LABORATORIO No.1 ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO INTRODUCCIÓN Desde los inicios de la microscopia, los investigadores vienen desarrollando métodos cada vez más sensibles, eficaces y con mejor resolución. Al principio ellos debieron enfrentarse a los problemas de aberraciones ópticas, imágenes borrosas y pobre desarrollo de lentes, los cuales se mantuvieron hasta mediado del siglo XIX que aparecieron los lentes objetivos que reducían la aberración cromática con una apertura numérica entre 0.65 y 1.25. Estos avances se iniciaron con los reportes sobre los métodos de iluminación que propuso el profesor August Kölher, en 1893, y que sentaron las bases de la microfotografía moderna. En las últimas décadas se ha incrementado la aplicación de la microscopía óptica en los laboratorios de investigación de una amplia variedad de disciplinas como la biología celular y molecular, microbiología, inmunología y virología. El rápido desarrollo de diferentes métodos como los de fluorescencia, contraste de fases, confocal y de campo oscuro entre otros, que sumados a los avances en la digitalización y análisis de imágenes, han permitido a los microscopistas obtener resultados rápidos, cuantificables y confiables de una gran variedad de especimenes biológicos. Al margen de estos avances, las bases del funcionamiento de los distintos tipos de microscopios ópticos siguen siendo los mismos que se presentan en esta práctica y con los cuales el estudiante deberá familiarizarse. BREVE HISTORIA DEL MICROSCOPIO Tres eminentes holandeses, Antón Van Leeuwenhoek, Hans y Zaccharias Janssen, fabricantes de lentes, contribuyeron al desarrollo de la microscopía. El museo de Middleburg, en

Holanda, conserva uno de los primeros microscopios conocidos, probablemente fabricado por uno de los hermanos Janssen. Estos aparatos, eran extremadamente simples, por lo que solo permitían el examen de cuerpos opacos. A fines del siglo XVII el italiano Camping construyó un microscopio que hizo posible la observación de preparaciones transparentes. Las imágenes obtenidas por estos microscopios eran muy deficientes. En Inglaterra el científico Robert Hooke, trató de construir lentes más eficaces, pero sus resultados no fueron satisfactorios; sin embargo, sus observaciones contribuyeron al establecimiento de la microscopía como ciencia. Mientras, en el siglo XVII Jonh Marshall y otros fabricantes de microscopios, perfeccionaron mucho el diseño mecánico, pero no la calidad de los lentes. Pero fue, durante el siglo XIX, que se realizaron grandes progresos en los sistemas ópticos y en la microscopía en general; aún así, fue imposible evitar la dispersión de la luz en sus colores componentes en la fabricación de microscopios. Este fenómeno conocido como aberración cromática, producía una imagen borrosa y coloreada. Las primeras lentes adecuadamente corregidas para microscopios, denominadas acromáticas, hicieron su aparición alrededor de 1830; pero la aberración esférica, también producía una imagen desenfocada. En 1886, Ernot Abbe y Caol Zeiss en Alemania fabricaron unas lentes apocromáticas que corrigieron ambas aberraciones. A finales del siglo XIX, los microscopios comenzaron a adquirir la forma que tienen actualmente, con los aportes de Khöler. Desde el año 1900, los microscopios se han modificado poco en sus principios fundamentales, pero mucho en sus

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detalles. Estos perfeccionamientos incluyen, la incorporación de varios objetivos, cada uno de aumento diferente y roscados a un tambor giratorio o revolver. En 1935, Frizt Zenique inventó la técnica del contraste de fase que hace posible la observación de especimenes antes invisibles. El microscopio electrónico, desarrollado en vísperas de la segunda guerra mundial, ha sido de gran utilidad para el estudio de moléculas químicas, virus y organelas celulares. Existe un tipo de microscopio electrónico, llamado de barrido, que ha adquirido una extraordinaria utilidad, ya que ofrece representaciones tridimensionales muy reales de las células y las estructuras celulares.

1.1 OBJETIVOS: 1.1.1 OBJETIVO GENERAL: • Valorar la importancia del microscopio como instrumento básico para el estudio e investigación en las Ciencias Biológicas. 1.1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS: • Identificar las diferentes partes que constituyen el microscopio y reconocer las funciones de cada una de ellas • Adquirir habilidad en el uso y manejo correcto del microscopio, siguiendo las indicaciones de las guías de laboratorio. 1.2 MATERIALES Microscopios Porta-objetos y cubre-objetos Papel limpia lentes Goteros Hilos de lana y algodón Flores con polen

1.3 CLASES DE MICROSCOPIOS: Existen dos tipos de microscopios: simples y compuestos Microscopios simples : Consta de un solo sistema de lente Microscopios compuestos: Constan de dos (2) sistemas de lentes: el objetivo y el ocular. El microscopio compuesto es un instrumento que aumenta considerablemente la imagen de los objetivos que en él se observan. Entre las variedades de éste microscopio encontramos el electrónico y el fotónico u óptico. Este último tipo de microscopio está formado por una parte mecánica y una parte óptica. (Figura No.1.1) Parte Mecánica: a. Pie o Base: Generalmente en forma de herradura o rectangular, es el apoyo de las demás piezas del microscopio. El pie debe ser sólido y pesado para asegurar su estabilidad. b. Columna o Brazo: Este elemento relaciona el tubo del microscopio con el pie; sostiene la platina y el condensador y de ella se agarrará el microscopio cuando se traslada durante los trabajos. En algunos microscopios la columna es móvil

Figura No.1.1 Microscopio Óptico Para observar imágenes de las diferentes partes del microscopio haz clic aquí

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c. Tubo del Ocular: Está colocado en la parte superior del microscopio, donde están acoplados los oculares, que pueden tener movimiento vertical, con ayuda de una cremallera sobre la columna. En algunos microscopios el tubo del ocular es inclinado y se mantiene fijo, en este caso se mueve la platina. d. Revólver o Disco Giratorio: Está debajo del tubo ocular donde están acoplados los objetivos, presenta movimiento giratorio para facilitar el cambio de un objetivo a otro. e. Platina: Es una placa que puede ser cuadrada, circular o rectangular, con un orificio central que permite el paso de la luz a través de ella. Su función es sostener las placas con los preparados biológicos que se van observar f. Carro: es un dispositivo ubicado sobre la platina, cuya función es sujetar y mover la placa que se va a estudiar. Posee dos tornillos que permiten movimientos horizontales (hacia adelante, hacia atrás, hacia la derecha y hacia la izquierda) del portaobjeto. Cuando la platina carece del anterior dispositivo, lleva dos soportes para fijar las placas llamadas ganchos o uñas. g. Mecanismos de Movimiento: Está integrado por el tornillo macrométrico y el micrométrico Tornillo Macrométrico: Acerca o aleja rápidamente el objetivo del preparado a observar; su función es lograr un enfoque más o menos claro o aproximado del objeto. Tornillo Micrométrico: Acerca o aleja el objetivo del preparado, pero lentamente, casi imperceptiblemente, permite desplazamientos muy finos de la platina o del tubo del ocular. Durante la observación y enfoque este tornillo debe estarse moviendo permanentemente; su función es darle nitidez al enfoque.

Parte óptica: Esta integrada por los objetivos, oculares y el aparato de iluminación (espejo, diafragma, condensador y filtros). Estos elementos son los que permiten la iluminación, ampliación y la visión aumentada del objetivo. a. Objetivo: Es la pieza más importante del microscopio. Ellos se acoplan mediante roscas estándar al revólver y pueden ser cambiados de posición con sólo rotarlos. Reciben el nombre de objetivos porque son los lentes que están más cerca del objeto. La mayoría de los microscopios tienen tres o cuatro objetivos. Las lentes de los objetivos son de aumentos diversos, los más usados son: Objetivos de pequeños aumentos 3.5x; 4x, 5x, 6x, 8x y 10x; objetivos de grandes aumentos 40x, 45x, 50x y objetivos de inmersión 90x, 95x y 100x. Las lentes de inmersión se emplean con aceite de inmersión para conectar la lente frontal (lente inferior del objetivo) al porta-objeto. Entre el objetivo y el objeto se produce una pérdida de luz por reflexión que se corrige adicionando al preparado unas gotas de aceite de cedro (aceite de inmersión) cuyo índice de refracción 1.515, es próximo al cristal. Este aceite también reduce o suprime por completo la refracción de los rayos de luz provenientes de la fuente luminosa.

Figura No. 1.2 Especificaciones de los objetivos.

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b. Ocular: Están colocados en la parte superior del tubo ocular. Está formado por dos sistemas de lentes dispuestos de un cilindro. Su finalidad es aumentar la imagen dada por el objetivo y eventualmente corregir algunos defectos de la misma. Reciben dicho nombre porque son las lentes que se encuentran más cerca del ojo. Hay oculares de 3.5x; 5x; 6,3x; 10x; 12.5x; 15x; 20x y 25x. El aumento de la imagen de un objeto observado a través de un microscopio, se calcula multiplicando el número de aumento del objetivo con el cual se está trabajando por el número de aumento del ocular que se está utilizando. c. Aparato de iluminación: Está conformado por la fuente de luz, el diafragma, el condensador y los filtros. d. Fuente de luz: Puede ser natural o artificial, cuando es natural (solar) o procede de un foco luminoso situado fuera del microscopio, un espejo recoge la luz del medio y la refleja a través del objeto y del sistema de lentes. La luz artificial la constituye generalmente un bombillo ubicado en el microscopio y conectado a un circuito eléctrico de bajo voltaje. e. Diafragma: Está ubicado entre la fuente de luz y el condensador, inmediatamente debajo de la platina, su función es regular la intensidad de luz que atraviesa el objeto. El diafragma tiene una palanquita que al moverla hacia delante o hacia atrás agranda o achica el orificio central, dejando pasar mayor o menor cantidad de luz respectivamente. f. Condensador: Es un elemento cónico que posee un sistema de dos lentes convergentes que recogen o concretan los rayos luminosos para enviarlos al objetivo por el agujero de la platina. Existe un tornillo manual que permite guardar la altura del condensador. Esta graduación es importante cuando se trabaja con objetivos de gran aumento (40x, 100x), ya que en la medida que se trabaja con éstos objetivos el condensador debe subirse. Lo contrario

sucede cuando se trabaja con objetivos de menor aumento (4x, 10x). g. Filtros: Entre la fuente de luz y el condensador de algunos microscopios existe un portafiltros en el cual se puede colocar filtros a voluntad del observador. Los filtros son elementos de cuarzo o de vidrio, pueden ser de color azul, amarillo o verde. Ellos interceptan el haz de rayos luminosos antes de entrar al condensador, esto se hace con el objeto de seleccionar un tipo de luz determinada para una experiencia dada. Para observar imágenes de filtros haz clic aquí.

1.4 LA LUZ: La luz es una forma de energía transportada continuamente por el espacio a velocidades muy elevadas (330.000 Km/s en el vacío). La luz está formada por pequeños corpúsculos que salen de un foco luminoso en forma de ondas. El brillo de la luz es proporcional a la altura o amplitud de la onda y su color depende de la longitud de ésta. La luz blanca está constituida por una gama de colores del espectro visible, éstos colores son: rojo, anaranjado, amarillo, verde, azul y violeta. Cada color corresponde a una longitud de onda determinada, por consiguiente, la luz blanca se compone de muchos rayos de luz, todos vibrando con diferentes longitudes de onda. (Figuras 1.3 y 1.4).

Figura No.1.3. Naturaleza Ondulatoria de la Luz

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La luz de una sola longitud de onda se llama monocromática. Si bien se utilizan casi solo microscopios de luz blanca, la mayoría de las lentes modernas están diseñadas para el uso de luz monocromática verde.

Figura No.1.4. Espectro de Luz Visible 1.5 LENTES: Las lentes son el componente más importante del microscopio; se fabrican de vidrio u otros materiales transparentes. Pueden ser convexas o cóncavas en ambas superficies, planas en una cara o tener cualquier combinación de éstas dos formas en su superficie. Las lentes son de dos tipos: positivas y negativas. Lentes Positivas: Hacen converger los rayos de luz, es decir, los concentra para formar una imagen real. Lentes Negativas: Hacen divergir los rayos de luz, sin formar ninguna imagen real. 1.6 PREPARACIONES MICROSCÓPICAS: Debemos tener en cuenta que a través del microscopio solamente se pueden observar objetos que dejan pasar rayos de luz, por esta razón el preparado debe ser lo más delgado y transparente posible, pues un preparado grueso solo nos permite observar una mancha negra.

Los detalles solo se observan si la preparación es lo suficientemente delgada para que sea transparente con la luz que recibe. Para realizar preparaciones microscópicas los porta y cubre-objetos deben limpiarse antes de usarse. Un buen método es guardarlos en alcohol y antes de utilizarlos secarlos con un paño limpio y libre de grasa. Los cubre-objetos deben limpiarse con mucho cuidado porque son frágiles. Las preparaciones microscópicas pueden ser acuosas o en seco. Las preparaciones acuosas son las más simples y fáciles usadas para examinar cualquier objeto fluido, como agua de estanque o sangre. Se deposita una gotita del líquido que se desea observar en el centro del porta-objeto, se coloca el cubreobjeto sobre el porta, forme con las dos láminas un ángulo de 45 grados y luego deje caer suavemente la laminilla cubre-objeto sobre el preparado, evitando la formación de burbujas. Figura No.1.5. El líquido no debe rebosar los bordes del cubre-objeto, en caso de que suceda seque cuidadosamente el líquido sobrante usando papel absorbente o papel toalla. La preparación queda así lista para la observación. Estas preparaciones son de corta duración porque se secan rápidamente; para hacerlas más duraderas debe cerrarse herméticamente los bordes del cubre objeto; la duración de ésta preparación no es indefinida. Los bordes se pueden cerrar con vaselina o esmalte. Un cierre más hermético se consigue cerrando con bálsamo de Canadá (Euparal). Las preparaciones en seco como lo índica su nombre, se hacen para observar objetos secos, tales como alas de insectos. Aquí se utiliza goma arábiga, la cual se extiende sobre el porta, luego se deposita el objeto sobre la superficie y se deja endurecer la

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goma. Una vez endurecida la goma se pone un poco de bálsamo de Canadá sobre el objeto y se coloca el cubreobjeto.

Figura No.1.5. Preparaciones Acuosas 1.7 COLORANTES : Los colorantes son sales compuestas por un ácido y una base. Se clasifican en ácidos, básicos y neutros, según la parte de los mismos que imparta el color. En los colorantes ácidos el grupo cromóforo, el que imparte el color, es el componente ácido, el componente básico es incoloro. Lo contrario sucede con los colorantes básicos. Los colorantes neutros tienen coloreado el componente ácido y el básico. La mayoría de los colorantes son sintéticos, aunque se emplean todavía algunos naturales. La hematoxilina y el carmín son los colorantes naturales más importantes para la tinción de tejidos. El carmín es producido por la conchinilla (Coccus cacti). La hematoxilina se extrae de la madera de un árbol de México, el palo Campeche. Otro colorante es la orceína que se extrae de líquenes. Existen tres técnicas de tinción de uso general: la coloración seca o de tejidos muertos, la coloración vital o de tejidos vivos y la histoquímica, en la cual se utilizan las reacciones de los colores para hacer visible los elementos estructurales de las células y de los tejidos. Una reacción histoquímica muy conocida es la de Feulgen, en la

que se emplea el reactivo incoloro de Schiff par teñir el DNA en tonos rojizos purpúreos. (Figura 1.6)

Figura No.1.6. Colorantes. Haz clic aquí.

1.8 MANEJO DEL MICROSCOPIO: Antes de iniciar una observación microscópica se debe iluminar completamente el campo visual, para lo cual se procede de la siguiente manera: 1. Gire el revólver hasta que el objetivo de menor aumento quede en posición de trabajo, o sea que quede alineado con los oculares. Usted sentirá un golpecito (como un clic) cuando el objetivo llegue a su posición de uso. 2. Lleve el condensador a su posición más alta. 3. Accione el tornillo macrométrico hasta que el objetivo de menor aumento descienda lo máximo posible o hasta que la mesa ascienda lo máximo posible, según sea el modelo del microscopio. Esta operación se hace llegar hasta un punto de parada (tope). 4. Mire a través del ocular o gire el espejo hacia la fuente de luz hasta obtener un máximo de iluminación. Si el campo visual no queda uniformemente iluminado, baje lentamente el condensador hasta obtener una iluminación uniforme. Si su microscopio es eléctrico siga los pasos 1, 2 y 3. Enchufe el cable del transformador a la fuente de energía.

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Conecte el cable del microscopio al transformador y luego accione el botón de éste para que encienda la bombilla. Mire por el ocular. 5. Una vez lograda una correcta iluminación coloque el preparado sobre la platina. Mirando de lado, asegúrese que el objeto a observar esté centrado justo debajo del objetivo de menor aumento. 6. Mirando a través del ocular mueva suavemente el tornillo macrométrico, si el objeto está bien centrado aparecerá su imagen en el campo visual. Déle nitidez al enfoque accionando el tornillo micrométrico. Mueva el carro en diferentes direcciones para seleccionar el mejor campo posible. Puede controlar la intensidad de la luz, mediante el diafragma o el regulador de la intensidad de la luz de la bombilla. Para hacer un enfoque con mayor aumento debe seguir las indicaciones anteriores. Una vez obtenido el enfoque correcto con menor aumento, mueva el revolver y coloque en posición de trabajo el objetivo de mayor aumento. Si su microscopio está bien calibrado debe aparecer enfocada la imagen del objeto. Este enfoque se refina accionando el tornillo micrométrico. Cuando el microscopio es monocular debe acostumbrarse a mantener también abierto el ojo que no utilice en la observación microscópica, esto le evita cansancio.

1.9 RECOMENDACIONES QUE DEBEN OBSERVARSE PARA EL BUEN USO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO: 1. El microscopio es un instrumento costoso y de precisión, con muchas partes delicadas, por lo tanto, debemos darle el mejor cuido posible. 2. Si su Microscopio presenta algún defecto, consulte con su profesor. No trate de arreglarlo Usted. 3. Las lentes del microscopio cuestan casi tanto como todas las demás partes

juntas. Mantenga las lentes limpias. No toque las lentes con los dedos, ya que el sudor las daña. Nunca limpie las lentes con otra cosa que no sea papel especial para lentes. 4. No permita que líquidos, especialmente ácidos o alcoholes, se pongan en contacto con su microscopio. 5. Use siempre cubre-objetos cuando observe en agua u otros líquidos 6. Localice siempre el objeto con el objetivo de menor aumento 7. Los sedimentos de grasa, el aceite de inmersión y los residuos de éstos productos deben eliminarse inmediatamente con un poco de disolvente como éter o xilol. Nunca se debe emplear alcohol, ya que disuelve el cemento utilizado en la fabricación de los lentes. La limpieza final es más efectiva usando un poco de agua destilada. 8. Cuando no se esté usando el microscopio, debe mantenerse siempre cubierto con una funda. 9. Al finalizar sus actividades de laboratorio, tenga en cuenta lo siguiente: 9.1 Antes de apagar la fuente de luz, llevar el dispositivo que regula la intensidad luminosa hasta O (cero). 9.2 Dejar el microscopio con el objetivo de menor aumento en la posición de enfoque y la platina en su máxima posición superior. 9.3 Desenchufar el microscopio y colocarle la funda protectora.

2.0 EJERCICIO DE APLICACIÓN: Con las siguientes prácticas se ejercitará inicialmente al estudiante en el uso y manejo del microscopio. 1. Fibra de lana o algodón: Coloca varias fibras de lana o algodón de diferentes colores sobre un portaobjetos, coloque el cubre-objetos, enfoque con menor y mayor aumento. Esquematice sus observaciones.

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2. Granos de polen: Coloque granos de polen del estigma de una flor en un porta-objetos, con ayuda de un gotero ponga una gota de agua, ubique el cubre-objetos y observe con menor y mayor aumento. Haga un esquema de lo observado.

3.0 CUESTIONARIO: 1. Coloque los nombres a las diferentes partes del microscopio numeradas en la Fig. No. 1.6 e investigue las funciones de cada una de ellas. 2. ¿Qué otros tipos de microscopios se utilizan en la investigación biológica? 3. ¿Qué son objetivos secos? 4. ¿Qué son objetivos de inmersión? 5. Para qué se utiliza el aceite de cedro, cuando usamos el objetivo de inmersión? Cuando se utiliza un microscopio de espejo: 6. ¿Qué importancia tiene utilizar la parte cóncava del espejo? 7. ¿Qué importancia tiene utilizar la parte plana del espejo? 8. Investigue sobre el funcionamiento de los diferentes microscopios electrónicos y establezca diferencias entre ellos. 9. Describa las principales técnicas de preparación de muestras empleadas en microscopía óptica. 10. ¿Qué son los colores complementarios y que utilidad tendrían en microscopía óptica.

3.1 ENLACES http://tq.educ.ar/tq03027/tipos.htm

:

Como usar el microscopio, tipos, generalidades http://www.itg.uiuc.edu/technology/at las/: Página con atlas de imágenes •

obtenidas en diferentes tipos de microscopios. Retornar a tabla de contenido

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FIGURA 1.6 EL MICROSCOPIO ÓPTICO

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GALERIA DE IMÁGENES 1. LAS PARTES DEL MICROSCOPIO 1.1 OCULARES

1.5 CONDENSADOR

1.2 OBJETIVOS Y REVOLVER

1.6 TORNILLOS

1.3 PLATINA Y CARRO

1.7 BRAZO

1.4 DIAFRAGMA

1.8 LA IMAGEN

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2. FILTROS 2.1 FILTROS POLARIZADORES

3. TINCIÓN DE MUESTRAS

2.2 FILTROS MONOCROMATICOS

2.3 UBICACIÓN DE LOS FILTROS

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2.4 COLORES COMPLEMENTARIOS

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