Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología

Diagnóstico bacteriológico En general, el diagnóstico bacteriológico sigue el siguiente esquema, con pequeñas variaciones dependiendo del tipo de muestra o bacteria a estudiar. Toma de muestra

Observación en fresco (400X)

Observación de Coloraciones (1000X)

Siembra para aislamiento primario en medios generales, selectivos y/o diferenciales

Incubación en atmósfera, temperatura y tiempo adecuados

Observación de las Colonias

Identificación bioquímica y/o serológica

Pruebas de sensibilidad antimicrobiana

MEDIOS PARA AISLAMIENTO PRIMARIO Permiten recuperar colonias aisladas de bacterias a partir de muestras clínicas (Primer postulado de Koch) y su composición es muy variada según el uso que se les quiera dar. En las colonias que desarrollan debe observarse las características de las mismas (color, textura, tamaño, brillo) y los cambios producidos en el medio de cultivo (cambios de color, difusión de pigmentos, hemólisis, etc). A continuación se describen algunos de los medios de cultivos para aislamiento primario más utilizados en bacteriología médica. Agar sangre Consiste en un agar usado como base al cual se le agrega un 5% de sangre humana, de caballo o de carnero para transformarlo en un medio enriquecido que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias causantes de enfermedades en el hombre. Sin embargo, su principal uso se basa en que en ellos se puede detestar el tipo de hemólisis que producen las bacterias alrededor de las colonias. La hemólisis puede ser total o transparente (betahemólisis), parcial o verdosa (alfahemólisis) o estar ausente (gammahemólisis).

Beta hemólisis

Alfa hemólisis 1

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Medio EMB (Eosina-azul de metileno) Es un medio selectivo que permite el crecimiento de bacilos gramnegativos, principalmente de la Familia Enterobacteriaceae, inhibiendo el crecimiento de las bacterias grampositivas. También es un medio diferencial ya que nos permite saber por la coloración de las colonias si los microorganismos que crecen fermentan lactosa o sacarosa. Si las bacterias fermentan lactosa o sacarosa, acidifican el medio y la eosina vira dando lugar a la aparición de colonias oscuras, de color rosado a verde brillante (Ej: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter). Las bacterias que no fermentan ni lactosa ni sacarosa originan colonias claras o transparentes (Ej: Salmonella, Proteus, Pseudomonas).

Lactosa positiva

Lactosa negativa

Medio CLDE (Cisteína Lactosa Deficiente en Electrolitos) Es un medio diferencial de aislamiento primario que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias productoras de infecciones urinarias. Es diferencial porque aquellas bacterias que utilizan la lactosa producen colonias amarillas (imagen de la izquierda) mientras que aquellas que no utilizan la lactosa producen colonias incoloras (imagen de la derecha).

Lactosa positiva

Lactosa negativa

Medio TCBS (Tiosulfato Citrato Sales Biliares) Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo de bacilos gram negativos de la familia Vibrionaceae, en concreto de Vibrio cholerae y otros vibrios. Las colonias de Vibrio son grandes, de color amarillo. Este medio inhibe selectivamente el crecimiento de la Familia Enterobacteriaceae.

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Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología Medio de Chapman o agar manitol salado Es un medio selectivo para estafilococos. Posee manitol y ClNa en altas concentraciones. Permite detectar el uso del manitol como fuente de carbono ya que este metabolismo se manifiesta como un cambio de color del medio de naranja a amarillo, mientras que las bacterias que crecen en ClNa pero no fermentan el manitol no producen cambios en el medio de cultivo. Neg

Pos

PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN Son muy numerosas y su aplicación depende del tipo de bacteria a identificar. La selección de cada una de ellas se realiza en base a la morfología colonial y la coloración de Gram de la bacteria. A continuación se mencionan algunas de las más utilizadas. Prueba de la catalasa Permite detectar la producción de la enzima catalasa que desdobla al agua oxigenada en agua y oxígeno. Esta actividad se pone de manifiesto cuando al enfrentar una colonia bacteriana con una gota de agua oxigenada se evidencia la formación de burbujas. Permite diferenciar estafilococos (prueba positiva) de estreptococos (prueba negativa).

-

Prueba de la Oxidasa

+

Se trata de determinar si un microorganismo posee citocromo c-oxidasa. Para ello se utiliza un compuesto orgánico que puede ser reducido por el sistema citocromo-oxidasa/citocromo c en presencia de oxígeno molecular, originando un producto coloreado fácilmente apreciable. Si el disco se pone de color rosado oscuro, el microorganismo es oxidasa positivo, Ej: Vibrio, Pseudomonas. Las bacterias oxidasa negativas no producen cambios de color, Ej: Escherichia, Proteus, Klebsiella, Salmonella, Citrobacter. Test del triple azúcar-hierro En este test se utiliza el medio de cultivo TSI y proporciona varios datos fisiológicos importantes para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar la glucosa, la lactosa o la sacarosa y si produce gas o ácido sulfhídrico. Pueden obtenerse los siguientes resultados: a) Fermentación de glucosa. Los microorganismos capaces de fermentar la glucosa darán lugar a la formación de ácidos que bajan el pH del medio, haciendo que el fondo del tubo aparezca de color amarillo y el pico de color rojo. Ej: Shigella. b) Fermentación de glucosa y lactosa (o sacarosa). Los microorganismos capaces de fermentar ambos azúcares darán lugar a la formación de ácidos que bajan el pH de todo el medio, haciendo que tanto el fondo como el pico del tubo aparezca de color amarillo. Ej: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Vibrio.

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Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología c) Incapacidad de fermentación de glucosa. Los microorganismos incapaces de fermentar la glucosa no darán lugar a la formación de ácidos que bajen el pH pero utilizarán las proteínas presentes bajando el pH por formación de aminas haciendo que el pico del tubo aparezca de color rojo. Ej: Pseudomonas. d) Producción de ácido sulfhídrico: Los microorganismos capaces de formar SH2 se manifiestan por la aparición de un color negro en fondo del tubo debido a la formación de sulfuro ferroso. Ej: Salmonella, Proteus, Citrobacter. e) Producción de gas: Los microorganismos capaces de formar gas producen la aparición de burbujas y/o la ruptura del medio de cultivo. Ej: Escherichia.

Glu+, Lac+ Gas+

Glu+, Lac-

Glu+, Lac-, SH2

Glu-, Lac-

+

-

Prueba de Bilis-Esculina

+

Esta prueba permite estudiar la capacidad de crecimiento de la bacteria en presencia de sales biliares y la hidrólisis de la esculina, sustancia que al hidrolizarse se une al hierro presente en el medio produciendo un color negro. (Ej: Enterococcus) mientras que las bacterias incapaces e crecer en bilis o de hidrolizar la esculina no producen cambios (Ej: Streptococcus agalactaiae)

Producción de pigmentos Numerosas bacterias son capaces de producir sustancias que le confieren color a las colonias. Por ejemplo: Staphylococcus aureus – amarillo; Pseudomonas – verdoso; Serratia - rojo

S. aureus

Pseudomonas

4

Serratia