Carrera de Ingeniería Agronómica Cátedra de Microbiología Agrícola Año 2014

Serie Didáctica Microorganismos relacionados al ciclo biogeoquímico del nitrógeno 1. Ciclo del Nitrógeno El nitrógeno es un nutriente esencial para el crecimiento de todos los organismos vivos, ya que forma parte de las moléculas de proteínas, ácidos nucleicos y de muchas otras moléculas de mediano y bajo peso molecular indispensables para el normal desarrollo del metabolismo celular. Es, frecuentemente, limitante del crecimiento vegetal ya que es removido del suelo en cantidades superiores al resto de los nutrientes y además su nivel en el mismo es bajo. Este elemento es de suma importancia en la agricultura, los rendimientos de los cultivos están directamente relacionados con los niveles de nitrógeno del suelo. La mayor reserva de nitrógeno la constituyen las rocas primarias (98% de todo el nitrógeno, el cual no es directamente aprovechable por los vegetales), le sigue la atmósfera, luego las rocas sedimentarias, los sedimentos marinos y el reservorio más pequeño lo constituye el suelo. La atmósfera es la fuente primaria de nitrógeno para el suelo, en donde el N2 representa un 79 % del total de gases que la constituyen. Sin embargo, metabólicamente no está disponible para su asimilación por las plantas superiores que no poseen mecanismos para romper el triple enlace covalente. Sólo es reducido biológicamente a amonio (fijación biológica) por un grupo de protistas inferiores, es decir el origen del nitrógeno en el suelo es principalmente microbiano. El proceso de fijación de nitrógeno es complejo y representa una entrada al ciclo terrestre del nitrógeno de gran importancia en los ecosistemas. También hay un aporte por descargas eléctricas de las tormentas y por reacciones químicas en los procesos industriales. En el suelo, la casi totalidad del nitrógeno, se encuentra bajo la forma orgánica (98% del total) constituyendo moléculas de aminoácidos, aminoazúcares, bases púricas y pirimídicas, heterociclos de moléculas húmicas. Estas formas no están disponibles inmediatamente para las plantas, ya que éstas asimilan el nitrógeno, casi completamente, en el estado inorgánico El nitrógeno inorgánico está constituido por las formas solubles como nitrito (NO2-) y nitrato (NO3-), amonio (NH4+) intercambiable y no intercambiable fijado en las arcillas. El N orgánico ingresa al suelo por aportes de los restos vegetales, animales y de microorganismos y por aportes de exudados de las raíces vivas (rizodepósitos) y vuelve a estar disponible solo mediante los procesos de descomposición y posterior mineralización. La liberación del elemento asociado y la movilización del vasto reservorio de nitrógeno combinado orgánicamente son esenciales para la recirculación del nutriente y por consiguiente para la fertilidad del suelo. La liberación del N orgánico bajo formas inorgánicas (mineralización) permite que este elemento pueda ser utilizado por otros organismos vegetales (asimilación) o microbianos (inmovilización), liberados a la atmósfera (volatilización y/o desnitrificación), o lavados hacia horizontes inferiores del suelo. La transformación de las distintas fracciones de N en el

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suelo es llevada a cabo por la acción microbiana del mismo. Todos estos procesos ocurren simultaneamente, a velocidades variables y dependen de numerosos factores. 2. Transformaciones del N en el suelo 2.1. Mineralización Los procesos de descomposición y mineralización son llevados a cabo por una comunidad muy dinámica de fauna y microorganismos descomponedores. La descomposición depende del clima, de la composición química de los restos vegetales y de los microorganismos del suelo. En zonas áridas y semiáridas los desdoblamientos microbianos de la materia orgánica de la superficie es limitada a breves periodos cuando el mantillo y el suelo están húmedos y las temperaturas del suelo son moderadas. El inicio de la descomposición es la fragmentación que puede ser abiótica o biótica. La fragmentación y mineralización en ambientes mésicos ocurre de manera simultánea, mientras que en ecosistemas desérticos puede estar separada temporal y espacialmente. Viento, agua, calor y luz pueden interactuar con la descomposición de algunos compuestos de las plantas. Se denomina mineralización al proceso mediante el cual el nitrógeno orgánico del suelo es transformado por los microorganismos del suelo a formas inorgánicas (amonio y nitrato).Este proceso se produce por medio de las siguientes reacciones principales: aminización, amonificación y nitrificación 2.1.1. Aminización Proceso de despolimerización de compuestos orgánicos nitrogenados, que inicialmente no son biodisponibles por ser demasiado grandes, sin embargo son separados por enzimas extracelulares (proteasas y peptidasas) a monómeros como aminoácidos, amino-azúcares, ácidos nucleicos, que se denominan nitrógeno orgánico disuelto (DON) y está disponible para los microorganismos, hongos micorrícicos y plantas en ecosistemas limitados en nitrógeno, aunque aún no está bien clara la proporción adquirida por las plantas. Es llevada a cabo por numerosos organismos, principalmente hongos y bacterias, que obtienen a cambio energía y productos necesarios para su crecimiento. 2.1.2. Amonificación Proceso de liberación del nitrógeno de los compuestos orgánicos, donde el producto resultante es el amoniaco (NH3) el cual puede adquirir un hidrógeno y formar amonio (NH4+), que puede ser fijado por las arcillas del suelo o por la materia orgánica, volatilizado como amoniaco, asimilado por plantas o microorganismos, lixiviado u oxidado por bacterias autotróficas mediante el proceso de nitrificación. En la amonificación participan microorganismos aerobios y anaerobios como bacterias (Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Serratia, Micrococcus), hongos (Alternaria, Aspergillus, Mucor, Penicillus y Rhizophus), actinomicetes, protozoos. Estos microorganismos sintetizan enzimas extracelulares para la descomposición de los sustratos. La amonificación es uno de los procesos menos sensibles a los cambios del ambiente por la falta de especificidad de los sustratos, y se realiza tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, bajo un rango de pH compatible con la actividad biológica, en regiones frías como en el rango termófilo. 2.1.3. Nitrificación Proceso por el cual el amonio libre es rápidamente oxidado por microorganismos autótrofos y heterótrofos, en donde pierde dos átomos de hidrógeno para formar nitrito (NO2-) y luego nitrato (NO3-). Parte de estas formas inorgánicas son tomadas por los microorganismos incorporándolas a su biomasa y es llamada inmovilización. El nitrato puede pasar al proceso de denitrificación donde se convierte a óxido nitroso (N2O) y nitrógeno elemental (N2). Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

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La cantidad total de nitrógeno liberada de la materia orgánica es llamada mineralización bruta, mientras que la cantidad resultante después de eliminar la inmovilización microbiana se denomina mineralización neta y se expresa como la tasa de cambio en un periodo de tiempo. La mineralización neta se ha utilizado para estimar el nitrógeno disponible para la planta, por lo que se han desarrollado formas in situ y de laboratorio para determinar dicha tasa. Algunas dificultades se presentan en su medición debido a los procesos de desnitrificación, volatilización, inmovilización, adquisición por la planta y lixiviado. 2.1.3.1. Nitrificación autótrofa Llevada a cabo por aquellos microorganismos especializados que toman la energía que necesitan de la oxidación del nitrógeno mineral amoniacal o nitroso. Las bacterias nitrificadoras autótrofas son aerobias estrictas y dependen del transporte de electrones a través de la cadena de citocromos para producir ATP, siendo el O2 el aceptor final de los electrones. Según el sustrato utilizado, la nitrificación, puede dividirse en dos pasos (nitritación y nitratación), cada uno realizado por un grupo particular de organismos quimiolitoautótrofos: Nitritación (oxida el amonio a nitrito): realizada por microorganismos del género Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus, Nitrosovibrio y Nitrobacter Nitratación (oxida el nitrito a nitrato): realizada por microorganismos del género Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus Enzimas involucradas en la oxidación de amonio. En los organismos autótrofos oxidantes de amonio, dos enzimas clave son necesarias para la conservación de energía durante el proceso de oxidación, la amoniaco monoxigenasa (AMO) y la hidroxilamina oxidoreductasa (HAO). In vivo las dos enzimas son codependientes una de la otra; AMO cataliza la oxigenación del amoniaco a hidroxilamina:

La enzima Amonio monoxigenasa (AMO), tiene tres subunidades, AMO-A, AMO-B y AMO-C, con tamaños, estructuras y arreglos diferentes, localizadas entre la membrana y el espacio periplásmico de las células. La enzima cataliza la oxidación de un amplio rango de sustratos, debido a su función esencial en el metabolismo energético de las bacterias oxidantes del amonio, la enzima es probablemente constitutiva. Las tres subunidades de la AMO de las bacterias oxidantes del amonio autótrofas son codificadas por los genes amoC, amoA y amoB del operón amo. Los genes amo de varias bacterias oxidantes del amonio han sido clonados y secuenciados. El gen amoA codifica la subunidad que contiene el sitio activo de la enzima. Los espacios intergénicos entre los genes amo son de tamaño variable en las distintas especies de las bacterias oxidantes del amonio y pueden utilizarse para distinguir o agrupar cepas. Esta característica puede ser utilizada para determinar la presencia de una cepa o para describir por DGGE la dinámica de una población particular en muestras ambientales. En la nitratación participa una nitrito oxidasa que involucra el sistema citocromos

Factores que afectan la nitrificación autótrofa: El nitrógeno mineralizable en el suelo depende del contenido original de nitrógeno orgánico. Este último, a su vez, depende del clima, la vegetación, la topografía, la edad y el manejo del suelo. Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

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La nitrificación es rápida en suelos húmedos, bien drenados y de buena estructura, lenta en suelos pesados. El óptimo de humedad varía considerablemente con los suelos, y se encuentra entre ½ y 2/3 de la capacidad de campo. La temperatura óptima entre 26 y 36 ºC, cesando a temperaturas mayores a 51ºC. La población autótrofa es mayor en suelos neutros o ligeramente alcalinos y el encalado favorece el proceso en suelos ácidos. Los factores limitantes del procesos puede ser el sustrato energético (amonio o nitrito). La producción de nitratos es proporcional al amonio disponible. El C no es limitante ya que lo toman del CO2, carbonatos, bicarbonatos. El nitrito puede acumularse cuando se inhibe la actividad de los oxidantes del nitrito, como ocurre luego de aplicar altas dosis de urea, amoníaco anhidro o sales de amonio, a pH alto. El rehumedecimiento de suelos secos estimula la nitrificación. Se explica este hecho por la acción de enzimas liberadas por células muertas en la desecación, que permanecerían adsorbidas a la fracción organo-mineral del suelo que se sumarían a las presentes en las células vivas. 2.1.3.2. Nitrificación heterótrofa Producida por microorganismos que no obtienen su energía de la oxidación del nitrógeno, sino que degradan compuestos orgánicos. Estos organismos son bacterias (Achromobacter, Corynebacterium, Bacillus, Pseudomonas, Vibrio), actinomicetes (Nocardia, Streptomyces) y hongos (Aspergillus, Penicillum).

2.2. Inmovilización El N mineral resultante de la mineralización puede tener distintos destinos. Puede ser inmovilizado, mecanismo que contribuye a la disminución, en el suelo, del nitrógeno mineral disponible para los vegetales. Los microorganismos asimilan el N mineral y lo convierten a formas orgánicas constituyentes de las células microbianas, quedando no disponible transitoriamente para los vegetales y luego por procesos de excreción o muerte celular, es rápidamente mineralizado. El N mineral disponible para los vegetales en un momento dado depende de la magnitud relativa de procesos simultáneos y opuestos: la mineralización y la inmovilización Estos procesos ocurren a velocidades variables y dependen de numerosos factores. La relación C:N de residuos orgánicos agregados a los suelos es de fundamental importancia en el control de la cantidad de N mineral disponible para las plantas. Los residuos con alta relación C:N conducen a una inmovilización de N disponible en el suelo, que es utilizado por los microorganismos responsables de la descomposición. De una manera general la relación C:N de equilibrio o crítica (la demanda iguala a la oferta) es 20-25: 1 en suelos de clima templado. Los residuos agregados al suelo con relaciones más altas que la crítica favorecen la inmovilización neta. Relaciones más bajas favorecen la mineralización neta. El tiempo necesario para que ocurra la disminución de la relación C:N hasta niveles en donde comienza a predominar la mineralización depende de factores como la tasa de adición de residuos, temperatura, etc. Una estimación razonable se sitúa en torno a las 4 a 8 semanas después de la adición de los residuos. Por lo tanto desde el punto de vista práctico se debe evitar el agregado de residuos vegetales con alta relación C:N a un suelo en la época inmediatamente anterior a la siembra de un cultivo, ya que se producirá la inmovilización, causando deficiencias de N para el cultivo. Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

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2.3. Salidas de N desde el suelo 2.3.1. Desnitrificación Conjuntos de procesos que conducen a la pérdida en forma gaseosa del nitrógeno del suelo mediante la reducción microbiana de los nitratos y nitritos. Un grupo de microorganismos aerobios facultativos utiliza el nitrato y nitrito como aceptores finales de electrones durante la respiración anaerobia de sustratos orgánicos, liberando nitrógeno molecular y oxido nitroso.

Esta capacidad ha sido descripta en bacterias del género Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus, Spirillum. No se han detectado hongos ni actinomicetes. Las pérdidas de nitrógeno 2.4. Entradas de N al ecosistema 2.4.1. Fijación biológica del nitrógeno Proceso biológico de reducción del nitrógeno molecular a amonio, realizado por un pequeño grupo de microorganismos altamente especializado (diazótrofos) que incluyen algas, bacterias y actinomicetes. Este proceso se realiza a temperaturas y presiones normales gracias a la acción de una enzima muy compleja, la nitrogenasa, según la siguiente ecuación:

Esta reacción requiere de grandes cantidades de poder reductor y energía (ATP), y la reducción obligada de protones con un mínimo de 1 mol de H2 producido por mol de N2 reducido. La actividad del complejo enzimático puede ser disminuída por el oxígeno, de tal manera que los organismos fijadores poseen mecanismos (e.j. alta tasa respiratoria, compartamentalizaciones o protección conformacional) que les permiten mantener bajas concentraciones de éste a fin de mantener la enzima funcionando. El grupo de microorganismos está integrado por protistas inferiores: bacterias heterótrofas aerobias, anaerobias facultativas, bacterias quimioautótrofas, fotosintéticas. Incluye microorganismos de vida libre, en combinaciones simbióticas y asociaciones más laxas. 2.4.1.1. Autótrofos: incluyen bacterias fotosintéticas y un grupo de cianobacterias. Bacterias fotosintéticas: son procariotas anaerobios, la mayoría de ambientes acuáticos o barros y sedimentos ricos en sulfuros. Pertenecen al orden Rhodospirillales, bacterias purpúreas no sulfurosas, flia Rhodospirillaceae con la especie Rhodospirillum rubrum. Las sulfurosas purpúreas, flia. Chromatiaceae y las sulfurosas verdes, flia Chlorobiaceae. La fotosíntesis no libera oxígeno y la fijación de N2 se realiza en anaerobiosis y a la luz. Pueden crecer en la oscuridad pero heterotróficamente. Estas bacterias fotosintéticas contribuyen a la depuración de los suelos y agua al consumir los sulfuros y aminas que perjudican a los cultivos. Cianobacterias (Bacterias Azul-Verdes, algas Cianofíceas): El tipo de fotosíntesis es similar al de las algas y a los vegetales. Son capaces de desarrollarse en medio mineral para obtener su C y N de la fijación fotosintética del CO2 y del N2. Se detectó fijación de N2 en 23 géneros, de 6 flias , y 2 órdenes. Los géneros más comunes son: Nostoc, Anabaena, (aerobias, filamentosas heterocísticas), Oscillatoria, Plectonema, Spirulina, Lyngbya, Gloeocapsa (microaerófilas). Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

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Presentes en suelos con altos contenidos de humedad, fijan de 50 -90 kg/ha de N2, presentes en suelos neutros y alcalinos. Las cianobacterias pueden presentar tres tipos de células: vegetativas, esporas, y heterocistos. Las células vegetativas pueden diferenciarse en esporas y heterocistos. Los heterocistos son células rodeadas de gruesas paredes y parecen vacías al microscopio óptico, son de mayor tamaño que las células vegetativas y están ubicados a intervalos a lo largo del filamento. La nitrogenasa está confinada a los heterocistos, los cuales carecen del fotosistema II, liberador de oxigeno, y rodeados de una pared glicolipídica gruesa que reduce la difusión del O2 hacia las células, es así que gracias a ellos la fijación se puede hacer en aerobiosis ya que la fijación de N2 está espacialmente y metabólicamente separada del proceso fotosintético. Las cianobacterias sin heterocistos presentan los dos procesos separados en tiempo; de tal manera que la fijación sólo ocurre en el período de oscuridad. También pueden fijar N sólo en microaerofilia. Algunas cianobacterias se asocian con hongos, hepáticas, helechos, gimnospermas y angiospermas, lo hacen con los representantes más primitivos entre los vegetales. Ejemplos de ello es la. simbiosis Azolla (helecho)-Anabaena (cianobacteria); los líquenes (hongos con cianobacterias). 2.4.1.2. Heterótrofos: aerobios (flia Azotobacteriaceae), aerobios facultativos (Paeneibacillus, Klebsiella), anaerobios (Clostridium, Desulfovibrio), microaerófilos (Azospirillum, Thibocillus) y simbiontes (rizhobios, Frankia). Aerobias: dentro de las Azotobacteriaceae, se encuentran representantes de los géneros Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia y Derxia. Las bacterias del género Azotobacter son aerobias, gram negativas, forman quistes, no forman esporos, capaces de fijar N atmosférico cuando se las provee de fuentes carbonadas. Se multiplican bien en medios deficientes en N. Se mencionan las especies: A. chrococcum: (especie más difundida en el mundo, predomina en los suelos de nuestros país). El rendimiento de fijación de N es 7,7 mg de N g-1 de hidrato de carbono empleado. La temperatura óptima es de alrededor de 28 °C. El pH más adecuado para su actividad es de 6,5 a 7,5. Por debajo de pH 6 no se lo encuentra. Su presencia en el suelo se ve favorecida por el carbonato de calcio que actúa como tampón. A. paspali: Habita el suelo y rizósfera de gramíneas, en especial de Paspalum notatum constituyendo entre ambos una asociación de mutuo beneficio. A. beijerinckii: Menos difundido que A.chrococcum se los encuentra en suelo y agua. A.r vinelandii: Forma quistes y abundantes gomas capsulares. Produce pigmentos fluorescentes que con la luz ultravioleta toman color verdoso. Las bacterias del género Beijerinckia, son las homólogas tropicales de Azotobacter. Son bastones provistos de glóbulos lipídicos polares de menor tamaño que Azotobacter. Las especies de este género son: B.índica, B.movilis B. fluminensis y B. derxii. El rendimiento de fijación de Beijerinckia es de 1,2 %, pero la velocidad de fijación es más lenta que Azotobacter. Usan carbono orgánico como elemento energético y plástico, no usan ácidos orgánicos, desarrollan con pH de 6,2. Son mesófilos pero resisten temperaturas de hasta 60°C. Se los encuentra en suelos tropicales. No requieren calcio, pero sí hierro. Las bacterias del género Derxia, La única especie es D. gummosa, son bastones más largos que Azotobacter, móviles, con flagelo polar, presentan glóbulos lipídicos. Presentes en suelos tropicales. El rendimiento de fijación es del 4% .

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Aerobias facultativas: Sólo fijan N2 anaeróbicamente. El grupo comprende a bacterias pertenecientes a las Enterobacteriaceae (ej. Klebsiella pneumoniae) y al género Bacillus (B. polymyxa, B. macerans, B. pasteurianum). Anaerobias: El rendimiento de fijación es 0,5- 0,8 % y realizado en forma muy lenta. Están presentes en suelos anegados, no exigen pH, son mesófilas, esporuladas. Los géneros representantes son Desulfovibrio y Clostridium, este último con las especies: C. pasteurianum, C. butyricum, C. acetobutyricum, C. beijerinckia. Microaerófilos: Azospirillum constituye un importante grupo de organismos aerobios que se comportan como microaerófilos cuando fijan N2. Son Gram negativos con forma de vibrio, presentan pleomorfismo, con flagelos perítricos o polares que le dan movilidad en espiral. Contienen sus células cantidades elevadas, hasta el 50% del peso seco celular, de polibeta-hidroxibutirato (PHB), observándose microscopicamente como gránulos refringentes en las células jóvenes. Los cultivos viejos presentan frecuentemente células refringentes de forma ovoide y paredes gruesas, semejantes a quistes. Este género fue el más estudiado entre las bacterias asociadas a plantas, ya que es capaz de estimular el crecimiento de las mismas y de aumentar el rendimiento de los cereales, por lo que provocó numerosos estudios sobre la ecología, fisiología y genética de esta bacteria y su efecto en la rizosfera de numerosas plantas. Se han descripto las siguientes especies: A. amazonense, A. halopraeferens, A. irakense y A. largomobile, luego reemplazado el nombre de este último por A.largimobile. Son utilizadas rutinariamente diversas pruebas bioquímicas y fisiológicas para el reconocimiento de las especies de Azospirillum. La identificación genotípica y su detección, se logra mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa, (PCR), y cortando los productos amplificados con la enzima de restricción AluI. Los fragmentos de tamaño específico para cada especie, se distinguen fácilmente en geles de agarosa. Simbiontes: microorganismos que establecen relaciones simbióticas con especies de plantas superiores. Entre los que se pueden mencionar rhizobios, Frankia Simbiosis rhizobio-leguminosas: los rhizobios son bacterias heterótrofas que se asocian en estructuras nodulares fijadoras de N2.en leguminosas contribuyendo de manera fundamental a la fertilidad del suelo, a la producción de alimentos y a la economía de fertilizantes nitrogenados, ya que esta asociación es valiosa por la cantidad de nitrógeno que es capaz de fijar y por la naturaleza de las plantas implicadas que son fuente de alimentación humana y animal. Este grupo de bacterias está formado por organismos Gram negativos con forma de bastón. No producen endosporas. Son móviles cuando jóvenes con 2-4 flagelos perítricos, polares o subpolares. Cuando las condiciones de crecimiento son adversas acumulan sustancias de reserva en gránulos de poli-ß-hidroxibutirato (PHB). Son aeróbicas a microaerofílicas. Su crecimiento es óptimo a pH neutro a alcalino, con escaso o nulo crecimiento a pH 5 o menor. Poseen la enzima nitrogenasa, y pueden desarrollarse en vida libre o establecerse como simbiontes en plantas de la familia Fabaceae (leguminosas). Se conoce una sola planta no leguminosa nodulada por rhizobios, el género Parasponia de la familia Ulmaceae. Los rizobios anteriormente se clasificaron siguiendo diferentes criterios: según la velocidad de crecimiento (Tabla 1) y según la especie vegetal con la cual realizaban simbiosis, la cual se dejó de utilizar ya que una misma especie vegetal podía ser infectada por más de una especie de rhizobio, llegándose en la 9° clasificación del Manual de Bergey a la taxonomía mostrada en Tabla 1. La taxonomía actual se basa en distintos aspectos, que incluyen morfología, bioquímica, fisiología, genética y filogenia. Este enfoque ha conferido a la taxonomía una base más natural Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

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y más confiable. Se han descripto 30 especies distribuídas en 6 géneros: Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium. Tabla 1: Especies de Rhizobium (9º edición del Manual de Bergey)

Los rhizobios sufren cambios morfológicos, fisiológicos y bioquímicos en las células del nódulo dando lugar a células pleomórficas, de formas irregulares, denominadas bacteroides que carecen de flagelos y no se dividen. Se presentan en envolturas membranosas originadas por la planta. El rizobio bajo la forma de bacteroide es cuando fija N2. El nódulo es resultado de complejas interacciones entre la planta y la bacteria . Una serie de eventos tiene lugar hasta la formación del nódulo: * Reconocimiento entre bacteria y células de los pelos radiculares. * Adhesión de los rizobios y encurvamiento de los pelos radiculares y deformación de los mismos. * Penetración de la bacteria en la pared de los pelos radicales y formación de un cordón de infección. * En respuesta a esta invasión, ciertas células corticales son estimuladas a proliferar, se alargan y emergen como tejido nodular diferenciado. * Después de varios días, la bacteria dentro de la célula hospedante comienza a fijar Nitrógeno. Existe cierta especificidad entre las leguminosas y sus rizobios. Se han postulado numerosas hipótesis para justificar ello. Condiciones que regulan el proceso simbiótico: Es importante tener en cuenta las exigencias del bacterio como de la leguminosa. La mayoría de las leguminosas necesitan un pH neutro a levemente alcalino. Hay excepciones, la soja y el maní pueden adaptarse a pH ácido. Los requerimientos de fósforo y calcio son altos para la leguminosa y el Rhizobium. Son necesarios además tres microelementos: molibdeno, hierro, y cobalto. El molibdeno y el hierro porque forman parte de dos enzimas: la hidrogenasa y nitrogenasa, que son molibdoferroproteínas, y el cobalto porque interviene como un cofactor de fijación, formando parte de un compuesto parecido a la vitamina B12. Estructura de un nódulo: En el nódulo maduro se diferencian tejidos en las zonas: * Cortical: formada por células no diferenciada ni infectadas. En especies perennes estas células puede aparecer suberificada. Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

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* Meristemática: con activas divisiones celulares, con células no infectadas que darán origen a otras zonas. En nódulos efectivos la actividad meristemática es más prolongada. * Vascular: Constituye un sistema de vasos ligados a los de la raíz y por ellos se realiza el intercambio nutricional. * Bacteriana: con células infectadas o no, las primeras contienen a los bacteroides y aparecen rodeados de la leghemoglobina. Todos los rizobios pueden vivir libres como saprófitos en los suelos o en medios de cultivo. Los generos Bradyrhizobium y Rhizobium son los más comúnmente conocidos Simbiosis Frankia-no leguminosas: Frankia es un genero del grupo de los actinomicetes que fija N2 en simbiosis, formando nódulos (actinorizas) o raíces laterales modificadas con plantas no leguminosas, generalmente árboles o arbustos de las familias de dicotiledoneas como Betulaceae, Casuarinaceae, Coriariaceae, Datiscaceae, Elaeagnaceae, Myricaceae, Rhamnaceae, y Rosaceae, Como consecuencia, estas plantas son capaces de crecer en suelos pobres e intervenidos, siendo así útiles en la recuperación de suelos y reforestación. Frankia presenta distintas estructuras en medios de cultivos y en los nódulos: hifas, esporangios y vesículas, siendo estas últimas el asiento de la fijación de N2 (protección de la nitrogenada) en aerobiosis. 3. Bibliografía consultada Celaya-Michel H., A. E. Castellanos-Villegas. 2011. Mineralización de nitrógeno en el suelo de zonas áridas y semiáridas. Terra Latinoamericana, Vol. 29, Nº. 3, pp. 343-356. Sociedad Mexicana de la Ciencia del Suelo, A.C. Chapingo, México Frioni, L. 2006. Microbiología: Básica, ambiental y agrícola. Facultad de Agronomía. Universidad Nacional de la República, Uruguay Isobe, K., Kose, K., Otsuka, S., Senoo, K. 2011. Nitrification and nitrifying microbial communities in forest soils. J For Res 16:351–362 Nannipieri, P., Eldor, P. 2009. The chemical and functional characterization of soil N and its biotics components. Soil biology and biochemistry 41: 2357-2369. Victoria, R.L., M.C. Piccolo, A.A.T. Vargas. 1992. O ciclo do nitrogênio. Em Microbiologia do solo, (coord) Cardoso, E.J.B:N., S.M.Tsai, M.C.P. Neves. Campinas, Sociedade Brasileira de Ciência do Solo. Mayz-Figueroa J. Fijación biológica de nitrógeno. 2004. Revista UDO Agrícola 4 (1): 1-20.

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Guía de Trabajo Práctico Nº 6 Grupos fisiológicos de microorganismos relacionados al ciclo del nitrógeno Objetivos: Que el estudiante - Determine grupos fisiológicos de microorganismos que participan en los procesos del ciclo del nitrógeno con énfasis en el proceso suministrador del sustrato. - Conozca el importante rol de la microflora del suelo en los ciclos biogeoquímicos. - Aisle e identifique bacterias fijadoras de nitrógeno del género Azospirillum de rizósfera y endorizósfera. -Evalúe la diversidad de grupos funcionales relacionados con el ciclo del N. Actividades 1) Determinación de la presencia de microorganismos cultivables relacionados con el ciclo del nitrógeno. a- Fijadores de N de vida libre (Género Azotobacter). Colocar gránulos de suelo en medio selectivo para Azotobacter (ver anexo). Incubar a 28ºC durante 15 días y observar ¿Cómo se manifiesta el crecimiento? Intente deducir ¿Cómo protege el sistema nitrogenasa este género? b- Fijadores de N (Género Azospirillum) Sembrar raícillas de grámineas en medio NFB semisólido (ver anexo). Incubar a 30º C y observar el tipo de crecimiento de Azospirillum en medio semisólido. c- Fijadores de N en asociación simbiótica (Géneros Rhizobium y Bradyrhizobium) i) Aislar desde inoculantes, a partir de diluciones sucesivas, colonias de rizobios en medio Agar Levadura Manitol (ver anexo). Observar y describir el tipo de colonia. ¿Este medio es diferencial o selectivo? ii) Realizar cuantificación de Rhizobium y/o Bradyrhizobium del inoculante mediante diluciones sucesivas 10-5, 10-6 y 10-7 y realizar siembra en cajas de Petri conteniendo medio ALM. 2) Cuantificación de microorganismos nitrificadores, fijadores de nitrógeno y desnitrificadores. a- Observar la Figura 1 y analizar. ¿Qué evidencia la correlación significativa entre densidad de genes amoA de Archaeas y la tasa de nitrificación?

Figura 1. Tasa de nitrificación en función de la abundancia de genes amoA. Fuente: Mao et al., 2011. Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014. Prof Titular Ing Msc Ada Albanesi; JTP Ing. Mag. Analia Anriquez; Ayud. Prof. Ing. Juan Silberman

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b- La Figura 2 muestra la abundancia de diferentes grupos funcionales relacionados con el ciclo del N estimados a través de la cuantificación de copias de genes amoA (nitrificación); nifH (fijación biológica de N); nosZ (desnitrificación) en diferentes sistemas de producción. Analizar la figura y responder: i ¿Existen fluctuaciones temporales en las poblaciones de bacterias nitrificadoras, arqueobacterias nitrificadoras, fijadores de nitrógeno y desnitrificadores? ii ¿Cuáles podrían ser las causas de la alta abundancia de genes nosZ en Abril?

Figura 2. Cambios en la abundancia de genes nifH, amoA archaea, amoA bacteria y nosZ en diferentes sistemas Miscanthus giganteus (MG), Panicum virgatum (PV), pradera restaurada (NP) y Zea mays (ZM). Fuente: Mao et al., 2011. c- Observar la Figura 3 y comentar acerca de las condiciones del suelo que minimizan la producción de gases de N con efecto invernadero.

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Figura 3. Emisiones de N2O en función del porcentaje de poros llenos de agua (WFPS). (Ciarlo, 2012)

d- Mencione otros factores que inciden en las emisiones de gases de N. 3) Diversidad de microorganismos relacionados con la fijación biológica de nitrógeno Se realizó la extracción de ADN de dos suelos diferentes, se amplificó por PCR la región correspondiente al gen nifH (codifica para la subunidad Fe de la enzima nitrogenasa) y la secuenciación (Vollú et al. 2012). a- Usando estas secuencias, identificar los microorganismos mediante NCBI - BLAST. ¿Debería usar la base de datos de ADNr 16S? ¿Por qué? b-Calcular el índice de diversidad de Shannon. c- ¿Qué muestra tendría mayor resiliencia? Bibliografía Ciarlo, E. 2012. Pérdidas gaseosas de nitróegno. Curso química de suelo. Escuela para graduados. Fac. de Agronomía. UBA. Mao Y, Yannarell A, Mackie R. 2011. Changes in N-Transforming Archaea and Bacteria in Soil during the Establishment of Bioenergy Crops. PLoS ONE 6(9): e24750. doi:10.1371/journal.pone.0024750 Vollú, R., Blank, A., Seldin, L., Rodrigues Coelho, M. 2011. Molecular diversity of nitrogenfixing bacteria associated with Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty (vetiver), an essential oil producer plant. Plant Soil 356:101–111 Anexo. Medios de cultivo Medio LG para Azotobacter: Sacarosa, 20 g; K2HPO4, 0,05 g; KH2PO4, 0,15 g; CaCl2, 0,01 g; MgSO4.7H2O, 0,2 g; Na2MoO4.2H2O, 0,002 g; FeCl2, 0,01 g; Azul bromotimol (0,5% en etanol), 2 ml; CaCO3, 1 g; Agar, 15 g; Agua destilada, 1000 mL. Medio Levadura manitol agar (ALM): Manitol, 10 g; Extracto de levadura, 0,4 g; K2HPO4, 0,5 g; MgSO4.7H2O, 0,2 g; NaCl, 0,1 g; Rojo congo, 5 mL; Agar, 15 g; Agua, 1000 mL. Medio Agar Rojo Congo: K2HPO4, 0,5 g; MgSO4.7H2O, 0,2 g; 0,2 g; NaCl, 0,1 g; Extracto de levadura, 0,5 g; FeCl3 6H2O 0,015 g; DL ácido málico, 5g; KOH, 4,8g; solución al 2,5‰ de rojo congo; Agar, 20g; agua, 1000mL (pH 7). Medio semisólido NFB: ácido málico, 5g; K2HPO4, 0,5g; MgSO4.7H2O, 0,2 g; NaCl, 0,1 g; Ca2Cl 2H2O, 0,02g; solución al 0,5% de azul de bromotimol, 2mL; solución de micronutrintes (H3BO3, 0,286g; MnSO4 H2O, 0,286; ZnSO4 7H2O, 0,024; CuSO4 5H2O, 0,008g; Na2MoO4 2H2O, 0,2; H2O, 1000mL); H2O, 1000mL. (pH 6,8).

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