Carrera de Ingeniería Agronómica Cátedra de Microbiología Agrícola Año 2014

Serie Didáctica Cuantificación de microorganismos 1. Introducción El crecimiento de los microorganismos ocurre generalmente por medio de la división celular. Los microbios se desarrollan principalmente como poblaciones de células y es importante distinguir entre el crecimiento de una célula individual y el crecimiento de una población. El crecimiento celular es el resultado de un aumento en el tamaño de la célula, seguido de su división. El crecimiento de una población es el resultado de un aumento en la cantidad de células. La mayor parte de los estudios sobre crecimiento en microbiología se refieren a las poblaciones más que a las células individuales. La cuantificación de tipos microbianos (bacterias, hongos, algas, protozoos, etc.) es importante para determinar la dinámica de estos grupos en los ecosistemas. Dicha cuantificación permite determinar el crecimiento de los mismos. Por otro lado, los ambientes naturales rara vez contienen un solo tipo de microorganismos, en la mayor parte de los casos existe una gran variedad. Estos microorganismos participan en las transformaciones de los elementos en la naturaleza y es frecuente realizar el estudio de los mismos en base a los ciclos biogeoquímicos de los distintos elementos. La puesta en evidencia de los grupos fisiológicos, conjunto de organismos taxonómicamente a veces no relacionados, pero que presentan la misma aptitud para efectuar reacciones de biodegradación o de biosíntesis, como los celulolíticos, los amonificantes, etc., se realiza por siembra en medios selectivos apropiados. Existen diferentes métodos para medir el crecimiento microbiano, ya sea de un tipo microbiano o de un grupo fisiológico. Los mismos pueden estar basados en la determinación del número, de la biomasa o de la actividad. Las metodologías son las siguientes: 2. Determinación del número de microorganismos 2.1. Recuento directo de células 2.1.1. Recuento microscópico El número de células de una población se puede medir contándolas bajo microscopio. Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos, por ej la de Petroff-Hausser. La misma consiste en un portaobjeto especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas: excavación de 0,02 mm de profundidad; área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes; cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 16 cuadrados pequeños. Es decir, la muestra se distribuye en 16x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños). La muestra, una vez colocada entre e l porta y el cub re, se deja reposar sobre la plataforma del mic roscopio durante unos minutos, y se cuenta el número 1 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Siendo la concentración celular = n x 25 x 50 x 1000= concentración en células mL-1 Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de las células contadas, y las limitaciones que presenta son:  no se distinguen las células muertas de las vivas  las células pequeñas son difíciles de medir bajo el microscopio y posiblemente se omitan algunas células.  la precisión es difícil de lograr  se requiere de un microscopio de contraste de fases cuando se trabaja con células sin teñir.  el método no es adecuado para suspenciones de células de baja densidad.  En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua. 2.1.2. Recuento en filtros de membrana El recuento se realiza por filtración de un volumen de muestra a través de un filtro de membrana de tamaño adecuado para retener a las bacterias (0,22- 0,45 um). Una vez filtrada la muestra, el filtro se coloca sobre un medio de cultivo sólido y se incuba. El recuento del número de colonias formadas sobre el filtro determina el número total de bacterias en la muestra filtrada. Es un método útil cuando el número de bacterias presentes en la muestra es muy bajo. Se utiliza con frecuencia para determinar el número de bacterias en agua. 2.1.3. Recuento electrónico Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Un volumen determinado de suspensión es aspirado a través de un orificio muy pequeño (5 10 µm de diámetro), mediante la manipulación con una micropipeta. La resistencia eléctrica a través del orificio está normalizada y se altera cada vez que una célula bacteriana pasa a través de él. Las modificaciones de la resistencia se amplifican y registran electrónicamente. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse células que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de más de una célula en un breve período de tiempo va a ser tomado como una célula más grande. Es común la obstrucción del orificio por microorganismos muy grandes. 2.2. Recuento indirecto de microorganismos 2.2.1. Recuento de unidades formadoras de colonia (UFC) en placa conteniendo medio sólido Se utilizan para recuento de células viables. El material que contiene los microorganismos se diluye seriadamente y se depositan alícuotas de cada dilución en medios de cultivos apropiados. La forma usual para realizar una cuenta de viabilidad es la determinación de la cantidad de células en la muestra, capaces de formar colonias sobre un medio adecuado de agar. Se supone que cada colonia que se desarrolla proviene de una unidad que, puede ser de una célula o un grupo de muchas de ellas. Este método también posee desventajas: 2 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

 Como no puede verse la célula que originó la colonia, no se puede estar completamente seguro que ésta se formó a partir de una célula aislada (dos o más células adyacentes pueden dar origen a una colonia).  Las células a contar deben disponerse de un medio de cultivo adecuado para su desarrollo.  El microorganismo debe ser capaz de crecer sobre un medio de cultivo sólido (con agar), a pesar que también existe un método para recuentos en medios de cultivos líquidos.  El número de colonias que aparecen dependerá del tiempo de incubación  La enumeración viable es lenta ya que casi siempre se necesita de por lo menos 24 horas para que las colonias alcancen un tamaño adecuado (en algunos casos el tiempo es mayor).  El número de colonias sobre la placa de cultivo no debe ser demasiado grande. Si las placas están muy pobladas, habrá en algunos casos superposición de colonias. Por otra parte, el número de colonias no debe ser muy bajo para evitar errores estadísticos. 2.2.2. Recuento en medios líquidos y determinación del Número más probable (NMP) El crecimiento en medios líquidos se indica mediante la observación de la existencia de velo, sedimento o turbidez. Se utiliza el método de Mac Crady en dónde se determina el NMP de microorganismos, El método consiste en:  realizar suspensiones-diluciones de la muestra a analizar y luego sembrar en medio líquido tres o cinco repeticiones por dilución.  incubar a temperatura y tiempo apropiados.  anotar el número de tubos positivos en cada suspensión-dilución.  determinar el número característico de tres cifras: la última dilución donde todos los tubos son positivos, es la primera cifra y las dos restantes se forman con el número de tubos positivos en las diluciones siguientes.  determinar el NMP de microorganismos, con ayuda de tablas construidas a partir de algunos datos de recuentos de viables en medio sólido (cajas) y luego por cálculos estadísticos se infieren todas las combinaciones posibles. Se entra en la tabla correspondiente con el número característico y se lee el NMP de microorganismos contenidos en el volumen de siembra en la dilución correspondiente a la primera cifra del número característico. 3. Determinación de la Biomasa 3.1. Medida de peso seco por gravimetría El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias. La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. 3.2. Métodos que utilizan la dispersión de la Luz Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos

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bacterianos. Son muy útiles pero pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetría: mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida. Cuanto más material celular haya, más dispersará la luz y será más turbia. La turbidez se puede medir con un dispositivo que funciona eléctricamente, llamado colorímetro o espectrofotómetro, expresando la turbidez en unidades de absorbancia. Para los organismos unicelulares, la absorbancia es proporcional a la cantidad de células, así como su peso, por lo que las lecturas de turbidez se pueden utilizar como un sustituto de la cuenta. Para efectuar el recuento de células se debe preparar una curva estándar para cada uno de los microorganismos estudiados. 3.3. Correlación entre microorganismos y el nivel de un componente celular (nitrógeno proteína, ADN, ATP, etc.) 3.3.1. Determinación de ácidos nucleicos: Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la población. 3.3.2. Determinación del C y/o N de la biomasa microbiana La importancia de los microorganismos en la intervención de la fertilidad de los suelos es conocida desde hace mucho tiempo pero su influencia en la calidad de los mismos es enfatizada recientemente, por ser muy sensibles a cambios del sistema de uso de la tierra u otros impactos, al ser la fracción más lábil de la materia orgánica de los suelos. Por ello, se han desarrollado numerosos métodos para determinar la biomasa microbiana del suelo: 3.3.2.1. Método de Fumigación y reinoculación. El CO2 es uno de los principales producto del metabolismo de organismos heterótrofos y cualquiera sean los intermediarios, la biodegradación tiene como último término la producción de CO2, (mineralización de la materia orgánica). La cantidad de CO2 liberado está relacionada aproximadamente con el Nº total de microorganismos y expresa la potencia biológica de ese suelo para transformar la materia orgánica. Jenkinson y Powlson (1976) encontraron que al desinfectar el suelo con cloroformo la mayoría de los microorganismos muere y sus restos son mineralizados al reinocularlo con suelo fresco. Evaluaron los picos de CO2 de muestras fumigadas y no fumigadas luego de un período de incubación. Una pequeña fracción de la materia orgánica es rápidamente convertida en CO2 (2,3-3,4 % del carbono del suelo) y representa la biomasa. Este constituye uno de los métodos más interesantes para evaluar la fracción viva de la microflora del suelo y refleja variaciones debidas a prácticas de manejo, uso de pesticidas, etc. 3.3.2.1. Método de Fumigación- extracción. Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Se basa en la determinación del C y N de la biomasa microbiana extraídos desde una muestra de suelo previamente desinfectada con cloroformo. El carbono se determina por colorimetría y el N por Kjeldahl. 4. Determinación de la actividad 4.1. Correlación entre microorganismos y una actividad metabólica (consumo de sustrato, formación de producto, emisión de luz, etc). 4 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

4.1.1. Actividad respiratoria: por evolución del CO2, absorción de O2. En la respiración, oxidación de la materia orgánica por microorganismos aerobios, el oxígeno funciona como el aceptor final de electrones. El producto final del proceso son CO2 y agua, por lo que la actividad metabólica de los microorganismos del suelo puede ser cuantificada por la medición de la producción de CO2 o consumo de O2. Como otras actividades metabólicas, ésta depende del estado fisiológico de las células y está influida por diferentes factores como la humedad, temperatura, disponibilidad de nutriente, etc. La producción microbiológica de CO2 en el suelo puede ser determinada incubando el suelo en jarras, cajas de Petri cerradas o en diferentes tipos de matraces o recipientes. Una de las técnicas más sencillas para la cuantificación de CO2 es adsorbiéndolo en NaOH y BaCl y determinándolo por titulación con HCl. 4.1.2. Actividad enzimática: Las actividades de los microorganismos requieren la participación de un conjunto de enzimas, la mayor parte de las cuales se producen solamente en pequeñas cantidades y participan en procesos celulares (enzimas intracelulares). Algunos organismos producen varias enzimas en cantidades mucho mayores y en lugar de mantenerlas dentro de las células, las excretan al medio de crecimiento (enzimas extracelulares). La actividad de una enzima bien escogida, puede reflejar la actividad biológica global. 4.1.2.1 Medida de la actividad enzimática en el suelo El suelo contiene muchas enzimas que regulan la actividad biológica del mismo. Existen entre otras: deshidrogenasas, fosfatasas, ureasas, hidrolasas, transferasas. Las primeras son las determinadas con mayor frecuencia porque son enzimas constitutivas encontradas sólo en los organismos vivos. Es necesario tener en cuenta que hay muchas enzimas extracelulares que están atrapadas en la materia orgánica o adsorbidas a coloides inorgánicos de modo que no están directamente asociadas con la biomasa microbiana. Un gran número de factores del medio ambiente afecta la velocidad de reacción llevada a cabo por las enzimas. Cada enzima tiene un intervalo de valores de pH y temperaturas óptimas para su actividad. La misma está asociada con la distribución de la materia orgánica en el perfil y generalmente decrece con la profundidad. La velocidad de desaparición del sustrato o formación de productos, también está regida por el tipo de suelo, estación del año y tipo de vegetación y debido a que la mayoría y posiblemente casi todas las enzimas son de origen microbiano, no es sorprendente que otros factores que rigen el tamaño de la comunidad tengan influencia en la actividad enzimática. La actividad enzimática se mide incubando una muestra que tenga la enzima en cuestión con su sustrato y después de un período adecuado se mide la cantidad de uno o más productos de la reacción o la cantidad de sustrato perdido. La actividad enzimática en el suelo puede medirse de una manera similar pero existe el problema de la presencia de células viables que afectarían la medición de dos maneras:  Crecerían durante el período de incubación a expensas del sustrato, por lo que la actividad se incrementaría con el tiempo y  Asimilarían o más aún degradarían los productos de la reacción, por lo que quedaría muy poco o nada de estos productos. Este problema ha sido superado parcialmente agregando un antiséptico para detener la proliferación microbiana durante el período de incubación y pueden evaluarse las enzimas 5 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

liberadas por los microorganismos, los vegetales y animales. En el caso de que las enzimas sean intracelulares se trabaja en ausencia de antiséptico. Entre las actividades enzimáticas que pueden ser determinadas se mencionan las siguientes: Deshidrogenasas La oxidación biológica de compuestos orgánicos es, generalmente, un proceso de deshidrogenación, y las deshidrogenasas son enzimas que catalizan este proceso. La determinación de la actividad deshidrogenasa de los suelos es muy empleado para evaluar más rápidamente respuestas de la microflora del suelo frente a diferentes manejos del suelo. Representa la actividad de la población microbiana oxidadora de la materia orgánica de los suelos. El método de determinación comprende la determinación colorimétrica (por espectrofotometría) de 2, 3, 5 -trifenilformazan (TPF), producido por la reducción de 2,3,5 cloruro de trifeniltetrazolium (TTC), por microorganismos del suelo. Fosfatasas Son enzimas que separan al fósforo de los sustratos orgánicos. En general una sola fosfatasa puede actuar en muchos sustratos diferentes (etilfosfato, glicerofosfato, fenilfosfato), aunque algunas fosfatasas son específicas. Por comodidad son designadas de acuerdo a los sustratos que atacan: Fitasas: hidrolizan sales solubles de ácido fitico o de sus sales de Mg o Ca: fitina. Esta actividad enzimática está ampliamente distribuida entre los microorganismos del suelo: hongos, bacterias, actinomicetes. Nucleasas: utilizan como sustrato ARN y ADN. Fosfolipasas: utilizan como sustrato fosfolípidos. Debido a que las enzimas tienen diferentes óptimos en valores de pH, para su actividad máxima, las mismas se designan como fosfatasas ácidas o alcalinas. Las especies de Aspergillus, Penicillum, Rhizopus, Arthrobacter, Streptomyces, Pseudomonas y Bacillus pueden sintetizar la enzima. La actividad fosfatasa de muchos suelos ha sido medida. Para este propósito, se incuba una muestra de suelo con un sustrato como glicerofosfato, fenilfosfato o algún otro compuesto orgánico, midiéndose entonces la liberación ya sea de fosfato inorgánico o de la fracción orgánica del sustrato (por ej. B-naftol o fenol). Estos estudios muestran que la actividad enzimática es usualmente alta y se ve afectada por la estación del año, profundidad y tipo de vegetación. La hidrólisis se lleva a cabo a valores de pH bajos y altos, posible indicación de la presencia tanto de fosfatasas ácidas como alcalinas. Ureasa Enzima extra celular responsable de la hidrólisis de la urea. La urea es un producto de la destrucción de bases nitrogenadas contenidas en ácidos nucleicos. Es un importante fertilizante, aunque también puede incorporarse al suelo con las excreciones de animales superiores. La posición de la urea como un intermediario en el metabolismo microbiano, como un producto de excreción animal y como fertilizante la hacen un compuesto importante en el ciclo del nitrógeno. La urea aplicada al suelo se hidroliza y gran parte del nitrógeno de la urea agregada puede ser transformada en amonio en varios días.

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Muchos microorganismos poseen la enzima ureasa, siendo en algunas especies constitutiva, en otras es una enzima inducible. Las bacterias, hongos y actinomicetes sintetizan ureasa y así pueden utilizar la urea como fuente de nitrógeno para su crecimiento. La actividad ureasa en el suelo se determina midiendo el amoníaco formado en muestras incubadas por cortos períodos con el sustrato. La tasa de hidrólisis, es decir la actividad ureasa, varía con la vegetación y la presencia de raíces de plantas, y disminuye con la profundidad. 5. Bibliografía consultada Brock, T. D.; M. Madigan. 1991. Microbiología. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. Sexta edición. Frioni L 1999. Procesos microbianos. Editorial de la Fundación Universidad Nacional de Río Cuarto.

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Guía del Trabajo Práctico Nº 4 Cuantificación de microorganismos

Objetivos Que el estudiante:

- Aprenda técnicas microbiológicas que permitan la determinación y la cuantificación de los microorganismos. - Conozca el rol importante de la actividad enzimática en los suelos. - Reconozca la importancia de la biomasa microbiana de suelos

Actividades 1) En un estudio de evaluación de la calidad biológica de un suelo agrícola se necesita conocer, entre otras variables el número de microorganismos por tipo microbiano (bacterias heterotróficas y hongos). Para lo cual deberá: a) realizar suspensiones-diluciones del suelo, hasta la dilución 10-6 i) Introducir asépticamente 1 g de suelo fresco (de contenido de humedad conocido) en un tubo con 9 ml de solución fisiológica (S.F.) estéril y agitar (dilución 10-1). ii) Tomar 1mL de la primera suspensión-dilución y pasarlo a otro tubo con 9 mL de S.F. estéril (dilución 102 ). iii) Proceder de igual forma según la densidad microbiana de la muestra (10 -7, 10-8etc.). Cambiar la pipeta en cada caso. b) Sembrar 0,1 mL (desde las suspensiones-diluciones de suelo 10-4, 10 -5 y 10 -6) en cajas de Petri por diseminación en superficie en medio de cultivo específico para cada tipo microbiano. Realizar 3 repeticiones por dilución. c) incubar a 30 ºC y leer entre las 24 y 48 hs. d) realizar recuento y cálculo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC): Contar las cajas que contengan entre 30 y 300 colonias, efectuar promedio de las tres cajas y multiplicar por la inversa de la dilución y determinar el Nº de microorganismos.g-1 de suelo. Composición de los medios de cultivo utilizados: * Medio de cultivo para microflora heterótrofa total:medio TSA (Tripteina soja agar) Tripteina 15 g, peptona de soja 5 g, NaCl 5 g, Agar agr 15 g, agua destilada 1000 mL., pH 7 * Medio de cultivo para Hongos: Sabouraud: pluripeptona 10g, glucosa 40g, cloranfenicol 0,05 g, agar agar 15 g, agua destilada pH 5,6.

2) Evaluar la biomasa y actividad enzimática de los microorganismos presentes en dos suelos con diferente uso, como variables indicadoras de calidad biológica del suelo. a- Determinación de actividad fosfatasa - Pesar 1 g de suelo en eppendorf de 1,5 ml - Añadir 4 mL de buffer - Añadir 1.5 mL de p-nitrofenilfosfato 5 mM a las muestras. - Simultáneamente se preparan controles igual que las muestras, pero el sustrato se agregar después de la incubación y antes de colocar en hielo - Incubar 1 hora. En caso de presentar actividad muy elevada, incubar 30 minutos - Colocar en hielo 15 minutos para detener la reacción

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- Agregar 1 mL de CaCL2 0,5 M - Agregar 4 mL de NaOH 0,5 M - Mezclar - Centrifugar a 300 rpm durante 10 minutos -Leer a 400 nm. - determinar la concentración en base a curva patrón de p-nitrofenol b- Determinación del C de la biomasa microbiana por Fumigación-extracción Obtención del extracto - incubar 7,5 g de suelo humedecido con 2,5 mLde agua destilada durante 15 hs en la oscuridad -fumigar con 0,4 mL de cloroformo 30 min (los blancos sin cloroformo) -agregar el extractante (sulfato de potasio 0.5 M) y agitar 1hs -centrifugar a 2000 rpm. durante 15 min. -filtrar con papel de filtro y recoger el extracto. Determinación del C de la biomasa microbiana -digerir el extracto (4mL) con dicromato de potasio (0,098 g) y H2SO4 (4mL) en la placa digestora (150ºC) durante 15 min. -dejar reposar toda la noche -agregar 2 mLde agua destilada -medir absorbancia en espectofotómetro a 590 nm. -Calcular la cantidad de ug.de C de la muestra, por referencia a un gráfico de calibración de C de glucosa.

3) En la Tabla 1 se presentan los contenidos de C y N microbianos por los métodos de fumigación-incubación (FI) y fumigación extracción (FE), la proporción que representa la fracción de C microbiano (C-bm) con respecto al contenido total de carbono del suelo (COT), el nitrógeno total (NT), la materia orgánica (MO), la textura (Tex), el N mineral inicial (Ni) y el N mineral después de 20 días de incubación (N 20 DDI) de tres suelos A, B y C. Analizar los resultados e indicar: a- si los métodos de evaluación de la BM (FE y FI) dieron resultados comparables? b- cual método de evaluación de la BM (FE y FI) usaría y porque? c- si existe alguna correlación entre la biomasa microbiana y la materia orgánica del suelo?. d- una hipótesis para explicar porque el suelo B, aún cuando presenta similares contenidos de MO y C-bm que el suelo A, presentó mayores contenidos de N mineral inicial (Ni) y N a los 20 días de incubación (N 20 DDI). Tabla 1. Valores medios de C y N microbiano (µg g-1 suelo) obtenidos por Fumigación-Extracción (FE) y Fumigación-Incubación (FI) y las características físico químicas del suelo. FE FI C-bm: COT NT M.O. Textura Ni N20 DDI (%) (%) mg/kg mg/kg C-bm NC-bm N-bm FE FI Suelo µg/g bm µg/g µg/g µg/g A 403 b 52 b 500 b 49 b 0,031 0,038 0,191 2,2 Fr-arc-aren 40,2 100,5 B 335 c 29 b 330 c 26 b 0,030 0,030 0,095 2,0 Fr- aren 75,7 125,8 C 586 a 116 a 639 a 143 a 0,034 0,037 0,258 2,7 Arc 241,4 273,1 Medias seguidas de la misma letra no presentan diferencias significativas (α = 0,05).

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4) Analizar y discutir los resultados que se presentan en la Tabla 2 de los contenidos de C de la biomasa microbiana (Cbm) por el método de fumigación- extracción (FE), en un ensayo de habilitación de tierras mediante rolado selectivo. a- Indicar si el rolado selectivo modifica el carbono de la biomasa microbiana. b- Indicar si la cobertura del suelo modifica el carbono de la biomasa microbiana. Tabla 2. Valores medios de C de la biomasa microbiana (Cbm), carbono orgánico total (COT) y relación Cbm:COT Cbm (mg C kg-1 suelo) COT (g C kg suelo-1) Testigo 182 a 29 a Rolado 153 a 28,14 a Cbm (mg C kg-1 suelo) COT(g C kg suelo-1) Suelo sin cobertura 99 9 Suelo con cobertura 186 37 Medias seguidas de la misma letra no presentan diferencias significativas (α = 0,05).

Cbm:COT (%) 0,63 a 0,54 a Cbm:COT (%) 1,13 0,48

5) En la tabla 2 se presentan los valores obtenidos de actividad deshidrogenasa durante 64 días de incubación, en un suelo (S) y en tres tratamientos con residuos orgánicos de diferente naturaleza A, B y C; siendo el contenido de carbono orgánico total de 0,64%; 25,33%; 32,66% y 39,75% respectivamente. a- Comparar los resultados y sacar conclusiones. Tabla 2. Actividad deshidrogenasa (µg TFF g-1 24 h -1) del suelo y los tratamientos con distintos residuos orgánicos A, B y C durante 64 días de incubación. Muestra Suelo testigo (S) Residuo orgánico A Residuo orgánico B Residuo orgánico C

0 62 508 3358 1671

7 58 184 751 375

14 47 181 752 210

Días de incubación 21 28 35 35 48 57 182 237 241 868 572 699 261 388 448

43 25 143 499 367

57 30 133 344 366

64 69 190 466 383

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