FLUOROQUINOLONAS-I MECANISMOS DE ACCION Y RESISTENCIA

4 Sun y col., 50th ICAAC (C1-1425) 2010. PMQRs ... 4. Modificación enzimática del ATB: .... Agents Chemother. (abstr C2-716), San Francisco, USA 2009.
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Quinolonas: mecanismo de acción

FLUOROQUINOLONAS -I

Ingreso a la célula a través de porinas

Sitio de acción: topoisomerasas tipo IIA i) ADNgirasa: GyrA-GyrB ii) Topoisomerasa IV: ParC-ParE

MECANISMOS DE ACCION Y RESISTENCIA

A

A

B B

Sitio primario bacilos Gram(-): ADNgirasa Separación cadenas ADN: replicación, reparación, transcripción

Marcelo Galas Departamento Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires

Super-enrrollamiento positivo

ADNgirasa y Topo IV:

Replicación de ADN

Baja a moderada

ADN girasa

1

ABSORCION

AUC CIP 750x2 mg vo CIP 500x2 mg vo CIP 400x2 mg p CIP 400x3 mg p

NOR 1,5 µg/ml (400 mg vo) CIP 3,0 µg/ml (750 mg vo) CIP 1,5 µg/ml (500 mg vo) CIP 1,0 µg/ml (250 mg vo) CIP 0,4 µg/ml (100 mg vo) GAT 4,3 µg/ml (400 mg vo) LEV 6 µg/ml (500 mg vo) MOX 4,5 µg/ml (400 mg vo)

Célula bacteriana

i) Unión al ADN ii) Cortan una cadena iii) Pasan la otra cadena por el gap iv) Unen la cadena cortada

NOR 15% CIP 30% GAT 20% LEV 30% MOX 40-50%

CMAX

Super-enrrollamiento negativo

Cromosoma

3

Células hijas

Separación de los cromosomas

EJEMPLOS

1º Generación

A. nalidíxico, A. oxolínico, A. pipemídico, Cinoxacina

2º Generación

Norfloxacina, Ciprofloxacina, Lomefloxacina, Ofloxacina, Levofloxacina

Excreción

NOR 3,3 h CIP 3-4 h GAT 7-10 h LEV 6 h MOX 8-15 h

Renal y biliar Altas concentraciones en orina de droga no modificada para casi todas las quinolonas.

Quinolonas: mecanismos de resistencia

Clasificación de Quinolonas CLASE

Buena penetración a Tejidos ↑↑ CC intracelular (Moderada LCR, hueso y tej. ocular)

T1/2 Cromosoma duplicado

35 20 25 40

DISTRIBUCION QUINOLONAS

2

Relajan tensión del superenrollamiento Topoisomerasa generada por IVseparación de cadenas

B

UNION A PROTEINAS

Todo proceso celular de separación de cadenas de ADN: 4

B

NOR 50% CIP 70% GAT 96% LEV 95-100% MOX 86-100%

ADN polimerasa

Cadena líder

A

Biodisponibilidad entre 50 y 100%

Primers de ARN

Cadena retrasada

A

Efecto: bloquean acción de ADNgirasa y Topo IV, induciendo fragmentación de ADN (sistema SOS) y muerte celular

ESPECTRO ANTIMICROBIANO Enterobacterias Enterobacterias, P. aeruginosa, algunos Gram(+), algunos patógenos atípicos

A. Mecanismos “clásicos” de resistencia: mutaciones cromosómicas (no transferibles) 1. Alteración de sitios blanco de las drogas: mutaciones en regiones QRDR (Quinolone Resistance Determining Region) de genes gyrA, gyrB, parC, parE QRDR ~ 240 pb

GyrA aa 60 3º Generación

Esparfloxacina, Gatifloxacina Enterobacterias, Gram(+) (SPN), Grepafloxacina, Tosufloxacina, patógenos atípicos, Temafloxacina, +/- actividad sobre anaerobios

4º Generación

Moxifloxacina,Gemifloxacina, Enterobacterias, P. aeruginosa Trovafloxacina, Clinafloxacina, Gram(+) (SPN), patógenos atípicos Sitafloxacina y ↑ actividad sobre anaerobios Andriole y col., Clin Infect Dis 41: S113-9, 2005

2634 pb

gyrA Mutaciones más frecuentes:

Ser83Phe-Tyr-Ala

aa 140 Asp87Gly-Asn-Tyr

2. Disminución de concentración citoplasmática de las drogas: b) Eflujo, Deficiencias a) Reducción de flia. RND en porinas permeabilidad OmpF, OmpC Review: Hooper DC. EID 7: 337–41, 2001

1

Adquisición secuencial de resistencia a quinolonas Aislamiento sin mecanismos R quinolonas

-↓ conc. CIP Aislamiento con ↓↓sensibilidad -Tx NAL CIP y NALR

Frec. Frec. mutació mutación 10-6-10-8

Aislamiento CIPR y ↑↑NALR

Presión antibiótica

Frec. Frec. mutació mutación 10-6-10-8

CIM (µg/ml)

Concentración que previene la selección de mutantes (CPM) Mínima concentración de antibiótico requerida para prevenir el crecimiento de mutantes resistentes

Frec. Frec. mutació mutación 10-6-10-8

CIM (µg/ml)

CIM (µg/ml)

CIP

NAL

CIP

NAL

CIP

NAL

16

512

16

512

16

512

2

256

2

256

2

256

0,06

8

0,06

8

0,06

8

WT

2 mutaciones gyrA + 1 en par C + acumulación deficiente + etc.

2º mutación gyrA 1º mutación gyrA + 1° parC, o acumulación deficiente

1° mutación gyrA

CPM: ventana de selección de mutantes

CPM ~ CIMmutante Metodología: inóculo 1010 bacterias en agar MH con ≠ [ATB]; incubación 72-96 hs a 37ºC y recuento de sobrevivientes Marcusson LL, y col., J Antimicrob Chemother 55: 938–943, 2005

B.Mecanismos Plasmídicos (transferibles) de Resistencia Review: Rodríguez-Martínez JM, y col. a Quinolonas: PMQRs

Concentracion de droga

J Infect Chemother 17: 149-82, 2010

3. Protección de sitios blanco del ATB: proteína Qnr protege ADN girasa y Topo IV dificultando la unión con quinolonas. “Cinco” clases de genes, con varios alelos en cada clase1:

Ventana de seleccion de mutantes

CPM

QnrVC1, 4 qnrA1 – A7 64% id qnrB1 – B32 QnrC1 70% id qnrS1 – S4 67% id 60% id qnrC1 qnrVC12 QnrS1 QnrE4 qnrD1 qnrVC43

Tiempo post administración Zhao X and Drlica K. Clin Infec Dis 33(suppl 3): S147-S156, 2001

PMQRs ...

A. Nalidíxico

H2N H2N

Incremento

4 0,008 0,015 0,008 0,03 0.008

8 – 32 0,125 – 2 0,250 – 1 0,250 – 1 0,500 – 1 0,250 – 1

2 – 8x 16 – 256x 16 – 64x 32 – 125x 16 – 32x 32 – 125x

http://www.lahey.org/qnrStudies

Excepto NAL (8-32 vs 256) ~ 1º mutación QRDR 2 3 4

Fonseca y col., EID 14: 1129-31, 2008 Xia y col., AAC 54: 3471-4, 2010 Sun y col., 50th ICAAC (C1-1425) 2010

CH2OH O 2” HO

O CO HN

HO OH

2’

3’

NH2

H3C

N

F N HN

Robicsek A, y col. Nat Medicine 12: 83-8, 2006

 Detectado en E. coli (clínicos y animales), E. cloacae y K. penumoniae, en Bélgica, Francia, Turquía (49th ICAAC, abstr. C2-707, SFO, USA 2009), Japón, China y Canadá1  Frecuentemente asociado a rmtB (metilasa ARNr 16S)

N O

CH3

 Nuevo alelo, qepA2, dos mutaciones puntuales2

O F

COOH

N

N CH3

Norfloxacina

2 mutaciones puntuales: W102R, D179Y

H3C

N

O

HO

COOH

N

N CH3

NH2

AAC(6’)-Ib

O F

COOH

OH 6’

O 3

O

OH 4’

O

Levofloxacina

5. Eflujo específico para FQ, bomba de 1 componente familia MFS: QepA, sólo quinolonas muy hidrofílicas, como NOR, CIP y enrofloxacina (vet)

– qepA

+ qepA

Incremento

Norfloxacina Ciprofloxacina Enrofloxacina

0,016 0,004 0,008

0,250 0,063 0,250

16x 16x 32x

Gatifloxacina Levofloxacina Sparfloxacina

0,004 0,008 0,001

0,016 0,016 0,002

4x 2x 2x

A. Nalidíxico

1

1

1x

y col. ERAIT 6: 685–11, 2008

2 Cattoir

COOH N

HN

Ciprofloxacina

AAC(6’)1b-cr acetila “NH” de grupo piperazina de NOR, CIP: incremento en CIMes ~ 4x

> hidrofobicidad

Amikacina H

A. nalidíxico Ciprofloxacina Levofloxacina Gatifloxacina Moxifloxacina Sparfloxacina

+ qnr

64% id

QnrD1

PMQRs ...

4. Modificación enzimática del ATB: enzima AAC(6’)-1b, inactivante de aminoglicósidos, kanamicina, amikacina, tobramicina, acetilación de grupo “NH2”:

H

1

– qnr

QnrB1

47% id 60% id

CIM de E. coli (µg/ml)

CIM

HO

41% id

QnrA1

1 Martínez-Martínez

qnr yy ~~ qnr aac(6’)-Ib-cr aac(6’)-Ib-cr

V, y col., AAC 52: 3801–4, 2008

2

PMQRs...

Perfiles de resistencia: 115 aislam. clínicos

(Argentina 2005-2008)

con sensibilidad disminuida a quinolonas Diámetro del halo de inhibición (mm)

Mecanismo de resistencia

NAL

CIP

LEV

AKN

Ninguno (WT)

24 – 34

30 – 45

30 – 44

20 – 25

≤ 12

26 – 33

26 – 33

20 – 25

qnr

9 – 20

13 – 27

16 – 29

20 – 25

aac(6’)-Ib-cr

22 – 26

15 – 27

22 – 33

16 – 22

9 – 19

6 – 21

13 – 28

12 – 22

≥17 14 – 16 ≤13

≥17 15 – 16 ≤14

QRDR (1° gyrA)1

qnr + aac(6’)-Ib-cr 1

Los PMQRs están fuertemente asociados a otros mecanismos de resistencia: ß-lactamasas de espectro extendido (BLEEs) ß-lactamasas de tipo AmpC Resistencia a trimetoprima-sulfametoxazol Resistencia a aminoglicósidos Resistencia a carbapenemes Resistencia a cloranfenicol

Cavaco LM and Aarestrup FM, J Clin Microbiol 47: 2751 – 8, 2009

CLSI S I R

≥19 14 – 18 ≤13

≥21 16 – 20 ≤15

ARGENTINA, PMQRs

Epidemiology of PMQRs in Argentina: Differential Distribution in Enterobacteria P. Andres, A. Soler Bistué, C. Lucero, M. Tolmasky, A. Corso, A. Petroni 50th ICAAC (abstr. C2-1471), Boston, USA 2010

112 enterobacterias 33 htales. y clínicas privadas

Enero 2005 a Diciembre 2008 24% (27) E. coli

qnrB9 (Kpn, Córdoba 1988),

Jacoby GA y col. AACh 53: 1665-6, 2009

qnrS1

Andres P y col. Plasmid Mediated Quinolone Resistance Mechanisms in

Clinical Enterobacteria from Argentina: A View from the Microbilogical Practice 49th Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother. (abstr C2-716), San Francisco, USA 2009

Andres P y col., 50th ICAAC 2010 …

Distribución PMQRs

1. Global (n = 112):

34% Klebsiella

34% (38) qnr

31% 15/24 “cr” + wt 9/24 “cr” sóla

8%

4% (5) aac(6’)-Ib-cr

9% Enterobacter

100

19/19 qnrB10 5/5 qnrS1

80

42% aac(6’)-Ib-cr

40

aac(6’)-Ib-cr

 71% (80/112) CIP ≥ 21mm, CLSIS  45% (36/80) con PMQRs

Disociación LEV-CIP: N 30 25 20

∆ ≤ 4 mm

∆ ≥ 5 mm

10

60

28/28 qnrB19 Ent Kle Eco Sal

2% aac(6’)-Ib-cr

SIN aac(6’)-Ib-cr CIP: 13 a 31 mm

CON aac(6’)-Ib-cr CIP: 6 a 26 mm

5 -4 -3 -2 -1 0

100

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14

∆halos LEV – CIP (mm) P ≤ 0,003

E = 99%

S = 96%

VPN = 99% VPP = 96%

40

20

 aac(6’)-Ib-cr : en 14 centros, CABA y 5 provincias

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR: PCR y secuenciación de genes qnrA, -B, -C, -D, -S y aac(6’)-Ib-cr

80

60

 qnrB10, 19, 1, 2 y S1: 21 centros, CABA y 9 provincias

8 Ecl, 2 Eae

8 S. marcescens 3 S. flexneri 1 M. morganii 2 P. mirabilis

15

2. Especies mayoritarias: Kle (38); Eco (27); Sal (23); Ent (10): ~ % PMQRs qnr

62/112 aislamientos

PMQRs en ARGENTINA: presencia de aac(6’)-Ib-cr

17% (19) qnr + aac(6’)-Ib-cr 61%

PMQRs: 55%

21% (23) Salmonella spp

35 Kpn, 3 Kox

CABA y 12 provincias

20

Ent Kle Eco Sal

3

QUINOLONAS Correlació Correlación entre el uso de Fluoroquinolonas y el aumento de la resistencia. Añ Años 19901990-2000 UCI, USA, N= 35.790

Marcelo Galas Servicio Antimicrobianos, Dto Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires Neuhauser et al. JAMA, February 2003; 289:885-888

Salmonella spp.

CLSI (Ex NCCLS) 2003

DETECCION DE RESISTENCIA A CIPROFLOXACINA Puntos de corte según NCCLS

• Salmonella y Reducida Sensibilidad a

Fluorquinolonas

S

I

Método de dilución

< 1 μg/ml

2 μg/ml

> 4 μg/ml

R

Método de difusión

> 21 mm

16-20 mm

< 15 mm

Puntos de corte según Criterio Poblacional

Tabla 2A, Enterobacterias (M2 y M7)

S

R > 0,25μg/ml (ó 0,125 μg/ml??)

Método de dilución

Disco de Ac. Nalidí Nalidíxico < 13 mm: Sensibilidad disminuí disminuída a CIP

Salmonella spp.

Salmonella spp. Distribución de Halos para CIPRO

Distribución de Halos para NAL 200

160 R

I

S

n 150

140

n

I

S

120 100

100

80

50

40

60 20 0

0 6 7 8 9 10 1112 13 1415 16 1718 19 2021 22 2324 25 2627 28 2930 31 32

halos (mm)

19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

NAL S

Halo (mm)

NAL R

4

Salmonella: Cipro vs Nal NAL

AM

Mutación gyrA

KPN Distribución de halos de CIP Red WHONET-Argentina. Año 2005 (N=1375)

% de Cepas

20

CIP NAL

15 10 5 0

CRO

CIP

6

Cepa salvaje

KPN Distrib de halos de CIP según sensibilidad a NAL Red WHONET-Argentina. Año 2005 (N=1375)

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

>35

Porcentajes de resistencia y sensibilidad disminuida a CIP en enterobacterias de Argentina Red WHONET añ año 2004 (n=3.520) 60%

20 % de Cepas

8

50%

15

40% 30%

10

20% 10%

5

0%

0

mmo (37) eco (2142)

6

8

10

12

14

16

18

NAL S

NAL R ó I + CIP S

20

22

NAL I

24

26

28

30

32

34

>35

NAL R

11 % de los aislamientos

Los PMQRs confieren bajos niveles de R..., A. FACTORES BACTERIANOS

relevancia clínica?

kox (62)

pmi (214)

pvu (33)

CIP S-NAL R

kpn (557)

CIP R-NAL R

eae (59)

ecl (195)

cfr (59)

sma (111)

TOTAL

NAL RR-CIP S = 55-8 % del total de las enterobacterias 1/3 de las que tienen R a NAL

ENTEROBACTERIAS

1. Genética: mayor ocurrencia Frecuencia evento conjugación ~10-5 vs 10-8 selección 1º mut. QRDR

2. Concentración que previene selección de mutantes (CPM): qnrA, aac(6’)-Ib-cr (3,2 µg/ml) vs wild-type (0,125 µg/ml)

E. coli WT E. coli qnrA1 E. coli aac(6’)-Ib-cr

Concentración sérica

100 veces > frecuencia selección mutantes QRDR CPM Kpn clínicas: 4-128 µg/ml Rodríguez-Martínez JM, y col., AAC 51: 2236-9, 2007

25 x Robicsek A, y col., Lancet Infect Dis 6: 629-40, 2006

Resistencia a fluoroquinolonas

5

Distribución de halo de inhibición de CIP en enterobacterias NALS o NALR (N = 3520, año 2004)

PMQRs y relevancia clínica

4. Corea 1998-2006 (Htal. de Univ. Nacional de Seúl): aislamientos (HC) consecutivos de Kpn, Eco, Enterobacter spp. Kim HB y col., AACh 53: 639-45, 2009  Correlación Emergencia de PMQRs vs Resistencia a CIP

 Los PMQRs favorecerían emergencia de mutaciones QRDR que

S

confieren altos niveles resistencia a FQ % aislamientos con mutaciones QRDR (gyrA, parC)

I R

NALnoS CIPS

1999 – 2001 (n=

35

753)

30

Cambios R a NAL y CIP en Salmonella sp.-1999-2001 vs 2009 (n=1272)

25 20 15 10 5

Ácido nalidíxico

0 8

11

14

17

20

23

1998-1999

2000-2001

2005-2006

Prob.

46 0

58 27

50 50

P = 0,012

NO producen PMQR Producen PMQR

RELACIÓN ENTRE AUC0-24hs / CIM Y LA CURVA CLÍNICA Y MICROBIOLOGICA DE 64 PACIENTES CON INFECCIONES GRAVES, TRATADOS CON CIPRO I.V. (Antimicrob Agents Chemother. 1993; 37: 1073-1081) 100

Porcentaje de pacientes curados

16

7

22

Clinico

80

Microbiológico

Ciprofloxacina 26

1era mutación en gyrA

29

32

35

2009 (n=519

35

60 9

)

30

10

40

25 20

20

15 10 5

0 0-62.5

Ácido

0 8

11

14

17

20

23

62.5-125

26

29

32

125-250

250-500

>500

AUC/MIC a 24 hs.

Ciproflox 35

Probable PMQRs (mecanismos plasmídicos de resistencia a FQ

1) DETERMINAR PUNTOS DE CORTE

UTILIDAD DE LOS PUNTOS DE CORTE ACTUALES PARA LAS QUINOLONAS FLUORADAS

DOSIFICACION DE LEV CONOCIDA (500 mg/24h) QF

AUC CONOCIDA (65 mg.h/l)

+ PARAMETRO INDICADOR DE ÉXITO = AUC/CIM > 125

Para éxito: AUC/CIM=125

CC AT B

Si AUC=65 CIM= AUC/125= 65/125= 0,52 µg/ml CIM Para CIMs >0,5 ➟ AUC/CIM