BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Desde hace unos años estamos asistiendo a una revolución tecnológica. Jugando un papel destacado en este contexto se encuentra la Biotecnología. Esta es una ciencia que aprovecha los conocimientos biológicos y químicos y los integra con el fin de desarrollar técnicas de producción industrial. Para alcanzar el logro de sus objetivos se sirve de elementos vivos tales como microorganismos y células vegetales o animales o bien de sus elementos constituyentes (enzimas, ácidos nucleicos). Es por esto que los conocimientos integrados provienen fundamentalmente del campo de la Bioquímica, Microbiología e Ingeniería Genética. La Biotecnología busca el desarrollo de técnicas dirigidas a reprogramar las células vivas para la obtención de productos óptimos. Así pues los conocimientos biológicos solo serán útiles en el campo biotecnológico cuando sean susceptibles de ser aplicados a procesos de producción, reproducibles, cuyo rendimiento y calidad permitan una aplicación industrial en gran escala. En este momento y mediante el empleo de dos herramientas importantes: cultivo in vitro y técnicas de transformación genética, las plantas van en camino de convertirse en industrias en miniaturas capaces de producir fármacos, lubricantes, nuevas fibras textiles (algodón que no se arruga), plásticos biodegradables y hasta vacunas. Las ventajas de los vegetales son cada vez más evidentes: son laboratorios naturales, eficientes, baratos e incansables y aceptan con docilidad la introducción de un gen foráneo. Cultivo in vitro En 1902 Gottlieb Haberlandt, un botánico austríaco enunció la hipótesis que toda célula viva posee potencialmente la propiedad de regenerar la planta de la cual es extraída. Si bien este investigador no pudo probar su hipótesis que se logró recién en 1957, ella constituye el principio rector del cultivo in vitro de los vegetales. Este principio expresa que toda célula viva cualquiera sea su grado de especialización, conserva su genoma intacto. En consecuencia toda célula aislada es equivalente a un zigota y por ende posee la potencialidad para convertirse en una planta entera, exactamente igual a la que le dió origen. Este hecho condujo al concepto de totipotencialidad de las células vegetales, es

decir que contienen toda la información genética necesaria para la especificación del organismo, aunque normalmente solo se expresa parte de ella. De esto se desprende que el desarrollo y la diferenciación implican el control selectivo de la expresión genética. La regeneración de plantas a partir de cultivos de tejidos y su conversión en una planta entera están regulados al menos en parte por una o varias de las cinco hormonas o grupos de hormonas más importantes: auxinas, citoquininas, giberelinas, ácido abscicico y etileno. Estos procesos también están influenciados por factores ambientales como: tipo de luz, longitud de día, gravedad, temperatura. Actualmente existen pruebas claras de que las respuestas a estas señales también suponen cambios en la expresión genética. Es por ello que para desarrollar un cultivo de tejido no solo debemos tener en cuenta la presencia de macronutrientes y micronutrientes (nitrógeno, carbono, vitaminas, aminoácidos, sales) en el medio de cultivo sino también la presencia de reguladores de crecimiento y las condiciones ambientales. Cuando en muchos órganos (tallos, hojas, pecíolos, etc) se produce una herida, sus tejidos (meristemas, parénquima, floema joven) responden dando origen por mitosis a una masa de células parenquimatosas denominada callo. Esta formación celular es una reacción al trauma, en la cual intervienen auxinas, citoquininas y etileno. Estas hormonas se trasladan a los tejidos dañados en dirección basípeta, generando un callo. Mientras esta masa celular se halla adherida al órgano original y en condiciones de humedad, temperatura y radiación adecuada sigue proliferando hasta alcanzar un volumen de varios cm, dimensión que depende de las reservas del órgano que le dio origen y de la cantidad del medio de cultivo. El callo puede ser separado del órgano original asépticamente y ser cultivado in vitro de manera aséptica por tiempo indefinido en un medio sólido. Un cultivo in vitro en sentido amplio comprende un grupo heterogéneo de técnicas mediante las cuales, un explanto (parte separada de un vegetal: órgano, tejido, célula, protoplasto) se cultiva asépticamente en medios nutritivos artificiales de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Para realizar un cultivo in vitro hay varias operaciones importantes a realizar: 1- Selección del explanto: Aislar una parte del vegetal a partir de la planta entera. Una

amplia variedad de órganos y tejidos vegetales pueden usarse como explantos para la iniciación de los cultivos de tejidos. En las plantas, la división celular coordinada tiene lugar en los meristemas. Las células parenquimáticas no divididas, las células de los meristemas, tejidos del cambium vascular y los tejidos embrionarios que están en los estadíos tempranos de desarrollo pueden proliferar rápidamente (desdiferenciarse) para producir un callo. Generalmente se utilizan como explantos tejidos meristemáticos ya que estos están libre de infección por virus (estos tejidos están desprovistos de tejido vascular) y se encuentran en activa división mitótica. El tratamiento con calor, 34-36C previo a los cultivos de meristema asegura la inactivación de virus. La selección del explanto es crítica si se quiere regenerar a partir de él una planta o producir metabolitos secundarios. 2- Desinfección de los explantos: Se puede utilizar hipoclorito de sodio entre el 1 y 2 % o hipoclorito de calcio entre el 9 y 10% para tallos, pecíolos, raíces y frutos. Etanol al 70% se utiliza para desinfectar hojas y semillas. Los tiempos de contacto con el agente son variables. 2- Cultivo de los explantos: Se debe proveer al explanto del medio ambiente apropiado en el que pueda expresar su capacidad morfogenética. Composición básica de los medios de cultivos utilizados: Los medios de cultivos deben tener: Macronutrientes inorgánicos: Fe, Ca, Mg, K, N Micronutrientes inorgánicos: Mn, Cu, Zn, B, Na, Cl, I, S, Mo, Co, Al y Ni Fuente de N orgánico: glicina e inositol Vitaminas: ácido nicotínico, piridoxina, tiamina Fuente de carbono: glucosa o sacarosa Reguladores de crecimiento: auxinas y citoquininas Compuestos orgánicos opcionales: hidrolizado de caseína, extracto de levadura Antibióticos Agente gelificante: agar entre 0,5-1% A partir del explanto cultivado y según las condiciones de cultivo se puede inducir la formación de un callo (una masa desorganizada de células no diferenciadas). La formación

de un callo puede llevar varios meses y puede ser subcultivado en 4 a 6 semanas a una temperatura de 20 a 25C en oscuridad o bajo iluminación suave. El callo prolifera activamente sin diferenciar tejido vascular. Solo cuando alcanza un tamaño voluminoso se puede observar protoxilema y una médula incipiente. En 4 a 6 semanas el tejido explantado ha producido su peso en tejido calloso el cual continúa creciendo si se separa y pasa a un medio nutritivo nuevo. Por tanto la producción de un callo puede considerarse como la desdiferenciación de un tejido organizado. Cuando las condiciones nutritivas y hormonales son las adecuadas, la morfología del callo puede describirse como friable (las células están asociadas de manera laxa) o compacta (si las células se agregan más densamente). La diferencia entre ambos callos se debe a la composición de la pared celular (compactos: mayor cantidad de pectina y hemicelulosa). Normalmente un callo friable en medio líquido con agitación se dispersa pronto y forma un cultivo en suspensión. Un callo puede ser roto mecanica, química o enzimáticamente en una suspensión uniforme de células únicas o en ramillete que pueden crecer en un medio líquido en suspensión. Durante el desarrollo de los callos se va monitoreando el peso seco, fresco, el número de células y la viabilidad. En condiciones de cultivo apropiado, la masa celular conocida como callo puede formar tallo y raíces (Fig 1) y eventualmente regenerarse en una planta entera (organogénesis indirecta). Si la relación citoquinina/auxina es alta desarrollan tallos (caulogénesis). Si la relación citoquinina/auxina es baja, se desarrollan raíces (rizogénesis). Todavía está en discusión si la organogénesis se inicia a partir de una célula única o de un grupo de ellas. Características del crecimiento La curva de crecimiento es sigmoidal. Hay una fase de latencia, una fase exponencial, una fase lineal o estacionaria Fase de latencia: En la que no hay división celular, se preparan las células para la mitosis, hay aumento de ATP, aumenta la síntesis de RNA, DNA y proteínas. Fase exponencial: las divisiones celulares alcanzan un máximo. En esta etapa las células están indiferenciadas con microvacuolización y acumulan pocos metabolitos secundarios. Fase lineal y estacionaria: Gradualmente disminuyen las divisiones celulares, prosiguiendo la vacuolización. Disminuye la actividad respiratoria, la síntesis de RNA y proteínas.

Aumenta la expansión y la acumulación de metabolitos secundarios (aprovechamiento biotecnológico). Todo el ciclo de crecimiento es una continuidad de cambios fisiológicos y en cualquier momento podrá encontrarse un espectro de células con morfología, comportamiento bioquímico y genético diferente.

Utilidades de los cultivos de tejidos y células 1- Regeneración de una planta a partir de cultivo de tejidos. Puede llevarse a cabo por tres caminos diferentes 

Organogénesis :

Organogénesis indirecta: a partir de un explanto (meristema) se desarrolla un callo, a partir de este se induce la caulogénesis y la rizogénesis. Se separan las plántulas las cuales se pueden rusticar (llevar a campo). Organogénesis directa: a partir de un explanto se induce la caulogénesis y la rizogénesis sin pasar por la etapa de callo. 

Cultivo de embriones cigóticos : se hace cuando la fecundación (entre dos especie

cruzadas sexualmente, taxonómicamente alejadas) tiene éxito, pero el embrión no consigue desarrollarse. Se puede extirpar y cultivar al embrión cigótico inmaduro para regenerar plantas híbridas. 

embriogénesis somática o asexual:

meristemas caulinares, trozo de tallo, raíz u hojas se colocan axénicamente en un medio de cultivo apropiado (medio sólido con 2,4 D). Una vez que desarrolla un callo friable, se dispersan las células en medio líquido (eliminando el 2,4 D). Se regula la composición del medio para diferenciar embrioides (105 embrioides por gramo de tejido). Luego se hace un cribado, aislando los embrioides de tamaño uniforme. Estos se subcultivan en medio sólido sin hormonas. Desarrollan las plántulas, las que luego se rustican. Las auxinas inducen y mantienen el embrión, la eliminación de las auxinas provoca su maduración. Las sales de amonio, la leche de coco, hidrolizados de caseína son coadyudvantes de la embriogénesis. Entre los aportes importantes de la embriogénesis somática es que los embriones somáticos pueden encapsularse en una matriz de alginatos sumergiendo los embriones en alginato sódico y solución nutritiva en CaCl2 5 mM. Los iones Calcio inducen un rápido

entrecruzamiento del alginato que formará esferas sólidas (5mm) que contienen los embriones. En la solución se pueden incluir aditivos, como fungicida y nutrientes antes del entrecruzamiento como en el caso de las semillas encapsuladas. Es posible deshidratarlos y almacenarlos hasta que se necesiten en el campo. Por esta técnica se han logrado semillas encapsuladas de alfalfa, apio, coliflor.

2- Regeneración de plantas a partir de protoplastos Algunos explantos pueden ser usados como fuente de protoplasto. El aislamiento de protoplastos viables capaces de una división celular sostenida y la regeneración a plantas está restringida a un número pequeño de combinaciones especie/explanto. Los protoplastos pueden cultivarse en medio líquido o en medio semisólido. Así el agar o agarosa provee el sustrato ideal para facilitar el desarrollo de la pared celular. Los protoplastos no comienzan a dividirse hasta que no se ha formado una nueva pared celular. Por fusión de protoplastos (métodos químicos o eléctricos) se pueden obtener híbridos somáticos. Para realizar la fusión se desestabiliza la membrana plasmática, se forman poros permitiendo las uniones citoplasmáticas entre protoplastos adyacentes a través de los mismos.

3- Producción de metabolitos secundarios La importancia biotecnológica de los metabolitos secundarios es múltiple: a- Compuestos químicos de valor comercial b- Compuestos tóxicos que deben eliminarse de los alimentos c- Agentes protectores utilizados por la planta contra agentes patógenos, insectos o animales herbivoros. c- Compuestos alelopáticos Un gran número de compuestos químicos importantes desde el punto de vista comercial derivan directamente de material vegetal y se trata casi invariablemente de metabolítos secundarios, con frecuencia difíciles de sintetizar químicamente. La aplicación de estos productos puede clasificarse en cinco grupos: fármacos, aromatizantes, perfumes, pigmentos, plaguicidas.

La posibilidad de usar células cultivadas en lugar de plantas cultivadas ofrece ventajas potenciales: a- Condiciones ambientales controladas b- ausencia de enfermedades, plagas, inundaciones, sequías, etc. c- la producción en forma continua La acumulación de un producto dado está limitada por a- heterogeneidad e inestabilidad de la expresión genetica y de la actividad metabólica de una población o células cultivadas b- La producción de metabolitos está inversamente relacionada con la tasa de división celular. La acumulación de metabolítos secundarios se produce en la fase de post división del ciclo de crecimiento celular. Las estrategias para la producción de metabolitos secundarios son dos: a- Sistemas de fermentadores en los cuales las células suspendidas libremente crecen hasta una fase estacionaria recuperándose a posteriori para extraer producto (fig 2) b- Sistemas de células inmovilizadas. La inmovilización de células o protoplastos puede realizarse por dos vías (tabla 1) 

imbibición: células o protoplastos embebidos en un gel polimérico o una mezcla de

geles tales como alginato de calcio, agar, agarosa 

Atrapamiento: inmovilización de células en espumas o mallas preformadas o en un

sistema de membranas de fibra hueca (acetato de celulosa, policarbonato de silicona) dispuestas como fibras tubulares, en cartuchos o en haces paralelos. Las células están atrapadas en los espacios comprendidos entre las membranas de las fibras que son permeables al medio líquido que atraviesa la cavidad de la fibra. La fibra de poliuretano reticulado es la más usada. En este sistema el objetivo es conseguir un proceso de producción continuo o semicontinuo que requiere a su vez que el producto se libere naturalmente o que la liberación pueda inducirse permeabilizando las células. Se puede utilizar como agente permeabilizante dimetilsulfóxido (DMSO). Las ventajas de este sistema son que reutiliza la biomasa, presenta resistencia a los daños por cizalla y la fase de producción es larga en proporción a la del crecimiento de masa.

Con el primer sistema la Mitsui Corporation de Japón ha desarrollado la producción de shikonina por células cultivadas de Lithospermum erythrohrizon en dos fases Primera fase: obtención de una masa celular. Segunda fase: transferencia al medio de producción que favorece la biosíntesis de shikonina a expensas de la división celular.

4. Estudio del metabolismo secundario Dilucidar los caminos que conducen a la biosíntesis de productos naturales muchas veces resulta difícil por cuanto las plantas sintetizan productos naturales a velocidades relativamente bajas, la concentración de las enzimas que catalizan los distintos pasos de la biosíntesis en el estado estacionario son bajas, las altas concentraciones de taninos y otros compuestos fenólicos presentes en los tejidos vegetales interfieren en la extracción de enzimas activas y por otro lado la concentración de los productos naturales en los diferentes tejidos por lo general es baja. El estudio en cultivos de células es ventajoso con respecto a la planta entera por varios motivos: Disponibilidad de material todo el año Estado no-diferenciado relativamente uniforme de las células Ausencia de microorganismos interferentes Los cultivos de células pueden sintetizar grandes cantidades de metabolitos secundarios en un período de dos semanas. Esto es una ventaja ya que en plantas enteras pueden demorar desde una estación en plantas anuales a varios años para especies perennes. Así, por ejemplo la biosíntesis de alcaloides se clarificó bastante empleando técnicas de cultivo de células. 

En los cultivos de células la velocidad de biosíntesis de estos compuestos puede incrementarse facilitando su estudio

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Las hormonas regulan la acumulación de alcaloides



La acumulación de alcaloides puede ser inducida por la adición de factores abióticos y bióticos.

Más de 80 nuevas enzimas que catalizan pasos en la biosíntesis de indol, isoquinolina, tropano, pirrolizidina, acridona y alcaloides de las purinas han sido descubiertas por

cultivo de células. Sin embargo algunos alcaloides de interés farmacéutico como la vincristina, vinblastina, pilocarpina, morfina y codeína no son sintetizados en concentración adecuada por cultivo de células. La razón de esto es la expresión órgano específica de los genes que participan en la biosíntesis de alcaloides. Por otro lado trabajar con cultivos de células nos permite estudiar como se regula la actividad de las enzimas que participan en los caminos biosintéticos.

Transformación genética: introducción en una célula de una molécula de DNA cuya información se incorpora al genoma de esa célula. Las etapas de transformación involucran: 1- Preparación del DNA transformante 2- Preparación del material a ser transformado (planta, tejido, protoplasto, etc) 3- Transformación por métodos directos o indirectos 4- Análisis de transformantes Métodos de transformación 1- Métodos indirectos: Los métodos indirectos usan como vectores virus o bacterias Métodos indirectos usando como vector una bacteria El Agrobacterium es una bacteria Gram negativa del suelo de la familia Rhizobiaceae igual que el Rhizobio. Hay cuatro especies de Agrobacterium el Agrobacterium tumefaciens (produce agallas de corona (fig 3), crecimiento canceroso formado por una proliferación desorganizada de células no diferenciadas de la planta, encontrados a nivel del suelo en la unión del tallo con la raíz), Agrobacterium rubí (produce teratomas con células diferenciadas las que aparecen como tallos o raíces), Agrobacterias rhizogenes (produce raíces en cabellera) y Agrobacterium radiobacteres (avirulento, no produce tumor). Por tanto el Agrobacterium es un agente “oncogénico” que transforma genéticamente células vegetales y dirige en los tumores producidos la síntesis de nutrientes especiales que soportan el crecimiento de las bacterias. Unicamente la cepa de Agrobacterium implicada adquiere la ventaja competitiva de utilizar como fuente de energía los nutrientes producidos por el tumor. El proceso de transformación conlleva la transferencia a la planta de información genética de la bacteria estimulada por compuestos exudados por las células

vegetales dañadas. Este es el único ejemplo conocido de intercambio de material genético entre reinos y se ha descripto como colonización genética. El Agrobacterium infectará una planta susceptible e inducirá el desarrollo del tumor únicamente en el lugar donde se ha producido la herida. Las células del Agrobacterium se unen a las células vegetales dañadas y causan posteriormente una proliferación celular localizada, que conduce al desarrollo de un tumor vegetal. Esos tumores se pueden extraer y cultivar in vitro y allí continuar creciendo indefinidamente sin suplemento de hormonas. Los tumores sintetizan una gama de aminoacidos poco frecuentes llamados opinas. La síntesis de opinas es una característica única de las células tumorales. Dentro de las opinas tenemos (fig4): a- octopinas: derivados carboxietílicos de la arginina b- nopalinas: derivados dicarboxipropílicos de la arginina. El Agrobacterium cataboliza las opinas para obtener energía en arginina y ácido piruvico. Cada cepa de Agrobacterium induce tumores que producen una opina específica. Esta opina puede entonces ser catabolizada únicamente por la bacteria inductora. El Agrobacterium tumefasciens presenta información cromosómica y plasmidica. El plásmido Ti presenta una región vir, una occ y un TDNA. Etapas de la infección de la célula vegetal por Agrobacterium tumefasciens (fig 5): 1- Etapa de Reconocimiento El reconocimiento de las células vegetales susceptibles está mediado por compuestos exudados por la planta, y por los genes localizados en la región vir del plásmido Ti. Una fase inicial de la interacción es la unión del Agrobacterium a la célula vegetal herida. Este proceso está controlado por dos locus de virulencia del Agrobacterium localizado en el cromosoma bacteriano, no en el plásmido Ti. Son genes no regulables, de expresión constitutiva. Los productos de esos genes solamente pueden promover la unión cuando el Agrobacterium está en la proximidad de la célula vegetal dañada, donde presumiblemente los sitios de unión llegan a estar expuestos después del daño. Las células vegetales excretan moléculas inductoras que activan ciertos genes en la región vir del plasmido Ti. En contraste con los genes de virulencia cromosómicos, los genes vir del plasmido Ti están estrechamente regulados. Concretamente hay dos compuestos de la planta que activan específicamente los genes vir del plásmido Ti. Son los

compuestos fenólicos vegetales (fig 4) acetosiringona (AS) y  hidroxiacetosiringona (OHAS). Aparentemente las células dañadas de plantas monocotiledóneas no exudan estos compuestos fenólicos inductores de los genes vir, por ello no son fácilmente infectadas por Agrobacterium. La región de virulencia del plasmido Ti tiene 6 genes: Vir A, VirB. VirC, VirD, VirE y VirG, la región Vir A codifica para una proteína de PM 92.000 con una secuencia hidrofóbica en el extremo amino terminal necesaria para el transporte de las moléculas inductoras de AS activas a través de la membrana plasmática, desde las células vegetales dañadas hasta el interior de la célula del Agrobacterium. AS actúa cooperativamente con la proteína VirG para inducir la expresión de Vir B,C,D,E. La expresión de estos genes es necesaria para la escisión del TDNA del plásmido Ti y su transferencia a la célula vegetal. 2- Escisión y transferencia del TDNA: El proceso comienza con el corte del DNA bicatenario cerca de los extremos del TDNA. Una secuencia repetida de 24 nucleótidos, llamada secuencia borde del TDNA juega un importante rol en el proceso de transferencia. De hecho cualquier secuencia del TDNA que estuviera localizada entre las secuencias bordes se transfiere a la planta y esta característica ha sido explotada en experimentos de manipulación genética. Las secuencias repetidas de nucleótidos de los bordes son similares en plásmidos Ti de nopalina y octopina y esta conservación sugiere un papel concreto para ella. El extremo derecho del TDNA está localizado a uno o dos nucleótidos de la secuencia de 24 pares de bases. El extremo izquierdo del TDNA es más variable y está localizado dentro de la secuencia de 24 pb o 100 nucleótidos a la derecha. La delección del borde derecho del TDNA suprime por completo la integración. El operón virD codifica para una nucleasa que inicia el proceso de transferencia cortando una de las cadenas de TDNA en el borde derecho, luego una cadena (T) es pelada y finalmente cortada en el borde izquierdo. Se sabe relativamente poco acerca de cómo la cadena T es posteriormente transportada al núcleo de la planta aunque probablemente tiene lugar como un complejo DNA-proteína. Se sabe que tanto la cadena lineal T como la cadena circular T pueden ser parte del proceso de transferencia originándose la última a partir de la primera. 3- Integración del TDNA : El mecanismo de integración del TDNA en el DNA cromosómico de la planta aún no es conocido pero un mapeo detallado mostró que el TDNA del plásmido de nopalina se integraba en el DNA de la planta como un trozo único.

En la mayoría de las líneas celulares tumorales de nopalina solamente uno o unas pocas copias de TDNA se integran por genoma haploide. 4- Funciones codificadas por el TDNA integrado: Ciertas funciones de la región del TDNA se expresan después de su integración: -

Síntesis de octopinas

-

Enzimas nopalina sintetasa y octopina sintetasas en los locus occ y nos de los plasmidos

octopina y nopalina respectivamente. 5- Síntesis de Hormonas: El ácido indol 3 acético se origina a partir del triptofano en dos pasos catalizados por enzimas codificadas por el locus aux del TDNA. La citoquinina isopentenil adenosina se sintetiza en un solo paso catalizado por la isopenteniltransferasa codificada por el gen cyt del TDNA. La presencia de estos oncogenes explica la independencia hormonal de las células tumorales y las características morfológicas del tejido tumoral. Basados en esta capacidad de transferencia del TDNA del plásmido Ti del Agrobacterium, los biotecnólogos utilizaron al Agrobacterium como una herramienta para transferir genes extraños a los cromosomas hospedadores. La fig. 6 esquematiza el plásmido Ti de Agrobacterium salvaje. La estrategia para usar el plásmido Ti en una transferencia genética es la del vector binario. El gen de interés y un gen marcador son introducidos entre las secuencias bordes en un plásmido pequeño capaz de replicar en Agrobacterium. La cepa de Agrobacterium a su vez contiene un pTi desarmado que posee una región de virulencia pero sin la región TDNA. La fig.6 muestra un plásmido TDNA binario y un plásmido Ti desarmado, en el que los genes vir del plásmido Ti actuan en trans para transferir el TDNA, que contiene el gen seleccionable y el gen extraño, a los cromosomas hospedadores. La Tabla 2 muestra ejemplos de genes seleccionables dominantes marcadores e informadores cuya expresión evidencian la transformación genética. En la Tabla 3 podemos ver ejemplos de plantas agrícolas transformadas por medio de Agrobacterium.

Agrobacterium y Rhizobium Ambos están estrechamente relacionados, se comunican con las células vegetales vía compuestos difusibles y cada uno de ellos induce una alteración del crecimiento de la

planta bajo control genético de un plásmido. En el primer caso la asociación es patogénica para la planta, en el segundo es beneficiosa. EL DNA del plásmido Ti del Agrobacterium tumefasciens se integra en los cromosomas del hospedador, el DNA del Rhizobium no lo hace. 2- Métodos directos de transformación : Microinyección de DNA. Una de las desventajas que presenta este método es que las células vegetales son más difíciles de inyectar que las animales por dos motivos: por un lado la pared celular de lignina y celulosa hace que sea más difícil de penetrar con una microaguja y por otro lado la presencia de una vacuola que contiene hidrolasas y compuestos tóxicos, si el contenido vacuolar se descarga en el citoplasma, podría matar a la célula. Hay varios sistemas para inyectar las células vegetales o protoplastos, uno de ellos usa dos micromanipuladores, uno sostiene el protoplasto y con el otro se inyecta el DNA. Otra de las desventajas que presenta esta metodología es que insume mucho tiempo, los protoplastos pueden ser inmovilizados a un vidrio con poli L lisina pero este resulta tóxico para algunas especies, o bien se pueden embeber en agarosa pero esta disminuye la visibilidad y hace difícil la inyección (fig 7). Biobalistica: El DNA transformante se introduce en el tejido a transformar por descarga de un revólver que utiliza como microproyectil partículas de oro o tungsteno cubiertas con DNA transformante. Las partículas son aceleradas con un pulso a baja Presión de Helio (1300 Psi). El influjo de Helio se regula a traves de una válvula selenoide. Este método permite la transformación de especies recalcitrantes al método convencional del Agrobacterium o por fusión de protoplastos. Este es un método apropiado para transformar monocotiledóneas (fig 8,9) Fusión de protoplastos La eliminación de las paredes celulares proporciona protoplastos aptos para varias técnicas de manipulación genética, en particular aquellas basadas en la fusión de diferentes tipos de protoplastos. Entre ellas se encuentran a) La combinación de dos genomas completos b) La transferencia parcial del genoma de un protoplasto donante a uno receptor, para producir híbridos asimétricos. c) La transferencia de orgánulos (producción de cíbridos), principalmente cloroplastos

y mitocondrias, para transferir así propiedades tales como la resistencia a herbicidas y la androesterilidad citoplasmática. Cuando se realiza la fusión de protoplastos, se obtiene una célula con dos o mas núcleos. Si los protoplastos proceden de diferentes tipos de células parenterales se denominan heterocariontes y si se originan de células genéticamente iguales homocariontes. Se denomina híbrido cuando se ha producido la fusión de los núcleos en el heterocarionte. Si se elimina algún cromosoma de uno de los núcleos parenterales, se pueden obtener híbridos parciales (fig.10). Durante el cultivo posterior se puede producir segregación y recombinación entre los genomas mitocondriales mientras que los genomas de los cloroplastos normalmente no se recombinan. Por tanto, las plantas regeneradas pueden contener núcleos híbridos, genomas mitocondriales híbridos, pero los cloroplastos procederán de una u otra célula parenteral. La fusión de protoplastos puede desarrollarse por métodos químicos y eléctricos (electrofusión) Fusión inducida por métodos químicos: Para que se inicie la fusión de los protoplastos, sus membranas plasmáticas deben estar en estrecho contacto. La carga neta negativa de la superficie de los protoplastos tiende a repeler a los protoplastos adyacentes. Para superar esta repulsión y desestabilizar las membranas plasmáticas adyacentes e inducir la fusión se utilizan fusógenos químicos, entre los que se encuentran algunos reactivos que modifican la carga de la superficie mediante la manipulación del pH, la adición de policationes o la deshidratación de los protoplastos. El método de fusión química más utilizado es la adición de polietilenglicol que produce la aglutinación de los protoplastos y la distorsión, seguido de la elución con un tampón hipotónico de pH elevado (pH 9 a 11) que contiene a su vez niveles elevados de calcio(Tabla 4). El mecanismo por el que se produce la fusión puede requerir la difusión lateral de proteínas en las membranas en contacto, creándose así dominios ricos en lípidos que se desestabilizan y fusionan. Esta estrategia se ha usado para crear plantas híbridas somáticas. Electrofusión Este proceso comprende dos etapas. 1- Los protoplastos se disponen en un medio de baja conductividad entre dos electrodos, aplicándose entre ellos un campo alterno de alta frecuencia. Por un proceso conocido como dielectroforesis, se polariza la carga superficial de los protoplastos, los cuales se comportan como dipolos, migrando a las regiones de mayor intensidad de campo. Durante la

migración a lo largo de las líneas del campo, los protoplastos contactan unos con otros formando cadenas paralelas a las líneas del campo aplicado. La longitud de las cadenas depende de varios factores, entre los que se incluyen la densidad de protoplastos, la fuerza del campo y el tiempo durante el que se aplica el campo. 2- Cuando los protoplastos se han alineado en cadenas, se aplica uno o más pulsos cortos de corriente directa, lo cual es suficiente para romper reversiblemente las membranas (formación de poro). Entonces, las membranas en contacto pueden fusionarse. La fusión es al azar y genera una mezcla de protoplastos homocariontes no fusionados y fusionados y heterocariontes fusionados. Esta metodología es preferible a la fusión química ya que es más reproducible y no daña a los protoplastos pero demanda equipamiento. Los híbridos se seleccionan y se transfieren a un medio de regeneración. Los parámetros de selección incluyen : características morfológicas, citológicas (número de cromosomas) y bioquímicas (isoenzimas, resistencia a la infección por bacterias y hongos, sensibilidad a toxinas, herbicidas etc). Las soluciones de electrofusión son isotónicas. Se reduce la presión osmótica del medio tanto como sea posible sin causar la lisis del protoplasto pero aumentando el diámetro del protoplasto, aumentando el voltaje a través de la membrana. Las soluciones son no iónicas (manitol, sorbitol, sacarosa o glucosa) solas o en combinación con Calcio lo que ayuda a estabilizar la membrana plasmática y mejora la eficiencia de la fusión (Fig 11) Electroporación: Permeabiliza transitoriamente a las membranas de células eucariotas y procariotas con un pulso eléctrico permitiendo la captación de una gran variedad de moléculas biológicas. La gran ventaja de la electroporación es la reproducibilidad y simpleza de la técnica. Permite la integración de secuencias transgenes nucleares, plastídicas o mitocondriales. Se necesita un equipo de electroporación. Aplicaciones de los métodos de transformación: La Ingeniería metabólica de las plantas medicinales puede ser la biotecnología farmacéutica del futuro ya que puede alterar la síntesis de productos naturales. Ejemplo 1- Las Solanaceas han sido usadas tradicionalmente por sus propiedades medicinales, alucinógenos y venenos, que derivan en parte de los alcaloides del tropano. La fuente comercial de escopolamina es Duboisia, que es cultivada en Australia, Indonesia y Brasil. Otras especies producen hiosciamina en lugar de escopolamina. Recientemente un

cDNA que codifica para hiosciamina 6-B hidroxilasa de Hiosciamus niger ha sido introducido en Atropa belladona mediante A. tumefasciens y A. rhizógenes. Las plantas transformadas contienen raíces en cabellera conteniendo altas concentraciones de escopolamina. Esta planta trangénica es el primer ejemplo de cómo una planta medicinal puede ser alterada usando técnicas de biología molecular para aumentar las cantidades de un alcaloide importante medicinalmente (Fig.12). Ejemplo 2- Otro ejemplo importante de cómo la ingeniería metabólica puede alterar la síntesis de productos naturales es la transformación de Brassica napus (canola) con el cDNA de Catharantus roseus que codifica para la triptofán descarboxilasa, enzima que participa en la biosíntesis de alcaloides indólicos monoterpénicos. Como consecuencia de esta transformación, las semillas maduras de canola contienen menos glucosinolato (compuestos de S que confiere mal sabor) haciendo mas apropiado para alimento animal y convirtiendolo en un producto con potencialidad económica (Fig.13). Ejemplo 3- Las plantas transgénicas pueden aumentar la resistencia a patógenos, mejorar la calidad de la madera, de las fibras, aumentar o disminuir los niveles de lignina, etc.

Resumen esquemático de los sucesos que conducen a la transformación de células vegetales por cepas de Agrobacterium productoras de octopina Las células heridas de la planta exhiben sitios de unión para la adhesión del Agrobacterium, proceso que es mediado por la expresión del locus chvA y B del cromosoma bacteriano (1). La AS excretada por las células vegetales dañadas (2) es transportada al interior de la bacteria por el producto del gen vir A (3), una proteína de membrana codificada por la región vir del plásmido Ti. La acetosiringona interacciona con el producto del gen vir G que posteriormente activa el resto de los genes vir (4) necesarios para movilizar y transferir el TDNA. El gen vir D controla la escisión del TDNA (5) y según una teoría una sola cadena, la cadena T (6), es transportada a la célula vegetal e integrada en el DNA nuclear (7). La expresión de los genes onc del TDNA, que especifican la biosíntesis de hormona causa el crecimiento del tumor (8). La octopina sintetizada en las células de las plantas transformadas (9) entra a la célula del Agrobacterium donde induce la expresión de dos locus del plásmido Ti (10), uno para el catabolismo de la octopina (occ) y otra (tra) que promueve la transferencia conjugativa del plásmido Ti a agrobacterias que carecen de él.