BIOTECNOLOGÍA Y GENÉTICA MOLECULAR

Conceptos de biotecnología y genética molecular. Importancia y beneficios de la biotecnología. Genética y Tecnología del DNA recombinante: estrategias de clonación. Enzimas de restricción: especificidad. Construcción de moléculas de DNA recombinante. Vectores de clonación. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): fundamentos. Organismos transgénicos: plantas transgénicas. Utilidad en agricultura y ganadería. Animales transgénicos: transferencia, transmisión y expresión de transgenes. Bioética y Bioseguridad.

BIOTECNOLOGÍA Y GENÉTICA MOLECULAR La Biotecnología Es la aplicación de técnicas aplicadas a la biología, mediante el uso de organismos vivos, para la generación de bienes y servicios. La biotecnología de avanzada apoya diversas disciplinas y técnicas tales como:  Biología molecular (ingeniería genética o genética molecular)  Biología celular (microinyección de células, cultivo de tejidos, clonación)  Embriología (fertilización in vitro y cultivos in vitro, animales transgénicos)  Bioquímica (técnicas de microsecuenciación de proteínas y ácidos nucleicos)

BIOTECNOLOGÍA Y GENÉTICA MOLECULAR

La aplicación de técnicas de Biotecnología Vegetal ha aportado métodos que hicieron posible extender la capacidad vegetativa de muchas especies vegetales de interés económico, permitiendo la propagación rápida de clones de individuos selectos. La micropropagación mediante el cultivo in vitro de meristemas, yemas, etc. es el método biotecnológico que mayores logros aportó al desarrollo de la agricultura.

GENÉTICA MOLECULAR oLa genética molecular estudia todo lo relacionado con la manipulación del ADN y del ARN.

oManipulación del ADN recombinante

tecnología del ADN

oUno de los objetivos de la tecnología del ADN recombinante es aislar segmentos de ADN específicos e introducirlos en un genoma más pequeño denominado vector.

Herramientas utilizadas en la manipulación del ADN

 Enzimas de restricción (tijeras moleculares)  ADN ligasas  Vectores de clonación: plásmidos, virus (fagos)

cósmidos  Otros

Enzimas de restricción  Enzimas capaces de degradar el ADN extraño (1970 en

bacterias)  Son endonucleasas  Función: reconocer y cortar ADN extraño, en secuencias

específicas de nucleótidos llamadas reconocimiento (palíndromes).

secuencias

de

 Deben su nombre -palíndromes- a que se leen de la misma

manera en un sentido y en otro de cada cadena del ADN.

Ej: 5´ A C G T 3´ 3´ T G C A 5’

Enzimas de restricción  Cada una de las enzimas toma el nombre de la bacteria de la cual ha

sido aislada. Ej.: Eco RI es la primera enzima de restricción identificada en Escherischia coli.  Las enzimas de restricción actúan como tijeras moleculares. Se

conocen más de 100 distintas y cada una corta en una secuencia específica a cada hebra de ADN.  Pueden cortar en el mismo lugar de las dos cadenas o pueden hacerlo

en posiciones distintas, en el primer caso generan extremos romos y

en el segundo extremos cohesivos, pegajosos o escalonado, así pueden unirse a otros trozos que sean complementarios.

Enzimas de restricción Enzima

Bacteria

Tipo de extremo

 Eco RI

Escherichia coli

cohesivos

 Bam HI

Bacillus amyloquefaciens

cohesivos

 Hae III

Haemophilus aegyptius

romos

 Kpn I

Klebsiella pneumoniae

cohesivos

 Sma I

Serratia marcenscens

romos

ADN Ligasas Las ADN ligasas son enzimas cuya función es regenerar las uniones de las moléculas de ADN, generando el rADN

Enzimas de restricción

Vectores de Clonación

 Vectores: plásmidos, virus, fagos, cósmidos, capaces de mover genes

de un organismo a otro  El uso de fragmentos de ADN con vectores cumple un rol fundamental

en la ingeniería genética, ya que sirven para transferir material genético de un organismo a otro.  Un plásmido vector es una molécula de ADN circular de doble cadena

que contiene un sector con un origen de replicación del ADN y un marcador selectivo, por ej., un gen que codifica para resistencia a un antibiótico. Los plásmidos vectores contienen a menudo genes marcadores adicionales que identifican un segmento llamado “inserto”.

Vectores  Los plásmidos se introducen en la célula bacteriana.  Hay plásmidos (ej. pBR322) que son portadores de genes

con resistencia a antibióticos y poseen un sitio de clonaje de manera que al introducir el ADN extraño se interrumpe el gen y solo queda como resistente a uno de los antibióticos que luego permite identificar la bacteria que lleva el inserto o ADN extraño.  Los plásmidos al replicarse, también replican el ADN

clonado (permite clonar 10 – 12 pares de bases ¨pb¨).

Marcadores moleculares Tipos de Marcadores

Los marcadores moleculares son aquellos sectores que permiten identificar una secuencia de interés. Pueden ser: •Directos o sea dentro del gen (intragénicos)

•Indirectos usando a otro gen o marcador cercano en el cromosoma para poder identificar diferencias entre individuos

Manipulación del ADN  El ADN motivo de estudio, puede ser cualquier

ADN animal o vegetal o un genoma bacteriano completo, se digiere con enzimas de restricción para obtener pequeños fragmentos de ADN con extremos cohesivos.  Por otro lado, el plásmido vector se corta con

enzimas de restricción en un lugar de clonado específico y único.  Se ponen en contacto el ADN extraño y el vector y

se agrega ADN ligasa que une los extremos pegajosos de ambos segmentos. Esta nueva molécula es el rDNA.

Manipulación del ADN  Las moléculas de rDNA se introducen en la bacteria huésped y se

multiplican independientemente del cromosoma bacteriano.  Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula

multiplicada a partir de una única bacteria que da origen a una colonia, esta técnica se denomina clonación.  Se identifica y selecciona el clon celular que lleva la molécula de rDNA.  Como los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al

exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán.  La bacteria con su rDNA recombinante se transfiere a un vegetal.  Por último, se debe detectar si se produjo o no la recombinación.

CLONACIÓN  El término clon proviene de la jardinería; desde

hace siglos los jardineros generan plantas nuevas a partir de gajos. Estas plantas son genéticamente idénticas y constituyen un clon. Por lo que se define a un clon como un grupo de células u organismos genéticamente idénticas.  La clonación molecular se hace utilizando células

hospedadoras, bacterias normalmente. realizar la clonación se utilizan vectores.

Para

CLONACIÓN

CLONACIÓN

Oveja Dolly  Se tomó una célula de la glándula mamaria de una

oveja Doeset (raza finlandesa) de seis años y se colocó el material genético de esa célula en un huevo vaciado (sin núcleo) de una oveja escocesa Blackface. Aplicaron una suave corriente eléctrica  La nueva célula dio origen a un embrión que fue

implantado en el útero de la oveja. Varios meses después, dio a luz a un animal idéntico a sí misma.  La clonación de esa oveja abrió un debate sobre la

ética de este tipo de experimentos, sobre todo por el temor a que se pueda utilizar en humanos.  Lo realmente novedoso fue que se había logrado

clonar a un animal desde una célula adulta ya diferenciada. Esta noticia sugería que el núcleo de una célula ya diferenciada era aún totipotente.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)  Método fue desarrollado por K. Mullis en 1983, se

extendió rápidamente tanto en investigación básica como en diagnóstico clínico.  Esta técnica permite multiplicar in vitro fragmentos de

ADN sin necesidad de recurrir a vectores y su replicación en bacterias.  Se puede amplificar pequeñas cantidades de ADN miles

de veces. El fragmento a multiplicar puede tener desde 50 hasta más de 2000 nucleótidos de longitud. Se basa, en su forma más simple, en reacciones sucesivas a distinta temperatura, y estas reacciones se repiten entre 20 y 40 veces.

Reacción en Cadena de la Polimerasa oSe calienta la muestra hasta lograr la separación de las dos cadenas de ADN “desnaturalización” a 95°C. oSe incorporan los primers, o iniciadores.

oSe disminuye la temperatura a 50 – 60 °C (apareamiento de la cadena de oligonucleótidos con la hebra del ADN molde) oLa ADN polimerasa extiende los primers, a 70°, se sintetizan las secuencias complementarias de hebra molde.

oSe agrega a la solución los nucléotidos (dexosiribonucleósidos trifosfatos).

Reacción en Cadena de la Polimerasa

o La temperatura está limitada a la temperatura en la cual trabaja la

ADN polimerasa. La más utilizada es la bacteria Thermus aquaticus Taq polimerasa, actúa eficientemente entre los 75 y 80°. o El resultado de la amplificación de numerosos ciclos da lugar a la

amplificación geométrica del segmento del ADN. o Cada ciclo dura unos 5 minutos, y para una amplificación útil se

necesita 20 ciclos. Actualmente se hacen de manera automática. o La PCR tiene varias aplicaciones: en criminología sirve para

obtener copias de la muestra de ADN de los sospechosos (huella genética), pruebas de paternidad, y recuperación de ADNs de especies extinguidas o a punto de extinguirse.

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Los fragmentos de ADN amplificados pueden ser analizados de diferente forma:  Visualización del fragmento de ADN en un gel de agarosa, por

electroforesis, proceso mediante el cual se produce la separación por difusión bajo la acción de un campo eléctrico.  Hibridación

con una sonda marcada radioactivamente, cuya secuencia de bases complementarias está contenida en el fragmento de interés.

 Colocar directamente el ADN en forma de pequeñas manchas (dot

blot) para su posterior hibridación con la sonda. La localización de la sonda radioactiva se logra mediante autoradiografías.

Utilidad Es un instrumento valioso en la determinación de lazos de parentesco o

en pruebas de paternidad. Detección de individuos portadores de un gen recesivo o de interés.

Test de paternidad. También sirve en el diagnóstico de enfermedades En el desarrollo de vacunas

En el estudio de especies extinguidas En la determinación del sexo en embriones, identificación de embriones

potencialmente transgénicos, investigación de mutaciones en embriones Clonación de genes de secuencia desconocida,  Variaciones génicas en poblaciones.

Organismos transgénicos Organismos transgénicos.  Son especies cuyo genoma ha sido alterado por la transferencia de

genes, es decir que posee genes extraños integrados en su patrimonio genético.  Debido a su importancia genética, en vegetales se ha utilizado la técnica del rADN en la obtención de mejores variedades.

Animales transgénicos  El primer caso se conoció cuando en 1982 dos investigadores en EEUU

obtuvieron ratones de entre dos y tres veces mayores a lo normal. Habían transferido por microinyección el gen de la hormona de crecimiento a células huevo de ratón y luego implantaron estas células en oviductos de hembras capaces de llevar a cabo la gestación.  Para la obtención de los animales transgénicos, los principales

procedimientos son: la microinyección y la utilización de virus como vectores.

Microinyección  Consiste en inyectar el gen de interés a uno de los pronúcleos

procedentes de las células sexuales masculinas o femeninas. Así, se obtuvieron los ratones transgénicos. De cada 100 embriones manipulados, se obtienen 1 a 5 ratones transgénicos, este valor disminuye en mamíferos.  Este procedimiento se ha usado para obtener la primera cerda

transgénica que terapeútico.

produce

una

proteína

humana

de

interés

 La leche de “Genie” produce la proteína C que controla la

coagulación de la sangre.  Al año de vida, cuando la cerda llegó a su madurez, se comprobó

que la cerda producía la proteína humana en su leche.

MICROINYECCIÓN oSe construyó un fragmento de ADN con una copia del gen humano de interés y una secuencia promotora. oEl promotor procedía del gen que codifica la proteína de la leche del ratón. oSe recogieron los embriones de una cerda donante y se seleccionaron los huevos fecundados, estos se inyectaron con el ADN extraño usando una micro pipeta de cristal. El ADN se inyectó en la región del pro núcleo macho y el ADN extraño se incorporó en uno de los cromosomas del cerdo. oLas células fecundadas se implantaron en una cerda madre “de alquiler” y se obtuvo la lechona portadora del ADN extraño en todas sus células.

Utilidad de los anímales transgénicos  Sirven para suministrar información sobre la función del gen y la

regulación de su expresión, es decir su traducción en proteína.  El gen insertado puede determinar la síntesis de una sustancia

útil que se puede extraer, en especial de la leche (proteínas), cuando se trata de un mamífero.  Mejora en la producción animal.

 Por transferencia de genes humanos a los cerdos, se intenta

conseguir que los órganos de este animal se pueden utilizar para ser transplantados al hombre.  Todavía es insuficiente el conocimiento de los genes que sería

interesante transferir para alcanzar estos objetivos.

Utilidad de los anímales transgénicos Científicos del INTA Balcarce y de la Univ. de San Martín obtuvieron una vaca transgénica capaz de producir leche maternizada. En edad adulta su leche contendrá dos proteínas importantes para los humanos, la lisozima y la lactoferrina. La lisozima tiene propiedades antibacterianas que los bebés necesitan y normalmente absorben al mamar de pecho de su mamá y la lactoferrina que está involucrada en la incorporación del hierro a los glóbulos rojos, necesario para la correcta oxigenación de la sangre.

Utilidad de los anímales transgénicos

Revista Nuestro Holando

La genómica está tomando cada vez más importancia en la selección genética del ganado lechero. Esto se debe, entre otras cosas, a la cantidad de información que aporta y a la posibilidad de acortar el intervalo generacional. Desde hace más de 50 años, se comenzó a utilizar el semen bovino congelado, empleando en las vacas de los mejores rodeos del mundo, los toros más destacados de la raza, mejorando así la capacidad productiva de las vacas lecheras en forma sorprendente. En los últimos tiempos se pide a la industria seleccionar además por otros rasgos ligados a calidad y fortaleza de las ubres, disposición de patas y pezuñas, capacidad corporal, etc.

Utilidad de los anímales transgénicos Estos gatos han sido modificados genéticamente con la inserción de un gen que codifica para una proteína PROTEINA FLUORESCENTE VERDE (GFP). El gen de la GFP, que tiene su origen en las medusas, es decir que se ha logrado insertar la proteína de medusa en un gato y esta se expresa normalmente cuando es iluminado con ciertas frecuencias de luz.  Esta GFP fue el descubrimiento por el cual se otorgó a 3 científicos el premio nobel de química en 2008. Esta proteína se usa para evaluar si un gen insertado se está expresando o para evaluar la extensión de tejidos tumorales, entre otras aplicaciones.  En el caso de los gatos que brillan intensamente, los científicos esperan poder utilizar a los animales modificados genéticamente en el estudio del VIH / SIDA.  Esta técnica no produce otros efectos en la salud del gatito 