del material en estudio y realizar una coloración diferencial para observar paredes celulares celulósicas y lignificadas con la coloración doble Safranina-Verde Rápido de la siguiente manera: 1) Tratar los cortes con hipoclorito de sodio al 50 % durante algunos minutos hasta clarificar y luego lavar 5-6 veces con agua destilada. 2) Pasar los cortes a alcohol 70 %. 3) Colorear con Safranina a saturación en alcohol 80 % durante 10 minutos. 4) Realizar un pasaje rápido por alcohol 96°. 5) Colorear con Verde Rápido a saturación en alcohol 100° (2 cambios). 6) Observar al microscopio las células que presentan distintos tipos de pared celular, drusas, rafidios, gránulos de almidón, cloroplastos, etc.