Diagnóstico Veterinario de Laboratorio Dr. Claudio Pidone • •

Diagnóstico clínico = diagnóstico presuntivo. Diagnóstico de laboratorio = diagnóstico de certeza.

Clasificación: a) Métodos directos: detectan al AGENTE CAUSAL Ejemplos: Aislamiento Detectar antígenos (ejemplos: inmunofluorescencia, inmunohistoquímica) Detectar ácido nucleico (ejemplos: PCR, hibridización de ácidos nucleicos) b) Métodos indirectos: detecta la RESPUESTA DEL ORGANISMO Inmunidad humoral (anticuerpos) (ejemplos: seroneutralización, inhibición de la hemaglutinación). Inmunidad celular (Ejemplo: prueba de la tuberculina) Aislamiento Bacteriología: en medios de cultivos bacteriológicos (Ejemplo: agar sangre, agar MacConkey). Micología: en medios de cultivos micológicos (Ejemplo: medio de Sabouraud). Virología: en cultivos experimentación.

celulares,

huevos

embrionados

o

animales

de

Características: Muestras: órganos, secreciones, excreciones, etc. Ventajas: específico, verdadero diagnóstico de certeza. Desventajas: el sustrato o medio puede sufrir contaminaciones, el tiempo de desarrollo o de cultivo a veces puede ser prolongado. Tiempo: depende del agente en estudio. Por ejemplo, las colonias de Escherichia coli desarrollan en 24-48 hs, las de Brucella en 6-7 días y las de Mycobacterium en 3-6 semanas. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

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La PCR, por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular. El molde puede ser ADN o ARN previamente transformado en ADNc mediante transcripción reversa (RT-PCR). El proceso se basa en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas, en un aparato denominado “termociclador”. La muestra primero se calienta hasta lograr la separación de las hebras de ADN (desnaturalización); luego la temperatura se reduce para permitir el “apareamiento” de dos cadenas cortas de nucleótidos (oligonucleótidos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Estos oligonucleótidos se sintetizan en el laboratorio, se denominan primers y son complementarios al tramo de ADN al que deben unirse. Luego, una ADN polimerasa sintetiza ADN complementario al molde en el espacio comprendido entre los primers (extensión). El resultado final es la amplificación geométrica de ese segmento de ADN delimitado por los primers. Responde a la fórmula X.2n, donde x = cadena de ADN y n = número de ciclos. •

Componentes de la reacción: ADN molde ADN polimersa (TAQ polimerasa): enzima catalizadora de la reacción Primers (o iniciadores) Dexosidonucleósidos trifosfato: son los “ladrillos” con los cuales se sintetiza el nuevo ADN.

Finalizado el proceso, el tamaño del fragmento amplificado puede determinarse sometiendo los productos de la reacción a una electroforesis en gel de agarosa; y la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridación con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases esté contenida en el fragmento de interés. Existen diferentes tipos de PCR, como el Nested PCR, RT-PCR, o Multiplex PCR. Características: Muestras: cualquier sustancia o tejido. Ventajas: técnica muy sensible y específica, rápida, permite detectar organismos no cultivables o no viables, permite diferenciar cepas vacunales de cepas de campo. Desventajas: su sensibilidad puede ser un problema si no hay una correcta interpretación de los resultados obtenidos (generación de resultados 2

falsamente positivos). Puede no haber a la venta el kit comercial que necesitamos. Tiempo: horas. Dada su gran sensibilidad, la posibilidad de contaminación de la muestra es uno de los principales problemas de la técnica. Por ello, existen muchas medidas para evitar las contaminaciones, como la separación física de las áreas pre y post PCR o el uso de tips de micropipeta con filtros resistentes a aerosoles, uso de cabinas de flujo laminar y cambio frecuente de guantes. Es fundamental el uso de controles negativos a lo largo de todo el proceso para detectar los posibles falsos positivos. Usos: Diagnóstico de enfermedades infecciosas Diagnóstico de enfermedades genéticas Estudios de medicina legal: estudios de paternidad o filiación, investigación de casos de abuso sexual, identificación de cadáveres, etc. Inmunofluorescencia (IF) Esta técnica se basa en la capacidad de los anticuerpos de unirse específicamente a los correspondientes antígenos. Esta reacción es visible, por ejemplo, si el anticuerpo está marcado con una sustancia que absorbe o emite luz .En la IF se utiliza como marcadores algunos compuestos fluorescentes que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de onda visible. Características: Muestras: tejido o improntas de tejido, cultivos celulares infectados, etc. Ventajas: el resultado se obtiene en horas. Desventajas: requieren microscopios ópticos especiales (microscopios de inmunofluorescencia), es una técnica poco específica y sensible, se requiere entrenamiento y pueden haber diferencias de interpretación entre los distintos laboratorios. Tiempo: horas Ejemplos de enfermedades que se diagnostican con esta prueba: Peste porcina clásica, Mancha, Rabia. Inmunohistoquímica (IHQ)

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Esta técnica se basa en la capacidad de los anticuerpos de unirse específicamente a los correspondientes antígenos. Esta reacción es visible, por ejemplo, si el anticuerpo está marcado con una sustancia que produce coloración. En la IHQ se utilizan como marcadores enzimas que son capaces de hacer cambiar de color a un sustrato incoloro. Características: Muestras: tejidos (incluso embebidos en parafina). Ventajas: no requieren del uso de microscopios especiales (utilizan microscopio óptico de campo claro), mantienen adecuadamente la morfología del tejido y la tinción no se pierde con el paso del tiempo. Desventajas: entrenamiento, costo. Tiempo: 24-48 horas ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Es una técnica inmunológica de gran sensibilidad y especificidad que se utiliza para detectar tanto antígenos como anticuerpos. Se basa en la gran capacidad de reacción del complejo enzima-antígeno que se une específicamente con un anticuerpo para formar un compuesto coloreado. La técnica tiene enorme cantidad de variantes y básicamente consiste en la adición secuencial de una serie de reactivos, separados por etapas de lavado. • Componentes de la técnica: 1) Fase sólida: en general se utilizan microplacas de poliestireno, como aquellas de 96 pocillos. En cada uno de ellos se fijará el antígeno o el anticuerpo, según el caso. 2) Antígeno (o anticuerpo): se adsorbe a la fase sólida. 3) Incubación y lavado: para permitir la unión antígeno - anticuerpo, primero, y para eliminar todo lo que no se ha unido, después. 4) Conjugado: es un anticuerpo conjugado con una enzima que debe tener un sustrato cromogénico sobre quien actuar. 5) Cromógeno 6) Lectura: se comparan las densidades ópticas en cada pocillo en relación a un patrón. Podría hacerse a ojo desnudo, pero lo mejor, más preciso y más utilizado para ello son los espectrofotómetros, ya sean manuales o automáticos, siendo estos últimos los reconocidos y modernos lectores de Elisa. Características: Muestras: suero u otros materiales líquidos. 4

Ventajas: permite la automatización y el procesamiento de muchas muestras a la vez, no requiere de esterilidad. Desventajas: no existen kits comerciales para todas las enfermedades. Tiempo: horas. ELISA diferencial: es un tipo de Elisa especial que permite diferenciar animales infectados de animales vacunados. Ejemplo: el Elisa aprobado por SENASA para el diagnóstico de la Enfermedad de Aujeszky. Cada vez son más las enfermedades infecciosas que se diagnostican con este método. Seroneutralización o Virusneutralización La seroneutralización viral se define como la pérdida de la capacidad infectante de un virus por la reacción del mismo con un anticuerpo específico presente en un suero. El grado de neutralización se calcula según el porcentaje de reducción de los efectos del virus en estudio sobre el hospedero elegido (muerte, signos, efecto citopatogénico, etc.). Esta técnica permite la identificación de un virus (incluso un serotipo) o un anticuerpo, así como también determinar el título de anticuerpos de un suero problema- La técnica tiene dos variables: a) suero variable - virus constante; b) suero constante - virus variable. Los anticuerpos neutralizantes frecuentemente se detectan durante toda la vida del animal que oportunamente se ha infectado. Características: Muestras: suero. Ventajas: muy específico. Desventajas: requiere de esterilidad y, como emplea cultivos celulares, de un laboratorio de virología. Tiempo: depende de varios factores (tipo de virus, título viral, etc.), por lo menos 48-72 hs Ejemplos de enfermedades que se diagnostican con esta prueba: Encefalomielitis equina, Rinotraqueítis infecciosa bovina, arteritis viral equina. Inhibición de la hemaglutinación (IHA)

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Se denomina hemaglutinación (HA) a la capacidad que presentan algunos virus de aglutinar los glóbulos rojos de distintas especies animales. Esto propiedad se aprovecha para titular una suspensión viral que aglutinará un número conocido de eritrocitos. Es una técnica poco sensible: se necesitan muchas partículas virales para poder visualizar la reacción, por eso cuando se titula el suero se diluye sólo en base 2 (1:2, 1:4, 1:8, etc.). La inhibición de la hemaglutinación (IHA), por su parte, es la capacidad de un suero de inhibir la acción de un virus con capacidad hamaglutinante, por acción directa de anticuerpos específicos presentes en él. Es un procedimiento que sirve para identificar virus hemaglutinantes. Características: Muestras: suero. Ventajas: muy específico. Desventajas: poco sensible. Tiempo: horas. Ejemplos de enfermedades que se diagnostican con esta prueba: parvovirosis, enfermedad de Newcastle, influenza equina. Inmunodifusión Es un método de estudio basado en la difusión de un antígeno y un anticuerpo en un gel, generalmente agar, con la subsiguiente formación de un inmunoprecipitado en el caso de que el anticuerpo sea específico para el antígeno en cuestión. Existen muchos tipos de técnicas de inmunodifusión, como la Difusión simple monodimensional o Técnica de Oudín, la Difusión simple bidimensional, la Doble difusión bidimensional o Método de Outcherlony y la Difusión radial. Características: Muestras: suero. Ventajas: técnica específica, económica, de desarrollo simple y fácil de estandarizar. Desventajas: el diagnóstico se obtiene recién en 72 hs. Sensibilidad relativa si se compara con otras técnicas. Tiempo: 72 hs. Ejemplos de enfermedades que se diagnostican con esta prueba: Anemia infecciosas equina (Test de Coggins), Leucosis bovina, Brucelosis canina, Brucelosis ovina. 6

Aglutinación La aglutinación es un fenómeno en el que las bacterias o las células en suspensión en un líquido precipitan cuando se añaden anticuerpos; éstos se unen a sus antígenos y originan complejos del tipo células-antígenos-anticuerpos en forma de grumos visibles a simple vista. Características: Muestras: suero, leche. Ventajas: técnica rápida, sencilla. Desventajas: poco específica. Tiempo: horas. Ejemplos de enfermedades que se diagnostican con esta prueba: Brucelosis bovina (BPA). Otras técnicas de diagnóstico de laboratorio o o o o o o o o o o o

Hibridización de ácidos nucleicos Polarización fluorescente Fijación de complemento Bacterioscopía Western Blott Southern Blott Dot Blott Secuenciación de ácidos nucleicos Microscopía electrónica Hemoadsorción Radioinmunoensayo (RIA)

A tener en cuenta: No es lo mismo el diagnóstico individual que el diagnóstico poblacional. El aislamiento, por ejemplo, es un claro ejemplo de un diagnóstico individual (por ejemplo, el aislamiento de un agente a partir de un aborto); los estudios serológicos, en cambio, en general son un buen ejemplo de un diagnóstico de tipo poblacional, en donde lo que se busca es conocer el estado sanitario de un grupo de animales y no de un sólo individuo. Seroconversión: se define como seroconversión al aumento del título de anticuerpos detectado en dos muestras de suero del mismo animal (muestras pareadas), tomadas con un intervalo de aproximadamente 14 días.

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Detectar la presencia de anticuerpos en un suero significa infección, pero detectar seroconversión significa infección "activa".

Tipificación o caracterización Luego de identificado el agente causal de una enfermedad se puede requerir la tipificación o caracterización del agente, es decir, ir más allá del género y especie y determinar su tipo, su serovariedad o detectar sus características particulares. Ejemplos de técnicas empleadas: Enzimas de restricción (REA) Las enzimas de restricción son endonucleasas que cortan el ADN de doble cadena cuando reconocen un patrón de secuencia específico. Generan fragmentos de ADN conocidos como fragmentos de restricción, y el tipo de éstos dependerá del sitio de corte de la enzima. Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales son producidos por hibridomas y son exactos en su unión al epítope diana. El uso de monoclonales es apto para aplicaciones donde la unión a la diana exacta es necesaria para evitar falsos positivos.

También se puede tipificar o caracterizar empleando algunas de las técnicas diagnósticas que también sirven para la identificación. Por ejemplo, la serovariedad de Salmonella se determina con pruebas de aglutinación, o el patotipo de Escherichia coli se puede determinar utilizando PCR, que determina si la cepa aislada tiene genes codificantes de toxinas. Conclusiones finales En resumen, el diagnóstico de laboratorio veterinario siempre nos ofrece un abanico de posibilidades, que incluye numerosos tipos de pruebas. El que utilicemos una u otra dependerá de muchos factores que el profesional deberá evaluar a la hora de elegir una: su costo, su existencia en el mercado, su disponibilidad, las estrategias elegidas para controlar la enfermedad, la oficialización de la prueba por parte del SENASA, etc., etc. Bibliografía - Satz M.L y Kornblit A.R. La reacción en cadena de la polimerasa. Revista Ciencia hoy. Vol. 4, Nº 23. 2003. 8

- Fain Binda J.C; Gaia O.E.; Rondelli, FM; Gherardi S; Fain Binda V; Pietronave V. Técnicas de Inmunología Diagnóstica Veterinaria. 1º edición, UNR Editora (Universidad Nacional de Rosario). 2007. - Sanidad animal. VISAVET, Universidad Complutense de Madrid. En: http://www.sanidadanimal.info/cursos/curso/4/diagnosticola.htm

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