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Genética bacteriana Luis A. Merino

NÚCLEO O GENOMA BACTERIANO Debido a las diferencias que existen entre el material genético de células procariotas y eucariotas, algunos autores han preferido denominarlo “equivalente nuclear”, “cromosoma bacteriano” o “nucleoplasma”. De aquí en más lo llamaremos cromosoma bacteriano, aunque su estructura y asociación a proteínas es muy diferente del cromosoma verdadero presente en las células eucariotas. El cromosoma bacteriano es una estructura filamentosa superenrollada de un único filamento de ADN que una vez separado de la bacteria aparece en forma circular. A diferencia de los cromosomas eucariotas no está asociado con histonas y ocupa aproximadamente el 10% de la célula bacteriana. El superenrollamiento en el cromosoma bacteriano se debe a la asociación con enzimas denominadas topoisomerasas (que producen cortes en las cadenas de ADN, aumentan o disminuyen el superenrollamiento y resellan) por lo que son indispensables para el mantenimiento y la división del ADN bacteriano. El ADN está compuesto por dos cadenas de polinucléotidos compuestos por mononucleótidos unidos entre sí por moléculas de ortofosfato. Cada una de estas moléculas esterifica por un lado la desoxirribosa de un nucléotido en posición 5’ y por el otro, el azúcar del nucleótido siguiente en posición 3’ (Figura 1). Las bases del ADN bacteriano son púricas (adenina y guanina) y pirimídicas (citosina y timina) y generalmente contiene de 1000 a 9000 kilobases (kb), dependiendo de la bacteria en estudio. Ambas cadenas poseen polaridades opuestas y es por ello que se establecen uniones adenina-timina y guaninacitosina en los dos sentidos posibles (AT o TA y CG o GC).

Fig. 1: Estructura de un nucléotido

Funciones de ADN 1. El ADN confiere a la bacteria todas sus características genéticas. El cromosoma se subdivide en segmentos denominados loci que actúan como unidades genéticas funcionales (genes). Cada gen posee una secuencia de bases y por lo tanto, determina la estructura de un polipéptido. La localización de cada gen dentro de un cromosoma constituye el denominado mapa genético de la bacteria. Se ha establecido que la composición de bases de un cromosoma se expresa como el porcentaje de guanina-citosina sobre el número total de bases y este porcentaje puede ser utilizado para estudiar relaciones filogenéticas entre diferentes bacterias. 2. Interviene en los mecanismos de transferencia genética de bacteria madre a hija. 3. La duplicación del ADN trae aparejada la simultánea división celular. 4. Regula la síntesis proteica ya que es capaz de portar genes que codifican hasta 4.000 cadenas polipeptídicas diferentes, cuya síntesis requiere la formación inicial de ARN a partir del ADN mediante la ARN-polimerasa en un proceso denominado transcripción.

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Replicación del ADN El ADN se reproduce mediante un mecanismo semiconservador, o sea que las cadenas se separan y cada una de ellas actúa como un molde para la nueva cadena suplementaria que se irá formando, obteniéndose como resultado dos nuevas hélices dobles idénticas a la original (Figura 2). El cromosoma es considerado un replicón, es decir, que es quien decide el momento de duplicarse pues es portador de los genes iniciador y autoduplicador. El autoduplicador es el gen que está unido a la ADN-polimerasa y el iniciador es el gen que le informa al autoduplicador para que comience la replicación. El autoduplicador estaría unido a la membrana y ocuparía un sitio del ADN denominado oriC y en ese lugar iría girando la molécula de ADN (Figura 3). La duplicación del ADN por la ADN-polimerasa implica la ruptura de los puentes de hidrógeno entre ambas cadenas y su separación y esto ocurre por giro del cromosoma sobre el punto de unión en el mesosoma. Terminada la replicación los dos cromosomas se

separan dividiendo el mesosoma sobre el cual estaban fijos, asegurando al mismo tiempo la división bacteriana mediante la formación de septos.

Fig. 3: Replicación del ADN a partir de su unión al mesosoma y posterior división en dos cadenas completas

Fig. 2: Duplicación del ADN bacteriano en dos cadenas idénticas

ARN BACTERIANO Son tres los tipos de ARN presentes en el citoplasma bacteriano: 1. ARN mensajero (ARNm) que lleva el menaje genético que codifica la síntesis de proteínas recogida en forma de tripletes de bases (codones). 2. El ARN ribosómico (ARNr) que es quien traduce el mensaje del ARNm. Consta de dos subunidades (50S y 30S) con dos lugares funcionales: aminoacil o aceptor (sitio A) donde se unen los aminoácidos y peptidil o dador (sitio P). 3. El ARN de transferencia (ARNt) es el encargado de transportar los aminoácidos hacia el ribosoma para realizar la síntesis proteica. (Figura 4). Fig. 4: Formación de polirribosomas y síntesis proteica. A: subunidades ribosómicas; B: extremo 5’ del ARNm; C,D y F: cadenas polipeptídicas en desarrollo; F: extremo terminal 3’ del ARNm; G: Síntesis completa del polipéptido; H: subunidades ribosómicas salientes.

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ADN EXTRACROMOSÓMICO Plásmidos Se consideran como tales una serie de moléculas facultativas no esenciales para la bacteria con las siguientes características: 1. 2. 3. 4. 5.

6. 7. 8.

9. 10.

11.

Son replicones (capaces de coordinar su propia replicación). Se duplican independientemente de la duplicación del cromosoma. Se transmiten por herencia a las células hijas. Son portadores de genes con gran función biológica pero generalmente no esencial para la vida bacteriana. Pueden ser transferidos a otra bacteria por conjugación (Figura 5). Los plásmidos de mayor tamaño portan genes que codifican la formación de pili sexuales y por ende su propia transferencia (plásmidos conjugativos) mientras que los de menor tamaño no lo hacen (no conjugativos). Aparecen como moléculas circulares de ADN de cadenas helicoidales y superenrolladas conocida como “círculo cerrado covalente” (ccc). Pueden aparecer en número mayor que uno. La competición entre plásmidos muy similares por la ADN-polimerasa y por el sitio de unión a los mesosomas hace que exista incompatibilidad entre distintos plásmidos lo que permite clasificarlos. La incompatibilidad condiciona que dos plásmidos muy similares (igual grupo de incompatibilidad) no puedan heredarse en forma conjunta. Puede ocurrir la pérdida espontánea o inducida de plásmidos durante la división bacteriana (curación). La presencia de un plásmido conjugativo puede inducir la transferencia de uno no conjugativo presente en la misma bacteria. Los plásmidos no conjugativos pueden transferirse mediante transducción por un bacteriófago. Los plásmidos pueden recombinarse con el cromosoma o con otros plásmidos mediante un mecanismo de crossing-over regulado por enzimas recombinasas e integrasas.

Fig. 5: Mecanismo de conjugación entre dos bacterias.. Tipos y funciones de los plásmidos Los plásmidos se clasifican en base a los caracteres que expresan. 1. Factores sexuales: son autotransferibles y codifican la producción de pili sexuales F. Las bacterias portadoras de este plásmido se denominan F+ y las que no lo poseen se denominan F-. 2. Factores de resistencia o factores R: codifican la resistencia de las bacterias frente a antibióticos. Están formados por dos componentes denominados “factor de transferencia de la resistencia” (FTR) y determinantes “r” que portan los genes responsables de las enzimas que destruyen los antibióticos (Figura 6). Los plásmidos R se transmiten de una bacteria resistente a una sensible propagando la resistencia a los antimicrobianos planteando situaciones epidemiológicas graves. Algunas bacterias presentan plásmidos R cointegrados que portan genes de resistencia a múltiples antibióticos covalentemente unidos en una misma molécula circular simple. 3. Plásmidos determinantes de patogenicidad: son aquellos que portan genes que codifican la producción de sustancias nocivas para el huésped. Ejemplos: Plásmidos “Ent”: codifican la síntesis de enterotoxinas (Escherichia coli, Vibrio cholerae). Plásmidos “Inv”: codifican la penetración (invasión) en células epiteliales (Shigella sp). Plásmidos “Hly”: codifican la producción de α-hemolisinas (S. pneumoniae). 4. Factores Col: son los que codifican la producción de sustancias antibacterianas similares a los antibióticos, las bacteriocinas, letales para bacterias del mismo o diferente género. Son ejemplos las colicinas (Escherichia coli), piocinas (Pseudomonas aeruginosa), marcescinas (Serratia marcescens). 3

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5. Plásmidos degradantes: portan genes capaces de codificar enzimas que las bacterias utilizan para degradar sustancias presentes en el ambiente como tolueno, alcanfor y salicilatos. Son frecuentes en bacterias que habitan el suelo. Fig. 6: modelo de plásmido portador de genes de resistencia a diferentes antimicrobianos. FTR: factor de transferencia de la resistencia. Cm: cloramfenicol. Sm: estreptomicina. Nm: neomicina. Su. sulfas. Tc: tetraciclina.

ALTERACIONES EN LAS CARACTERÍSTICAS DE UNA POBLACIÓN BACTERIANA La información genética codificada en el ADN se denomina “genotipo”, sin embargo no todos los caracteres codificados se manifiestan, sino que el medio ambiente condiciona la aparición o no de ellos. Es por ello que a los caracteres manifestados o expresados por interacción entre el genotipo y el medio ambiente se denomina “fenotipo”. Las modificaciones que pueden aparecer en una población bacteriana pueden afectar su fenotipo o su genotipo. En el primer caso se denominan variaciones fenotípicas o adaptaciones y en el segundo caso se trata de variaciones genotípicas que pueden ser mutaciones o fenómenos de transferencia de material genético. Variaciones fenotípicas o adaptaciones Las variaciones fenotípicas o adaptaciones son cambios en el fenotipo que no afectan al genoma bacteriano o sea que no son heredables. Responden a una presión del medio ambiente en el cual la bacteria se está desarrollando y revierten al estado inicial cuando se elimina la causa de presión. Las variaciones fenotípicas pueden ser: 1. Morfológicas: cambios de forma, de tamaño, aparición o no de flagelos, esporas, cápsula, etc. 2. Cromógenas: producción o no de pigmentos según la temperatura a la que están creciendo las bacterias, por ejemplo, algunas cepas de P. aeruginosa suelen producir pigmentos a temperatura ambiente pero no a 37ºC. 3. Enzimáticas: producción de enzimas inducibles, por la presencia del sustrato en el medio. Por ejemplo la producción de β-galactosidasa en presencia de lactosa. 4. Patogénicas: cambios en la capacidad de producir enfermedad. Por ejemplo Corynebacterium diphteriae toxigénica y la producción de una toxina según la concentración de hierro en el medio. Mutaciones Las mutaciones son cambios espontáneos, irreversibles y hereditarios de alguna característica de la bacteria y que no dependen de la incorporación de material genético de otro microorganismo. La bacteria con la característica original se denomina salvaje y la que varía se denomina mutante. Bioquímicamente las mutaciones son cambios en la secuencia nucleotídica por sustitución, adición o pérdida de un par de bases (mutaciones puntuales), por alteraciones en muchos pares de bases (fragmento de ADN cromosómico) o por translocación de secuencias de inserción o transposones. La consecuencia será la producción de una proteína nueva que puede no producir alteraciones en la función, alterarla o incluso puede no ser funcional en cuyo caso, si la proteína es esencial para la vida bacteriana, se trataría de una mutación letal. Las mutaciones se caracterizan por. 8 1. Son de baja frecuencia de aparición, con una probabilidad de 1 por cada 10 bacterias como promedio. 2. El carácter heredado por una mutación solo puede ser revertido por otra mutación (mutación reversa). 3. La mutante puede producirse aún en ausencia del agente que se ve afectado, pero éste selecciona a la mutante. Es el ejemplo de selección de mutantes resistentes a un determinado antimicrobiano durante un tratamiento prolongado. 4. Las mutaciones pueden traducirse en modificaciones de diferentes tipos: • Morfológicas: se manifiestan por cambios en la cápsula, flagelos, pared, fimbrias, etc.

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•

Bioquímicas: con cambios en el metabolismo con incapacidad para sintetizar un determinado metabolito. • Patogénicas: se traducen en alteraciones en la virulencia bacteriana. • Mutantes letales condicionales: se expresan en determinadas condiciones ambientales y no en otras. • De sensibilidad a fagos y bacteriocinas: de gran importancia en epidemiología. • De sensibilidad a antimicrobianos: de gran importancia en infectología. Se manifiesta por la producción de enzimas inactivantes de antimicrobianos o por cambios en los sitios sobre los cuales actúa el antibiótico. En algunos casos la mutación no se expresa fenotípicamente y entonces a la bacteria se la denomina mutante reprimida, pero en determinada circunstancia ésta puede comenzar a expresar el nuevo fenotipo y entonces pasa a ser una mutante desreprimida. 5. La tasa de aparición de mutaciones puede incrementarse ampliamente por el uso de radiaciones ionizantes o ultravioletas, por productos químicos como la mostaza nitrogenada, mitomicina C, 5bromouracilo, ácido nitroso, etc. A todos estos agentes se los denomina mutágenos. TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO Las bacterias pueden cambiar su composición genética no sólo por mutaciones sino por la adquisición de ADN proveniente de otras bacterias o virus. Estas transferencias pueden llevarse a cabo por los siguientes mecanismos: Transformación, Transducción, Transfección, Conversión y Conjugación. El ADN transferido se denomina exogenote por su condición de extraño y puede permanecer libre en el citoplasma bacteriano o incorporarse al ADN cromosómico (endogenote) en un proceso de recombinación o integración. Transformación Ciertas bacterias son capaces de tomar ADN exógeno a partir del medio ambiente e integrarlo a su cromosoma propio. El ADN se fija a la pared celular, es dividido en pequeños fragmentos, atraviesa la membrana citoplasmática y en el interior se separan las dos cadenas de las cuales sólo una se integraría al cromosoma. Transducción Es la transferencia de un fragmento de ADN de una bacteria a otra por intermedio de un bacteriófago cuyo ácido nucleico es un ADN bicatenario. La transducción puede ser generalizada o restringida. Transducción generalizada: al ingresar el fago induce una nucleasa que fragmenta el cromosoma bacteriano a la vez que se forma ADN vírico y proteínas de envoltura viral. Las proteínas rodean al ADN vírico y a los fragmentos de ADN bacteriano. Se produce la lisis celular con liberación de los bacteriófagos nuevos. Al infectarse una nueva célula con el fago portador del fragmento de ADN bacteriano, la bacteria no es lisada sino que el fragmento de ADN se incluye en el ADN de la bacteria infectada (Figura 7).

Fig.7: Esquema de una transducción generalizada completa que termina con una nueva célula infectada que adquiere un nuevo fragmento de genoma bacteriano.

Transducción restringida o especializada: Cuando un fago no lítico infecta una bacteria, el ADN fágico se incorpora al ADN bacteriano (profago) y la bacteria permanece en estado lisogénico hasta que algún factor induce la transformación del profago en fago vegetativo y es en ese momento en el que el profago se separa del ADN bacteriano arrastrando algunos genes circundantes y la bacteria inicia un ciclo lítico con la liberación de bacteriófagos portadores de genes propios y ajenos. Cuando este bacteriófago in5

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fecta a otra bacteria le transfiere ciertas características de la bacteria anterior pero sin dar lugar a un ciclo lítico. (Figura 8).

Fig. 8: Esquema de una transducción restringida en la cual la bacteria adquiere una porción de ADN fágico y una porción de ADN bacteriano.

Transfección Es la infección de la célula bacteriana con el ADN obtenido previamente de un virus. El resultado es la producción de virus completos dentro de la bacteria con la posterior lisis de ésta. Para que se produzca la transfección la bacteria debe estar en estado de competencia. Tiene gran aplicación en ingeniería genética. Conversión Cuando el ADN de un bacteriófago se integra a un cromosoma bacteriano estamos en presencia de una conversión lisogénica y aunque no hay transferencia de genes de una bacteria a otra, la bacteria infectada puede adquirir características que ante no poseía como ser la producción de toxinas. Conjugación Es la transferencia de material genético de una bacteria a otra por contacto directo entre ellas. La capacidad de transferir ADN está codificada en el plásmido que se conoce como factor de transferencia o + factor sexual. Las células que lo poseen se llaman F , masculinas o donantes y las que carecen de él se denominan F , femeninas o receptoras. El resultado de la conjugación es una bacteria con las características de las dos cepas progenitoras. Para que se realice la transferencia es necesaria la presencia de pili sexuales (que son filamentos huecos) o de pili de sujeción o anclaje que mantendrían juntas a las dos células estableciéndose un puente entre las membranas citoplasmáticas por las que pasaría el ADN. En algunas bacterias el factor F+ se encuentra integrado en el cromosoma y estas células pueden transferir genes cromosómicos a bacterias F- con gran frecuencia y se denominan Hfr (high frecuency recombination) ESTUDIO DEL GENOMA BACTERIANO - MÉTODOS Y APLICACIONES ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Extracción del ADN: la lisis celular es el primer paso para la extracción del ADN bacteriano. Las células en crecimiento exponencial se someten a la acción de enzimas (lisozima), antibióticos (penicilina), calor, agentes tensioactivos (polianetol sulfonato de sodio), álcalis (NaOH), etc. o una combinación de éstos, lo que destruye la pared celular liberando sus componentes citoplasmáticos incluyendo el ADN. Purificación del ADN: El ADN se purifica con solventes orgánicos como el alcohol o fenol y el ARN que está presente se destruye por acción de una ARNasa. Digestión: una vez extraído y purificado, el ADN cromosómico puede ser dividido en fragmentos pequeños por enzimas de restricción, o sea enzima que cortan la cadena en secuencias de bases específicas que presentan simetría binaria alrededor de un punto dado. Por ejemplo, la enzima EcoRi presente en Escherichia coli corta al ADN cuando encuentra la siguiente secuencia:

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↓ 5’ . . . G-A-A-T-T-C . . . 3’ 3’ . . . C-T-T-A-A-G . . . 5’ ↑ Dado que esas secuencias pueden encontrarse varias veces dentro del genoma bacteriano, el ADN fragmentado resulta en numerosos fragmentos de diferente número de pares de bases y por ende de diferente peso molecular (Figura 9)

Lisis

Extracción

Digestión

Fig. 9: Pasos para la extracción y digestión enzimática del ADN bacteriano. Electroforesis: dichos fragmentos pueden ser separados por electroforesis sobre gel de agarosa dado que las moléculas más pequeñas migrarán rápidamente a través de los poros del gel, mientras que las más grandes lo harán con mayor lentitud. Estudio de las bandas: luego de terminada la electroforesis (usualmente unas pocas horas), los fragmentos se colorean con un colorante fluorescente (bromuro de etidio) y se visualizan con luz ultravioleta. El tamaño de los fragmentos obtenidos se compara con un marcador de pesos moleculares conocido (Figura 10). Esta técnica es muy útil en estudios epidemiológicos para comparar dos poblaciones bacterianas ya que si ambas provienen del mismo origen deberán presentar igual número de bandas y del mismo peso molecular. Dotación plasmídica: Un procedimiento similar al descripto anteriormente puede ser utilizado para el estudio de la presencia de plásmidos dentro de una bacteria. La comparación de las bandas producto de la migraFig. 10: Bandas de ADN en gel de agarosa. ción de los diferentes plásmidos puede servir para A: patrón de pesos moleculares; B, C y D: comparar bacterias y de esta manera determinar si bacterias en estudio. están emparentadas genéticamente o no. Los plásmidos también pueden ser digeridos con enzimas de restricción obteniéndose un número mayor de bandas tras la electroforesis y esto es muy útil para diferenciar bacterias con un solo plásmido o con plásmidos de peso molecular muy parecido. HIBRIDACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS Se entiende por hibridación la construcción artificial de un ácido nucleico de doble cadena por apareamiento complementario de bases de dos ácidos nucleicos de cadena sencilla. Por acción del calor, las dobles cadenas de ADN en estudio se separan y si se las deje enfriar lentamente, muchas de las cadenas complementarias volverán a asociarse. La reasociación solo se lleva a cabo si ambas cadenas son complementarias. Así, la hibridación de ácidos nucleicos utilizando una de las cadenas sintetizada artificialmente y marcada con alguna sustancia detectable (isótopo radioactivo, peroxidasa o fluoresceína), permite la formación de híbridos artificiales de doble cadena de ADN, ARN o ADN-ARN que pueden ser detectadas en el laboratorio. La hibridación permite estudiar relaciones genéticas entre dos ácidos nucleicos provenientes de diferentes bacterias. También permite detectar trozos de ácido nucleico complementarios de una cadena sencilla de secuencia conocida. Esta cadena sencilla se denomina “sonda” y esta sonda puede utilizarse para localizar en una mezcla desconocida una secuencia de ácido nucleico complementario con ella. La cadena de ácido nucleico que se quiere estudiar se denomina “conductor”. La detección de la hibridación de ácidos nucleicos se hace por lo general con filtros de membrana de nitrocelulosa a los cuales se adhieren las cadenas simples de ADN y ARN y los híbridos (Figura 11). 7

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Fig.11: Esquema de la técnica de hibridación sobre filtros de celulosa.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Es una técnica que permite amplificar miles de veces una porción del ADN en estudio (o ARN luego de la síntesis del ADN por acción de una transcriptasa inversa). El fundamento de esta técnica es la amplificación enzimática de un fragmento de ADN flanqueado por dos oligonucleótidos cebadores o iniciadores (primers) que hibridan con las cadenas opuestas de la secuencia nucleotídica que nos interesa (secuencia blanco) y es a partir de alli donde comenzará la síntesis de nuevo ADN. Para ello se necesita el ADN a estudiar, los cebadores, las bases nucleotídicas (dNTPs) y una ADN polimerasa resistente al calor (ya que la desnaturalización de las cadenas de ADN se realiza a altas temperaturas). La técnica consta de ciclos que se repiten aproximadamente 40 veces y cada ciclo consta de los siguientes pasos: desnaturalización, hibridación con los cebadores, síntesis de nuevo ADN (Figura 12).

Fig. 12: Amplificación selectiva de ADN por PCR. (1) Separación de las cadesnas de ADN (desnaturalización). (2) Unión de los cebadores o primers (Hibridación). (3) Síntesis de nuevos fragmentos de ADN (Elongación). (4) Reinicio de la reacción P: ADN Polimerasa ADN en la muestra Iniciador o primer Fragmento nuevo

El producto de esta amplificación puede evidenciarse en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio o puede hibridizarse con una sonda marcada, que son los procedimientos más usados. Esta técnica puede utilizarse para detectar pequeñas cantidades de genoma de un agente infeccioso en una muestra clínica o para detectar ciertos genes de secuencia conocida dentro del genoma de algún agente infeccioso. 8