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FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE Luis A. Merino, Liliana S. Lösch Generalidades La Flia. Enterobacteriaceae está formada por bacilos y cocobacilos gramnegativos (Figura 1), anaerobios facultativos, no formadores de esporas, fermentadores de glucosa, no presentan actividad de citocromooxidasa (son oxidasa negativa), reducen nitratos a nitritos y las especies móviles lo son mediante flagelos de distribución peritrica. Están muy diseminadas en la naturaleza, las encontramos en el agua, en la tierra, en los animales, etc. En el hombre se localizan en las vías aéreas superiores (en pequeña proporción), en la piel (sobre todo en la región perianal), en la uretra anterior y sobre todo en el intestino. Desde el estómago al intestino grueso, la concentración va aumentando a lo largo del tubo digestivo. Fig. 1: imagen microscópica con coloración de Gram de las Enterobacterias

Taxonomía

Dentro de la esta Familia se reconocen más de 30 géneros diferentes. Actualmente, varios de ellos están siendo sometidos a revisión mediante técnicas de Biología Molecular, estudiando la homología de sus ADN y frecuentemente se crean nuevos géneros con especies de géneros ya existentes. A continuación se presentan algunos de los géneros, y dentro de ellos algunas especies, que con mayor frecuencia se aíslan a partir de muestras clínicas humanas Géneros Escherichia Shigella Salmonella Klebsiella Enterobacter Serratia Citrobacter Proteus Morganella Providencia Yersinia

Especies E. coli S. flexneri, S. sonnei, S. boydii, S. dysenteriae S. enterica, S. bongori K. pneumoniae, K. oxytoca E. cloacae, E. aerogenes, E. agglomerans S. marcescens, S. odorifera, S. fonticola C. freundii, C. kooseri P. vulgaris, P. mirabilis M. morganii P. rettgeri, P. stuartii Y. enterocolitica, Y. pestis

Estructura antigénica Las enterobacterias poseen una estructura antigénica muy compleja. Mencionaremos los más importantes. Antígeno O o somático, es parte de un lipopolisácarido que se encuentra en la pared celular. Este lipopolisacárido tiene tres fracciones: o Región uno: oligosacárido que contiene al Antígeno O. o Región dos: polisacárido central constante para un género determinado. o Región tres: dado por el lípido A, que constituye la endotoxina. Antígeno K o capsular, que está presente sólo en algunas bacterias capsuladas como Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli. Antígeno Vi es un polisacárido que rodea a la bacteria sin llegar a ser una cápsula y es característico de algunas especies de Salmonella.

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Antígeno H o flagelar es proteico, es específico de especie y está presente sólo en las especies móviles. Antígeno F o fimbrial: presente en las fimbrias. Son de naturaleza proteica. Factores determinantes de patogenicidad – La cápsula tiene propiedades de adhesina y es antifagocitaria. – Las fimbrias permiten la adherencia a la célula huésped e impiden el barrido por las barreras mecánicas de defensa del organismo. – Algunas especies producen exoenzimas como ureasa, gelatinasa, lipasa, desoxirribonucleasa, las cuales actúan permitiendo la sobrevida de la bacteria dentro del órgano afectado. – Debido a que el hierro es indispensable para ciertas funciones de las bacterias, estos microorganismos producen aerobactinas que permiten la captación de hierro desde el medio. – Todas las enterobacterias poseen el lipopolisacárido (LPS) de pared, el cual tiene acción de endotoxina, la cual se libera al destruirse la bacteria. – Exotoxinas: no todas las especies las producen. Sólo son producidas por las patógenas obligadas y poseen efectos específicos. Enterobacterias Patógenas Oportunistas Dentro de este grupo se incluyen aquellas especies que forman parte de la flora normal del hombre y los animales, están presentes en el suelo, el agua y las plantas. Producen infección cuando salen de su hábitat o hay alteraciones de las defensas locales. Los Géneros oportunistas que con mayor frecuencia se aíslan de muestras clínicas son Escherichia, Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Morganella, Providencia, etc. Estas bacterias producen infecciones extraintestinales como ser infecciones urinarias, sepsis, meningitis, abscesos, neumonías, otitis, sinusitis, meningitis, etc. Género Escherichia Dentro del género la especie de mayor importancia es Escherichia coli. E. coli se encuentra en número muy elevado en el contenido intestinal y tiene la capacidad de suprimir el crecimiento de microorganismos proteolíticos debido a la liberación de bacteriocinas (colicinas), sustancias con acción bactericida, y está relacionado con la síntesis de vitamina K. Son fermentadoras de lactosa y móviles. E. coli es el principal agente etiológico de infecciones urinarias, tanto en pacientes internados como ambulatorios ya que posee fimbrias capaces de adherirse al epitelio urinario y colonizarlo. Produce además peritonitis, abscesos, meningitis, endocarditis, neumonías nosocomiales, etc.. Género Klebsiella El género Klebsiella está muy extendido en la naturaleza: en la tierra, en el agua, en el polvo, en la leche, en los alimentos. También se las ve como organismos saprófitos de las vías respiratorias y del tracto digestivo del hombre y de los animales. Son microorganismos capsulados, inmóviles, fermentadores de lactosa, que fermentan la glucosa mediante la vía de fermentación del 2-3 butanodiol al igual que los del género Enterobacter. Dentro de este género, la especie más importante es K. pneumoniae. Es la especie tipo y produce infecciones urinarias, respiratorias y sepsis, siendo frecuentemente involucrada en brotes de infecciones hospitalarias. En algunos hospitales Klebsiella ha desplazado a E. coli como agente etiológico de infecciones intrahospitalarias. Existen dos subespecies, Klebsiella rhinoescleromatis y K. ozenae que se relacionan con otitis y rinitis de olor fétido con destrucción granulomatosa de la nariz y la faringe.

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Géneros Proteus Este género está muy difundido en la naturaleza, se lo encuentra en el suelo, agua, aguas servidas, materiales de animales en descomposición, tracto intestinal del hombre, etc. Juega un papel importante en la descomposición de los cadáveres. Se presenta con flagelos perítricos muy abundantes que hacen que “hormiguee” sobre la superficie de un medio sólido de cultivo. Dentro del género Proteus las especies más importantes son: P. mirabilis (indol negativo) y P. vulgaris (indol positivo). Estos microorganismos son lactosa negativos y son productores de ureasa, factor de patogenicidad en la producción de infecciones urinarias ya que esta enzima desdobla a la urea (muy abundante en la orina) en amoníaco y dióxido de carbono. El amoníaco es tóxico para las células con lo que se produce la irritación del epitelio urinario, lo que desencadena una reacción inflamatoria. La alcalinidad alcanzada por la orina predispone a la litiasis urinaria. Ciertas cepas de P. vulgaris (OX19 y OXK) comparten determinantes antigénicos con algunas Rickettsias, por lo que los éstas cepas de Proteus sirven como antígeno para encontrar anticuerpos anti-Rickettsias en la llamada prueba de Weil-Felix:. Diagnóstico de laboratorio de infecciones extraintestinales A continuación se presenta un esquema del procesamiento de una muestra extraintestinal a partir de la cual se espera aislar una Enterobacteria. Orina, sangre, punción de heridas y abscesos, esputos, etc. ⇓ Examen en fresco y Coloración de Gram ⇓ Siembra en Agar E.M.B. o Mac Conkey y Agar sangre ⇓ Incubar 24 hs a 37ºC Coloración de Gram ⇓ Pruebas bioquímicas ⇓ Antibiograma Es conveniente incluir algún medio selectivo para bacilos gramnegativos como el Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) o Agar Mac Conkey, especialmente en aquellas muestras donde pueda aparecer flora acompañante. Luego de aislada la bacteria, la identificación se lleva a cabo mediante pruebas bioquímicas, de las cuales existe un elevado número para llegar a identificar el género y la especie. En la siguiente tabla se muestra el resultado de algunas pruebas bioquímicas para los géneros más frecuentes. Género

Fermentación de Lactosa

Movilidad a 35ºC

Producción de Ureasa

Utilización de Citrato

Producción de SH2

Escherichia Klebsiella Proteus Citrobacter Serratia Enterobacter

+ + + + +

+ + + + +

+ + -

+ +/+ + +

+ + -

Otras pruebas que se utilizan son producción de indol, descarboxilación de lisina y ornitina, prueba del rojo de metilo, producción de DNAsa, prueba de Voges-Proskauer, fermentación de azúcares, etc. Siempre debe realizarse un antibiograma una vez identificada la bacteria, ya que los miembros de esta Familia presentan resistencia muy variable a los antimicrobianos, pudiendo muchos de 3

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ellos, especialmente los recuperados a partir de muestras de pacientes hospitalizados, ser resistentes a múltiples antimicrobianos. Enterobacterias Patógenas Obligadas No forman parte de la flora normal y su presencia en la muestra es indicativa de infección. En esta categoría se incluyen los géneros Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia. Se transmiten de hombre a hombre por la vía ano-mano-boca o se adquieren a partir de aguas y alimentos contaminados. Producen infecciones intestinales excepto Salmonella que puede producir sepsis, neumonías, etc. Son la primer causa de muerte de etiología infecciosa en niños de países subdesarrollados. Escherichia coli diarreogénicas Se conocen diferentes categorías de E. coli capaces de producir diarrea, las cuales difieren en el mecanismo de patogenicidad. La diarrea se produce en relación a la ingestión de agua o alimentos contaminados con materia fecal. A continuación se resumen las características de cada una de ellas. E. coli entropatógena (ECEP o EPEC): Se adhiere a la célula epitelial del enterocito, produce destrucción del ribete en cepillo por reordenamiento del citoesqueleto, disminuyendo la superficie de absorción de agua. Esto da como resultado una diarrea del tipo acuosa. El diagnóstico se realiza estudiando el efecto sobre cultivos celulares. En la siguiente imagen se esquematiza este mecanismo de patogenicidad (FBP: unión de fimbrias a proteínas; eaeA y eaeB: proteínas de unión y lesión; ZO: zónula de oclusión)

E. coli enterotoxigénica (ECET): Una vez adherida al enterocito, produce una toxina termolábil (TL) y una termoestable (TS) que Diarrea activan la adenilato y guanilato ciclasa, respectivamente. Este mecanismo aumenta la secreción de cloruro y bicarboRibete en cepillo nato, a la vez que disminuyen la absorción de agua y electrolitos. El resultado es una diarrea acuosa de tipo coleriforEfecto sobre AMPc y GMPc me. Se puede diagnosticar detectando y otros la toxina en las heces o en los cultivos mediadores mediante técnicas de ELISA. En la figura de la izquierda se muestra el mecanismo de acción de ECET E. coli enteroinvasiva (ECEI): la bacteria se adhiere al enterocito, induce la captación por la célula intestinal (endocitosis inducida). Una vez internalizada se produce la lisis de las vacuolas y las bacterias liberadas se reproducen en el citoplasma, invaden células vecinas y producen lesión en el epitelio. Las bacterias que llegan a lámina propia son fagocitadas y esto trae como resultado la llegada de más cantidad de macrófagos al lugar. Todo este 4

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proceso da como resultado una materia fecal con sangre, moco y pus (disenteriforme). El diagnóstico debe hacerse mediante inoculación en cultivos celulares. En el siguiente esquema se detalla este mecanismo de patogenicidad. Disentería

Entrada

Leucocitos, sangre y moco

Endocitosis

Células del epitelio columnar del intestino

Muerte celular

Lisis vacuolar Multiplicación

Capilares Neutrófilos y macrófagos (fagocitosis9

Invasión del tejido superficial

E. coli enterohemorrágica (ECEH): la bacteria se adhiere a la célula intestinal y secreta una toxina denominada Shiga-like o Verotoxina la cual produce daño en los capilares dando como consecuencia una diarrea sanguinolenta. Esta bacteria también produce una hemolisina que destruye los glóbulos rojos y en aproximadamente un 6% de los niños infectados puede complicarse con Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) y Púrpura Trombocitopénica Trombótica (PTT). El serotipo que con mayor frecuencia se asocia a este mecanismo es E. coli O157:H7 y es endémica en nuestro país. Para diagnosticarla puede detectarse la verotoxina mediante ELISA en heces o a partir de un cultivo de la bacteria. También puede estudiarse la producción de hemolisina en agar sangre. Género Shigella Este género incluye 4 especies pertenecientes a 4 grupos serológicos O: Grupo A: S. dysenteriae Grupo C: S. boydii

Grupo B: S. flexneri Grupo D: S. sonnei

Las especies más frecuentes en nuestro país son S. flexneri (85%) y S. sonnei (14%). Estas bacterias son todas inmóviles. Producen diarrea relacionada con la ingestión de agua y alimentos contaminados con materia fecal, pudiendo transmitirse además de persona a persona por la vía ano-manoboca.. Luego de ingerida, la bacteria se adhiere al enterocito, induce la captación por la célula intestinal mediante reacomodamiento del citoesqueleto (endocitosis inducida). Una vez internalizada, la bacteria destruye la vacuola endocítica y se reproduce en el citoplasma, invade células vecinas y produce lesión en el epitelio Leucocito dando como resultado una materia Muerte del macrófago fecal con sangre, moco y pus (disenLiberación bacteriana teriforme). Secretan además la toxina Inflamación (IL-1β) Shiga, por lo que también pueden desencadenar un Síndrome Urémico

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Hemolítico. Aquí se esquematiza el mecanismo de patogenicidad de Shigella spp. (IL: interleucina; IpaB, IpaC: proteínas de invasividad, IcsA: proteínas activas sobre actina). Género Salmonella En este género se describen 2 especies: S. bongori y S. enterica. Dentro de la especie S. enterica están incluidas 6 subespecies: S. enterica, S. salamae, S. arizonae, S. houtenae, S. diarizonae, S. indica. Salmonella enterica subespecie enterica es la única descripta como patógena humana. Dentro de este género se encuentran más de 2000 serotipos teniendo en cuenta sus antígenos O, H y Vi. Los serotipos se denominan con letra mayúscula normal (no en redondilla) y generalmente indican el lugar del primer aislamiento. A fin de simplificar la nomenclatura, sólo se mencionan la especie y el serotipo, obviando la subespecie, por ejemplo S. enterica subespecie enterica serotipo Typhimurium se resume a: Salmonella Typhimurium. Los serotipos más frecuentes en nuestro país son Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis y Salmonella Agona. Estas bacterias no fermentan la lactosa, la mayoría de los serotipos son móviles y producen diarrea relacionada con la ingestión de alimentos contaminados con materia fecal, pudiendo dar complicaciones como sepsis, neumonías, abscesos, etc. Sus factores de patogenicidad son: 1) Invasividad: es una bacteria inminentemente enteroinvasora. Salmonella atraviesa el epitelio del intestino delgado pasando los tejidos subepiteliales de la mucosa y submucosa. 2) Endotoxina: fracción tres del lipopolisacárido de la pared celular. Se ha visto que actúa tanto en la fiebre tifoidea como en los casos de septicemias. 3) Antígeno Vi: solo está presente en Salmonella Tiphy, Salmonella Paratiphy C y Salmonella Dublin. Se relaciona con la sobrevida dentro de los macrófagos. 4) Enterotoxina: no es constante y sólo se la ve en algunos serotipos. La acción patógena de Salmonella puede dividirse en tres tipos de cuadros clínicos: Septicemias: principalmente en pacientes hospitalizados o inmunosuprimidos se producen septicemias graves cuyas lesiones metastásicas son los abscesos, osteomelitis, meningitis, endocarditis, etc. Gastroenteritis: Las salmonellas son invasivas. Se adhieren al enterocito, inducen la endocitosis, se multiplican en el interior de la vesícula endocítica y a partir de allí se diseminan hacia células vecinas. Como consecuencia de su acción se destruye el epitelio y llegan gran cantidad de polimorfonucleares, dando como resultado heces con moco y pus. Fiebres entéricas: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi B producen fiebre entérica. Las salmonellas se ingieren con el agua y alimentos contaminados. Desde la boca llegan al intestino delgado, atraviesan la mucosa intestinal y se alojan en las placas de Peyer y ganglios meséntericos, multiplicándose activamente durante unos doce días (que es el período de incubación). De los ganglios pasan al conducto torácico a través del cual llegan a la sangre. De la sangre pasan al bazo, médula ósea, hígado y vesícula biliar, desde donde llegan al intestino delgado. Diagnóstico de Fiebre Tifoidea – 1er semana: hemocultivo – 2da semana: hemocultivo y coprocultivo – 3er semana: urocultivo y mielocultivo Reacción de Widal: es una reacción de aglutinación directa con cepas de S. Typhi y S. Paratyphi A y S. Paratyphi B. Detecta anticuerpos contra los antígenos O y antígenos H. Se realiza mediante aglutinación en portaobjetos. Debe hacerse en la primer semana y repetir una semana después para ver variaciones de título. Títulos de Anti O > 1/80 son indicativos de infección actual.

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Género Yersinia Este género, antes llamado Pasturella, tiene tres especies importantes: 1) Yersinia pestis 2) Yersinia pseudotuberculosis 3) Yersinia enterocolítica Yersinia pestis es el agente etiológico de la peste. La peste es una zoonosis, o sea que la sufre un animal (la rata) y esta la trasmite al hombre por medio de las pulgas. La especie de pulga más importante es la Xenopsylla cheopis que adquiere la Yersinia al picar a un animal con bacteriemia y al picar a un hombre las inyectan con la sangre del animal enfermo. Se conocen tres formas clínicas de la peste: 1) Forma bubónica: es la forma más frecuente. La pulga pica generalmente en los miembros inferiores y al progresar por los linfáticos producen los típicos bubones (que son los ganglios inguinales infectados e infartados). La infección toma solamente un ganglio, el cual se hipertrofia y se hace doloroso. Además, puede supurar liberando un pus que contiene a las Yersinias. Si esta supuración no se produce, la enfermedad evoluciona hacia la forma septicémica de la peste.2) Forma septicémica: se manifiesta como una sepsis gravísima de tipo hemorrágico. Puede producirse como una forma primaria o bien ser secundaria a la forma bubónica. En muchos casos la evolución es fulminante. 3) Forma pulmonar: puede ser una forma primaria o secundaria a una forma bubónica. La forma primaria se debe a un contagio interhumano directo. Por los esputos de los enfermos se liberan las Yersinias y suele acompañarse de daño del SNC. Yersinia enterocolítica produce diarrea por enteroinvasión sobre todo en el colon. Al igual que la Y. pseudotuberculosis, es ureasa positiva (Y. pestis es ureasa negativa). Afecta sobre todo a niños, siendo más frecuente en invierno. La vía de transmisión es la fecal - oral. Se produce un compromiso ganglionar intenso. La complicación más grave es la septicemia aunque es poco frecuente. Diagnóstico de laboratorio de las infecciones intestinales La muestra debe ser materia fecal recién emitida, la cual se debe transportar en un frasco estéril de boca ancha o pueden seleccionarse las porciones más patológicas con un hisopo y remitirlas en medio de transporte. Materia fecal ↓ Examen en fresco y Coloración de Gram ↓ Siembra en Agar E.M.B. o Mac Conkey y Agar SS ↓ Incubar 24 hs a 37ºC Pruebas bioquímicas ↓ Identificación serológica ↓ Antibiograma Siempre deben sembrarse medios selectivos como Agar E.M.B. o Agar Mac Conkey y Agar Salmonella-Shigella ya que en materia fecal siempre hay gran número de bacterias acompañantes. Para más detalles acerca del procesamiento de estas y otras muestras, se recomienda consultar la Guía de Trabajos Prácticos. Luego de aislada la bacteria, la identificación se lleva a cabo mediante pruebas bioquímicas, de las cuales existe un elevado número para llegar a identificar el género. En la siguiente tabla se muestra el resultado de algunas pruebas bioquímicas para los géneros enteropatógenos.

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Género Escherichia Shigella Salmonella Yersinia

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Fermentación de Lactosa

Movilidad a 35ºC

Producción de Ureasa

Utilización de Citrato

Producción de SH2

+ -

+/+ -

+

+ -

+ -

Otras pruebas que se utilizan son producción de indol, descarboxilación de lisina y ornitina, prueba del rojo de metilo, producción de DNAsa, prueba de Voges-Proskauer, fermentación de azúcares, etc. A continuación se muestran algunas imágenes de cultivos en medios selectivos y pruebas bioquímicas para la identificación de Enterobacterias. La identificación serológica es útil para subtipificar cepas de E. coli, Salmonella y Shigella, en algunos casos para determinar la especie y el serotipo y en otros casos para estudios epidemiológicos. Si bien el tratamiento con antibióticos de las diarreas se limita a pacientes con enfermedades de base e inmunocomprometidos, debe realizarse un antibiograma porque estas bacterias presentan resistencia variable frente a los antimicrobianos.

Cultivo en Agar Mac Conkey Colonias Lactosa Colonias Lactosa negativa positiva

Sin Sembrar

Lac +

Lac + Gas +

Lac SH2 +

Diferentes reacciones en el medio Triple Azúcar Hierro (TSI)

SH2

Urea

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Citrato