Métodos de Estudio en Biología Celular

A. INFORMACIÓN MORFOLÓGICA

Microscopía Óptica Microscopía Electrónica Técnicas Cito-histológicas Cultivo in vitro de células y tejidos B. ORIENTACIÓN SOBRE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA Citoquímica-Histoquímica Inmunohistoquímica Autorradiografía C. SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES Fraccionamiento Celular Ultracentrifugación Citometría de Flujo D. INFORMACIÓN ANALÍTICA A NIVEL MOLECULAR Cromatografía Electroforesis

1. Técnicas Histoquímicas Objetivos • Permitir la identificación y localización de los diferentes compuestos químicos dentro de la célula. • Pero en muchos casos hace posible también la cuantificación de los compuestos.

Aplicaciones • Diagnóstico

son un instrumento invalorable en la detección y pronóstico de innumerables alteraciones histopatológicas.

• Investigación ayudan a establecer el papel que desempeñan los diferentes componentes celulares en los procesos metabólicos de la célula.

Característica • Es básicamente un método microscópico.

Técnicas histoquímicas

Condiciones 1. la sustancia original debe ser inmovilizada y visualizada por el microscopio en su localización celular original. 2. la sustancia debe ser identificada por un procedimiento que sea específico para ella o para el grupo químico al que pertenece.

Identificación de la Sustancia a) reacciones químicas similares a las usadas en química analítica, pero adaptadas a los tejidos. b) reacciones que sean específicas para ciertos grupos de sustancias. c) medios físicos.

Técnicas histoquímicas

Detección de Lípidos

• Se utilizan generalmente colorantes del grupo del Sudán o aceite rojo.

• Generalmente se realizan cortes por congelación, para evitar la solubilización de los lípidos que producen los solventes orgánicos. • También puede utilizarse osmio como fijador-colorante, ya que insolubiliza a los lípidos.

Técnicas histoquímicas

Detección de Hidratos de Carbono

Tinción PAS-hematoxilina de vellosidades intestinales

• La técnica más empleada es la reacción de PAS (Peryodic acid Schiff). • el reactivo de Schiff se une a grupos aldehído, que pueden tener diferentes orígenes: 1. aldehídos libres, presentes en forma natural en los tejidos. 2. aldehídos producidos por hidrólisis selectiva (reacción de Feulgen-ADN). 3. aldehídos producidos por oxidación selectiva (reacción de PAS-glúcidos).

Técnicas histoquímicas

Reacción de PAS

• La reacción de PAS (ácido peryódico-Schiff) fue ideada por McManus (1948). • Está basada en la generación de grupos aldehído libres por oxidación de los grupos glicólicos 1-2 de los polisacáridos por medio del ácido peryódico. • Este método es positivo en células vegetales para el almidón, la celulosa, la hemicelulosa y las pectinas. • En los tejidos animales para el glucógeno, las mucinas, las mucoproteínas, el ácido hialurónico y la quitina.

Técnicas histoquímicas

Reacción de PAS

Técnicas histoquímicas

Detección de Ácidos Nucleicos

• La técnica más empleada es la reacción de Feulgen, que depende de la presencia de desoxirribosa. • Los tejidos fijados se someten a una hidrólisis ácida débil con ácido clorhídrico y luego se tratan con el reactivo de Schiff. • La hidrólisis ácida extrae las purinas a nivel de la unión desoxirribosa-purina del ADN y libera los grupos aldehído de la desoxirribosa. • Los grupos aldehído libres reaccionan con el reactivo de Schiff.

2. Inmunohistoquímica Objetivos • Permitir la detección de sustancias tisulares específicas por medio de anticuerpos. • Identificar la presencia de distintos componentes celulares que no pueden detectarse mediante otras técnicas.

Aplicaciones • Análisis de la ultraestructura celular. • Estudio de funciones de proteínas y ácidos nucleicos.

Característica • Se utilizan anticuerpos específicos contra una determinada sustancia que luego se marcan para su identificación microscópica.

Inmunohistoquímica

Anticuerpos Monoclonales Milstein, Jerne y Köhler (1975) Premio Nobel de Medicina en 1984

César Milstein (1927-2002)

Inmunohistoquímica

Técnica Inmunohistoquímica • Se aplican sistemas de detección enzimáticos o fluorescentes ( ) para detectar los anticuerpos unidos al antígeno, ya que no son visibles por sí mismos.

• Luego se lava el preparado para eliminar las moléculas del anticuerpo no unidas.

• Sobre un corte histológico se hace actuar una solución con el anticuerpo ( ) capaz de unirse específicamente a un componente ( ).

Inmunohistoquímica

Sistemas de Detección de Anticuerpos Método Directo: consiste en la unión de un anticuerpo primario (2) a una enzima, fluorocromo o metal pesado (3), con la consiguiente formación de un Ac primario conjugado que se une luego a un Antígeno (1).

Método indirecto de dos pasos: se usa un anticuerpo primario (2) contra la proteína o sustancia que se desea detectar (1) y luego un anticuerpo secundario (3) contra el anticuerpo primario, marcado enzimáticamente (4).

Método indirecto de tres pasos: consiste en un anticuerpo terciario (5) conjugado con una enzima (6), que reacciona con un anticuerpo secundario (3) conjugado con otra enzima (4), previamente unido al anticuerpo primario (2).

3. Fraccionamiento Celular Objetivos • Permitir la separación y aislamiento de organelos o estructuras celulares. • Obtener componentes celulares aislados para su posterior análisis molecular.

Aplicaciones • Análisis de las diferentes funciones celulares (síntesis de proteínas de membrana, transporte de solutos, desarrollo de gradientes iónicos, fosforilación oxidativa, etc). • Estudio de funciones de proteínas y ácidos nucleicos.

Característica • Se emplea la centrifugación diferencial, para lograr separar los diferentes organelos o componentes celulares.

Fraccionamiento Celular

Centrifugación “Es el método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos con diferente densidad mediante una centrífuga, la cual imprime una fuerza mayor que la gravedad provocando la sedimentación del sólido o las partículas de mayor densidad”

A. Diferencial • El tubo se llena con una mezcla uniforme. • Tras la sedimentación se obtienen dos fracciones: • Pellet: que contiene el material sedimentado • Sobrenadante, que tiene el material no sedimentado

B. Gradiente de Densidad • La muestra se ubica como una capa en la parte superior del tubo. • Tras la sedimentación se obtienen varias fracciones en forma de bandas diferentes

Fraccionamiento Celular

Centrifugación Diferencial

Fraccionamiento Celular

Tipos de Centrífugas Rotor Basculante

Rotor Angulo Fijo

permite que los tubos oscilen externamente para que las partículas se muevan en dirección paralela a las paredes del tubo.

los tubos no se dejan oscilar libremente, sino que se mantienen en un ángulo oblicuo específico

Fraccionamiento Celular

Fraccionamiento Celular

Fraccionamiento Celular

Centrifugación en Gradiente de Densidad

La centrifugación a través de un gradiente de densidad distribuye el contenido de la fracción en varias capas, según la densidad de los componentes

4. Ultracentrifugación Objetivos • Separación de moléculas y componentes subcelulares. • Permitir la obtención de componentes y moléculas aisladas para su posterior análisis molecular.

Aplicaciones • Estudio de las características de sedimentación de estructuras subcelulares y moléculas. • Análisis de las funciones de proteínas y ácidos nucleicos.

Característica • Se utilizan ultracentrífugas capaces de alcanzar las 100.000 rpm.

Ultracentrifugación

Ultracentrífugas

1. Analíticas • contiene dispositivos e instrumentos que permiten seguir el avance de las sustancias en los tubos (celdas) durante la centrifugación. • Se puede estimar varias veces la velocidad de sedimentación durante el proceso de centrifugación y determinar valores de peso molecular, pureza, etcétera.

2. Preparativas • Todas las determinaciones se llevan a cabo luego de retirar el tubo de la centrífuga. • Están diseñadas simplemente para generar grandes fuerzas centrífugas durante un periodo establecido. • La centrifugación ocurre en un ambiente casi al vacío para reducir al mínimo la resistencia friccional. • Este tipo de centrífuga se usa para purificar componentes que después serán sometidos a estudios adicionales (preparativas).

Ultracentrifugación

Separación de Ácidos Nucleicos

La ultracentrifugación permite separar moléculas de ADN según la longitud de sus nucleótidos

Técnicas de Centrifugación Sedimentación de Precipitados

Centrífuga Preparativa Velocidad Fija

Separación de células y organelos • Centrifugación diferencial

Centrífuga Rotor Angular

• Centrifugación en gradientes

Centrífuga Rotor Basculante

Separación de macromoléculas • Purificación de ADN o proteínas

Ultracentrífuga Preparativa

• Sedimentación en gradiente

Centrífuga Rotor Basculante

Determinación de S • Sedimentación en gradiente

Ultracentrífuga Analítica

Determinación de M • Sedimentación en gradiente

Ultracentrífuga Analítica

5. Cromatografía Objetivos • Permitir la separación o fraccionamiento de moléculas a partir de una mezcla de componentes disueltos. • Purificar un determinado tipo de compuesto a partir de una mezcla.

Aplicaciones • Aislamiento de distintos compuestos químicos en estudio. • Identificación y determinación de cantidades de componentes

Característica • Consiste en fraccionar una mezcla de componentes disueltos a medida que se desplazan a través de algún tipo de matriz porosa.

Cromatografía

Características • es un método físico de separación de moléculas basado en el principio de retención selectiva. • las técnicas cromatográficas son variadas, pero en todas hay una fase móvil (gas o líquido) que arrastra a la muestra a través de una fase inmóvil (sólido o líquido fijado a sólido). • los materiales de la fase inmóvil tienen sitios a los cuales se pueden unir las moléculas disueltas. • conforme las moléculas interactúan con la matriz, su avance a través de la columna se retrasa. • cuanto mayor sea la afinidad de una molécula por el material de la matriz, más lento será su paso a través de la columna. • diferentes componentes de la mezcla poseen distinta afinidad por la matriz, serán retardados diferencialmente • a medida que el solvente pasa por la columna y se desliza hacia el fondo se puede recolectar como fracciones en una serie de tubos.

Cromatografía

Cromatografía por Intercambio de Iones

• se emplea la carga iónica como base de purificación o fraccionamiento analítico. • es utilizado para la separación de proteínas, ya que es improbable que diferentes proteínas de una preparación tengan la misma carga total. • se produce la asociación iónica entre proteínas y grupos con carga unidos a un material inerte de sostén, corno la celulosa. • las dos resinas más empleadas son dietilaminoetil (DEAE)-celulosa y carboxi-metil (CM)-celulosa. • la primera posee carga positiva y se une a moléculas con carga negativa (intercambiador aniónico), la CM-celulosa posee carga negativa y actúa corno intercambiador catiónico.

Cromatografía

Cromatografía por Filtración en Gel • permite separar proteínas o ácidos nucleicos por su peso molecular. • el material de separación consta de minúsculas esferitas ubicadas en una columna a través de la cual pasan las moléculas en solución. • las esferitas con polisacáridos con enlaces transversos (dextranos o agarosas) de porosidad diferente. • para purificar la proteína buscada se pasa la mezcla a través de una columna con esferillas. • éstas solo permiten el paso a su interior de moléculas con un determinado peso molecular.

Cromatografía

Cromatografía por Afinidad • utiliza las propiedades estructurales únicas de una proteína para eliminar la molécula específicamente de la solución, en tanto que las otras permanecen disueltas. • las proteínas interactúan con compuestos específicos: enzimas con sustratos, receptores con ligandos, anticuerpos con antígenos, etc. • cada proteína se puede eliminar de la solución pasando la mezcla por una columna donde la molécula interactuante especifica (sustrato, ligando, antígeno, etc.) se encuentra inmovilizada por unión a un material inerte (la matriz). • ej.: se pasa una mezcla de receptores de insulina a través de esferillas de agarosa unidas a insulina, el receptor se enlazará específicamente a las esferillas.

6. Electroforesis Objetivos • Permitir la separación de moléculas a partir de una mezcla. • Identificar diferentes moléculas en una mezcla.

Aplicaciones • • • •

Caracterización química de proteínas y ácidos nucleicos. Aislamiento de distintos compuestos en estudio. Determinación del peso molecular relativo. Análisis de la expresión génica.

Característica • Consiste en la separación de proteínas y ácidos nucleicos por medio de un campo eléctrico

Electroforesis

Características • es una técnica de separación de moléculas por aplicación de un campo eléctrico. • las moléculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relación entre sus cargas.

• si dos moléculas tienen la misma masa, la de mayor carga neta se moverá con mayor velocidad hacia un electrodo.

• se deposita una gota de muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa embebida en una solución conductora. • se aplica un campo eléctrico sobre los extremos de la tira y las moléculas disueltas en la solución conductora se desplazan a lo largo de la tira, según de su carga

Electroforesis

Electroforesis en Gel • la separación de proteínas se suele efectuar en geles de poliacrilamida, que se extienden entre dos láminas de vidrio. • el tamaño del poro del gel se cambia mediante ajustes en las concentraciones de poliacrilamida y el reactivo. • cuando se coloca una mezcla de proteínas y se aplica corriente, las proteínas más pequeñas migran por el gel con mayor velocidad que las más grandes.

• la velocidad del movimiento depende del tamaño del poro del gel y de la fuerza del campo eléctrico. • un gel de poliacrilamida con abundantes enlaces cruzados los poros son bastante pequeños. • este tipo de gel puede separar proteínas y péptidos pequeños, pero los más grandes no podrán desplazarse.

Electroforesis

Electroforesis SDS-Poliacrilamida • es la técnica más importante para separar mezclas de proteínas. • éstas son expuestas al detergente iónico SDS (dodecilsulfato de sodio) antes y durante la electroforesis en gel . • el SDS desnaturaliza las proteínas, por lo que las multiméricas se disocian en sus subunidades. • todas las cadenas polipeptídicas son forzadas a adoptar conformaciones extendidas, con relaciones carga/masa similares. • el SDS elimina las diferencias de formas y solo la longitud de la cadena (masa) determina la velocidad de migración.

• con esta técnica se pueden separar cadenas cuyos pesos moleculares difieren en menos del 10%. • además se puede estimar el peso molecular de una proteína por comparación de la distancia que migró en un gel con las de proteínas de peso molecular conocido.

Electroforesis

Electroforesis Bidimensional en Gel • las proteínas se separan en dos pasos: primero por su carga y luego por su masa. • en el primer paso se desnaturaliza el extracto celular (urea en alta concentracion). • luego se separa en un tubo de vidrio con poliacrilamida saturado con una solución de anfolitos (mezcla de moléculas polianiónicas y policatiónicas). • en un campo eléctrico los anfolitos se separan y crean un gradiente en base a la carga neta, lo cual establece un gradiente de pH. • las proteínas cargadas migran a través del gradiente hasta que alcanzan su punto isoeléctrico (el pH en que la carga neta de la proteína es cero). • esta técnica, denominada enfoque isoeléctrico (IEF), es capaz de separar proteínas que sólo difieren en una unidad de carga.

Electroforesis

Electroforesis Bidimensional en Gel

• en el segundo paso se saca el gel IEF del tubo y se lo coloca sobre un segundo gel de poliacrilamida saturado con SDS.

• al aplicar un campo eléctrico, las proteínas migran desde el gel IEF al gel de la capa de SDS y se separan de acuerdo con la masa. • mediante la separación secuencial de las proteínas por carga y masa se logra una excelente separación de proteínas celulares . • los geles bidimensionales permiten separar hasta 1.000 proteínas al mismo tiempo.

7. Cultivo de Tejidos Objetivos • Permitir obtener células en gran cantidad. • Contar con mucha cantidad de células derivadas de una única célula. • Tener muchos tipos diferentes de células vivas al mismo tiempo.

Aplicaciones • Análisis de diferentes actividades celulares (endocitosis, movimiento celular, división celular, transporte de sustancias y síntesis de macromoléculas). • Estudio del proceso de diferenciación y muerte celular. • Análisis de la respuesta de las células a tratamientos con fármacos, hormonas, factores de crecimiento y otras sustancias activas

Característica • Se basa en recrear las condiciones fisiológicas de las células en su tejido original.

Cultivo de Tejidos

Tipos de Cultivos • • • •

Cultivos Primarios son los que se obtienen directamente de los tejidos vegetales o animales. se cortan fragmentos pequeños de tejido y separan las células entre si por medio de enzimas proteolíticas como la tripsina a continuación se lavan las células para liberarlas de la enzima y se las coloca en medios de cultivo apropiados en recipientes de vidrio o plástico. normalmente se utilizan tejidos embrionarios o tumorales, debido a que su grado de diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.

cultivo en masa se coloca un gran número de células, que al desarrollarse y dividirse forman una capa uniforme de células que cubre el fondo del recipiente.

cultivo clonal se colocan pocas células en el cultivo, que quedan separadas de sus vecinas, de manera que la proliferación forma colonias derivados de una única célula madre.

Cultivo de Tejidos

Tipos de Cultivos Cultivos Secundarios

• son aquellos que se obtienen por subcultivo o resiembra de un cultivo primario. • se separan las células y se las coloca en un medio de cultivo dentro de recipientes. • generalmente las líneas celulares no se pueden cultivar indefinidamente, sino que luego de unas cuantas generaciones comienzan a morir.

Cultivos de Líneas Establecidas • son cultivos que continúan creciendo y multiplicándose en forma indefinida. • las células se han adaptado al crecimiento prolongado in vitro por una transformación de tipo tumoral. • las células establecidas crecen en forma más apretada y necesitan menor cantidad de nutrientes.

Cultivo de Tejidos

Líneas celulares estables Ventajas

Desventajas

• Control del entorno celular



Falta de diferenciación

• Homogeneidad celular



Inestabilidad de la línea (mutaciones DNA)

• Conocimiento del tipo celular • Economía

Cultivo de Tejidos

Líneas celulares estables BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel) CHO: Epitelio de ovario de hamster chino VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino Etc., etc., etc.

Cultivo de Tejidos

Preparación cultivos

Cultivo de Tejidos

Cultivo de Tejidos

Las células vegetales crecen formando grupos de células indiferenciadas llamados callos, en los cuales se puede inducir el desarrollo de retoños para regenerar nuevas plantas