Carrera de Ingeniería Agronómica Cátedra de Microbiología Agrícola Año 2014

Serie Didáctica Siembra y aislamiento de microorganismos 1. Introducción La manipulación de los microorganismos requiere de técnicas especiales, no sólo por su tamaño microscópico, sino porque es necesario evitar la contaminación de los cultivos por gérmenes indeseables e impedir el traslado de gérmenes patógenos desde los cultivos al medio ambiente. Para una correcta manipulación de los microorganismos es necesario trabajar con instrumentos estériles sobre medios de cultivo estériles. Para estudiar un microorganismo determinado, es necesario destruir todos los demás que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de trabajo. 2. Siembra En términos microbiológicos es el proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos (inóculo) a un medio nutritivo adecuado, elegido de acuerdo a las exigencias vitales del microorganismo, de tal manera que permita su desarrollo y manipulación, colocándolo a una temperatura adecuada, y durante un tiempo conveniente. La finalidad de la siembra es: 2.1. Aislamiento Consiste en separar de una población heterogénea (muestra de agua o leche, suspensión de suelo, etc.) al microorganismo que se desea estudiar para obtenerlo al estado puro. En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas de una gran variedad de tipos diferentes entre sí. Cuando se hacen cultivos de estos materiales (tierra, leche, aire, materia fecal, alimentos, etc.) pueden desarrollar muchas especies de gérmenes. Este cultivo recibe el nombre de "cultivo mixto". Cuando el cultivo solamente contiene una sola clase de microorganismos, es decir que pertenecen a una misma población, se obtiene un cultivo puro. Este tipo de cultivo se requiere para el estudio intensivo de un microorganismo (morfología, fisiología, identificación). Como en la naturaleza no es corriente encontrar microorganismos de una sola especie sino mezcladas, y como dos especies distintas que crecen juntas pueden dar reacciones muy diferentes de las de cada una por separado, es necesario conocer como separarlas. 2.2. Transplante Consiste en colocar al microorganismo ya aislado (en cultivo puro) en un nuevo medio de cultivo a fin de conservarlo a través del tiempo, lo que permitirá realizar diferentes estudios, tales como pruebas bioquímicas, morfología, coloración, análisis genéticos, identificación taxonómica, etc.

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3. Técnicas de cultivo Existen diversas técnicas de laboratorio para aislar microorganismos, entre ellas están las que dependen del comportamiento de éstos frente a la acción del oxígeno del aire. Los microorganismos presentan una considerable variación en cuanto a sus exigencias en oxígeno atmosférico y de acuerdo a ello se clasifican en:  Aerobios: sólo crecen en presencia de oxígeno libre. No sobreviven en su ausencia.  Anaerobios: su crecimiento es inhibido por el oxígeno  Anaerobios facultativos: crecen en ausencia de O2 pero se adaptan a la presencia del O2  Microaerófilos: necesitan oxígeno libre pero en pequeñas concentraciones. Los microorganismos como toda célula viva oxidan ciertos sustratos y de esta forma, obtienen la energía para la síntesis de sus macromoléculas. Cuando el proceso ocurre en ausencia de un aceptor de electrones, muchos organismos efectúan reacciones redox balanceadas de algunos compuestos orgánicos, con liberación de energía. Este proceso se llama fermentación. Hay muchos tipos diferentes de fermentación, pero en condiciones fermentativas solamente se efectúa una oxidación parcial de los átomos de C del compuesto orgánico y por consiguiente, solo una pequeña cantidad de energía potencial disponible se libera. La oxidación en una fermentación está acoplada a la reducción posterior de un compuesto orgánico generado a partir del catabolismo del sustrato inicial fermentable, así, no se requiere un aceptor de electrones suministrado externamente. En las fermentaciones, el ATP se produce por un proceso que se llama fosforilación a nivel de sustrato, sintetizándose durante etapas enzimáticas especificas en el catabolismo del compuesto orgánico. La cantidad de energía liberada en este proceso es relativamente pequeña (y pocas moléculas de ATP son sintetizadas) en comparación a los que ocurren en presencia de O2, debido a a que los átomos de C del sustrato inicial están sólo parcialmente oxidados y la diferencia en los potenciales de reducción entre el donador de electrones inicial y el último aceptor de electrones es pequeña. Si el O2 está presente como aceptor de electrones tiene lugar la respiración y todas las moléculas de sustratos pueden oxidarse completamente hasta CO2 liberando mayor cantidad de energía. En este proceso es posible la síntesis de gran cantidad de ATP, debido a que el aceptor final de electrones tiene un potencial de reducción relativamente positivo, provocando una diferencia neta mayor en los potenciales entre el donador primario y el aceptor final. Los organismos del metabolismo oxidativo disponen, para una producción más activa de ATP, de un sistema especial, de transporte de electrones en la cadena respiratoria. La producción de ATP está directamente vinculada al establecimiento de un gradiente de protones a través de la membrana, sirviendo las relaciones de transporte de electrones para generar la fuerza motriz protónica necesaria. Durante el transporte de electrones, se produce ATP por el proceso de fosforilación oxidativa. Es decir que el H2 (con sus electrones) pasa por una serie de transportadores de electrones para reaccionar con el O2 (aceptor final) o con otros aceptores finales de H (SO =, 2

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NO3-, CO3=). En el transporte de electrones participan varios tipos de enzimas de oxidaciónreducción y de proteínas transportadoras de electrones: 1) NADH deshidrogenasas (unidas a la superficie interna de la membrana celular), las cuales transfieren átomos de hidrógeno del NADH; 2) acarreadores de electrones que contienen riboflavina, llamados generalmente flavoproteínas (como el FAD); 3) proteínas ferrosulfurosas y 4) los citocromos. Además se 2 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014.

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conoce una clase de acarreadores no proteínicos de electrones, las quinonas liposolubles (coenzimas Q) En la respiración aerobia, el H2 proveniente de la deshidrogenación del sustrato oxidable se fija, a través de grados sucesivos, a diferentes receptores, en primer lugar al NAD que se reduce. El FAD se reduce al mismo tiempo que se oxida el NADH2. El FADH2 se reoxida al transferir sus electrones al sistema de los citocromos (Figura 1).

Figura 1. Esquema de la cadena transportadora de electrones. Como la oxidación del FADH2 es una deshidrogenación, la transferencia de cada electrón va acompañada de la liberación de un ión hidrogenado.

La reducción del O2 a 2 H2O que tiene lugar durante la respiración, requiere que se agreguen 4 electrones. Esta reducción generalmente tiene lugar por dos pasos, un electrón a la vez, y el primer producto formado en la reducción del O2 es el anión superóxido, O2-. El superóxido es altamente reactivo y puede producir destrucción oxidativa de lípidos y otros componentes bioquímicos. El siguiente producto en los pasos para la reducción del oxígeno es el peróxido, O22-. Generalmente se forma mediante la reducción de dos electrones de O2, mediado por flavoproteínas

El H2O2 es un compuesto extremadamente tóxico y su acumulación produce serios daños a la célula.

En los organismos aerobios y anaerobios facultativos, la acumulación letal de oxígeno es prevenida por enzimas que destruyen los productos tóxicos del O2. Las mismas pueden ser: superóxido dismutasa (SMD) que cataliza la siguiente reacción:

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Todos los organismos también contienen la enzima catalasa, cuya acción es:

Un grupo bacteriano capaz de crecer en presencia de aire (Lactobacilos) no tiene catalasa. Sin embargo, la mayoría de estos organismos no acumulan cantidades significativas de H2O2 ya que la descomposición es por medio de la enzima peroxidasa, la cual cataliza la oxidación de compuestos orgánicos por el H2O2, la que a su vez es reducida a H2O. Donde A puede ser un dador de electrones; citocromo C: NADH y NADPH. La presencia de estas enzimas (SMD, catalasa, y peroxidasa) es la que permite a los aerobios y anaerobios facultativos crecer en presencia de O2 ya que intervienen protegiendo a las células de las consecuencias tóxicas del metabolismo del O2. La distribución de estas enzimas se muestra en la Tabla 1 Tabla 1. Distribución de enzimas en los tipos microbianos

Las razones de la inhibición del crecimiento de gérmenes anaerobios estrictos en presencia de oxígeno molecular ha sido objeto de múltiples investigaciones. Hasta ahora, las causas más importantes que se encontraron son:  Los microorganismos anaerobios estrictos carecen de citocromo-oxidasa por lo se forma H2O2 y O2. La acumulación de estos productos, debido a que no elaboran SMD, catalasa ni peroxidasa, intoxica a la célula.  El desarrollo depende de un potencial de óxido-reducción bajo, imposible en presencia de oxígeno libre. 3.1. Siembra de bacterias aerobias 3.1.1. Siembra para lograr transplantes: se realiza en distintas formas, teniendo en cuenta el medio de cultivo que se va emplear y el material que contiene la bacteria en estudio. 3.1.1.1. En medios líquidos

Desde un medio líquido Siembra a Medios Líquidos Desde un medio sólido

con ansa con pipeta graduada con pipeta Pasteur con ansa con aguja

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Los tubos, tanto el que contiene el material a sembrar como el que contiene el medio al cual se va a transplantar, se toman con la mano izquierda colocando las bocas a la misma altura y sosteniendo con los dedos índice, medio y anular. Se usa el pulgar para sujetarlos poniéndolo muy cerca de la base para dejar a la vista toda la superficie del cultivo. Con la mano derecha, se toma el ansa como si fuera una lapicera y se esteriliza a la llama vertical sobre la misma y hasta que llegue al rojo. Se destapan los tubos, ambos a la vez, tomando los tapones entre el dedo meñique y el borde cubital de la mano derecha. El tapón no puede ser depositado sobre la mesa de trabajo bajo ninguna circunstancia, y la parte del tapón que se introduce en el tubo no debe entrar en contacto con la piel ni objeto alguno para evitar posibles contaminaciones. Se esterilizan las bocas de los tubos pasándolos ligeramente pr la llama, se introduce el ansa en el tubo que contiene la muestra. Se carga con ésta, se saca cuidando de no tocar las paredes del tubo y se introduce en el medio de cultivo fresco hasta tocar el borde de la superficie del medio. Se retira el ansa y se quema nuevamente la boca del tubo, se tapa y se esteriliza el ansa. Las pipetas graduadas y pipetas Pasteur se pasan por la llama para esterilizarlas superficialmente. Se introduce la pipeta en el medio de cultivo líquido que contiene los microorganismos, se carga una cantidad adecuada de material y se deja caer en el tubo o series de tubos, destapándolos y tapándolos sucesivamente. 3.1.1.1.1. Formas de crecimiento bacteriano en medio líquido  Enturbamiento: opacidad más o menos densa y homogénea en todo el cultivo.  Formación de velo: una pequeña masa de células flotan en la parte superior del cultivo.  Sedimento: un depósito de células que permanecen en la parte inferior del cultivo pero que se pone nuevamente en suspensión si el tubo se sacude. 3.1.1.2. En medios sólidos Si se añade una sustancia solidificante a un medio líquido que contiene células bacterianas, cada célula se inmoviliza en el lugar en que se encuentra. En lugar de flotar de un lado para otro, como sucede en un medio líquido, cada célula viable origina una "colonia" de células hijas que crecen hasta formar una masa fija, visible. Si las células primitivas son atrapadas distantes entre sí, cada célula viva origina una colonia separada, diferente. Por consiguiente, se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la producción de una colonia en un breve lapso de tiempo Este hecho es de gran importancia y constituye el fundamento de ciertas técnicas que usan medios sólidos que proporcionan ventajas que no ofrecen los medios líquidos. en tubos de ensayo desde un medio líquido Siembra en un medio sólido

desde un medio sólido

en cajas de Petri en tubo de ensayo en cajas de Petri

Por estrías Por picadura Por estrías por diseminación por estrías por picadura por estrías

En tubos de ensayo por estrías: Se toman los tubos en la forma ya descripta para siembra en medios líquidos, y una vez extraído el material, se introduce el ansa hasta el fondo 5 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014.

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del tubo, diluyendo en el agua de condensación que se acumula en esa parte, y luego, con movimientos en zig-zag desde el fondo del tubo, cruzando hacia arriba se raya toda la superficie del medio cuidando de no romperlo. En tubos de ensayo por picadura: La toma del material se efectúa en la forma descripta más arriba, utilizando aguja de platino en lugar del ansa. El tubo en el que se va efectuar la siembra contiene agar o gelatina, que se ha dejado solidificar en posición vertical. Una vez tomado el material a sembrar se introduce rápidamente la aguja en el seno del medio fresco. Hecho esto se retira la aguja rápidamente, se quema la boca del tubo y se tapa. Se esteriliza la aguja. Se incuban los tubos recién sembrados. El desarrollo se producirá a lo largo de la picadura. Esta técnica sirve para conocer, en especial , si un microorganismo es móvil o no, cuando se usan medios semisólidos ( 0,3-0,5 % de agar ). En cajas de Petri: Para la preparación de las placas de agar se funde el medio agarizado calentándolo en baño María y se deja enfriar a 45-47ºC. A continuación se vierten 12- 15 mL. del medio enfriado pero aún líquido en una caja de Petri estéril (el enfriamiento disminuye la cantidad de agua que se condensa cuando el agar líquido se solidifica en placas de Petri). Para evitar la contaminación son necesarias varias precauciones. Primero, cuando se saca el agar fundido del baño de agua, se seca el exterior del tubo o frasco, pues sino, el agua caerá en la placa e introducirá contaminantes. A continuación, cuando se quita el tapón para verter el agua, debe flamearse la boca del tubo o frasco para matar los microorganismos. Al verter el agar, se debe levantar solamente por un lado la tapa de la caja y únicamente lo suficiente para permitir el paso de la boca del recipiente con agar. Asimismo, se debe tener cuidado de no rozar la placa o su tapa cuando se vierta el agar. Después de haber vertido el medio en la placa, se tapa ésta inmediatamente y se deja que se distribuya uniformemente en la parte inferior de la misma. Se deja solidificar sin moverlo hasta que esté completamente sólido y frío. Antes de sembrar la placa conviene desecar la superficie del medio eliminando el agua de condensación que se hubiera formado. Para ello se dejan secar durante 20 a 30 minutos en estufa, destapadas o invertidas. En estas condiciones ya se pueden sembrar los cultivos microbianos en la superficie del medio por estriado o por diseminación con espátula de Drigalsky. En cajas de Petri por estrías: El material a sembrar se toma con ansa siguiendo las precauciones de asepsia antes citadas, y se deposita sobre la placa de agar, en el borde más alejado del operador, extendiendo el cultivo de una parte a otra, de borde a borde, haciendo una serie de movimientos en zig-zag en dirección hacia el operador. Cuando se alcanza el centro de la placa, se gira ésta unos 180º y se continúa la extensión o el estriado. Esta intervensión evita el obstáculo del borde de la placa que hace casi imposible continuar con el estriado. La tapa de la caja de Petri puede mantenerse en la mano izquierda cubriendo parcialmente el medio de cultivo; o bien puede ser dejada sobre la mesa de trabajo, manteniendo la placa a sembrar lo más cerca posible del mechero. Otra técnica de estriado consiste en extender el material haciendo 3-4 estrías en ángulo recto con las primeras, y repetir el proceso. Con el estriado se obtiene la dilución del cultivo. El objetivo inmediato del estriado es obtener colonias de bacterias, separadas, a partir de cultivos concentrados de células. Durante la inoculación, al comienzo de la siembra, las células forman colonias que se desarrollan juntas, pero a medida que el estriado continúa, cada vez son menos las células que permanecen en el ansa. A medida que estas son depositadas , van a crecer en la superficie del medio originado colonias separadas. Una buena placa resulta de los movimientos suaves y progresivos del ansa, repetidos muchas veces, con estrías muy juntas entre sí, sin romper el medio de cultivo. 6 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014.

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Debido a la elevada concentración de agar, se forma algo de agua de condensación durante la preparación de las placas y aún durante la incubación. El agua puede resbalar de la tapa a la superficie del medio y extenderse provocando una masa de crecimiento confluente impidiendo la formación de colonias aisladas. Para evitar esto, las cajas son, rutinariamente, incubadas invertidas. En cajas de Petri por diseminación: Sobre el medio de cultivo se deposita una gota del material a sembrar. Con una espátula de Drigalsky estéril, se extiende el material rasando toda la superficie. Se tapa la caja, se introduce la espátula en alcohol y se flamea rápidamente por la llama. 3.1.2. Siembra para lograr aislamientos Para el aislamiento de bacterias y obtención de un cultivo puro se pueden aplicar varios métodos.

Métodos en Medios Sólidos Métodos Biológicos Métodos en Cultivos Unicelulares

Métodos Cualitativos Métodos Cuantitativos

3.1.2.1. Métodos en medios sólidos El problema de separar bacterias de una mezcla de microorganismos con el objeto de obtener cultivos puros, puede ser resuelto con la aplicación de técnicas especiales que se detallan a continuación:

Métodos Cualitativos

Métodos Cuantitativos

Agotamiento en caldo- agar fundido Agotamiento en superficie por diseminación por estriado

en placa en tubo

Diluciones Sucesivas

3.1.2.1.1. Métodos cualitativos: son utilizados cuando se quieren aislar las células existentes en una mezcla de diferentes bacterias sin predecir el número de células viables. Si las bacterias son separadas por dilución, fijadas sobre un medio nutritivo sólido e incubadas convenientemente, formarán colonias aisladas unas de otras. Como las colonias de distintos microorganismos difieren en tamaño, forma, consistencia y color su aspecto es valioso auxiliar para la identificación posterior. Agotamiento en caldo agar fundido: Se aprovecha la propiedad que tiene el caldo agar de permanecer líquido a temperaturas relativamente bajas lo que permite así la incorporación del material en estudio que contiene la mezcla bacteriana, sin tomar en particular ninguna especie. El material incorporado se disemina por toda la superficie del cultivo y una vez solidificado, las bacterias quedan inmovilizadas y separadas unas de otras. Se funde en Baño María tres tubos con 10 mL de agar y se enfrían a 45ºC (para mantener la licuación del medio) y con el ansa se toma el material guardando las precauciones de asepsia. Se siembra en el primer tubo agitando el ansa. Se mezcla perfectamente bien haciendo rotar el tubo entre las manos. De esta primera siembra se toma una ansada que se diluye en el segundo tubo y de idéntica forma, se procede con el tercero, partiendo del segundo. Se han hecho así tres diluciones sucesivas del material. Como se desconoce su riqueza bacteriana se deben hacer varias diluciones de la muestra a fin de obtener cultivos ni muy abundantes ni muy pobres. 7 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014.

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El contenido de los tres tubos se vierten en sendas cajas de Petri estériles abriéndolas lo menos posible para evitar contaminaciones. Se agita por rotación suave para distribuir bien el material y se deja solidificar en superficie plana. Después del tiempo apropiado de incubación se observará que la mayoría de las colonias desarrollan dentro del agar y sólo unas pocas aparecen en la superficie. La primera placa generalmente contiene demasiados gérmenes y es difícil de encontrar en ella una colonia bien aislada, pues están muy juntas. La segunda y tercera placa deben presentar colonias separadas de dimensiones normales. Puede obtenerse un cultivo puro retirando con aguja o ansa, parte de una colonia bien aislada, sembrándola en medio apropiado. Agotamiento en superficie por diseminación: se debe disponer de varias cajas con el medio de cultivo solidificado como ya se indicó anteriormente. Sobre la superficie del medio de cultivo se deposita una gota de la muestra y se disemina por toda la superficie con espátula de Drigalsky estéril. Luego, sin cargar la espátula nuevamente, se pasa a otra caja agotándola sobre la superficie del medio y en la misma forma, sobre una tercera placa. Las cajas son numeradas de la primera a la última y se incuban invertidas. El desarrollo aparecerá en la superficie del medio y el número de colonias desarrolladas decrecerá de la primera a la última caja. De una colonia bien aislada es posible obtener un cultivo puro trasplantando con aguja o ansa una porción de ella a un medio apropiado. Agotamiento por estriado en placa: se procede agotando el inóculo con ansa (Figura 1).

Figura 1. Agotamiento por estriado en placas. Agotamiento por estriado en tubos: éste se usa menos porque el medio de cultivo en bisel presenta poca superficie para obtener colonias bien separadas unas de otras y por ser más difícil transplantar las colonias desarrolladas. Pero cuando se trata de pocos gérmenes o de un medio donde desarrolla bien una especie y mal las que acompañan, se puede usar los tubos que presentan la ventaja de facilidad de manipulación y menos riesgos de contaminación. 3.1.2.1.2. Métodos cuantitativos: prácticamente todas las fases de la microbiología requieren métodos para medir el número de microorganismos presentes en una muestra. Por el método de las diluciones sucesivas se consigue el aislamiento de microorganismos en una mezcla de especies diferentes y al mismo tiempo se logra conocer el número de células viables en la misma. Diluciones sucesivas: debido a que una bacteria da origen a una colonia, se puede determinar el número de microorganismos presentes en una muestra si las diluciones se realizan cuidadosamente y se siembran en placas. Después de la incubación se cuenta el número de colonias que han desarrollado. Para determinar el número original de bacterias se multiplica el número de colonias por el grado de dilución de la placa en la que se está haciendo el recuento. 8 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014.

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Procedimiento: Con una pipeta estéril se toman 0,5 mL de la muestra, en condiciones asépticas y se llevan a un tubo de solución fisiológica (S.F.), se mezcla perfectamente bien por rotación. Se rotula el tubo con la dilución efectuada (10-1). De la dilución 10-1 se toman 0,5 mL y se llevan a un segundo tubo con S.F, se mezclan bien, se rotula el tubo con la dilución efectuada (10-2). De igual manera se procede a realizar la dilución 10-3. De cada dilución se toman 0,1 mL, se llevan al tubo con caldo agar, se mezcla y se vierten en sendas cajas de Petri. Se rotula cada caja con el número de dilución. Se deja solidificar y se incuban a 37ºC invertidas (Figura 2). Recuento y cálculo del número de colonias: Se debe elegir la caja que contenga entre 30 y 300 colonias (se supone que cada colonia se originó a partir de una célula microbiana). Se descartan las cajas con desarrollo muy pobre o muy abundante. Las colonias pueden contarse de modo muy eficaz poniendo las placas invertidas hacia el observador y marcar sobre el vidrio con un lápiz graso cada colonia que se va contando para evitar contar varias veces la misma colonia. El número de unidades formadoras de colonias (ufc) de la muestra original se obtiene multiplicando el número de colonias contadas por la inversa de la dilución de esa caja. Si por ejemplo se cuentan 150 colonias en la caja de dilución 10-3 se tiene: 150 x 103 = 1,5 x 105 En cada caja se sembraron 0,1 mL, para conocer cuantos microorganismos hay en un mL se hace el cálculo siguiente: 1,5 x 105 x 10 = 1,5 x 106 unidades formadoras de colonia mL-1

Figura 2. Diluciones Sucesivas. 3.1.2.2. Métodos biológicos: Se basan en propiedades biológicas de las bacterias. Movilidad de los microorganismos: se siembra por punción una mezcla de microorganismos móviles e inmóviles en medios sólidos (agar 0,3- 0,5 % ), los móviles desarrollan lejos del canal de punción y los inmóviles permanecen a lo largo de la picadura. Para obtener un cultivo puro de móviles es suficiente con tomar muestra de la zona más alejada a la punción y sembrar en medio apropiado. Termorresistencia de las bacterias esporuladas: los esporos son formas de resistencia que toleran temperaturas que resultan letales a las formas vegetativas. Cuando el gérmen en estudio se encuentra en forma de esporos, su aislamiento de los acompañantes se 9 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014.

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logra fácilmente por calentamiento superior a 80ºC durante 10 minutos. Se transplanta a un medio apropiado y desarrolla únicamente la bacteria esporulada. Empleo de animales receptivos: por inoculación de animales se logran cultivos puros de gérmenes. Para ello se le inyecta el material que contiene la mezcla de microorganismos. En estos casos el animal actúa como medio selectivo ya que su organismo destruye los gérmenes no patógenos y respeta los patógenos. Trascurrido algún tiempo se mata el animal y se hace siembra de trozos de sus órganos afectados obteniéndose así cultivos puros del gérmen patógeno. 3.1.2.3. Métodos de cultivos unicelulares Son métodos de aislamiento usados en problemas especiales de investigación en que se consigue aislar una sola célula. En todos los casos se efectúan diluciones de la muestra sobre portaobjetos o cubreobjetos estériles, y mediante el uso del microscopio se trata de localizar aquellas gotitas diluidas que contengan una sola célula que es transferida a un medio de cultivo apropiado. 3.2. Siembra de bacterias anaerobias Debido a la inhibición del crecimiento de microorganismos anaerobios estrictos en presencia de oxígeno molecular el cultivo de éstos debe realizarse previa eliminación del oxígeno libre del medio y manteniendo el potencial redox muy bajo, con esta finalidad se han ideado diversos procedimientos que se detallan a continuación. 3.2.1. Procedimientos para eliminar el O2 3.2.1.1. Adición de productos Reductores a los medios de cultivos Es un método simple y eficaz que consiste en añadir a los medios de cultivo un producto químico inofensivo que absorbe el O2 del aire tan rápidamente como éstos difunde en el medio. Se establece así un potencial redox bajo y se mantiene a las enzimas celulares en forma reducida. Los productos usados con este fin son: tioglicolato de sodio, cisteína, glucosa y ácido ascórbico. 3.2.1.2. Eliminación del oxígeno del medio de cultivo Por ebullición: Los medios de cultivo una vez esterilizados, al tiempo de estar preparados, redisuelven el oxígeno del ambiente que debe ser eliminado antes de efectuar la siembra. Esto se consigue llevando el medio a ebullición durante 20 min. en baño maría. Se enfría rápidamente para evitar la redisolución del O2 y se siembra. Para evitar que el O2 vuelva a penetrar, se cubre la superficie del medio con gotas de vaselina o parafina estériles que forman una capa impermeable. Aunque esto no impide por completo la entrada de oxígeno, es suficiente para que se inicie el desarrollo bacteriano el que una vez comenzado, se ve mejorado por el CO2 del metabolismo celular. Agar en profundidad: Se usan tubos largos y de poco diámetro para que el medio agarizado forme columnas de 15-18 cm de alto. El medio se funde y se enfría a 50oC, se siembra y se mezcla por rotación suave (evitando así, la redisolución del O2 del aire). Se deja solidificar en posición vertical. Se cubre la superficie con vaselina estéril. Los anaerobios estrictos sólo desarrollan en la profundidad. Para examinar las colonias ya desarrolladas, se calienta cuidadosamente el tubo a la llama para despegar el agar de las paredes del tubo. Se destapa y se flamea la boca del tubo y se lo vuelca sobre una caja de Petri estéril flameando el fondo del tubo para forzar al agar a salir, por la presión del vapor que produce. 10 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014.

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3.2.1.3. Absorción del oxígeno del aire Pirogalol alcalino: Este reactivo es venenoso por lo que debe ser mantenido separado del medio de cultivo. Se siembra el microorganismo en tubos con agar en bisel. El tapón de algodón se corta al ras y la porción restante se introduce unos 4 cm. Se añade a la superficie del tapón unos cristales de pirogalol y se humedece luego con unas gotas de NaOH al 30% Inmediatamente se tapa con tapón de goma y se incuba en posición vertical. El pirogalol se oxida en presencia de álcali usando el O2 del aire, creando condiciones óptimas de anaerobiosis. Si se trabaja con medios líquidos, se puede colocar dentro de un tubo de ensayo grande un soporte de vidrio pequeño. Se añade el pirogalol seco. Se añade la solución de NaOH, se introduce el tubo sembrado y se tapa el tubo grande herméticamente con tapón de goma. Si la siembra se realiza en placas, se adhiere a la tapa de la caja un sobre de papel poroso conteniendo NaOH y pirogalol. Se humedece con unas gotas de agua y se coloca la tapa invertida sobre la base de la caja. La unión de ambas mitades se sella con tela adhesiva. Uso de bacterias aerobias: Son muchas las técnicas que se pueden poner en práctica. Su fundamento consiste en sembrar aerobios que absorben el oxígeno libre permitiendo el desarrollo de los anaerobios. Los resultados son mejores si se usan medios de cultivos con compuestos reductores como el agar-tioglicolato. Con un bisturí estéril pueden cortarse en el sentido de uno de los diámetros una placa de agar; la placa queda separada en dos mitades. En una de las mitades se siembra un aerobio y en la otra un anaerobio. Se tapa y se sella con plastilina el espacio que queda entre la base y la tapa de la caja. Una modificación consiste en sembrar una placa con el anaerobio y otra con el aerobio. Se descartan las tapas y se unen ambas bases con tela adhesiva. 3.2.1.4. Conbustión del O2 del aire con H2 Vasija de Brewer: Es un recipiente cilíndrico, de cierre hermético, con capacidad para alojar las cajas de Petri y tubos de ensayo, que van a ser incubados. El H2 es introducido a presión y reacciona con el O2 del aire ( contenido en el recipiente ) para formar agua por acción de un sistema frío o caliente de catalizador de platino. Jarra para anaerobiosis: Una modificación actual de la vasija descripta, consiste en usar recipientes de cierre hermético en el que se colocan sobres disponibles en el comercio, que liberan H2 y CO2 al añadirles agua. El H2 se combina con el O2 del recipiente, por la acción de un catalizador de platino, para formar agua. Debido a esto, siempre deben envolverse las cajas con cultivos en papel absorbente para retener el agua que se produce. Para la producción de H2 y CO2 los sobres comerciales traen pastillas de borohidrato de sodio, bicarbonato de sodio y ácido cítrico que al ser humedecidas en el momento de usar general suficiente H2 como para reaccionar con todo el O2 contenido en el recipiente. El CO2 que se genera sirve para compensar la atmósfera y para favorecer la anaerobiosis. Granallas de zinc impurificado con sulfato de cobre y ácido sulfúrico: Este sistema, colocado en un recipiente de cierre hermético, genera una buena cantidad de H2 por la acción catalítica del zinc (éste puede reemplazarse por Fe ). 3.2.1.5. Sustitución del O2 del aire por gases inertes Es ampliamente usado y ofrece numerosas ventajas. Las placas o tubos que van a ser incubados se colocan en un recipiente de cierre hermético que consta de una boca de entrada de H2, N2 o CO2, y una salida de aire. Cuando el aire fué expulsado por los gases inertes se cierra ambas bocas, quedando el interior del recipiente con una atmósfera libre de O2. 11 Cátedra de Microbiología Agrícola-FAyA-UNSE. 2014.

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Cuando se usan recipientes de cierre hermético es necesario, siempre, controlar las condiciones de anaerobiosis. Esto se logra colocando dentro de la jarra un tubo adicionado de azul de metileno (indicador redox) que se decolora cuando se logra la anaerobiosis. 3.2.2. Siembra para aislamiento de anaerobios Se emplean las mismas técnicas ya vistas para el aislamiento de aerobios siempre que se usen medios de cultivo apropiados y se incube en condiciones de anaerobiosis. 3.3. Siembra para aislamiento de microaerófilos En un recipiente cerrado, conteniendo las placas o tubos que van a ser incubados puede encenderse una vela. La llama arderá hasta que el nivel de oxígeno descienda por debajo del necesario para una combustión contínua. Cuando la llama se extingue hay en la atmósfera, aproximadamente, un 7 % de O2 Este es un método imperfecto para el cultivo de anaerobios estrictos, pero de óptimos resultados para el desarrollo de microaerófilos. Para el aislamiento de microaerófilos se emplean las mismas técnicas ya vistas para aerobios, pero debe observarse esta condición de incubación. Se realiza en medios semisólidos: con concentración de agar de 0,5 a 0,8 % 4. Bibliografía consultada Brock, T. D.; M. Madigan. 1991. Microbiología. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. Sexta edición. Frioni L 1999. Procesos microbianos. Editorial de la Fundación Universidad Nacional de Río Cuarto.

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Carrera de Ingeniería Agronómica

Cátedra de Microbiología Agrícola Año 2014

Guía de Trabajo Práctico Nº 2 Siembra y aislamiento de microorganismos Objetivos Que el estudiante: - Aprenda técnicas microbiológicas para lograr el aislamiento de microorganismos a partir de cultivos mixtos.

Actividades 1. Sembrar para lograr transplantes de cultivos puros a) de un medio sólido a otro medio sólido b) de un medio sólido a otro medio liquido c) de un medio sólido a otro medio sólido en caja de Petri, por estriado y por agotamiento. 2. Sembrar para lograr aislamientos (método cualitativo) a) mediante agotamiento en superficie por diseminación, a partir de un cultivo mixto. b) mediante agotamiento en superficie por estriado en placa, a partir de un cultivo mixto. c) mediante siembra por punción 3. Se desea conocer si las bacterias Pseduomonas fluorescens y Bacillus amyloliquefaciens producen sustancias antagonistas de hongos fitopatógenos. Sabiendo que el primer paso para su estudio es obtener ambas bacterias en cultivo puro y que estos microorganismos habitan el suelo. ¿Cómo procedería para obtener un cultivo puro de cada bacteria? Y que métodos utilizaría para asegurar que se trata de un cultivo puro? 4. Se hipotetiza que las bacterias del rumen de llama (ambiente anaerobio) podrían poseer enzimas de interés para la degradación de material celulósico en el proceso de producción de biocombustibles. Para su estudio se deben obtener aislamientos puros. ¿Qué condiciones deben tenerse en cuenta para cultivar estos microorganismos? ¿Qué métodos emplearía para tal fin? ¿Qué constituyente deberían poseer los medios de cultivo? 5. Se descubrió que una bacteria posee capacidad de producir sustancias antibióticas de interés para el control de fitopatógenos en cítricos. Para que la bacteria produzca constantemente el antibiótico es necesario mantener los cultivos en la fase exponencial de crecimiento. ¿Cómo lograría este objetivo mediante los métodos aprendidos en este práctico? 6. Ud. posee una colección de cepas de bacterias de interés agronómico que desea conservar en el tiempo. ¿Cómo lograría este objetivo?

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