ENZIMOLOGÍA VEGETAL Enzimología vegetal. Problemas propios del manejo de las enzimas vegetales. Cinética enzimática utilizando los principios del cuasi-equilibrio o equilibrio rápido. Regulación del metabolismo en la célula vegetal. Las enzimas son sustancias que poseen una extraordinaria capacidad catalítica (1), tienen un alto grado de especificidad por sus sustratos (2), aceleran reacciones químicas específicas (3) y funcionan en soluciones acuosas bajo condiciones suaves de temperatura y pH (4). Las enzimas, actuando en secuencias organizadas, catalizan los cientos de reacciones que ocurren en una vía metabólica mediante la cual un nutriente es degradado o biosintetizado asegurando la supervivencia y proliferación celular. Algunas de las enzimas son reguladoras, esto es, que pueden responder a varias señales metabólicas cambiando de acuerdo a éstas su actividad catalítica. A través de la acción de las enzimas reguladoras, los sistemas enzimáticos están altamente coordinados para formar un conjunto armónico entre las diferentes actividades metabólicas y de esta manera sostener la vida. PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS Las enzimas, son proteínas con excepción de un pequeño grupo de moléculas de ARN que también poseen actividad catalítica (ribosimas). En el caso de tratarse de proteínas su actividad catalítica depende de la integridad de la conformación nativa, es decir, de las estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria (Esquema 1).
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Estructura primaria
Estructura secundaria (tipo hélice)
Estructura secundaria (hoja β)
Estructura terciaria
Estructura cuaternaria
Esquema 1: Estructura de las proteinas
La estructura tridimensional de una proteína prové una discriminación precisa en el reconocimiento de los ligandos -la molécula que interactúa con la proteína-. Una molécula de proteína está compuesta de varios dominios de masas moleculares de alrededor de 104 daltons. El sitio activo de una enzima- que es la región donde el sustrato se liga y la reacción catalítica ocurre- está localizado en la interfase entre dos dominios. Si la enzima es desnaturalizada o disociada en sus subunidades, en general, la actividad catalítica se pierde. Por otra parte, las enzimas, al igual que otras proteínas, tienen un peso molecular que oscila desde aproximadamente 12.000 hasta más de 1.000.000. Algunas requieren cofactores que pueden ser uno o más iones metálicos como por ejemplo Fe2+, Mg2+, Mn2+,Zn2+ o bien una molécula orgánica o metaloorgánica llamada coenzima. A veces ambos, es decir, una coenzima y uno o más iones metálicos para su actividad. Una molécula de enzima catalíticamente activa con su coenzima y/o iones metálicos se llama holoenzima. La proteína de esa enzima se llama apoenzima o apoproteína. La coenzima funciona como un transportador transitorio de grupos funcionales específicos.
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Tabla 1: Elementos inorgánicos (cofactores) necesarios para la actividad enzimática. Iones
Enzimas
Fe2+ o Fe3+
Citocromo oxidasa Catalasa Peroxidasa
Cu2+
Citocromo oxidasa
K+
Piruvato quinasa
Mg2+
Hexoquinasa Glucosa-6-fosfatasa Piruvato quinasa
Tabla 2: Transportadores transitorios de grupos de átomos o grupos funcionales (coenzimas). Coenzima Pirofosfato de tiamina
Grupo Transferido Aldehído
Coenzima A
Grupo acilo
Piridoxal fosfato
Grupo amino
Flavina adenina dinucleótido
Electrones
Nicotinamida adenina dinucleótido
Ión hidruro (:H-)
CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS Con el objeto de sistematizar el estudio de las enzimas, las mismas fueron clasificadas por el tipo de reacción que catalizan en 6 grupos. Cada uno de esos grupos tiene subclases basadas en el tipo de reacción que catalizan. A cada enzima se le ha dado un número de clasificación de cuatro dígitos y un nombre sistemático que identifica la reacción catalizada y un nombre trivial. Se las denomina con el sufijo asa añadido al nombre de su sustrato o con una palabra o frase que describe su actividad.
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•
Nomenclatura:
-
Número clasificatorio de 4 dígitos (E.C.)
-
Nombre sistemático
-
Nombre trivial
ATP + D-Glucosa
ADP + D-Glucosa-fosfato
Número clasificatorio: E.C. 2.7.1.1. 2. Clase: Transferasa 7. Subclase: Fosfotransferasa 1. Fosfotransferasas con OH como aceptor 1. D-glucosa como aceptor del fosfato Nombre sistemático: ATP:glucosa fosfotransferasa Nombre trivial: hexoquinasa Por acuerdo internacional se las ha clasificado en 6 clases principales. Nro Clase Grupo.
Tipo de reacción catalizada
1
Oxidorreductasas
Transferencia de electrones
2
Transferasas
Reac. de transferencia de grupos
3
Hidrolasas
Reac. de hidrólisis funcionales al agua)
4
Liasas
Adición de grupos a enlaces dobles o formación de enlaces dobles por eliminación de grupos.
5
Isomerasas
Transferencia de grupos dentro de una molécula para dar formas isoméricas.
6
Ligasas
Formación de uniones C-C, C-S, C-O y C-N por reacciones de condensación acopladas a la ruptura de ATP
(transferencia
de
grupos
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PRINCIPALES PROBLEMAS EN EL MANEJO (EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS)
DE
LAS
ENZIMAS
El primer paso en la obtención de una enzima es la degradación del órgano, tejido o células que la contienen. Para ello el órgano o tejido vegetal es desintegrado en licuadora, molido, o exprimido en juguera. Estos procesos deben ser efectuados siempre en frio (corrientemente entre 0-4°C), pero pueden hacerse a temperaturas inferiores como en el caso del molido del material vegetal verde que suele llevarse a cabo en morteros enfriados a -20 °C o en presencia de N2 líquido. Cuando se homogeneiza un tejido fresco es necesario utilizar una cierta cantidad de líquido. Este líquido o medio de homogeneización debe tener una composición adecuada para proteger la enzima que queremos extraer de posibles desnaturalizaciones. Así, si una enzima es sensible a los metales pesados podemos agregar un quelante (por ej. EDTA) al medio de homogeneización, evitando pérdidas de actividad por éste tipo de factor. Igualmente si la enzima es sensible a la oxidación, el medio de homogeneización puede llevar agentes reductores tales como la cisteína, mercaptoetanol u otros compuestos antioxidantes. Por lo general los tejidos vegetales tienen elevados niveles de enzimas proteolíticas y de compuestos fenólicos, por ello en el medio de extracción se agregan inhibidores de proteasas o sustancias que precipitan los polifenoles como la polivinilpolipirrolinona (PVPP). Además se buscará un buffer cuya composición, pH y concentración (fuerza iónica) mantenga lo mejor posible los niveles de la actividad enzimática en estudio. Por otra parte, deberán controlarse otros factores tales como la temperatura, ya que las proteínas son, generalmente, termolábiles y sin este control podríamos inactivar la enzima a extraer, o bien obtener rendimientos muy bajos que no reflejen los niveles de la actividad “in vivo”. En vegetales, generalmente se trabaja entre 04°C y a pH 7-7,5, ya que a este pH se consiguen mejores extracciones de proteínas. Una vez extraída la enzima debemos contar con una forma de cuantificarla. Como, en general, la única propiedad característica que le conocemos es su actividad sobre un cierto sustrato al que convierte en uno o más productos, utilizamos esta característica para detectar y medir la enzima. Es, sin embargo necesario, que antes de proceder a medir la enzima se eliminen moléculas pequeñas que pudieran estar presentes en el preparado. Ello puede realizarse por varios métodos, pero uno de los más utilizados es la diálisis o ultrafiltración a través de membranas de diferente tamaño de poro. De acuerdo a lo expresado la enzima va a ser detectada a través de la reacción que cataliza, por espectrofotometría o por otro método que resultare conveniente, la desaparición de sustrato o la aparición de productos. PURIFICACIÓN ENZIMATICA El homogenato obtenido contiene todos los metabolitos solubles de la célula así como una gran cantidad de enzimas diferentes. Esta mezcla impide estudiar algunas características de las enzimas y, además, puede modificar el comportamiento de muchas de ellas. Por esto es que en la mayoría de los casos se procura purificar las enzimas, esto es, separarlas de la
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compleja mezcla de proteínas, lípidos, azúcares y otras sustancias que se encuentran en el homogenato. Existen numerosas técnicas basadas en las propiedades de las distintas proteínas que pueden aplicarse para la purificación de enzimas. Entre las técnicas aplicadas mencionaremos: 1- Los métodos basados en la solubilidad de las proteínas, a saber: precipitación con sales, precipitación con solventes, etc. 2- Métodos basado en fenómenos de adsorción: los adsorbentes empleados pueden ser, entre otros: gel de fosfato de calcio, alúmina, hidroxiloapatita, etc. Estos métodos pueden aplicarse directamente sobre la solución de la enzima o bien aplicando la solución de enzima a estos materiales colocados en columnas. En este último caso los adsorbentes son preparados de modo que sean retenidos por las columnas: cromatografía de adsorción. 3- Métodos basados en las cargas de las proteínas: cromatografía de intercambio iónico, electroforesis de poliacrilamida con y sin dodecilsulfato de sodio. 4- Métodos basados en el tamaño de las proteínas: diversos tipos de filtración por gel (métodos de exclusión molecular) o electroforesis preparativa. 5- Métodos basados en la especificidad de las enzimas: cromatografía de afinidad. 6- Métodos basados en el puntos isoeléctrico: isoelectroenfoque, cromatoenfoque. 7- Métodos mixtos: cromatografía de intercambio iónico (catiónico o aniónico), electroforesis en geles de poliacrilamida u otro soporte, etc. Cuando se intenta purificar una enzima por primera vez no hay regla sobre el método a utilizar ni sobre la secuencia de métodos necesarios para lograr la purificación. Hay que decidir qué métodos se aplicarán de acuerdo con las posibilidades del laboratorio. Se ensaya el método elegido y se lo incorpora al protocolo de purificación en elaboración o se lo desecha según los resultados que se obtengan. Es casi imposible que un único método sea suficiente para logar una purificación elevada de una proteína. La única regla general aplicable a las purificaciones es la utilización de métodos suaves que no alteren las estructuras de las enzimas y protocolos de purificación cortos (Tabla 3).
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Tabla 3: Principales tipos de cromatografía Fase móvil Líquida
Fase estacionaria Líquida
Clase
Sólida
Adsorción
Reparto
Tipo (propiedad) Tamaño
Nombre
Ejemplo
Exclusión
Interacciones electrostática
Intercambio iónico
Filtración por gel Intercambio aniónico Intercambio catiónico Interacción hidrofóbica Afinidad
Hidrofobicidad Interacción hidrofóbica Interacciones Afinidad por afinidad biológica Interacciones Adsorción inespecíficas
Hidroxilapatita
Cromatografía de filtración en gel La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las esferas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las esferas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las esferas. La segunda proteína, por su tamaño, sólo puede encontrarse entre las esferas. El flujo de solvente es más elevado entre las esferas que en el interior de los poros
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de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto a las de menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. La filtración por gel se emplea para determinar el peso molecular de proteínas desconocidas mediante el uso de patrones de peso molecular de proteínas conocidas. Cromatografía de intercambio iónico La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta, positiva o negativa. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las proteínas retenidas se pueden variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad En la cromatografía de afinidad las esferas de gel que conforman el lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando, una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las esferas de gel la proteína afín, y deja pasar el resto. La elución de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico, variando la fuerza iónica del solvente, etc.) con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla. La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (proteína) unido a las esferas, que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja, o un antígeno (usado en una inmunización) que recubre las esferas y que retendrá aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las esferas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epitopes que reconocen. En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elución, primero de las proteínas no unidas y posteriormente de las retenidas (eluido específico). Expresión de los resultados de la purificación:
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Luego de cada paso de purificación de una enzima es necesario expresar los resultados de esa purificación en forma tabulada. La tabla debería contener los siguientes datos agrupados en columnas: Procedimiento
Vol.
Actividad
Unidades
Proteína
Actividad
Rendimiento
(ml)
(Unid./ml)
Totales
(mg/ml)
Específica
%
Grado de Purificación
Unidades de enzima: Se define una unidad internacional de enzima (UI) como la cantidad de la enzima que cataliza la transformación de 1 µmol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de medida (temperatura, pH, concentración de sustrato o sustratos y cofactores). Si se logra obtener una enzima pura y se conoce su peso molecular se puede definir la actividad molecular o molar, o número de recambio como el número de moléculas de sustrato transformados por minuto y por molécula de enzima en condiciones en que se mida la velocidad máxima de la enzima. Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica recomienda el uso del Katal (Kat) que se define como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato en producto en 1 segundo. Así: 1 Katal= 6 x 107 UI Actividad específica: La actividad específica está dada por el cociente entre el número de unidades de enzima y los mg de proteína del preparado. Esta unidad es muy usada en los estudios de purificación enzimática. Aplicaciones del concepto de actividad específica: 1- Permite calcular la purificación de una enzima. 2- Sirve para diferenciar dos enzimas o actividades contenidas en un mismo extracto. PRINCIPIOS GENERALES DE LA ACCIÓN CATALÍTICA DE UNA ENZIMA Las enzimas proveen un entorno específico llamado sitio activo en que está energéticamente favorecida una determinada reacción. Es así como las enzimas pueden ser modificadas dentro de ciertos límites sin que pierdan su actividad biológica. En algunos casos se logró eliminar uno o más aminoácidos sin pérdida de actividad. También se han efectuado digestiones enzimáticas parciales de algunas enzimas con los mismos resultados. Esto nos indica que no toda la proteína enzimática participa en la catálisis sino que sólo
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parte de ella es la que intervienen en la unión (sitio de ligamiento del o de los sustratos) y transformación de los sustratos (grupos catalíticos). Una reacción enzimática simple puede escribirse: E+S
ES
EP
E+P
donde: E: enzima libre S: sustrato libre ES: complejo enzima-sustrato EP: complejo enzima-producto P: producto La función del catalizador biológico (E) es aumentar la velocidad de la reacción sin afectar el equilibrio de la reacción. Para visualizar ambos conceptos estudiemos la representación de la reacción anterior en un diagrama en que la variación de la energía libre (ΔG) de la reacción se representa en función de la coordenada de reacción, es decir, del curso de la reacción (Figura 1). En el equilibrio la energía libre del estado fundamental de P es menor que de S, por tanto la reacción está favorecida (ΔG < 0). Como se puede apreciar el equilibrio entre S y P no es afectado por el camino que haya seguido S para convertirse en P, es decir, por cualquier intermediario que haya podido formar S con el catalizador.
Figura 1: Variación de la energía libre (ΔG) de la reacción en función de la coordenada de reacción, es decir, del curso de la reacción
Existe una barrera energética entre S y P que representa la energía necesaria para el alineamiento correcto de los grupos reaccionantes, la formación de intermediarios transitorios, reordenamiento de enlaces y otras transformaciones necesarias para que la reacción se produzca en uno otro sentido. Esto significa que la o las sustancia/s reaccionantes adquieren una cierta energía (energía de activación) y pasan del estado
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fundamental a un estado de transición. Una vez en este nivel energético (estado activado) la probabilidad de que el compuesto vuelva a S o se transforme en P es la misma. La velocidad de la reacción es un reflejo de esta energía de activación pues cuanto mayor es la barrera tanto menor será la velocidad de la reacción. Por tanto la función de los catalizadores biológicos es disminuir esta barrera y de este modo aumentar la velocidad de la reacción. Merece destacarse que si bien los catalizadores no afectan el equilibrio de la reacción hacen que este equilibrio se alcance más rápido aumentando la velocidad de la reacción. En presencia de un catalizador la transformación de S en P, puede describirse mediante la formación de varios intermediarios de transición. El paso que incluye la formación de uno de tales intermediarios con mayor energía de activación será el limitante de la velocidad de la reacción. La relación entre la variación de energía libre (ΔGo´) y la Keq de dicha reacción es: ΔGo´= - RT ln K eq lo que indica que la Keq está relacionada directamente con el ΔGo´ de la reacción. Por otra parte, para la transformación de S P la v = k [S] donde: v= velocidad de la reacción K= constante de la reacción
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS. El estudio de los factores que tienen influencia sobre la actividad de las enzimas permite una mejor comprensión de los mecanismos involucrados en el proceso catalítico. La mejor metodología a emplear para el análisis del progreso de una reacción enzimática es el estudio del efecto de la variación de uno de los factores que tienen influencia sobre la misma mientras los demás se mantienen invariables. En la figura 2 se puede observar la variación de la concentración de cada uno de los componentes de la reacción descripta más arriba en el transcurso del tiempo.
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Figura 2: Variación de la concentración de cada uno de los componentes de la reacción en el tiempo de reacción
A excepción de la fase inicial de la reacción, las pendientes de las curvas de progresión para [E] y [ES] son esencialmente cero siempre que la [S] sea mucho mayor que la [E] hasta que el S está prácticamente agotado. En consecuencia la velocidad de síntesis de ES debe ser igual a la velocidad de descomposición de ES. En otras palabras ES se mantiene en un estado estacionario y la [ES] puede tratarse como si se mantuviera constante. Para evitar posibles perturbaciones en las determinaciones de las velocidades de las reacciones es aconsejable hacer las mediciones en los primeros instantes de la reacción, es decir, determinar velocidades iniciales en las que hay proporcionalidad directa entre la cantidad de enzima utilizada, el tiempo y la cantidad de sustrato transformado y en la que hay exceso de sustrato. Operando en esta zona y en presencia de gran exceso de sustrato la reacción enzimática puede considerarse como una reacción de orden 0, es decir, que la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (velocidad de la reacción) es independiente del tiempo. Estas son, también, las condiciones que deben emplearse para la medición de unidades de enzima. Los principales factores que afectan la velocidad inicial de una determinada reacción son: Temperatura, pH, concentración de enzima, concentración de sustrato y la presencia de activadores o inhibidores
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Efecto de la temperatura: Las reacciones enzimáticas suelen comportarse como reacciones químicas ordinarias ya que su velocidad aumenta como consecuencia de un aumento de la temperatura. Sin embargo con las enzimas se alcanza un punto en que todo nuevo aumento de la temperatura provoca una disminución de la velocidad de la reacción (Figura 3). Esto se debe a que a temperaturas relativamente altas las enzimas se desnaturalizan.
Figura 3: Efecto de la Temperatura sobre la velocidad de la reacción catalizada por enzimas.
Según la Figura 3 parecería existir una temperatura en que la actividad enzimática es óptima. Sin embargo este óptimo no es constante ya que depende de una serie de factores tales como la presencia de activadores, inhibidores, agentes desnaturalizantes, proteasas, etc. presentes en el preparado. En condiciones definidas (pH, fuerza iónica, concentración de sustrato) la velocidad de una reacción enzimática varía con la temperatura debido a que la constante específica de la velocidad es función de la temperatura. Arrhenius expresa una relación entre el logaritmo de la constante K de velocidad y la temperatura absoluta T: Log k= log C- Ea/2,3 R x 1/T En donde: R=constante de los gases Ea= energía de activación C= constante De donde se puede calcular Ea de la pendiente de la curva (Figura 4).
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La mayor parte de las reacciones enzimáticas siguen la ecuación de Arrhenius en la zona fisiológica de temperaturas. La ecuación tiene la misma forma que la ecuación de Van´t Hoff con la diferencia de que en este caso se utilizan constantes de velocidad en lugar de constantes de equilibrio. Es asi como a una concentración constante de reaccionantes las constantes de velocidad se pueden sustituir por velocidades ya que la velocidad es proporcional a K. En la Figura 4 podemos estimar la Ea de la pendiente de la recta
Figura 4: A) Actividad enzimática a diferentes temperaturas de incubación. B) Gráfico de velocidad en función de la inversa de la temperatura de reacción enzimática.
Efecto del pH sobre la actividad enzimática: Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo. La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la glucosa 6-fosfatasa lo tiene a pH 7,5 y la arginasa lo tiene a pH 10, Figura 5.
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Figura 5: Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática.
Para eliminar efectos destructivos del pH sobre la enzima es necesario hacer una curva de tiempo a cada pH, a fin de medir la velocidad inicial correspondiente. El efecto del pH sobre las afinidades se elimina utilizando, concentraciones suficientemente altas de sustrato como para mantener siempre saturada la enzima cualquiera sea el pH utilizado (Figura 6). Para conocer cuál es la cantidad de sustrato necesaria es imprescindible obtener V M y KM a cada pH.
Figura 6: Actividad enzimática a diferentes pH y en diferentes condiciones de concentración de sustrato
Efecto de la concentración de enzima:
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Cuando representamos la velocidad de la reacción en función de la concentración de enzima podemos obtener curvas como las ilustradas en la figura 7 en que a es la curva normal, b es la curva obtenida en presencia de un inhibidor reversible y c es la curva obtenida en presencia de un activador disociable. Figura 7: Efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática
Efecto de la concentración de sustrato: Ya vimos que para ocurra una reacción enzimática debe haber una interacción entre enzima y el o los sustratos. En el caso más simple la reacción enzimática estará descripta por la ecuación química en que un sustrato es transformado en un producto:
K1
k2
E+S
ES k-1
E+P k-2
en donde las constantes K son las constantes de velocidad. La ecuación propuesta supone la formación del complejo enzima-sustrato (ES) y fue la base que utilizó V. Henri en 1903 para explicar la catálisis enzimática. En fundamento de esta idea fue la observación del efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad inicial de una reacción enzimática. Posteriormente, en 1913, L. Michaelis y M. Menten desarrollaron una teoría general en la que postularon que la enzima se combina con el sustrato en forma reversible y rápida para formar el complejo enzima-sustrato: K1 E+S
ES k-1
y que ese complejo luego dá origen a la formación de producto y liberación de la enzima en un proceso más lento que el primero: k2 ES
E+P k-2
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por tanto la segunda reacción es la que determina la velocidad de la transformación. Si se considera que sólo los componentes tempranos de la reacción están en equilibrio, estas condiciones se conocen como suposición de cuasi-equilibrio o equilibrio rápido. Así la ecuación anterior la podemos escribir: K1 E+S
kcat ES
E+P
k-1
donde kcat es la constante catalítica de velocidad y en las condiciones de cuasi-equilibrio corresponde a K2.
La velocidad de la reacción está dada por: V=kcat [ES] (ecuación 1) en que [ES] representa al complejo enzima-sustrato y la velocidad máxima de la reacción (VM) será: VM = kcat [Et] (ecuación 2) en donde [Et]= [ES] + [EL] La velocidad de la reacción estará dada por la variación de la concentración del complejo ES en función del tiempo que en el equilibrio es igual a cero, y podemos escribir: k1 [EL] [S] = K-1 [ES] + kcat [ES] y como [EL] = [ET] – [ES] luego K1 ([ET] – [ES]) [S] = [ES] (k-1 + kcat) resolviendo la ecuación para [ES] y agrupando: [ES] = ([ET][S])/ [S]+ (k-1 + kcat)/k1 ecuación 3 dado que v= kcat [ES] (ecuación 1) y reemplazando en la ecuación (1) podemos expresar la velocidad de la reacción
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v= kcat ([ET][S])/ [S]+ (k-1 + kcat)/k1 y como VM = Kcat [ET] luego: v=Vmax[S])/ [S]+ (k-1 + kcat)/k1 El segundo término del denominador es una relación de constantes que se denomina constante de Michaelis-Menten (Km) Km = (k-1 + kcat)/k1 v= Vmax[S])/ [S]+ km que es la expresión conocida como de Michaelis-Menten y que representa una ecuación de velocidad de una reacción enzimática. En ella se relaciona la velocidad de la reacción con la velocidad máxima que puede alcanzar la misma, la concentración de sustrato y una constante (Figura 8).
Figura 8: Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática
Significado del KM: Si analizamos el gráfico anterior veremos que el K m es la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si tomamos una concentración de sustrato idéntica al valor del Km y reemplazamos en la ecuación de Michaelis-Menten tenemos: v= Vmax[S])/ [S]+ [S])= Vmax/2 Por otra parte cuando Km es mucho menor que la concentración de sustrato empleada se alcanza la velocidad máxima de la reacción: v= Vmax[S])/ [S]+ Km = Vmax
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y tenemos una reacción independiente de la concentración de S, la velocidad es de orden cero. Se admite que este es el caso cuando se trabaja con concentraciones de sustrato del orden de 10 veces el valor de Km. Esto es particularmente importante cuando se procura valorar una enzima ya que sólo en estas condiciones estará trabajando la totalidad de la misma. A su vez cuando trabajamos con concentraciones muy bajas de sustrato: v= (Vmax/ Km) [S] Es decir que en estas condiciones la velocidad de la reacción enzimática es proporcional a la concentración del sustrato, consideración de importancia cuando se desea analizar el efecto de un metabolito mediante reacciones enzimáticas. Debe recordarse que para la mayoría de las enzimas Kcat es del mismo orden de magnitud que K-1, es decir, que en la mayoría de los casos no se cumplen las suposiciones de base de la cinética de equilibrio rápido. En esos casos definimos la K m como: Km = (k-1 + kcat)/k1 En donde queda expresado que en esas situaciones Km es una constante dinámica o de equilibrio que expresa la relación entre las concentraciones reales del estado estacionario más que las concentraciones de equilibrio. Por el contrario cuando Kcat es la reacción que limita la velocidad del proceso global, es decir que Kcat
