GENÉTICA MOLECULAR

Conceptos de Biotecnología y Genética Molecular. Concepto. Importancia y beneficios de la biotecnología. Ingeniería Genética. y Tecnología del ADN recombinante: estrategias de clonación. Enzimas de restricción: especificidad. Construcción de moléculas de ADN recombinante. Vectores de clonación. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): fundamentos. Organismos transgénicos: plantas transgénicas. Utilidad en agricultura y ganadería. Animales transgénicos: transferencias y expresión de los transgenes. Bioética y Bioseguridad.

GENÉTICA MOLECULAR

oLa genética molecular estudia todo lo relacionado con la manipulación del ADN y del ARN. oManipulación del ADN del ADN recombinante

tecnología

oUno de los objetivos de la técnica del ADN recombinante es aislar segmentos de ADN específicos e introducirlos en un genoma más pequeño denominado vector.

Las herramientas más utilizadas en la manipulación del ADN:

• Enzimas de restricción. • ADN ligasas • Vectores: plásmidos, virus (fagos) cósmidos, vectores de clonación.

Enzimas de restricción  Enzimas capaces de degradar el ADN extraño (1970 en bacterias)  Son endonucleasas  Función: reconocer y cortar ADN extraño, en secuencias específicas de nucleótidos llamadas secuencias de reconocimiento.  Estas secuencias de reconocimiento son palíndromes, es decir que se leen de la misma manera en cada cadena del ADN. Ej: 5´ A C G T 3´ 3´ T G C A 5

Enzimas de restricción • Cada una de las enzimas toma el nombre de la bacteria de la cual ha sido aislada. Ej.: Eco RI es la primera enzima de restricción identificada de Escherischia coli. • Las enzimas de restricción actúan como tijeras moleculares. Se conocen más de 100 distintas y cada una corta en una secuencia

específica a cada hebra de ADN. • Pueden cortar en el mismo lugar de las dos cadenas o pueden hacerlo en posiciones distintas, en el primer caso generan extremos

romos y en el segundo extremos cohesivos, pegajosos o escalonado, así puede unirse a otros trozos que sean complementarios.

Enzimas de restricción Enzima

Bacteria

Tipo de extremo

 Eco RI

Escherichia coli

cohesivos

 Bam HI

Bacillus amyloquefaciens

cohesivos

 Hae III

Haemophilus aegyptius

romos

 Kpn I cohesivos

Klebsiella pneumoniae

 Sma I

Serratia marcenscens

romos

ADN Ligasas Las ADN ligasas son enzimas cuya función es unir las moléculas de ADN, generando el rADN

Enzimas de restricción

Vectores • Vector: plásmidos, fagos, virus, cósmidos, capaces de mover genes de un organismo a otro • El uso de fragmentos de ADN como vectores cumple un rol fundamental en la ingeniería genética, ya que sirven para transferir material genético de un organismo a otro. • Un plásmido vector es una molécula de ADN circular de doble cadena que contiene un sector con un origen de replicación del ADN y un marcador selectivo, por ej., un gen que codifica para resistencia a un antibiótico. Los plásmidos vectores contienen a menudo genes marcadores adicionales que identifican un “inserto”.

Vectores • Los plásmidos se introducen en la célula bacteriana. • Hay plásmidos (ej. pBR322) que son portadores de genes con resistencia a antibióticos y poseen un sitio de clonaje de manera que al introducir el ADN extraño se interrumpe el gen y solo queda como resistente a uno de los antibióticos que luego permite identificar la bacteria que lleva el inserto o ADN extraño. • Los plásmidos al replicarse, también replican el ADN clonado (permite clonar 10 – 12 pb).

Manipulación del ADN  El ADN motivo de estudio, puede ser cualquier ADN animal o vegetal o un genoma bacteriano completo, se digiere con enzimas de restricción para obtener pequeños fragmentos de ADN con extremos cohesivos.

 El plásmido vector se corta con enzimas de restricción en un lugar de clonado específico y único.  Se ponen en contacto el ADN extraño y el vector y se agrega ADN ligasa que une los extremos pegajosos de ambos. Esta nueva molécula es el rDNA.

Manipulación del ADN • Las moléculas de rDNA se introducen en la bacteria huésped y se multiplican independientemente del cromosoma bacteriano. • Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica se denomina clonación. • Se identifica y selecciona el clon celular que lleva la molécula de rDNA. • Como los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán. • La bacteria con su rDNA recombinante se transfiere a un vegetal o a un callo. • Por último, se debe detectar si se produjo o no la recombinación.

CLONACIÓN

Clonación del ADN • El término clon proviene de la jardinería; desde hace siglos los jardineros generan plantas nuevas a partir de gajos. Estas plantas son genéticamente idénticas y constituyen un clon. Por lo que se define a un clon como un grupo de células u organismos genéticamente idénticas. • La clonación molecular se hace utilizando células hospedadoras, bacterias normalmente. Para realizar la clonación se utilizan vectores.

CLONACIÓN

Oveja Dolly  Se tomó una célula de la glándula mamaria de una oveja Doeset (raza finlandesa) de seis años y se colocó el material genético de esa célula en un huevo vaciado (sin núcleo) de una oveja escocesa Blackface. Aplicaron una suave corriente eléctrica  La nueva célula dio origen a un embrión que fue implantado en el útero de la oveja. Varios meses después, dio a luz a un animal idéntico a sí misma.  La clonación de esa oveja abrió un debate sobre la ética de este tipo de experimentos, sobre todo por el temor a que se pueda utilizar en humanos.

 Lo realmente novedoso fue que se había logrado clonar a un animal desde una célula adulta ya diferenciada. Esta noticia sugería que el núcleo de una célula ya diferenciada era aún totipotente.

Reacción en Cadena de la Polimerasa  Método fue desarrollado por K. Mullis en 1985, se extendió rápidamente tanto en investigación básica como en diagnóstico clínico.  Esta técnica permite multiplicar in vitro fragmentros de ADN sin necesidad de recurrir a vectores y su replicación en bacterias.  Se puede amplificar pequeñas cantidades de ADN miles de veces. El fragmento a multiplicar puede tener desde 50 hasta más de 2000 nucleótidos de longitud. Se basa, en su forma más simple, en reacciones sucesivas a distinta temperatura, y estas reacciones se repiten entre 20 y 40 veces.

Reacción en Cadena de la Polimerasa oSe calienta la muestra hasta lograr la separación de las dos cadenas de ADN “desnaturalización” - 95°C. oSe incorporan los primers, o iniciadores.

oSe disminuye la temperatura a 50 – 60 °C apareamiento de la cadena de oligenucleótidos con la hebra delADN molde. oLa ADN polimerasa extiende los primers, a 70°, sintetizan las secuencias complementarias de hebra molde. oSe agrega a la solución los nucléotidos – dexosiribonucleósidos trifosfatos.

o La temperatura está limitada a la temperatura en la cual trabaja la ADN polimerasa. La más utilizada es la bacteria Thermus aquaticus Taq polimerasa, actúa eficientemente entre los 75 y 80°. o El resultado de la amplificación de numerosos ciclos da lugar a la amplificación geométrica del segmento del ADN. o Cada ciclo dura unos 5 minutos, y para una amplificación útil se necesita 20 ciclos. Hoy día se hace de manera automática. o La PCR tiene varias aplicaciones: en criminología sirve para obtener copias de la muestra de ADN de los sospechosos (huella genética), pruebas de paternidad, y recuperación de ADNs de especies extinguidas o a punto de extinguirse.

Reacción en Cadena de la Polimerasa  Los fragmentos de ADN amplificados pueden ser analizados de diferente forma:  Visualización del fragmento de ADN en un gel de agarosa, por electroforesis, proceso mediante el cual se produce la separación por difusión bajo la acción de un campo eléctrico.  Hibridación con una sonda marcada radioactivamente, cuya secuencia de bases complementarias está contenida en el fragmento de interés.  Colocar directamente el ADN en forma de pequeñas manchas (dot blot) para su posterior hibridación con la sonda. La localización de la sonda radioactiva se logra mediante autoradiografías.

Reacción en Cadena de la Polimerasa Utilidad en general y en medicina veterinaria: • Es un instrumento valioso en la determinación de lazos de parentesco o en pruebas de paternidad. • • • •

También sirve en el diagnóstico de enfermedades En el desarrollo de vacunas En el estudio de especies extinguidas En la determinación del sexo en embriones, identificación de embriones potencialmente transgénicos, • Investigación de mutaciones en embriones • Clonación de genes de secuencia desconocida, • Variaciones génicas en poblaciones.

Organismos transgénicos •

Son especies cuyo genoma ha sido alterado por la transferencia de genes, es decir que posee genes extraños integrados en su patrimonio genético.

•

Debido a su importancia genética, en vegetales se ha utilizado la técnica del rADN en la obtención de mejores variedades.

Animales transgénicos •

El primer caso se conoció cuando en 1982 dos investigadores en EEUU obtuvieron ratones de entre dos y tres veces mayores a lo normal. Habían transferido por microinyección el gen de la hormona de crecimiento a células huevo de ratón y luego implantaron estas células en oviductos de hembras capaces de llevar a cabo la gestación.

•

Para la obtención de los animales transgénicos, los principales procedimientos son: la microinyección y la utilización de virus como vectores.

Microinyección • Consiste en inyectar el gen de interés a uno de los pronúcleos procedentes de las células sexuales masculinas o femeninas. Así, se obtuvieron los ratones transgénicos. De cada 100 embriones manipulados, se obtienen 1 a 5 ratones transgénicos, este valor disminuye en mamíferos. • Este procedimiento se ha usado para obtener la primera cerda transgénica que produce una proteína humana de interés terapeútico. • La leche de “Genie” produce la proteína C que controla la coagulación de la sangre. • Al año de vida, cuando la cerda llegó a su madurez, se comprobó que la cerda producía la proteína humana en su leche.

MICROINYECCIÓN oSe construyó un fragmento de ADN con una copia del gen humano de interés y una secuencia promotora. oEl promotor procedía del gen que codifica la proteína de la leche del ratón. oSe recogieron los embriones de una cerda donante y se seleccionaron los huevos fecundados, estos se inyectaron con el ADN extraño usando una micropipeta de cristal. El ADN se inyectó en la región del pro núcleo macho y el ADN extraño se incorporó en uno de los cromosomas del cerdo. oLas células fecundadas se implantaron en una cerda madre “de alquiler” y se obtuvo la lechona portadora del ADN extraño en todas sus células.

Genie

Utilidad de los anímales transgénicos Sirven para suministrar información sobre la función del gen y la regulación de su expresión, es decir su traducción en proteína. El gen insertado puede determinar la síntesis de una sustancia útil que se puede extraer, en especial de la leche (proteínas), cuando se trata de un mamífero.

Mejora en la producción animal. Por transferencia de genes humanos a los cerdos, se intenta conseguir que los órganos de este animal se pueden utilizar para ser transplantados al hombre. Todavía es insuficiente el conocimiento de los genes que sería interesante transferir para alcanzar estos objetivos.

Utilidad de los animales transgénicos Científicos de INTA Balcarce y de la universidad de San Martín lograron producir la primera vaca transgénica capaz de producir leche maternizada. Es decir, que en adulto la leche contenga dos proteínas importantes para los humanos, la lisozima y la lactoferrina.

La lisozima tiene propiedades antibacterianas que los bebés necesitan y normalmente absorben al mamar de pecho de su mamá. La lactoferrina, involucrada en la incorporación del hierro a los glóbulos rojos, necesario para la correcta oxigenación de la sangre. La leche de vaca también la lleva pero no es igual a la humana y por ende no funciona de la misma forma.

Rosita

Otras aplicaciones • •

• •

Gato modificado genéticamente con la inserción de un gen que codifica una proteína: PROTEINA FLUORESCENTE VERDE (GFP: Green fluorescent proteín ). Esta GFP fue el descubrimiento por el otorgara a 3 científicos el premio nobel de química en 2008. La proteína se usa para evaluar si un gen insertado se está expresando o para evaluar la extensión de tejidos tumorales, entre otras aplicaciones. Tiene su origen en las medusas. Este tipo de modificación genética es más simple y eficiente que los tradicionales de clonación. Los gatos son susceptibles al virus de la inmunodeficiencia felina [FIV], un pariente cercano del VIH, la causa del SIDA. La aplicación de la nueva tecnología es desarrollar el uso de gatos genéticamente modificados para el estudio de la FIV, proporcionando información valiosa, a su vez, para el estudio del sida.

• Se sabe que los gatos son una de las pocas especies animales que normalmente son susceptibles a estos virus, y de hecho están sujetas a una pandemia, con síntomas tan devastadores en los gatos como los que ya que son para los humanos. • •

Se aclara que esto no produce nada en la salud del gatito Fuente: http://www.guardian.co.uk/science/2011/sep/11

BIBLIOGRAFÍA •DE ROBERTIS, E. D. Y E. M. DE ROBERTIS (h). Biología celular y Molecular. El Ateneo, 1983.

•Klug, W. S.; Cummings, M. R.; Spencer, C. A. 2006. CONCEPTOS DE GENÉTICA. 8va. Ed. Pearson. Prentice Hall. •Pierce,B. A. 2005. GENÉTICA. Un enfoque conceptual. 2da. Edición. Ed. Médica Panamericana •Tamarin, R. 1996.PRINCIPIOS DE GENÉTICA. Reverté S. A.