Cátedra Biología Molecular Teórico Práctico de Problemas Nº 2 Replicación. PCR. Transcripción en procariotas y eucariotas. Regulación de la expresión génica. 1. Indique la o las respuestas correctas a. Los factores de transcripción a) Se unen únicamente a ADN. b) Se unen únicamente a proteínas. c) Deben unirse tanto a ADN como a proteínas para controlar la transcripción. d) Son sólo activos en el cromosoma a partir del cual fueron transcriptos. b. Cuáles de las siguientes afirmaciones sobre la síntesis de ARN ribosomales es falsa? a) En una célula típica, hay aproximadamente 100 copias de los genes para r ARN. b) La producción de r ARN no necesita splicing. c) Los r ARN se producen a partir de un precursor 45S que se procesa en fragmentos pequeños d) La mayor parte de los r ARN son transcriptos por la ARN polimerasa II c. Antes de que un ARN mensajero recién sintetizado se una a los ribosomas debe sufrir: a) Capping. b) Poliadenilación. c) Splicing. d) Transporte al citosol. e) Todas las anteriores. d. B) La secuencia consenso para la adición de poly-A es/está: a) En el sitio donde se adiciona la cola poly A. b) AAUAAA c) Aguas abajo del sitio de clivaje d) Ninguna de las anteriores e. El mecanismo de splicing a) requiere del clivaje de uniones de alta energía del ATP. b) de intrones del grupo I (incluyendo intrones de pre-r ARN de Tetrahymena) se inicia por el ataque nucleofílico del hidroxilo 3' de un nucleótido guanina. c) El splicing de pre-m ARN nucleares se inicia por el ataque nucleofílico de un hidroxilo 2' de una guanina inte ARN. d) Las reacciones individuales de transesterificación son reversibles, pero el proceso completo es irreversible debido a que la circularización del intrón eliminado es irreversible. e) En todos los casos los intrones están flanqueados por exones. f. Qué es snRNP? a) Un complejo nuclear de proteínas y ARN catalítico b) Una particular requerida para el reconocimiento de la secuencia señal N-terminal de proteínas destinadas a la membrana celular c) Un complejo enzimático requerido para la iniciación de la transcripción en eucariotas g. Cuáles de los siguientes procesos no requiere de enzimas de naturaleza proteica? a) ARN editing b) Escisión del grupo II de intrones c) Transsplicing d) Escisión del grupo III de intrones h.
ARN editing es:
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Cátedra Biología Molecular a) Una alteración post-transcripcional de las secuencias de m ARNs b) Una alteración pre-transcripcional de las secuencias de ARNs c) Unión post-transcripcional de dos moléculas de ARN d) Ninguna de las anteriores i. H) Cuál de los siguientes ARN participa en la exportación de ARNm hacia fuera del núcleo a) ARNsn b) ARNhn c) ARNt d) ARNr j. I) Los ARNm de histonas carecen: a) Colas de poly A b) Intrones c) 3'UTR d) Todos las anteriores k. Si tres proteínas diferentes son codificadas por el mismo gen, esto es probablemente el resultado de: a) Regulación transcripcional del gen b) Atenuación c) Un operón d) Splicing alternativo del m ARN e) Tres proteínas diferentes no pueden ser codificadas por el mismo gen. l. El mecanismo de supervivencia de ARN se refiere a: a) Estabilización de ARN no procesados por la maquinaria de splicing. b) Mecanismo de retención en el núcleo de ARN no procesados . c) Degradación de ARN que carecen de codones de terminación. d) Degradación de ARN que carecen de señales de terminación de transcripción. 2. Responda brevemente las siguientes preguntas a. ¿Qué proteínas son necesarias para la transcripción basal por la ARN pol II y cuáles para la transcripción activada? b. ¿Cuáles son las propiedades de un enhancer y cómo actúa? c. Haga un diagrama de los elementos promotores típicos de los genes que codifican para t ARN, r ARN, y m ARN genes. Marque la posición de dichos elementos en relación al sitio de inicio de la transcripción (+1). Indique además si dichos elementos son esenciales o activadores. d. Algunos libros como por ej "Principles of Genetics, 5th ed Tamarin, R. 1996 afirman que la actividad "proofreading" (correctora de errores) es muy importante durante la replicación del ADN, porque los errores serían transmitidos a la descendencia, sin embargo, este principio no se aplica a la transcripción ya que los ARN tienen una vida media corta en el citoplasma y los errores en su síntesis no serían permanentes. En este contexto en bibliografía aparecen afirmaciones como: "las ARN polimerasas no poseen actividad correctora de errores" "los errores en el ARN no son tan críticos como en el ADN" "no es necesario que se efectúe una corrección de errores durante la transcripción, ya que de esta manera se logra un proceso mucho más rápido" Otros libros como por ej Lodish et al. Molecular Biology of the Cell (2004) o el Genes VIII, Lewin, Ed 2004, no hacen ninguna mención a la actividad proofreading de las ARN polimerasas. ¿Cuál es su opinión respecto a la actividad de corrección de errores de las ARN polimerasas y las afirmaciones anteriores? e. ¿Qué mecanismos de degradación de ARNm conoce? f. ¿Qué mecanismos moleculares post-transcripcionales conoce que sean capaces de producir una sustancial modificación en la secuencia de un transcripto primario? Describa los 4 tipos de procesamientos. Describa el editing del ARN.
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Cátedra Biología Molecular g. ¿Cómo influyen los distintos órdenes de empaquetamiento del ADN en la expresión genética? ¿Cómo varía el grado de empaquetamiento durante el ciclo celular? ¿Cómo resulta la susceptibilidad de corte por ADNasa I en cromatina transcripcionalmente activa con respecto a la inactiva? h. ¿Cómo influye la metilación de las citosinas sobre la expresión genética en eucariotas? Compare el grado de metilación de la heterocromatina en relación con el resto del genoma. i. Indique las características moleculares distintivas de los diferentes tipos de factores de transcripción eucariotas. 3. Defina los siguientes términos F1- 5’ Capping F2-Dominio CTD de la Pol II F3- HATs y HMTs
4. Se ha desarrollado un sistema de corte y empalme en un tubo de ensayo que contiene todos los componentes necesarios para el corte y empalme de genes nucleares. Cuando se añade al sistema un trozo de ADN que contiene un intrón y dos exones, el intrón se elimina como un lazo y los exones se empalman uno junto al otro. Si la molécula de ARN añadida al sistema tiene las siguienetes mutaciones, ¿qué productos intermediarios de corte y empalme se acumualarán? a. Deleción de GT en el corte y empalme 5’ b. Deleción de A en el punto de ramificación c. Deleción de AG en el sitio de corte y empalme 3’ ¿Qué sugiere este resultado sobre el mecanismo de activación de GAL4? En una situación en la cual hubo una sobreproducción de la proteína lexA-GAL4, la expresión de GAL1 fue constitutiva. Sugiera una explicación. 5. El operón fox y su regulador tiene las secuencias A, B, C y D, y codifica las enzimas 1 y 2. Las mutaciones en las secuencias A, B, C y D tienen los siguientes efectos, en los que un signo más (+) indica que la enzima se está sintetizando y un signo menos (-) indica que la enzima no se sintetiza. Fox ausente Mutación en la secuencia Ausencia de mutación A B C D
Fox presente
Enzima 1
Enzima 2
Enzima 1
Enzima 2
-
-
+
+
+
+
+ +
+ +
6. ¿Cuales de las siguientes cepas de E. coli pueden hidrolizar la lactosa?, ¿lo hacen constitutivamente o por inducción? a) i+ p+ o+ z+ / i+ p+ oc z+ b) i- p- o+ z+/ i+ p+ o+ zc) i+ p+ o+ z+ / i+ p- oc z+ d) i+ p+ o+ z+/ i+ p+ oc ze) i- p+ o+ z+ / i+ p- oc zf) i+ p+ o+ z- / i+ p- oc z+ i+.......... regulador salvaje i- ......... regulador constitutivo (represor inactivo) p+......... promotor salvaje p-......... promotor inactivo o+......... operador salvaje
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Cátedra Biología Molecular o-......... operador constitutivo z+......... galactosidasa salvaje z-......... no hay síntesis de galactosidasa 7. Indique si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas. Explique por qué. i) Cuando se lee en la misma dirección (5’ a 3’), la secuencia de nucleótidos en la cadena de ADN recientemente sintetizada es la misma que el templado parenteral. ii) Una síntesis de ADN 5’ a 3’ significa que el crecimiento de la cadena ocurre por adición de dNTPs al grupo 3’-OH, con eliminación de un pirofosfato inorgánico. iii) La pérdida de la actividad exonucleasa 3’ a 5’ de la ADN polimerasa en E. coli debería disminuir la velocidad de síntesis de ADN, pero no debería afectar su fidelidad. iv) En E. coli , levaduras y algunos virus eucariótas, las nuevas rondas de replicación del ADN son iniciadas en un sitio específico, el cual contiene varias copias de una secuencia corta que une un complejo de proteínas de inicación. 8. Usted quiere amplificar el ADN que se encuentra entre los dos grupos de secuencias de la figura 1. Elija de la lista u par apropiado de primers que le permita amplificar esa secuencia por PCR. Secuencia 5´GACCTGTGGAAGC.....................................CATACGGGATTC 3´CTGGACACCTTCG......................................GTATGCCCTAAC Primers 5´GACCTGTGGAAGC 5´CTGGACACCTTCG 5´GCTTCCACAGGTC 5´CGAAGGTGTCCAG
5´ CATACGGGATTC 5´ GTATGCCCTAAC 5´ CTTAGGGCATAC 5´ CAATCCCGTATG
9. La ADN polimerasa I posee actividad exonucleasa 3’ a 5’, además de su actividad polimerizante. Esta actividad funciona durante la corrección para remover bases mal apareadas desde el final de la nueva cadena de ADN. Para estudiar esta actividad, preparamos un sustrato artificial con una cadena poli (dA) y una poli (dT) que contenía unos pocos residuos dT marcados con 32P, seguidos por unos pocos residuos de dC marcados con 3H en su extremo 3’, como se vé en la figura 2. Medimos la pérdida de los residuos dT y dC marcados, en presencia y en ausencia de dTTP (figura 3). i) ¿Por qué fueron marcados con diferentes isótopos los residuos T y C? ii) ¿Por qué toma más tiempo remover los residuos T, en ausencia de dTTP, que los residuos C? iii) ¿Por qué ningún residuo T fue removido en presencia de dTTP, mientras que los residuos C fueron removidos tanto en presencia como en ausencia de dTTP? iv) ¿Se podrían esperar resultados diferentes en la figura 2 B, si se agregaran dCTP y dTTP?
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10. Ciertas mutaciones condicionalmente letales son muy útiles en el análisis genetico y bioquímico de procesos complejos tales como la replicación del DNA. Las mutaciones “Temperaturasensibles” (ts) son una forma de mutaciones condicionalmente letales las cuales permiten a la célula crecer a una determinadad temperatura (por ejemplo, 30°C) y no a otra (por ejemplo, 42°C). Una gran cantidad de mutantes temperatura-sensibles se han aislado en E. coli. Estas bacterias mutantes son defectuosas en la replicación de DNA a 42°C pero no a 30°C. Si la temperatura del medio se eleva de 30°C a 42°C, estos mutantes detienen la síntesis deDNA en una de dos maneras características: "corte rápido": la síntesis del DNA se detiene inmediatamente, mientras que en las de"corte lento" la síntesis del DNA se detiene solamente después de muchos minutos. i) Prediga cuáles de las proteínas siguientes, si es termosensible, exhibirían el fenotipo de corte rápido y cuál exhibiría el fenotipo de corte lento. En cada caso explique su predicción. DNA topoisomerasa I Una proteína de iniciación de la replicación. 3. SSBP DNA helicasa DNA primasa DNA ligasa ii). Los extractos de células mutantes muestran esencialmente el mismo patrón de replica-ción de las células intactas. Los extractos de mutantes de corte rápido -paran la síntesis del DNA inmediatamente a 42°C, mientras que los extractos de mutantes de lento corte- paran la síntesis de la DNA por varios minutos después del cambio a 42°C. Si mezcla los extractos de un mutante temperatura-sensible de DNA helicase y de un mutante temperatura-sensible de DNA ligase a 42°C. usted ¿que fenotipo esperaría que la mezcla exhibiera: corte rápido, corte lento o no mutante? 11. Secuencia de un fragmento de una cadena de ADN aislada de E. coli: 5’-GTAGCCTACCCATAGG-3’ i) ¿Esta secuencia podría pertenecer al principio, al medio o al final de la región codificante del gen? ii) ¿Cuál sería la secuencia del ARNm transcripto a partir de esta secuencia? ¿Cuántos péptidos diferentes están codificados en este ARNm? iii) El ARNm transcripto a partir de este ADN, usando la cadena complementaria como templado¿codificaría los mismos péptidos que el anterior?
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