Universidad de Colima

Postgrado Interinstitucional de Ciencias Agrícolas y Forestales

BIORREMEDIACION DE UN SUELO AGRÍCOLA CONTAMINADO CON ACEITE RESIDUAL AUTOMOTRIZ

Tesis que para obtener el grado de DOCTOR EN CIENCIAS

Presenta MARIBEL LEAL CASTILLO

Asesor y coasesor Dr. Juan Manuel Sánchez Yáñez Dr. José Luis Hernández Mendoza

Colima, Col.

Agosto del 2003

ÍNDICE ÍNDICE DE CUADROS

PÁGINA 1

ÍNDICE DE FIGURAS

3

RESUMEN

5

ABSTRACT

6

I. INTRODUCCIÓN

7

II. ANTECEDENTES

9

1.- Biorremediación.

9

2.- Metabolismo.

11

3.- Degradación de xenobióticos.

12

4.- Fitorremediación.

15

HIPÓTESIS

18

OBJETIVO GENERAL

18

OBJETIVO ESPECÍFICO

18

META

18

III. MATERIALES Y METODOS 1.-

19

Biodegradación de aceite residual en medio líquido.

19

1.1.-

Análisis microbiano preliminar.

19

1.2.-

Captación de CO2 en álcali bajo diferentes tratamientos.

19

1.2.1.- Efecto de dos concentraciones de Fósforo y Potasio.

19

1.2.1a.- Con agitación.

20

1.2.1b.- Sin agitación.

20

1.2.1c.- Con H2O2.

20

1.3.-

20

Concentración de grasas y aceites.

1.4.- Medición de volátiles orgánicos y metales pesados.

20

1.5.- Análisis estadístico.

20

2.-

Efecto de la solución mineral 3, H2O2 y un microcosmos cerrado en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA

22

2.1.- Propiedades fisicoquímicas del suelo

22

2.2.- Captación de CO2 en álcali.

23

2.3.- Determinación de grasas y aceites

23

2.4.- Análisis estadístico

23

3.-

Efecto de diferentes factores y un microcosmos con flujo de aire en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA. 3.1.- Captación de CO2 en álcali.

23

3.2.- Determinación de grasas y aceites.

25

3.3.- Análisis estadístico.

25

3.4.- Fitorremediación

26 27

IV. RESULTADOS 1.-

25

Biodegradación de aceite residual en medio líquido

27

1.1.- Análisis microbiano preliminar

27

1.2.- Captación de CO2 en álcali

28

1.2.1.- Efecto de dos concentraciones de fósforo y potasio

28

1.2.2.- Comparación del efecto de dos soluciones minerales y la oxigenación sobre la producción de CO2 por la microflora activa en ARI, ARA y SI.

35

2

1.2.3.- Efecto de dos soluciones minerales y la oxigenación sobre la biodegradación de grasas y aceites.

37

1.3.-

Medición de volátiles orgánicos y metales pesados

40

Efecto de la SM3, H2O2 y un microcosmos cerrado en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA.

43

Propiedades fisicoquímicas del suelo.

43

2.-

2.1.-

2.2.- Captación de CO2 en álcali.

43

2.3.- Determinación de grasas y aceites.

45

3.-

Efecto de diferentes factores y un microcosmos con flujo de aire en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA.

47

3.1.- Captación de CO2 en álcali.

47

3.2.- Determinación de grasas y aceites.

49

3.3.-

50

Fitorremediación.

52 V. DISCUSIÓN 58 VI. CONCLUSIONES 59 VII. LITERATURA CITADA 71 ANEXO I 112 ANEXO II 118 ANEXO III

3

ÍNDICE DE CUADROS CUADRO

TÍTULO

PÁGINA

1.-

Composición química de las soluciones minerales empleadas para estimular la microflora en los aceites residuales

20

2.-

Combinación de factores para determinar su efecto sobre la biodegradación de ARA en un suelo agrícola.

25

3.-

Características coloniales y microscópicas de microorganismos en muestras de aceite.

27

4.-

ANAVA de la producción de CO2 por la microflora de ARA y ARI con la SM1 y SM2.

29

5.-

Coeficientes de determinación del análisis de regresión de los valores ...30 valores de CO2 generado por la microflora de dos aceites en dos SM.

6.-

ANAVA de la producción de CO2 en ARA, ARI y SI, estimulada por la solución mineral 1 con y sin agitación.

7.-

Coeficientes de determinación del análisis de regresión de los valores 32 de CO2 generado por la microflora de tres aceites con la solución mineral 1 con y sin agitación.

8.-

ANAVA de la producción de CO2 por la microflora de los aceites estimuladas por la SM1 ca y cp.

33

9.-

Coeficientes de determinación del análisis de regresión de los valores de CO2 generado por la microflora de los aceites en la SM1.

34

10.-

ANAVA del efecto de dos soluciones minerales y condiciones de oxigenación sobre la producción de CO2 por la microflora del ARI.

35

31

11.ANAVA del efecto de dos soluciones minerales y condiciones................36 ...........de oxigenación sobre la producción de CO2 por la microflora del ARA. 12.-

ANAVA del efecto de la SM1 y condiciones de oxigenación sobre la producción de CO2 por la microflora acompañante en el SI.

13.-

ANAVA de la biodegradación de ARI en ppm causada por la 38 microflora activa con diferente SM y oxigenación, durante 5 semanas.

14.-

. ANAVA de la biodegradación de ARA en ppm por la microflora activa con diferente SM y oxigenación en 5 semanas.

1

37

39

15.-

ANAVA de la biodegradación de ARA en el SI, con diferente oxigenación en la SM1, durante 5 semanas.

40

16.-

Componentes químico de los aceites antes de la bioestimulación con la solución mineral 1 y H2O2.

41

17.-

Componentes químicos de los aceites después de la bioestimulación con la solución mineral 1 y H2O2.

42

18.-

Propiedades fisicoquímicas del suelo muestreado.

43

19.-

ANAVA de la producción de CO2 generada por la microflora de un suelo agrícola contaminado con ARA bajo diferentes tratamientos.

44

20.-

ANAVA de los valores totales de biodegradación de ARA inducidos por la SM3 y el H2O2 sobre la microflora de un suelo agrícola.

45

21.-

Análisis bifactorial del efecto del flujo de aire sobre la biodegradación de ARA en un suelo agrícola con diferentes factores fisicoquímicos.

51

2

ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA

TÍTULO

PÁGINA

1.-

Degradación de Xenobióticos. Reacciones de la Fase I.

13

2.-

Degradación de Xenobióticos. Reacciones de la Fase II.

13

3.-

Respirómetro tipo Bartha.

21

4.-

Modelo de microcosmos para determinar la biodegradación del aceite....22 residual automotriz en un suelo agrícola

5.-

Modelo de microcosmos con flujo de aire, para determinar la biodegradación del aceite residual automotriz en un suelo agrícola.

23

6.-

Producción de CO2 por la biodegradación de aceite residual en solución mineral, con dos concentraciones de Fósforo y Potasio.

28

7.-

Producción de CO2 por la microflora acompañante de ARI y ARA con dos concentraciones de Fósforo y Potasio.

29

8.-

Efecto de la SM1 con y sin agitación sobre la producción de CO2 por la flora microbiana en aceites.

31

9.-

Efecto de la solución mineral 1 y la agitación sobre la producción de CO2, por la microflora acompañante de ARA, ARI y SI con la solución mineral 1.

32

10.-

Efecto de dos formas de introducción de oxígeno y la solución mineral 1 en la producción de CO2 por la microflora de los aceites.

33

11.-

Efecto de la solución mineral 1 y dos fuentes de oxigenación en la biodegradación de ARI, ARA y SI.

34

12.-

Efecto de dos SM y formas de oxigenación en la biodegradación de de ARI por su microflora acompañante.

35

13.-

Efecto de dos soluciones minerales y formas de oxigenación en la biodegradación de ARA por su microflora acompañante.

36

14.-

Efecto de la SM1 y diferentes formas de oxigenación en la biodegradación de ARA en SI por su microflora activa.

37

3

15.-

Efecto de dos SM y condiciones de oxigenación sobre la biodegradación de ARI en 5 semanas.

38

16.-

Efecto de dos SM y formas de oxigenación sobre la biodegradación de ARA en 5 semanas.

39

17.-

Efecto de la SM1 y condiciones de oxigenación sobre la Biodegradación de ARA por la microflora activa en el SI por cinco semanas.

40

18.-

Efecto de la SM3 y el H2O2 en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA.

44

19.-

Efecto de la SM3 y el H2O2 en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA.

45

20.-

Efecto de la SM3 y el H2O2 en la biodegradación de ARA por la microflora de un suelo agrícola.

46

21.-

Efecto de diversos factores y un flujo de aire sobre la microflora de un suelo agrícola contaminado con ARA.

47

22.-

Efecto de diversos factores y un flujo de aire en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA.

48

23.-

Efecto de diferentes factores sobre la máxima biorremediación de un suelo agrícola contaminado con aceite residual automotriz.

49

4

RESUMEN

El agua de riego agrícola frecuentemente contiene aceite residual, automotriz (ARA) o industrial (ARI) que contaminan y reducen la fertilidad de los suelos. Se evaluó el efecto de la oxigenación y dos soluciones minerales (SM1 y SM2) en la microflora inicial de ARA, ARI y un suelo impactado (SI) con ARA, en líquido. Además, se evaluaron con un diseño completamente al azar, diferentes factores en un suelo agrícola contaminado con ARA, el cual se trató con: solución mineral 3 (SM3), peróxido de hidrógeno (H2O2), filtrado de Phanerochaete chrysosporium (fPch), flujo de aire y Lolium multiflorum. Como indicadores de la biodegradación se determinaron producción de CO2 y grasas totales. En liquido la SM1 con H2O2 favoreció la biodegradación de aceites. La combinación de SM3, fPch y L. multiflorum mostró la máxima biorremediación en suelo. La integración oportuna de los diferentes factores estimuló la biodegradación de aceites y la biorremediación del suelo contaminado con ARA.

Palabras clave: microflora, biodegradación, biorremediación, contaminación

5

ABSTRACT

Agricultural irrigation water, frequently contain, automotive waste oil (AWO), or industrial waste oil (IWO); that pollute and reduce soil fertility. In this research was evaluated the oxygenation effect and two minerals formulations (MS1 and MS2), over initial microflora of AWO, IWO and an impacted soil (IS) with AWO, in liquid medium. Also, was evaluated with a completely randomized design, different factors in a contaminated agricultural soil with AWO, which was treated with mineral solution 3 (MS3), hydrogen peroxide (H2O2), Phanerochaete chrysosporum filtrate (fPch) with air flow and Lolium multiflorum. As biodegradation indicators, was utilized CO2 production and total oils monitoring. In liquid medium, MS1 with H2O2 favored oils biodegradation. The MS3 fPch and L. multiflorum combination, shows maximum soil bioremediation. Opportune different factors integration stimulates oils biodegradation and AWO contaminated soil bioremediation.

Key words: microflora, biodegradation, bioremediation, contamination.

6

I. INTRODUCCIÓN

La contaminación ambiental forma parte de la vida moderna, una de las causas principales es el uso de combustibles derivados del petróleo, durante el proceso de extracción, manejo y disposición, además al oxidarse liberan al ambiente productos tóxicos para casi todas las formas de vida. En el pasado esto no fue complicado, progreso era sinónimo de bienestar social, las industrias no tenían mayor problema para deshacerse de sus residuos puesto que eran vertidos en los cauces de los ríos o dejados a la intemperie. Sin embargo cuando la velocidad de generación de residuos superó la velocidad de integración al ambiente, surgió la contaminación; que se ha agudizado gradualmente en las ciudades industrializadas donde se observa en todas sus modalidades: en el aire, el agua y el suelo. El progreso es hoy un sinónimo de daño ecológico. Afortunadamente se han establecido normas en cuanto a la disposición de residuos y se han clasificado en base a su peligrosidad (LGEEPA, 2001; NOM-052-ECOL-93, 1993). Los

aceites

residuales

se

consideran

desechos

peligrosos

y

provienen

principalmente de dos fuentes: las industrias, que son llevados a confinamiento y los talleres que realizan cambios de aceite automotriz, que comúnmente son vertidos en el drenaje municipal (LGEEPA, 2001). Otro problema de las ciudades industrializadas es la falta de agua, por esta razón es usada solo para las necesidades básicas de la población, también es común que los suelos agrícolas sean regados con aguas residuales, que contienen desechos orgánicos y productos generados por la industria, así como aceite residual automotriz (ARA) procedente de talleres. Según un cálculo estimativo, un taller de servicio de lavado y engrasado en promedio recibe 15 automóviles diarios, así le corresponden 4 litros con un total de 60 litros diarios de desecho. Multiplicado por el número de talleres, la cantidad es muy elevada. La importancia de eliminar el ARA radica en que 7

un litro de éste contamina 250 mil litros de agua, o forma una película sobre una extensión de cuatro mil metros cuadrados. Además los lubricantes y aceites en los cuerpos acuosos o el drenaje sanitario impiden la potabilización y la eficiencia del tratamiento de las aguas domésticas. Según informes de la Subsecretaría de Ecología del estado de Nuevo León, entre las descargas químicas a las aguas residuales en 1994 se arrojaban 16,174 toneladas diarias de grasa y aceite, desde ese tiempo ya excedían los límites oficiales permitidos. Un ejemplo es el río Pesquería utilizado como vertedero clandestino de las aguas residuales de la zona metropolitana de Monterrey, aunque se conducen a una planta de tratamiento, para llegar a la presa Marte R. Gómez donde se emplean para riego de suelos agrícolas en el noreste de Nuevo León y Tamaulipas. Sin embargo no todas las ciudades industriales tienen la capacidad económica para tratar sus aguas residuales antes de ser utilizadas para riego, así que el ARA se acumula y disminuye el suelo agrícola productivo.

8

II. ANTECEDENTES

1. Biorremediación Es un proceso que consiste en la aplicación de tratamientos biológicos para la limpieza de áreas contaminadas con químicos peligrosos, se requiere el control y manipulación de procesos microbianos. Esta es una posible solución a los problemas antes

mencionados,

se

puede

lograr

mediante

la

bioestimulación

de

microorganismos nativos del suelo, donde existen bacterias, hongos y actinomicetos los cuales por adaptación, inducción y cometabolismo desarrollan una capacidad potencial para degradar y/o mineralizar compuestos recalcitrantes en aguas residuales industriales, desechos de refinerías, combustibles, o derrames en tanques de

almacenaje,

aplicable

también

a

desechos

químicos

orgánicos,

organohalogenados y metales pesados. La biorremediación baja los costos en comparación con otras tecnologías (Konopka et al., 1999; Leahy y Colwell, 1990; Roane et al., 2001). Al estudiar la degradación de hidrocarburos en un ambiente natural, se comprobó que ciertos microorganismos obtienen sus nutrientes y energía a través de materiales hidrocarbonados simples y complejos. Las bacterias más comunes del suelo están entre ellos. Mediante muestreos y análisis se observó que son los organismos oxidativos los más activos en tierra agrícola y lodos, se demostró que las técnicas agronómicas como el cultivo, riego y la fertilización elevaron drásticamente el porcentaje de degradación. En el caso de aguas subterráneas se encontró que los acuíferos que estaban en conexión con la superficie se limpiaron más rápido que las aguas profundas, donde la difusión del oxígeno estaba limitado. Cuando el agua contaminada fue bombeada a la superficie y aireada se obtuvieron mejores resultados. Mediante la introducción de oxigeno y nutrientes, estos acuíferos fueron remediados con “tratamiento in situ” (Leahy y Colwell, 1990).

9

En trabajos más recientes se observó que el grado de biotransformación y la persistencia del contaminante se controló con la aplicación de oxígeno en aguas subterráneas contaminadas con hidrocarburos. Se afirma que este es el factor más limitante para los procesos de biorremediación en estas áreas (Thomas y Ward, 1989). Se ha calculado que se necesitan 3 lb de oxígeno/lb de petróleo degradado (Fogel et al., 1988). Goldsmith y Balderson (1989) estimaron un requerimiento estequiométrico de 8.6 moles de oxígeno/mol de diesel degradado. De acuerdo con Bajpai y Zappi (1994) se necesitan de 0.5-1 g de oxigeno/g de hidrocarburo degradado, afirman que la concentración de oxígeno que acelera la oxidación del hidrocarburo, en relación de peso es de 4:1. Huling y colaboradores (1990) estimaron una proporción en peso de 5:1 de oxígeno para la gasolina, este calculo fue basado en pruebas de laboratorio efectuadas en columna. En base a estas referencias se establece que la efectiva introducción de oxígeno en zonas con alta actividad biológica es de gran importancia en el diseño y mantenimiento de un efectivo sistema de biotratamiento “in situ”. Las opciones para la aplicación potencial de oxígeno incluyen; la perforación profunda con introducción de aire, aeración/inyección sobre el suelo, o inyección de H2O2 directamente en el acuífero (Wilson y Brown, 1989; Zappi et al., 1997). Otra manera de proveer oxígeno al subsuelo es mediante la introducción de H2O2 que típicamente se disocia en ½ mol de oxígeno disuelto/mol de H2O2 : H2O2 + H2O --- 0.5 O2 + 2H2O (Hulling et al., 1990). El oxígeno molecular puede ser suplido usando H2O2 o asperjando oxígeno puro, tiene una solubilidad de 40-50 mg/l, representa un incremento de al menos 4 veces el oxígeno disponible en un medio acuífero saturado (Morgan y Watkinson, 1992). El H2O2 como una fuente de oxígeno para el biotratamiento “in situ”, tiene las siguientes ventajas: es razonablemente barato, no persistente, es un líquido estable sin problemas de almacenaje e introducción en los acuíferos, generalmente es favorable al ambiente (Britton, 1985; Zappi et al., 2000). Los suelos ricos en materia orgánica pueden incrementar significantemente los costos de biorremediación, ya que el H2O2 reacciona con ésta constituyendo graves pérdidas económicas (Aggaewal et al., 1991; Barcelona y Holm, 1991). 10

Existen numerosos reportes que señalan la necesidad de la microflora nativa de disponer de nitrógeno, fósforo, potasio y de los metales que sirven como cofactores para catalizar las diferentes reacciones metabólicas en concentración suficiente para la síntesis de enzimas (API, 1983; Margesin y Schinner, 2001; Walker y Colwell, 1974). Adams y sus colaboradores (1999) recomiendan una relación de 100-10-1 para N-P-K en la mineralización de combustible, lubricantes y petróleo crudo. Margesin y Schinner (2001) probaron una relación de 15-15-15 en N-P-K y obtuvieron una reducción del 70% en la concentración de diesel en suelo.

2. Metabolismo Las bacterias poseen una amplia variedad de sistemas de respiración. Esos pueden ser caracterizados por la naturaleza de las sustancias que se utilizan como agentes reductores y de los oxidantes. En la respiración aeróbica, el aceptor de electrones es el oxígeno molecular. La respiración anaeróbica de las bacterias requiere de sustratos orgánicos, en la mayoría de los casos, muy similar. Los sustratos son oxidados a CO2, con la remoción sucesiva de pares de H+ y electrones (Horvath, 1972). La biodegradación de hidrocarburos alifáticos se lleva a cabo mediante un proceso aeróbico. El oxígeno es el factor limitante en la mayoría de los casos en que se tratan suelos contaminados y aguas subterráneas. La primera etapa en la degradación de los hidrocarburos es la incorporación del oxígeno por las enzimas oxigenasas. Existen dos grupos de oxigenasas: monooxigenasas y dioxigenasas (Holm et al.,1992). La manera común en la degradación de alcanos, es la oxidación en el grupo metilo terminal, donde el alcano es oxidado a alcohol y luego a su correspondiente ácido graso. El hidrocarburo se oxida a un ácido, con la formación de un grupo carboxil, y la oxidación sucesiva, remueve dos unidades de carbón, ésta es universal para la mayoría de los sistemas vivientes y la secuencia termina con la beta oxidación. 11

En esta ruta, el grupo metileno , es oxidado a un grupo cetonico, seguido por la remoción de un fragmento de doble carbón del compuesto. Además de la oxidación terminal, la degradación subterminal ocurre ocasionalmente (Johnson et al., 1990; Van den Wijngaard et al., 1993). La degradación de alquenos, es más variada, ya que el ataque microbiano ocurre en el grupo metilo o en el doble enlace. Los hidrocarburos insaturados de cadena lineal, son generalmente mas difíciles de degradar que los saturados. El metabolismo resulta en la formación de compuestos intermediarios, tales como alcoholes insaturados, ácidos grasos, alcoholes primarios o secundarios, metil cetonas, 1,2epóxidos, y 1,2-dioles (Ramanand et al.,1995).

Los hidrocarburos con cadena ramificada, son menos susceptibles a la degradación. Este hecho es recalcado por la resistencia al rompimiento biológico de los ABS (alquil-bencen-sulfonatos). Los compuestos de cadenas ramificadas: en un carbón cuaternario y los compuestos -alquil-ramificados, se consideraban recalcitrantes y acumulables en la biosfera. No obstante existen pocos organismos capaces de utilizar esos compuestos alquil-ramificados que pueden utilizarlos como fuente de carbón y de energía (Nelson et al., 1986).

3. Degradación de xenobióticos Los procesos por los cuales los organismos metabolizan especies xenobióticas, son reacciones enzimáticas catalizadas en dos fases: Fase I. Las especies xenobióticas en la célula tienden a llevar a cabo reacciones que hacen al compuesto más soluble y reactivo al agua, por la incorporación de grupos funcionales, tales como el -OH. La mayoría de las reacciones de la Fase I, son producto de las oxidasas microsomáticas, catalizadas por el sistema enzimático citocromo P-450, asociado con el retículo endoplásmico de la célula, esto ocurre con mayor frecuencia en los vertebrados, en las células vegetales y en levaduras.

12

O Producto. más soluble en Epóxido C --C agua y con mayor reactividad

Sustancia xenobiótica, lipolítica, poco soluble en agua, sin metabolizar

Sistema enzimático

Hidróxido

-OH

Sulfhidril

-SH

Hidroxilamina

H - N -- OH

Citocromo P-450 Figura 1. Degradación de xenobióticos. Reacciones de la Fase I (González, 1998; Millburn, 1995)

Fase II. Los grupos funcionales polares incorporados a los compuestos xenobióticos en las reacciones de la Fase I, proveen sitios de reacción para esta fase. O

‫װ‬ Compuesto Carboxil --C-OH xenobiótico comúnmente Hidroxil OH los productos de reacción de Halógeno -F,Cl,Br,I la Fase I

Agente conjugante endógeno

+

Producto de conjugación

C

Epóxido Amino

C N

O

 

H



H

Polaridad alta Solubilidad mayor en el agua Más fácilmente eliminado

Grupos funcionales que reaccionan con un agente de conjugación Figura 2. Degradación de xenobióticos. Reacciones de la Fase II (González, 1998; Millburn, 1995)

13

La Fase II consta de reacciones de conjugación, donde las enzimas incorporan agentes de conjugación a los xenobióticos, productos de la reacción de la Fase I, éstos son a menudo menos tóxicos que los compuestos originales. Los principales agentes de conjugación y las enzimas que catalizan las reacciones de la Fase II, son el ácido glucorónico (UDP enzima glucoroniltransferasa) y el glutatión (enzima glutationtransferasa). Los productos de conjugación más abundantes, son los glucorónicos (González, 1998; Millburn, 1995). Desde el descubrimiento del citocromo P-450 en mamíferos en 1964 se ha enfocado el interés en este importante grupo de enzimas que contienen el grupo hemo. Se conocen al menos dos tipos de Citocromo P-450, ambos contienen protoporfirina IX, han sido encontrados en levaduras y filamentos de hongos. El citocromo P-450 tiene enzimas que generalmente funcionan como componentes de monooxigenasas, las cuales participan en la oxidación en una variedad de compuestos alifáticos y aromáticos. El paso inicial en la activación de estos compuestos hacia la carcinogénesis es desactivado por una flavoproteína enzimática (NADPH)-citocromo P-450 reductasa) y una hemoproteina enzimática asociada con un fosfolipido. El P450 14DM está relacionado con la síntesis de esteroles, el P-450 está relacionado con el metabolismo de hidrocarburos, acidos grasos y compuestos xenobióticos. (Atlas y Cerniglia, 1995; Guengerich, 1993). Recientemente se probó que los hongos tienen la capacidad de romper cadenas largas y complejas de hidrocarburos más eficientemente que las bacterias, al iniciar la oxidación de los bifenilos policlorados (BPC). Por cometabolismo muchos microorganismos del ambiente oxidan hidrocarburos alifáticos que no utilizan como fuente de carbono, por ejemplo Phanerochaete chrysosporium, este hongo oxida algunos tipos de compuestos organoclorados incluyendo DDT, BPCs, y clorodioxinas. El sistema enzimático que participa en la oxidación de estos compuestos es el mismo que el hongo emplea para degradar la lignina en condiciones naturales y consiste en un

sistema

multienzimático

productor 14

de

lignina-peroxidasas

y

peroxidasas

manganeso-dependiente, así como un mecanismo generador de H2O2 (Michael, 1999; Yadav et al., 1995). Se ha reportado también la participación de las enzimas del citocromo P450, que constituyen una super familia de haem-thiolato monooxigenasas, algunas de las cuales catalizan la hidroxilación de contaminantes orgánicos, que facilitan su biodegradación y/o metabolismo (Masaphy et al., 1996; Mehmood et al., 1997; Topal et al., 1996). Es común la presencia de metales pesados en áreas contaminadas con hidrocarburos, esto puede hacer más difícil el proceso de biorremediación, no obstante se reporta la existencia de microorganismos tolerantes a metales pesados, con la capacidad de captar Pb+ en las proteínas y en los polisacáridos de su pared celular (Kjaergaard et al., 2000; Richards et al., 2002). Se cree que esto depende de la síntesis de enzimas y “fitoquelatinas” (Phitochelatins): péptidos ricos en cisteína que se unen a metales pesados, estos péptidos se sintetizan en plantas y levaduras (Sauge-Merle et al., 2003). Se comprobó la capacidad de cepas específicas y de la microflora del suelo para fijar cadmio tanto en la membrana como intracelularmente y con capacidad para oxidar 500-μg ml-1 de ácido 2-4 diclorofenoxiacético (Roane et al., 2001). Los microorganismos de suelo pueden quelar plomo y oxidar gluosa marcada con C14 (Konopka et al., 1999).

4. Fitorremediación Otra manera de combatir la contaminación por hidrocarburo en suelos es la fitorremediación, esta depende de las relaciones sinérgicas naturales entre el sistema radicular de plantas y los microorganismos del suelo. No requiere de técnicas de ingeniería ni de excavaciones, solo la intervención humana para establecer una relación radicular adecuada planta-microorganismo en el sitio, o la aplicación de técnicas agronómicas fertilizantes para inducir la mineralización natural del hidrocarburo. Las rutas metabólicas más importantes que puede seguir un hidrocarburo en la planta son: quedar contenidos en la zona de la raíz durante la absorción de agua, las raíces de la planta pueden conducir el hidrocarburo hacia la superficie, puede ser biodegradado o acumulado dentro la planta, los hidrocarburos 15

volátiles pueden ser transferidos al aire mediante la evapotranspiración, los exudados radiculares estimulan la actividad oxidante de las comunidades microbianas y oxidan hidrocarburos (Cunningham et al., 1996; Ferrera-Cerrato, 1997; Siciliano y Germida, 1998; Siciliano et al., 2003; Yoshitomi y Shann, 2001). En 12 especies de pasto de regiones cálidas, 4 de las cuales aceleran la oxidación de hidrocarburos poliaromáticos de bajo peso molecular, solo una especie disminuyó la concentración de compuestos de alto peso molecular (Qiu et al., 1997). En un suelo sembrado con el pasto ryegrass se redujo notablemente la mezcla de hidrocarburos, de n-alcanos (C10, C14, a C18, C22, C24), como el pristano, el hexadecano, el fenantreno, el antraceno, el fluorantraceno, y el pireno. La concentración inicial de hidrocarburos extractables fue de 4.33 g/kg de suelo, después de 22 disminuyó a 0.120 g/kg de suelo (97% de reducción) en un suelo cultivado y 0.790 g/kg en el suelo no cultivado (82% de reducción)(Gunther et al., 1996). Se conocen tres mecanismos principales por los que las plantas y los microorganismos remedian suelos y agua contaminados con petróleo, estos mecanismos incluyen su oxidación y acumulación, así como la transferencia del hidrocarburo del suelo a la atmósfera (Cunningham et al., 1996; Siciliano y Germida, 1998; Sims y Overcash, 1983). Las plantas proveen a las poblaciones microbianas de la rizósfera de exudados radiculares, de carbón, energía, nutrientes, enzimas y en ocasiones de oxígeno. Los que contienen azucares, alcoholes y ácidos representan del 10 al 20% de la fotosíntesis anual de la planta. Debido a la acción de los exudados, las poblaciones microbianas son de 5 a 100 veces mayores en la rizósfera que en suelo sin plantas. Los tipos y cantidad de exudados radiculares dependen de la especie vegetal y de su estado de desarrollo, del tipo de suelo, concentración de nutrientes esenciales, pH, disponibilidad de agua, temperatura, concentración de oxígeno, dióxido de carbono 16

atmosférico e intensidad de luz (; Cunningham et al., 1996; Schnoor et al., 1995; Vance, 1996). Las interacciones específicas de los microorganismos con las raíces vegetales ocurren cuando la planta exuda un compuesto en respuesta a un hidrocarburos contaminante. Las interacciones no-específicas se presentan cuando los exudados de la planta son químicamente similares al hidrocarburos, esto incrementa la densidad y la actividad de los microorganismos y en consecuencia la mineralización del contaminante. Los hidrocarrburos sirven a los microorganismos como fuente de carbono y energía. El metabolismo microbiano de oxidación de hidrocarburos se debe básicamente a la respiración aeróbica, aunque existen variantes como la respiración anaeróbica, el cometabolismo, la fermentación, la deshalogenación reductiva y el uso de compuestos inorgánicos como donadores de electrones (Siciliano y Germida, 1998). Además se ha detectado que dentro de la raíz incrementa el número de bacterias con capacidad para degradar determinados contaminantes cuando estos se encuentran en la rizósfera de la planta (Siciliano et al., 2001). La industria del ramo automotriz libera aceite y otros hidrocarburos en agua residual de las ciudades mientras que la carencia de agua para riego obliga a la utilización del tipo residual para la producción de cultivos agrícolas. A pesar de estos antecedentes sobre la oxidación de hidrocarburos en el ambiente, la literatura no reporta la biodegradación de ARA. En base a esta revisión y a que en México no existen estrategias precisas para la recuperación de suelos agrícolas contaminados con ARA, se planteó la integración de los aspectos más importantes que han sido probados de manera independiente en trabajos previos.

17

HIPÓTESIS

La capacidad natural de los microorganismos nativos del suelo para oxidar ARA se puede emplear en la biorremediación de suelos agrícolas contaminados con estos hidrocarburos, mediante bioestimulación con diferentes factores.

OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto de diferentes factores sobre la microflora (inicial del aceite y nativa de suelo) para la inducción de la biorremediación “in vitro” en un suelo agrícola contaminado con aceite residual.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Evaluar el efecto de soluciones minerales y la oxigenación sobre la

biodegradación de aceites en medio líquido. 2. Valorar la integración de diferentes factores o estrategias para la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA.

META

Desarrollar metodologías y / o estrategias para la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA.

18

III. MATERIALES Y METODOS

1.- Biodegradación de aceite residual en medio líquido. Se realizaron muestreos de aceite residual en los siguientes lugares : 1).- Una industria de Monterrey, N. L. Se colectó aceite residual industrial (ARI) 2).-Suelo impactado con aceite automotriz (SI), del estacionamiento de la industria. 3).-En un lavadero de automóviles, se obtuvo aceite residual automotriz (ARA). Las muestras se colectaron en frascos de 250 ml estériles con tapón esmerilado, se transportaron y almacenaron en refrigeración. 1.1.- Análisis microbiano preliminar. Las muestras se colocaron en matraces de 250 ml con 48 ml de la solución mineral 1 (SM1, cuadro 1) + 2 ml de aceite (industrial o automotriz) o 2 g de SI, se probaron las 3 muestras por separado. Se incubaron de 28 a 30ºC sin agitación. Después de 9 días se sembraron en agar nutritivo, agar EMB, agar papa glucosa y agar mineral y aceite, éste se preparó con la SM1 y ARA o ARI como única fuente de carbono, con la finalidad de comprobar si la microflora acompañante de los aceites y la flora nativa del SI son capaces de utilizarlos como única fuente de carbono, una vez que los micronutrientes y cofactores enzimáticos fueron suplidos por la SM1. Se incubaron a 30ºC durante 48 h. Los aislados se mantuvieron en agar mineral y aceite, se hicieron observaciones microscópicas con tinción de Gram y para bacterias ácido alcohol resistente (Walker y Colwell, 1974). 1.2.- Captación de CO2 en álcali bajo diferentes tratamientos. Se determinó la actividad metabólica de la microflora inicial de cada aceite ARI, SI y ARA mediante captación de CO2 en álcali, en matraces tipo Bartha (Fig. 3), de 250 ml con 45 ml de SM, 5 ml de aceite residual como única fuente de carbono e inóculo, en el reservorio del matraz se colocaron 5 ml de NaOH 0.1N y se tituló cada 48 h con HCl 0.1N, y se evaluaron las siguientes variantes: 1.2.1.- Efecto de dos concentraciones de fósforo y potasio Se probaron dos formulaciones de SM (Cuadro 1) con ARA y ARI, se seleccionó la mejor para comparar las siguientes condiciones de oxigenación: 19

1.2.1a.- Sin agitación (sa). 1.2.1b.- Con agitación (ca). 1.2.1c.- Con H2O2 a 50 ppm. este se agregó cada semana (cp). Cada una de las condiciones para ARA, ARI y SI, con 5 repeticiones y un control estéril para verificar que el CO2 fue generado por la microflora presente en los aceites. Se incubaron de 28 a 30ºC durante 5 semanas (Leal et al., 1996; Lorraine, 1973).

Cuadro 1. Composición química de las soluciones minerales empleadas para estimular la microflora en los aceites residuales. REACTIVO g/l No.1 (SM1) K2HPO4 10.0 KH2PO4 8.0 MgSO4 6.0 NH4(NO3)2 15.0 CaCO3 1.0 KCl 2.0 ZnSO4 0.5 CuSO4 0.5 0.2 FeSO4

mol/l P = 0.1062

K = 0.0268

SM = solución mineral

g/l mol/l No.2 (SM2) 5.0 P = 0.0581 4.0 6.0 15.0 1.0 4.0 K = 0.0537 0.5 0.5 0.2

REACTIVO g/l No.3 (SM3)* Na2HPO4 4.303 KH2PO4 1.179 MgSO4.7H2O 0.225 NH4Cl 1.9 CaCl2 0.275 NH4MoO4 0.250 FeCl3 .6H2O 0.250

mol/l P = 0.03866 K = 8.66 x 10-3

*(Cookson, 1995)

1.3.- Concentración de grasas y aceites. Al finalizar el período de incubación se determinó la concentración de grasas y aceites por el método de Soxhlet (NMX-AA-005-SCFI-2000, 2000).

1.4.- Medición de volátiles orgánicos y metales pesados. Se determinaron antes y después de la bioestimulación con la SM1 cp mediante cromatografía de gases (referencia en pag. 35 y 36).

1.5.- Análisis estadístico. Los matraces se distribuyeron bajo un diseño completamente al azar. Los resultados se sometieron a un análisis de varianza para establecer las diferencias entre las condiciones probadas, prueba de Tukey, correlación y regresión (Walpole y Myers, 1992).

20

Filtro de aire

fibra

Aguja para

de vidrio

Algodón

inyectar NaOH

NaOH

Tapón de hule

Fibra de

vidrio

Algodón

Filtro de aire

Reservorio de NaOH

Muestra de Aceite con la solución mineral y nutrientes

Figura 3. Respirómetro tipo Bartha.

21

2.- Efecto de la solución mineral 3 (SM3), H2O2 y un microcosmos cerrado en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA. 2.1.- Propiedades fisicoquímicas del suelo. Se colectaron muestras de un suelo agrícola sin previa exposición al contaminante ARA,

en

Cadereyta

Jiménez

N.

L.

Se

determinaron

sus

características

fisicoquímicas, contenido de materia orgánica, nitrógeno y fósforo total (NMX-AA008-SCFI –2000, 2000; NMX-AA-026-SCFI-2001, 2001; NMX-AA-072-SCFI-2001, 2001). El suelo se cribó con un tamiz de 200 mallas, se mezcló con 20,000 ppm de ARA y se agregaron 30 ml/kg de tween 80 al 0.2% . Se utilizaron microcosmos de vidrio rectangulares de 45 x 25 x 25 cm de altura como el que se ilustra en la Fig. 4.

Figura 4. Modelo de microcosmos para determinar la biodegradación del aceite residual automotriz en un suelo agrícola. En cada microcosmos se colocaron 2 kg de suelo, se probaron cuatro condiciones: 1.- Suelo sin ARA (control relativo). 2.- Suelo con ARA y 50 ml de H2O2 a 50 ppm. 3.- Suelo con ARA. 4.-Suelo con ARA estéril (control absoluto). A los cuatro tratamientos se les agregó 15 ml/kg de SM3 (Cuadro 1) y agua destilada para completar un volumen de 100 ml/kg de suelo (Kanaly et al., 1997).

22

2.2.- Captación de CO2 en álcali. Se determinó la actividad metabólica de la microflora del suelo, en cada unidad de prueba se introdujo un vaso de precipitado con 40 ml de NaOH al 0.1N, los recipientes se abrieron cada 48 h para titular con HCl 0.1N y humedecer con agua destilada, cada dos semanas se agregó SM, H2O2 a 50 ppm y se mezcló el suelo en cada unidad de prueba. Se incubaron por ocho semanas entre 30 y 35ºC (Kanaly et al.,1997; Leal et al., 1996; Lorraine, 1973).

2.3.- Determinación de grasas y aceites. Cada dos semanas se determinó la cantidad de grasas y aceites totales mediante el método de Soxhlet (NMX-AA-005-SCFI-2000, 2000).

2.4.- Análisis estadístico. Se empleó el diseño experimental y pruebas mencionadas en la sección anterior.

3.- Efecto de diferentes factores y un microcosmos con flujo de aire en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA. En esta serie de pruebas se empleó suelo obtenido de la misma fuente. Se colocó en porciones de 3 kg en microcosmos rectangulares de vidrio de 45 x 25 x 25 cm de altura, como el que se ilustra en la Fig. 5. Orificio para la introducción de nutrientes y agua Salida de aire

Entrada de aire

suelo

Figura 5. Modelo de microcosmos con flujo de aire, para determinar la biodegradación del aceite residual automotriz en un suelo agrícola.

23

El ARA se mezcló a 25,000 ppm con el suelo agrícola para verificar la estrategia a una concentración crítica del contaminante. Como agente tensoactivo se empleó tween 80 al 0.2%, 30 ml/kg (Rojas et al., 1997). En esta etapa se probaron diferentes factores para lograr una biorremediación integral, tanto de hidrocarburos aromáticos como alifáticos que pueden estar presentes en el aceite residual automotriz. Para inducir el desarrollo de la flora microbiana inicial del aceite y la microflora nativa del suelo se aplicó la SM3 (Cuadro 1) se agregaron 75 ml a cada tratamiento excepto al control relativo, se probaron las combinaciones que se describen en el cuadro 2. Al suelo del tratamiento 3 se le agregaron 75 ml de H2O2 a 50 ppm, el suelo del tratamiento 4 se enriqueció con 75 ml de un filtrado de Phanerochaete chrisosporium (fPch), el filtrado se obtuvo después de sembrar la cepa en un medio mineral con paja de zacate como única fuente de carbono, con la finalidad de inducir la producción de enzimas ligninasas, peroxidasas etc. responsables de la degradación de compuestos aromáticos. El hongo se incubó a 30°C/12 días en agitación a 250 rpm. El cultivo fúngico se filtró con membrana milipore 0.2 y el filtrado libre de células se agregó al suelo del tratamiento 4. (La cepa de P. chrysosporium fue proporcionada por el Laboratorio de Ecología, Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del CINVESTAV-IPN).

El suelo del tratamiento 6 se esterilizó y enriqueció con la SM3 y el tween 80, también estériles. A todos los tratamientos se les agregó agua destilada para mantener al 60% la humedad (Cookson, 1995; Rojas et al., 1997; Spencer et al., 1996).

24

CUADRO 2. Combinación de factores para determinar su efecto sobre la biodegradación de ARA en un suelo agrícola. TRATAMIENTOS Blanco

C. Relativo C. absoluto

FACTORES

1

2

3

4

5

6

Solución mineral 3

+

+

+

+

-

+

Condición del suelo

NE

NE

NE

NE

NE

E

f Pch*

-

-

-

+

-

-

Agua

-

-

-

-

+

-

ARA**

-

+

+

+

+

+

H2O2 (50 ppm)

-

-

+

-

-

-

(+) = Se agregó (-)= no se agregó. NE = no esterilizado, E=esterilizado, *fPch = filtrado de Phanerochaete chrysosporium. ** ARA = aceite residual automotriz. C = control

3.1.- Captación de CO2 en álcali Se midió la actividad metabólica de la microflora activa: A cada microcosmos se le adaptó una entrada y salida de aire que se burbujeó en un matraz con NaOH al 0.1N. El CO2 capturado se tituló cada 48 h con HCl 0.1 N (Leal-Castillo et al., 1994). Los microcosmos se distribuyeron bajo un diseño completamente al azar con cinco repeticiones y se incubaron a 30°C por doce semanas con flujo de aire y ocho semanas sin éste. Cada dos semanas se enriquecieron con SM, H2O2, fPch, y agua destilada, según el tratamiento (Cookson, 1995; Kanaly et al., 1997; Rojas et al., 1996).

3.2. Determinación de grasas y aceites. Se efectuó la cuantificación de las grasas y aceites totales al finalizar el período de prueba, por el método de Soxhlet (NMX-AA-005-SCFI-2000, 2000).

3.3. Análisis estadístico. Se realizó un análisis de varianza, prueba de Tukey y un análisis bifactorial de las cantidades de ARA biodegradado por el efecto del flujo de aire sobre la actividad microbiana del suelo agrícola en los microcosmos (Walpole y Myers, 1992). 25

3.4. Fitorremediación Para complementar la estrategia de biorremediación en los microcosmos con flujo de aire y reducir al máximo la concentración del ARA, se aplicó fitorremediación con el pasto L. multiforum en el suelo parcialmente biorremediado. En vasos de unicel de 14 oz, con 90 g, se colocaron 5 plántulas por vaso del pasto de 8 días de germinadas. Las que se mantuvieron en el invernadero por 16 semanas entre 28 y 30°C. a) Se determinó la concentración de grasas y aceites totales en el suelo rizosferico del pasto (Aprill y Sims, 1990; Cunningham et al., 1996; Kanaly et al., 1997).

26

IV. RESULTADOS

1.- Biodegradación de aceite residual en medio líquido. 1.1.- Análisis microbiano preliminar. De las muestras de aceite inoculadas en agar aceite se obtuvieron 24 aislados de hongos bacterias y levaduras. Para demostrar la amplia capacidad metabólica potencial de los microorganismos presentes en los diferentes aceites, se sembraron en tres medios de cultivo, como se muestra en el Cuadro 3, donde se resumen las características coloniales y microscópicas de los microorganismos aislados a partir de ARI, ARA y SI. Dominaron levaduras, actinomicetos, hongos y cocobacilos Gram negativo (-), probablemente enterobacterias. Cuadro 3. Características coloniales y microscópicas de microorganismos en muestras de aceite. ACEITE RESIDUAL INDUSTRIAL MEDIO DE CULTIVO MORFOLOGÍA COLONIAL MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA Agar nutritivo Colonias húmedas cremosas Cocobacilos Gram( - ) Agar EMB Colonias húmedas Cocobacilos Gram( - ) moradas Agar papa glucosa Colonias secas polvosas, Levaduras, hifas, mezcladas con micelio micelio septado con blanco esporas esféricas ACEITE RESIDUAL AUTOMOTRIZ Agar nutritivo Agar EMB Colonias puntiformes Bacilos delgados Gram ( - ) y actinomicetos Agar papa glucosa SUELO IMPACTADO CON ARA Agar nutritivo Colonias polvosas Estructuras ramificadas, Agar EMB Micelio algodonoso levaduras, actinomicetos y Agar papa glucosa grisáceo hongos

27

1.2.- Captación de CO2 en álcali. 1.2.1.- Efecto de dos concentraciones de fósforo y potasio, SM1 y SM2. En la Fig. 6 se muestra la producción de CO2 derivada de la biodegradación de aceite residual, en 4 unidades de prueba y 2 controles; 3 con la SM1 y 3 con la SM2. Con la SM1 se registró la mayor producción de CO2 durante 5 semanas, por la microflora presente en el ARI, que fue de 7.9 ppm, mientras que el ARA produjo un valor máximo de 5.2 ppm. Con la SM2 el ARI registró una disminución en la producción de CO2 con un máximo de 2.5 ppm, con ARA se detectó un patrón semejante al descrito con SM1, los controles registraron valores no mayores a 0.3 ppm en ambas SM.

Concentración 1 = g/l [ P-18, K-2 ]. 2 = g/l [ P-9, K-4 ]. ARI = Aceite Residual Industrial. Aceite Residual Automotriz. Ctrl.= Control.

9 8 ARI 1

7

ppm

6 ARA 1

5

ARA 2

4 3

ARI 2

2 Ctrl. 1

1

Ctrl.2

0 1

2

3

4

5

Semanas Figura 6. Producción de CO2 por la biodegradación de aceite residual en medio mineral, con dos concentraciones de Fósforo y Potasio.

En el Cuadro 4 se presenta el análisis de varianza de la producción de CO2 por ARA y ARI en la SM1 y SM2, se estableció diferencia significativa entre los tratamientos probados.

28

Cuadro 4. ANAVA la SM1 y SM2. FV TRATAMIENTOS ERROR TOTAL

de la producción de CO2 por la microflora de ARA y ARI con GL 5 24 29

SC 228.131714 1.425171 229.556885

CM 45.626343 0.059382

F 768.3515

SM1= Solución Mineral 1

P>F 0.000

SM2= Solución mineral 2

La Fig. 7 muestra la comparación de medias según Tukey con 3 valores de medias diferentes; la flora microbiana activa en ARI fue estimulada por la SM1, con

el

mayor valor (A = 7.9), en comparación con C (2.3) correspondiente a ARI con la SM2, la microflora de ARA no mostró diferencia significativa al desarrollarse en las SM1 y SM2 (B = 4.5). Mientras que los valores de CO2 detectados en los controles fueron semejantes entre sí pero diferentes al resto de los tratamientos.

SM1 = Solución mineral 1 [P-18 g/l K-2 g/l] SM2 = Solución mineral 2 [ P-9 g/l K-4 g/l] ARI = Aceite Residual Industrial. ARA = Aceite Residual Automotriz. Ctrl.= Control (Tukey 0.01)

9 8

A

7 ppm

6 5 4

B

B

C

3 2 D

1

D

0 SM1 ARI SM1ARA SM2 ARA SM2 ARI

SM1Ctrl

SM2 Ctrl

Figura 7. Producción de CO2 por la microflora acompañante de ARI y ARA con dos concentraciones de Fósforo y Potasio.

29

Cuadro 5. Coeficientes de determinación del análisis de regresión de los valores de CO2 generado por la microflora de dos aceites en dos SM Origen Solución mineral 1 Solución mineral 2 σ2 σ2 Aceite Residual Industrial. 0.9982 0.8525 Aceite Residual Automotriz. 0.9363 0.8605 Control. 0.3077 0.5294 El Cuadro 5 presenta los coeficientes de determinación del análisis de regresión de cada tratamiento probado, los valores señalan que existe correlación significativa entre los puntos obtenidos en cada una de las variantes probadas: ARI, ARA y el Ctrl. con las SM1 y SM2. En base a estos resultados, se seleccionó la SM1 para probar el efecto de la agitación sobre la producción de CO2. El análisis de regresión se calcula en base a la ecuación de regresión y = a x + b, en este caso la variable dependiente fue la producción de CO2 en función de un parámetro independiente con incremento fijo que fue el tiempo, si σ 2=0.05 entonces ”y” no depende únicamente de “x” sino de otras variables. Cuando todos los puntos de la regresión coinciden se incrementa “y” en función de “x”, si es exacta el coeficiente de determinación es = 1 ó muy cercano a este valor y significa que “y” depende principalmente de “x”. En la Fig. 8 se ilustra el efecto de la agitación sobre la producción de CO2 por la flora microbiana activa en: ARA y ARI empleadas en el experimento anterior, en este ensayo se incluyó un suelo impactado (SI) con ARA. La figura señala que los máximos valores de CO2 se alcanzaron en los tratamientos incubados con agitación, donde la flora microbiana activa en el SI generó 15.3, con el ARI; 14.9, 13 ppm de CO2 con el ARA, mientras que los tratamientos incubados sin agitación presentaron valores menores. En contraste con los controles con y sin agitación donde se registraron cantidades mínimas de 0.35 ppm de CO2.

30

18 16

SI ca

14

ppm

12

ARI ca ARA ca

10 8

ARI = Aceite residual industrial. SI = Suelo impactado. ARA = Aceite residual automotriz. ca = con agitación. sa= sin agitación. SM1= Solución mineral 1 ctrl. control

SI sa ARI sa

6 4

ARA sa

2

Ctrl. sa

Ctrl.ca

0 1

2

3

4

5

Semanas

Figura 8. Efecto de la SM1 con y sin agitación sobre la producción de CO2 por la flora microbiana en aceites.

El análisis de varianza del Cuadro 6 señala que existe diferencia significativa en la respuesta de las poblaciones incubadas con y sin agitación en la SM1.

Cuadro 6. ANAVA de la producción de CO2 en ARA, ARI y SI, estimulada por la solución mineral 1 con y sin agitación. FV GL SC CM F P>F TRATAMIENTO 7 1257.224609 179.603516 1317.7896 0.000 ERROR 32 4.361328 0.136292 TOTAL 39 1261.585938 La Fig. 9 muestra la comparación de medias según Tukey donde las poblaciones microbianas activas en el ARI y SI con agitación, generaron la máxima cantidad de CO2; media A. La respuesta fue diferente en el ARA con y sin agitación: medias B y D respectivamente. El ARI y SI sin agitación presentaron valores similares; media C. En los controles se observaron los valores mínimos.

31

SI= suelo impactado ARI= aceite residual industrial ARA= aceite residual automotriz. Ctrl.= control. ca= con agitación sa = sin agitación (Tukey 0.01)

18 16

A

A B

14

ppm

12 10

C

8

C D

6 4 2

E

E

0 SIca

ARIca

ARAca

ARIsa

SIsa

ARAsa

Ctrlsa

Ctrlca

Figura 9. Efecto de la solución mineral 1 y la agitación sobre la producción de CO2, por la microflora acompañante de ARA, ARI y SI con la solución mineral 1.

El Cuadro 7 presenta los coeficientes de determinación del análisis de regresión de cada tratamiento, los valores señalan una correlación significativa entre los puntos obtenidos en cada una de las muestras probadas: ARI, ARA, SI y el Ctrl. en la SM1 con y sin agitación.

Cuadro 7. Coeficientes de determinación del análisis de regresión de los valores de CO2 generado por la microflora de tres aceites con la solución mineral 1 con y sin agitación. Origen Sin agitación Con agitación Aceite residual industrial 0.8525 0.9889 Aceite residual automotriz 0.8605 0.9931 Suelo impactado 0.8915 0.9903 Control 0.2262 0.2720

32

ARI-CP

25

ARA-CP SI-CP

20

Ctrl-CP

ppm

ARI-CA

15

ARA-CA SI-CA Ctrl-CA

10

5 0 1

2

3

Semanas

4

5

SI = suelo impactado. ARI = aceite residual Industrial. ARA = aceite residual Automotriz. ca =con agitación. cp = con H2O2

Figura 10. Efecto de dos formas de introducción de oxígeno y la solución mineral 1 en la producción de CO2 por la microflora de los aceites. En la Fig.10 se compara el efecto de la SM1 con dos fuentes de oxígeno;con agitación (ca) y aplicación de H2O2 a 50 ppm (cp) en la producción de CO2 por la flora microbiana presente en ARA, ARI y SI. Los mayores valores se registraron en la SM1cp: la flora microbiana presente en el SI con un máximo de 19.2, ARI 17.62, y ARA 16.16. Las muestras incubadas en la SM1ca mostraron valores menores. El análisis de varianza del Cuadro 8 señala diferencia significativa entre los tratamientos probados.

Cuadro 8. ANAVA de la producción de CO2 por la microflora de los aceites estimuladas por la SM1 ca y cp FV GL SC CM F P>F TRATAMIENTO 7 1947.005859 278.143707 2123.2878 0.000 ERROR 32 4.191895 0.130997 TOTAL 39 1951.197754 SM1 solución mineral 1.

ca= con agitación.

33

cp = con H2O2

La Fig. 11 muestra la comparación de medias según Tukey, donde los valores se agrupan en 6 categorías, con nivel de significancia 0.01. La microflora de los aceites estimulados por la SM1cp registraron los mayores valores: A SIcp, B ARIcp, C ARAcp. Las medias D y E correspondieron a SI, ARI y ARA incubadas en la SM1ca. La media F se asignó a ambos controles que presentaron los menores valores.

20

B

18

C

16

C

D E

14

ppm de CO2

SI = suelo impactado. ARI = aceite residual industrial. ARA = aceite residual automotriz. Ca = con agitación. cp = con H2O2 50 ppm. (Tukey 0.01)

A

12 10 8 6 4 2

F

F

0 S Icp

ARIcp

ARAcp

S Ica

ARIca

ARAca

Ctrlcp

Ctrlca

Figura 11. Efecto de la solución mineral 1 y dos fuentes de oxigenación en la biodegradación de ARI, ARA y SI. El Cuadro 9 presenta los coeficientes de determinación del análisis de regresión de cada tratamiento probado, los valores señalan que existe correlación significativa entre los puntos obtenidos en cada una de las muestras probadas: ARI, ARA, SI, y el ctrl. en la SM1 y SM2.

Cuadro 9. Coeficientes de determinación del análisis de regresión de los valores de CO2 generado por la microflora de los aceites en la SM1. Tipo de aceite Con agitación Con H2O2 Aceite Residual Industrial 0.9889 0.9982 Aceite Residual Automotriz 0.9931 0.9963 Suelo Impactado 0.9903 0.9974 Control 0.2720 0.3077 SM1 = solución mineral 1

34

1.2.2.- Comparación del efecto de dos soluciones minerales y la oxigenación sobre la producción de CO2 por la microflora activa en ARI, ARA y SI. El Cuadro 10 muestra diferencia significativa en el análisis de varianza de la producción de CO2 generada por la microflora presente en ARI, con dos SM y fuentes de oxigenación. La composición química de las SM y oxigenación ejercieron diferente efecto en la microflora inicial de ARI. Cuadro 10. ANAVA del efecto de dos soluciones minerales y condiciones de oxigenación sobre la producción de CO2 por la microflora del ARI. ___

FV TRATAMIENTOS ERROR TOTAL

GL 4 20 24

SC 1118.294434 2.855957 1121.150391

CM F 279.573608 1957.8278 0.142798

P>F 0.000

ARI = Aceite residual Industrial

La comparación de medias según Tukey establece diferencia en el efecto de cada SM y fuente de oxigenación. Se establecieron cinco grupos, la mayor cantidad de CO2 se indujo con la SM1 y H2O2 a 5 ppm como fuente de oxígeno (Fig. 12).

20 18

B

16

ppm de CO2

SM = Solución mineral. sa = sin agitación. ca = con agitación. cp = con H2O2 a 50ppm. ARI = Aceite residual industrial. Ctrl. = Control. (Tukey 0.01).

A

14 12 10

C

8 6

D

4

E

2 0 SM1cp

SM1ca

SM1sa

SM2sa

Ctrl.

Figura 12. Efecto de dos SM y formas de oxigenación en la biodegradación de ARI por su microflora acompañante.

35

El Cuadro 11 muestra el análisis de varianza con diferencia significativa en el efecto de las fuentes de oxigenación sobre la producción de CO2 generada por la microflora del ARA con la SM1.

CUADRO 11. ANAVA del efecto de dos SM y fuente de oxígeno sobre la producción de CO2 por la flora microbiana acompañante en el ARA. ___ FVL GL SC CM F P>F TRATAMIENTOS 4 836.533691 209.133423 2639.3792 0.000 ERROR 20 1.584717 0.079236 TOTAL 24 838.118408 SM= solución mineral.

ARA= Aceite residual automotriz

La prueba de medias según Tukey no señala diferencia en la respuesta de la población activa en el ARA con la SM1sa y SM2sa, pero diferencía entre SM1cp y ca. La máxima estimulación en la producción de CO2 por la flora microbiana del ARA se registró con la SM1cp (Fig. 13).

18 16

A B

14

ppm de CO2

ARA = Aceite residual automotriz. SM = Solución mineral. sa = sin agitación. ca = con agitación. cp = con H2O2 a 50ppm. Ctrl = Control (Tukey 0.01).

12 10 8

C

6

C

4

D

2 0 SM1cp

SM1ca

SM1sa

SM2sa

Ctrl.

Figura 13. Efecto de dos soluciones minerales y formas de oxigenación en la biodegradación de ARA por su microflora acompañante.

El Cuadro 12 muestra el análisis de varianza con diferencia significativa en el efecto de dos SM y la fuente de oxígeno sobre la producción de CO2 por la población acompañante del SI.

36

Cuadro 12. ANAVA del efecto de la SM1 y condiciones de oxigenación sobre la producción de CO2 por la microflora acompañante en el SI. ___ FV GL SC CM F P>F TRATAMIENTOS 3 1048.031494 349.343842 3203.3857 0.000 ERROR 16 1.744873 0.109055 TOTAL 19 1049.776367 SM1= solución mineral 1.

SI = Suelo impactado

La comparación de medias según Tukey estableció cuatro grupos de valores diferentes, donde la SM1cp favoreció los mayores valores de CO2. Fig. III.1.2.2c.

25

ppm de CO2

20

SI = Suelo impactado. SM = Solución mineral. sa = sin agitación. ca = con agitación. cp = con H2O2 a 50ppm (Tukey 0.01).

A B

15 10

C

5

D 0

SM1cp

SM1ca

SM1sa

Ctrl.

Figura 14. Efecto de la SM1 y diferentes formas de oxigenación en la biodegradación de ARA en SI por su microflora activa.

1.2.3. Efecto de dos soluciones minerales y la oxigenación sobre la biodegradación de grasas y aceites. El análisis de varianza de la biodegradación en ppm del ARI con dos SM y condiciones de oxigenación, presentó diferencia significativa sobre la biodegradación generada por la población activa del ARI (Cuadro 13).

37

Cuadro 13. ANAVA de la biodegradación de ARI en ppm causada por la microflora activa con diferente SM y oxigenación, durante 5 semanas_________ FV GL SC CM F P>F TRATAMIENTOS 4 2531146.000000 632786.50 28600.5195 0.000 ERROR 20 442.500000 22.125000 TOTAL 24 2531588.500000 SM= solución mineral.

ARI = Aceite residual industrial

La comparación de medias según Tukey señala que la respuesta de la población microbiana activa en ARI fue diferente en cada SM y condiciones de oxigenación probadas. La SM1cp estimuló la máxima mineralización (Fig. 15).

ARI = Aceite residual industrial SM = Solución mineral. sa = sin agitación. ca = con agitación. cp = con H2O2 a 50 ppm. (Tukey 0.01)

1000 900

A

800

B

700

ppm

600 500

C

400 300

D

200 100

E

0 SM1cp

SM1ca

SM1sa

SM2sa

Ctrl.

Figura 15. Efecto de dos SM y condiciones de oxigenación sobre la biodegradación de ARI en 5 semanas.

El cuadro 14 muestra el análisis de varianza con diferencia significativa entre los valores de biodegradación con diferentes fuentes de oxígeno y SM generada por la microflora acompañante en ARA.

38

Cuadro 14. ANAVA de la biodegradación de ARA en ppm por la microflora activa con diferente SM y oxigenación en 5 semanas _______________ FV GL SC CM F P>F TRAT 4 1372873.250000 343218.312500 88859.1094 0.000 ERROR 20 77.250000 3.862500 TOTAL 24 1372950.500000 ARA = aceite residual automotriz.

SM = solución mineral

La prueba de Tukey muestra el efecto sobre la mineralización de ARA, que fue diferente en cada SM y condiciones de oxigenación, se encontraron 5 valores de medias, el mayor correspondió a la SM1cp (Fig. 16).

700

ARA= Aceite residual automotriz. SM = Solución mineral. sa = sin agitación. ca = con agitación. cp = con H2O2 a 50 ppm (Tukey 0.01).

A

600

B

ppm

500 400

C

300

D

200 100

E

0 SM1cp

SM1ca

SM1sa

SM2sa

Ctrl.

Figura 16. Efecto de dos SM y formas de oxigenación sobre la biodegradación de ARA en 5 semanas.

El análisis de varianza de los resultados de la biodegradación del ARA en el SI, expresado en ppm, con diferentes fuentes de oxigenación y la SM1 mostró diferencia significativa en la respuesta de la población microbiana activa (Cuadro 15).

39

Cuadro 15. ANAVA de la biodegradación de ARA en el SI, con diferente oxigenación en la SM1, durante 5 semanas. ___ FV GL SC CM F P>F TRAT 3 1372303.2500 457434.406250 142115.5469 0.000 ERROR 16 51.500000 3.218750 TOTAL 19 1372354.750000 SI = Suelo impactado

SM1= Solución mineral 1

La prueba de Tukey señala que existen cuatro grupos diferentes de valores (Figura 15) la SM1cp generó los mayores valores de biodegradación de aceite.

ARA = Aceite residual automotriz. SI = suelo impactado. SM = Solución mineral. sa = sin agitación. ca = con agitación. cp = con H2O2 50ppm. (Tukey 0.01).

800 700

A B

ppm

600 500

C

400 300 200

D

100 0 SM1cp

SM1ca

SM1sa

Ctrl.

Figura 17. Efecto de la SM1 y condiciones de oxigenación sobre la biodegradación de ARA por la microflora activa en el SI por cinco semanas.

1.3. Medición de volátiles orgánicos y metales pesados. Antes de iniciar el proceso de bioestimulación de la microflora inicial, se analizaron los tres aceites. En el Cuadro 16 se muestran los diferentes componentes de ARI, ARA y SI expresados en mg/l, así como las técnicas empleadas para cada determinación, en dicho cuadro destacan los valores de plomo con 153.7 mg/l y de zinc que registró 1157.5 mg/l, ambos en el ARA. Después del proceso de bioestimulación con la SM1cp, se analizaron los aceites tratados. En el Cuadro 17 se presentan los resultados obtenidos, los valores para el plomo y el zinc en el ARA disminuyeron notablemente, con < 2.0 y < 7.58 mg/l respectivamente.

40

2. Efecto la SM3, H2O2 y un microcosmos cerrado en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA. 2.1. Propiedades fisicoquímicas. Las propiedades fisicoquímicas del suelo empleado en esta prueba se expresan en el Cuadro 18.

Cuadro 18. Propiedades fisicoquímicas del suelo muestreado Parámetro Concentración Saturación 40.5 % pH 7.2 Conductividad eléctrica 0.24 Mmhos/cm Calcio 2.25 Meq/l Magnesio 2.25 Meq/l Carbonatos 0.00 Meq/l Bicarbonatos 2.50 Meq/l Cloruros 1.00 Meq/l Sulfatos 1.00 Meq/l Nitrógeno total 28.59 mg/l Fósforo total 0.09 mg/l Textura Arena 68 % Limo 22 % Arcilla 10 % Materia orgánica 1.50 %

Interpretación Alcalino

Libre de sales

Franco arenoso Suelo pobre

2.2. Captación de CO2 en álcali. La Fig. 18 muestra el efecto de estimulación de la SM3 sobre la producción de CO2 generada por la microflora activa del suelo agrícola contaminado con ARA, durante 8 semanas, con una dinámica de liberación de CO2 en función del tipo de bioestimulación aplicada en el tratamiento, la máxima producción de CO2 se registró en el suelo enriquecido con SM y H2O2 a 50 ppm con un máximo de 77.6 ppm, al agregar solo SM la concentración de CO2 fue de 58 ppm. En el suelo sin ARA con SM la cantidad fue de 47 ppm. Los resultados en los tres tratamientos fueron diferentes en comparación con el control, donde no se indujo la producción de CO2. 43

90

SM3 = Solución mineral 3. ARA = Aceite residual automotriz. H2O2 a 50 ppm. Ctrl.= ARA + SM estéril.

80

SM3 + H2O2

ppm de CO2

70 60

SM3 50 40

Sin ARA+SM3

30 20 10

Ctrl.

0 1

2

3

4

5

6

7

8

Semanas

Figura 18. Efecto de la SM3 y el H2O2 en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA. El análisis de varianza del establece diferencia significativa en la producción de CO2 por la flora microbiana del suelo con los diferentes tratamientos (Cuadro 19)

Cuadro 19. ANAVA de la producción de CO2 generada por la microflora de un suelo agrícola contaminado con ARA bajo diferentes tratamientos. FV GL SC CM F P>F TRAT 3 25026.281250 8342.093750 11061.0674 0.000 ERROR 28 21.117188 0.754185 TOTAL 31 25047.398438 ARA = Aceite residual automotriz

Los coeficientes de determinación del análisis de regresión de acuerdo con los tratamientos, fueron los siguientes: para el control (SM + ARA estéril), 0.2450; SM, 0.9853; SM3 + ARA, 0.9774; SM3 + ARA + H2O2 a 50 ppm, 0.9885, estos valores sugieren una correlación significativa entre los puntos obtenidos en cada tratamiento. La prueba de medias señala diferencia en la respuesta a los tratamientos probados, la SM3 + H2O2 estimularon la máxima producción de CO2 (Fig. 19).

44

SM3 = Solución mineral 3. ARA = Aceite residual automotriz. H2O2 a 50 ppm. Ctrl.= ARA + SM3 estéril. (Tukey 0.01).

90 80

A

ppm de CO2

70

B

60

C

50 40 30 20 10

D

0 SM3+H2O2

SM SM3

SM sin sin ARA SM3 ARA

Ctrl.

Figura 19. Efecto de la SM3 y el H2O2 en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA.

2.3. Determinación de grasas y aceites. El análisis de varianza de los valores totales de la biodegradación del ARA por la microflora del suelo agrícola estimulada con la SM3 y el H2O2 durante 8 semanas, mostró diferencia significativa entre los tratamientos probados (cuadro 20).

Cuadro 20. ANAVA de los valores totales de biodegradación de ARA inducidos por la SM3 y el H2O2 sobre la microflora de un suelo agrícola. FV GL SC CM F P>F TRAT 2 21307350.00 10653675.00 36526.88 0.000 ERROR 12 3500.00 291.6666 TOTAL 14 21310850.00 ARA = Aceite residual automotriz

45

En la prueba de Tukey se encontraron 3 grupos de valores donde la SM3 + H2O2 indujo la máxima biodegradación de ARA con 2884 ppm (Fig. 20).

3000

ARA = Aceite residual automotriz. SM3 = Solución mineral 3. H2O2 a 50 ppm. Ctrl.= Control estéril con ARA y SM. (Tukey 0.01).

A

2500

ppm

2000 1500

B

1000 500

C

0 SM3 + H2O2 SM+H2O2

SM3 SM

Ctrl.

Figura 20. Efecto de la SM3 y el H2O2 en la biodegradación de ARA por la microflora de un suelo agrícola

46

3. Efecto de diferentes factores y un microcosmos con flujo de aire en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA. 3.1. Captación de CO2 en álcali En la Fig. 21 se ilustra el efecto de la SM3, H2O2 y fPch sobre la producción de CO2 con flujo de aire, por la microflora nativa de un suelo agrícola contaminado con ARA. Se probó un control relativo sin ARA, enriquecido con la SM3, que estimuló la mineralización de la materia orgánica al detectarse aumento en la producción de CO2, y alcanzó un máximo de 44 ppm de CO2. En el suelo contaminado con ARA y adicionado con la SM3, se incrementó la concentración de CO2 con respecto al tiempo que llegó a 77.1 ppm. Cuando al suelo agrícola contaminado con ARA y enriquecido con la SM3 se agregó H2O2 como fuente adicional de oxígeno, la producción de CO2 por la microflora nativa fue de 94.3 ppm.

SM3 = solución mineral 3. fPch = filtrado de Phanerochaete chrysosporium. ARA = aceite residual automotriz H2O2 a 50 ppm

120

ppm de CO2

100

SM3+fPch

80 60

SM3 SM3+H2O2

Sin ARA+SM3

40

agua

20

SM3 estéril 0

2 1

24

6 3

84

10 5

12 6

Semanas Semanas Figura 21. Efecto de diversos factores y un flujo de aire sobre la microflora de un suelo agrícola contaminado con ARA.

47

El suelo agrícola tratado con el ARA y enriquecido con la SM3 y el fPch, generó la mayor producción de CO2 con 105.3 ppm. En el suelo contaminado con ARA y regado solo con agua la producción de CO2 fue de 19.4 ppm.

Finalmente, en el tratamiento 6 se muestra el suelo contaminado con ARA y enriquecido con la SM3 en condiciones de esterilidad, en este caso la adición de la SM3 no tuvo efecto sobre la producción de CO2. 80 T3 C

70 T2 B

ppm de CO2

60 50 40

T4 D

T1 A

SM = solución mineral 3. fPch = filtrado de Phanerochaete chrysosporium. ARA = Aceite residual automotriz. H2O2 a 50 ppm. (Tukey 0.01).

T4

T2

30

T5 E

20

T6 F

10 0 SM sin 1 ARA

SM 2

SM+H2O2 3

SM+fPch 4

agua 5

SM 6estéril

Tratamientos probados

Figura 22. Efecto de diversos factores y un flujo de aire en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA.

La Fig. 22 muestra la comparación de medias según Tukey y los valores promedio, de la producción de CO2 por la microflora nativa de un suelo agrícola contaminado con ARA, bajo diferentes factores representados en 6 tratamientos. Cada uno ejerció un efecto diferente entre sí sobre la flora microbiana nativa del suelo, la máxima producción de CO2 se alcanzó en el suelo contaminado con ARA y tratado con SM3 + fPch.

48

3.2. Determinación de grasas y aceites. En la Fig. 23 se comparó el efecto de diferentes factores y el flujo de aire sobre la máxima biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA, en diferentes períodos de tiempo. En las primeras 5 columnas se muestra el efecto del flujo de aire continuo por 12 semanas (En el tratamiento 1 no se le agregó ARA, por lo tanto no aparece en la figura).

En el tratamiento 2, suelo contaminado con ARA y enriquecido con SM3, se degradaron 3900 ppm, en comparación con las 1290 ppm cuando no se aplicó el flujo de aire.

T2 SM3

20000

T4

ppm de ARA biodegradado

T3 SM3+H2O2

T3

18000

T4 SM3+fPch

16000

T5 agua

14000 T4

12000

T6 SM3 estéril

T2

10000 T3

8000 6000 4000 2000 0

T2 T3 T4

T3

T2 T5

T2

T5

T4

T6

T6

T5

T6 12 con aire

T5

SM3 = solución mineral 3. H2O2 a 50 ppm. fPch = filtrado de Phanerochaete chrysosporium. Pasto = Lolium multiforum.

T6 8 sin aire

16 con pasto

36 TOTAL

Tiempo en semanas Semanas

Figura 23 Efecto de diferentes factores sobre la máxima biorremediación de un suelo agrícola contaminado con aceite residual automotriz.

El tratamiento 3 con H2O2 y la SM3 generó un incremento en la cantidad de ARA degradado, alcanzando 8200 ppm con flujo de aire y 4810 sin su aplicación.

49

En el suelo contaminado con ARA, enriquecido con la SM3 y el fPch (trat. 4) se produjo un impacto positivo sobre la biodegradación del ARA; con flujo de aire fue de 12080 ppm, comparado con la biodegradación obtenida sin él, de 1810 ppm.

En el tratamiento 5, se muestra el suelo contaminado con ARA y adicionado con agua, con aireación se detectaron 1310 ppm de ARA biodegradado y 830 sin aire.

En el suelo del tratamiento 6 enriquecido con la SM3 en condiciones de esterilidad, se comprueba que el la biodegradación del ARA fue exclusivamente dependiente de la actividad microbiana heterotrófica de los organismos activos, la cual, al eliminarse, hizo imposible la biorremediación del suelo.

Esto se demuestra con los valores de biodegradación de 25 ppm con flujo de aire y de solo 20 ppm en su ausencia. Si se comparan todos los tratamientos, en base a las ppm de ARA degradado los mejores son el 4, 3 y 2. Siendo el tratamiento 4 más efectivo que el 3 y el 2.

3.3. Fitorremediación. Después de mantener los suelos con y sin flujo de aire, del impacto de cada uno de los factores que se agregaron en cada tratamiento y con la finalidad de reducir al máximo la concentración de ARA; en este suelo se colocaron plántulas del pasto L. multiforum. Los resultados se muestran en la Fig. 23 donde se puede apreciar la similitud entre las cantidades de ARA degradado en el suelo de los tratamientos 2, 3 y 4; con los valores: 4697, 5027 y 5075 ppm, respectivamente.

La Fig. 23 también ilustra el total de biodegradación de ARA por acción de la microflora activa en el suelo agrícola, donde los mayores valores fueron de 18965 ppm para el tratamiento 4, 18037 ppm para el tratamiento 3 y de 10157 ppm para el 2, en un tiempo total de 36 semanas.

50

En el Cuadro 21 se presentan los resultados del análisis bifactorial del efecto de la SM3, H2O2, fPch con y sin flujo de aire sobre la biorremediación del suelo agrícola contaminado con ARA y las diferencias altamente significativas entre las estrategias empleadas () para estimular la actividad biodegradadora de la microflora con y sin flujo de aire. Además, se señalan las diferencias significativas () entre los tratamientos utilizados, en el caso del tratamiento 3 (c); con H2O2 + SM3 y 4 (d); suelo tratado con la SM3 + fPch. Esto sugiere que la combinación de factores en los tratamientos 3 y 4, estimularon la biorremediación del suelo agrícola contaminado con ARA.

CUADRO 21. Análisis bifactorial del efecto del flujo de aire sobre la biodegradación de ARA en un suelo agrícola con diferentes factores fisicoquímicos. Tratamiento X  E E 3 5 4 H2O SM3+H2O2 SM3+fPch Con aire 1470.95 0.0000 SM3  12 semanas 44.06 23.32 6.4 34.18 0.0748 0.666 0.471 0.188 d b e c Sin aire 110.849 0.0000 17.629  15.556  3.1964  6.198   8 semanas 0.151 1.067 0.7388 0.2693 b c d e   Datos procesados de la biodegradación de ARA con y sin flujo de aire. SM3 = solución mineral 3. H2O2 a 5 ppm. fPch = filtrado de Phanerochaete chrysosporium. H2O =suelo con agua. Condición

F

P

2

51

V. DISCUSIÓN

Los microorganismos observados en el agar aceite se desarrollaron muy lentamente, esto sugiere dependencia entre las diversas poblaciones microbianas para degradar compuestos orgánicos complejos, ya que en su forma natural conviven en asociación, donde los productos metabólicos de unas especies pueden ser aprovechados por otras, creando una interdependencia nutricional en los consorcios microbianos (Kanaly et al., 2000). Los microorganismos desarrollados en el agar aceite fueron morfológicamente similares a los encontrados en los medios selectivos, entre los aislados a partir de ARI, ARA y SI, se detectaron levaduras, hongos y actinomicetos, nativos de suelo, pero en este caso sobrevivieron a pesar de los aceites residuales. En estudios realizados en Brasil se aislaron de diesel (Bento y Gaylarde, 2001), también se encontraron cocobacilos Gram negativos, enterobacterias provenientes de la actividad humana, este grupo se detectó en investigaciones en agua salada y sedimento como en la Bahía Chesapeake, EUA donde se reportó la oxidación de petróleo (Austin et al., 1977). En un derrame experimental de petróleo en la costa de Delaware, EUA, se observó un evidente incremento de bacterias Gram negativas al enriquecer el área con una solución mineral que equilibró el desbalance nutricional en ese sitio (Macnaughton et al., 1999). El desarrollo de estas poblaciones en medios selectivos sugiere que tienen una amplia capacidad metabólica y tolerancia a los agentes antimicrobianos, propiedad esencial de los microorganismos oxidantes de hidrocarburos. La literatura señala que las coliformes son capaces de oxidar hidrocarburos, y que existe correlación entre esta propiedad bioquímica y la tolerancia a diversos agentes antimicrobianos; se utilizaron medios selectivos para determinar el tipo de

52

microorganismos en el ARA, ARI y SI, método de investigación recomendada para este propósito (Austin et al., 1977; Macnaughton et al., 1999; Martínez, 1997). La producción de CO2 en medio líquido fue afectada por diferentes factores; en primer lugar el origen del aceite residual, que influyó en la carga microbiana inicial. En el caso del ARI; que al momento de su colecta circulaba por la planta industrial mezclado con agua, con exposición a la materia orgánica desechada por los trabajadores de la empresa, lo que probablemente aumentó la diversidad de su flora microbiana inicial y la concentración de oxígeno. Comparado con las condiciones en que se encontraba el ARA, en un depósito estático, sin agua, carente de materia orgánica, anóxico, sin posibilidades de aumentar su carga microbiana inicial. Bento y Gaylarde (2001) reportaron la importancia del agua para iniciar el desarrollo microbiano en tanques con diesel. El SI empleado como fuente de inóculo permaneció almacenado el tiempo suficiente para inducir la proliferación de microorganismos oxidantes de ARA. Swannell y col. (1996) enfatizaron la capacidad de los microorganismos para oxidar componentes del petróleo después de períodos cortos de exposición. Otro factor clave en este proceso fue la relación de nutrientes en la SM de prueba; los resultados muestran una evidente diferencia en la producción de CO2 y en la biodegradación de las fuentes de carbono del aceite residual, al probar dos concentraciones de P-K para SM1 y SM2 con ARI, ARA y SI. La concentración de nutrientes en la SM1 estimuló la máxima biodegradación de las fuentes de carbono del aceite residual, este resultado no coincide con las recomendaciones de Adams y colaboradores (1999) que sugieren una relación 100-10-1 de la fórmula N-P-K para inducir la biodegradación de combustibles, lubricantes y petróleo crudo. Mientras que Margesin y Schinner (2001) probaron una relación de 15-15-15 en N-P-K y obtuvieron una reducción del 70% en la concentración de diesel en suelo. Lo anterior sugiere que la relación adecuada de nutrientes dependerá del tipo de contaminante que se pretende eliminar y de un análisis preliminar para garantizar la eficiencia del proceso. Margesin y Schinner (2001) señalan que una concentración y relación 53

equilibrada de nutrientes inorgánicos esenciales, induce la actividad biodegradadora de la diversidad microbiana presente. En el suelo contaminado con ARA e irrigado solo con agua, la falta de N y P limitaron la actividad microbiana nativa para la biodegradación del ARA a 19.4 ppm. En un suelo contaminado con diesel se logró un 90% de biodegradación en 45 días al agregar P y N mineral (Gallego et al., 2001). En el suelo contaminado con ARA y enriquecido con la SM3 en condiciones de esterilidad, fue evidente que la biodegradación del ARA depende de la microflora activa del suelo, el enriquecimiento con la SM3 no tuvo efecto sobre la producción de CO2, pues se eliminó la flora nativa del suelo, lo que sugiere que en efecto la mineralización de ARA depende de los microorganismos activos en el suelo. Durante un proceso de biorremediación, se demostró el aumento de la población microbiana de un suelo al tratarlo con [14C] Benzo [a] pireno y petróleo crudo (Kanali et al., 1997). Otro factor determinante para la biodegradación de hidrocarburos fue la fuente de oxígeno donde el H2O2 fue una de las mejores alternativas recomendada tanto en suelo, como para acuíferos (Backer et al.,1994; Wilson y Brown, 1989; Zappi et al., 1997). El efecto observado se atribuyo a que el H2O2 incrementa el oxígeno disponible en un ambiente acuífero saturado, puesto que el H2O2 se disocia en ½ mol de oxígeno disuelto/mol de H2O2 : H2O2 + H2O --- 0.5 O2 + 2H2O (Hulling et al., 1990; Morgan y Watkinson, 1992). En esta investigación la aplicación de H2O2 a 50 ppm indujo un efecto positivo, ya que como una fuente de oxígeno para el biotratamiento “in situ” tiene las siguientes ventajas: es barato, no persistente, estable, sin problemas de almacenaje, de fácil aplicación y no contamina (Britton, 1985). La baja concentración de materia orgánica en el suelo agrícola favoreció la biodegradación, de acuerdo con los reportes existentes, los suelos ricos en materia orgánica requieren mayores volúmenes de H2O2 que al reaccionar con ésta, reduce

54

su concentración e incrementa el costo de la biorremediación (Aggaewal et al., 1991; Barcelona y Holm, 1991; Zappi et al., 2000). El tratamiento con SM1cp, en el ARA utilizado en esta investigación, redujo notablemente las cantidades de Pb y Zn. Este fenómeno se ha observado en otros estudios donde se reporta la existencia de microorganismos tolerantes a metales pesados, con la capacidad de captar Pb+ en las proteínas y en los polisacáridos de su pared celular (Kjaergaard et al., 2000; Richards et al., 2002). Se cree que esto depende de la síntesis de enzimas y “fitoquelatinas” (Phitochelatins): péptidos ricos en cisteína que se unen a metales pesados, estos péptidos se sintetizan en plantas y levaduras (Sauge-Merle et al., 2003). Esto pudo deberse a que las levaduras existentes en el ARA se activaron al contacto con la SM1cp para captar los metales pesados. Los microorganismos activos, además de su tolerancia al Pb y Zn demostraron capacidad para biodegradar ARA y la producción de CO2 derivada de la misma, esto sugiere una doble bioestimulación de la flora microbiana. Se reporta la capacidad de cultivos específicos y de la microflora del suelo para fijar cadmio tanto en la membrana como intracelularmente y con capacidad para oxidar 500-μg ml-1 de ácido 2-4 diclorofenoxiacético (Roane et al., 2001). Se probó la capacidad de los microorganismos de suelo para captar plomo y oxidar glucosa marcada con C14 (Konopka et al, 1999). Entre los factores evaluados en esta investigación, la aplicación del fPch fue clave en suelo contaminado con ARA, este hongo está reconocido por su capacidad de hidrolizar cloroaromáticos contaminantes del ambiente. Esta capacidad bioquímica se atribuye a un sistema multienzimático productor de lignina-peroxidasas, peroxidasas manganeso-dependiente, y un mecanismo generador de H2O2 (Michael, 1999; Reddy, 1993; Yadav et al., 1995). A pesar de que el ARA empleado como contaminante contenía cantidades bajas de aromáticos, la aplicación del fPch estimuló la producción de CO2 y la cantidad de ARA biodegradado. En el suelo contaminado con ARA, enriquecido con la SM3 y el fPch se indujo un efecto positivo sobre la biodegradación del ARA; con flujo de aire fue de 12080 ppm, posiblemente 55

la actividad enzimática del fPch se estimuló por el flujo de aire, en comparación con la biodegradación observada sin aire, que fue de 1810 ppm. Es probable que las enzimas sintetizadas por el sistema multienzimático y el mecanismo productor de H2O2 estimularon la liberación de O2 para inducir la biodegradación del ARA. Esto pudo deberse también a la participación de las enzimas del citocromo P450, que constituyen una super familia de haem-thiolato monooxigenasas, algunas de las cuales catalizan la hidroxilación de contaminantes orgánicos, (Masaphy et al.,1996; Mehmood et al., 1997; Topal et al., 1996). El suelo sembrado con del pasto L. multiflorum, después de la aplicación de los diferentes factores mostró similitud en las cantidades de ARA biodegradado en los tratamientos 2, 3 y 4; con los valores: 4697, 5027 y 5075 ppm, respectivamente durante 16 semanas de incubación. Los tres tratamientos coinciden en que pueden contener los remanentes de la SM que se agregó en las etapas previas del experimento. En trabajos anteriores se estableció la importancia del equilibrio mineral para estimular la fitorremediación (Linn y Mendelssohn, 1998). Otro factor crítico en este trabajo fue que se empleó un suelo no esterilizado, donde la flora microbiana nativa y activa de la rizósfera fue la responsable de llevar a cabo el proceso de fitorremediación del suelo contaminado con el ARA. Esto ha sido ampliamente estudiado en suelos contaminados con hidrocarburos poliaromáticos (Siciliano et al., 2003). En el suelo de los tratamientos 5 y 6 se muestran valores inferiores en la biodegradación del ARA, el primero se humedeció solo con agua en la etapa previa del experimento y mostró 2625 ppm de ARA biodegradado, es posible que los remanentes de la SM hayan sido suficientes para estimular la actividad de la microflora capaz de degradar ARA en la rizósfera. El suelo del tratamiento 6 se mantuvo en esterilidad durante la investigación, esto prueba que la flora microbiana activa del suelo es indispensable para la biodegradación (Cunningham et al., 1996; Ferrera-Cerrato, 1997; Linn y Mendelssohn, 1998; Siciliano y Germida, 1998).

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Falta mucho por hacer e investigar en cuanto a la degradación de aceites residuales, como perspectivas de continuación podemos citar las siguientes: 1.- Probar si se eliminan los metales pesados en suelo al igual que en medio líquido. a) Cómo se lleva a cabo el proceso de eliminación o transformación. b) Quienes son los microorganismos responsables de dicho proceso. 2.- Qué enzimas están presentes y activas en el jugo enzimático y cuales actúan en la biodegradación del aceite. 3.- Que parte de la mezcla de constituyentes del aceite es eliminada por la microflora de la rizósfera de la planta. 4.- Qué tipo de plantas además del pasto pueden utilizarse para fitorremediar suelos contaminados con ARA.

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VI. CONCLUSIONES

El ambiente natural tiene la capacidad de amortiguar el efecto contaminante de ARA para mantener el equilibrio mediante la microflora nativa del suelo. Los consorcios microbianos del suelo pueden ser inducidos para utilizar ARA como fuente de carbono y biodegradarlo.

En este estudio se demostró que tanto la microflora inicial de los aceites residuales como la flora nativa del suelo agrícola, fueron estimuladas para su biodegradación, así como en la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA y que dicha capacidad fue potenciada con la aplicación oportuna de las diferentes combinaciones de factores que facilitaron este proceso.

Este es uno de los primeros trabajos realizados en México en relación con la biorremediación de un suelo agrícola contaminado con ARA, lo cual abre grandes expectativas para actuar y remediar procesos contaminantes causados por estos productos.

58

VII. LITERATURA CITADA Adams, S. R.; V. I. Domínguez. y Y. L. García. (1999). Potencial de la biorremediación de suelo y agua impactados por petróleo en el trópico mexicano. Terra, 17: 159-174. Aggarwal, P.; J. Means; D. Downey and R. Hinchee. (1991). Use of Hydrogen peroxide as an oxygen source for in situ biodegradation, Part II: Laboratory studies. Journal Hazardous Materials, 27: 301-314. American Petroleum Institute. (1986). Beneficial stimulation of bacterial activity in ground waters containing petroleum products. API, 4442-4496 Washington, D. C. Aprill, W. and R. C. Sims. (1990). Evaluation of the use of prairie grasses for stimulation polycyclic aromatic hydrocarbon treatment in soil. Chemosphere, 20: 253-265. Atlas, R. M and C. E. Cerniglia. (1995). Bioremediation of petroleum pollutants. Bio-Science, 45: 332-338. Austin, B.; J. J. Calomiris; J. D. Walker and R. R. Colwell. (1977). Numerical taxonomy and ecology of petroleum-degrading bacteria. Applied Environmental Microbiology, 34: 60-68. Barcelona, M. and T. Holm. (1991). Oxidation-Reduction capacities of acuifer soils. Environmental Science Technology, 25:1565-1572. Barry K. R.; G. M. Long and J. K. Sheldon. (1992). Applied bioremediation. En Practical Environmental Bioremediation. Lewis Publishers, 11-26 p.

59

Bajpai, R.K. and M. E. Zappi. (1994). Additives for establishment of biologically active zones during in situ bioremediation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 25-38. p. Bento, F. M. and C. C. Gaylarde. (2001). Biodeterioration of stored diesel oil: studies in Brazil. International Biodeterioration & Biodegradation, 47: 107- 112. Biederbeck, V. O.; O. T. Bouman and C. A. Campbell; L. D. Bailey; G. E. Winkleman. (1996). Nitrogen benefits from four green-manure legumes in dryland cropping systems. Canadian Journal of Plant Science, 76: 307-315. Bogan, B. W.; B. Schoenike; R. T. Lamar and D. Cullen. (1996). Manganese peroxidase mRNA and enzyme activity levels during bioremediation of polycyclic

aromatic

hydrocarbon-contaminated

soil

with

Phanerochaete

chrysosporium. Applied Environmental Microbiology, 62: 2381-2386. Britton, L.N. (1985). Feasibility studies on the use of hydrogen peroxide to enhance microbial degradation of gasoline. American Petroleum Institute. Washington, D.C. 56-98 p. Chayabutra, Ch. and L. Ju. (2000). Degradation of n-hexadecane and Its metabolites by Pseudomonas aeruginosa under microaerobic and anaerobic denitrifying conditions. Applied Environmental Microbiology, 66:493-498. Cheung, P-Y. and B. K. Kinkle. (2001). Mycobacterium diversity and pyrene mineralization

in

petroleum-contaminated

soil.

Applied

Environmental

Microbiology, 67: 2222-2229. Cookson, J.T. (1995). Treatability studies. in Bioremediation engineering: design and application. McGraw-Hill, New York, U.S.A., 433-459 p. Cunningham, S. D.; T. A. Anderson; A. P. Schwab and F.C. Hsu. (1996). Phytoremediation of soils contaminated with organic pollutants. Advances in Agronomy, 56: 55-114.

60

Dass, S. B.; G. C. Dosortez; C. A. Reddy and E. A. Grethlein. (1995). Extracellular

proteases

Phanerochaete

produced

chrysosporium

by

under

the

wood

degrading

ligninolytic

and

fungus

non-ligninolytic

conditions. Archives of Microbiology, 163:254-258. Dinkla, J.T.; M. E. Gabo and B. C. Janssen. (2001). Effects of iron limitation on the degradation of toluene by Pseudomonas strains carrying the TOL (pWWO) plasmid. Applied Environmental Microbiology, 67: 3406-3412. EPA-200.7. (1994). Environmental Protection Agency. Metals and trace elements by ICP/ atomic emission spectrometry “Methods for the determination of metals in environmental samples – Suplement 1”, EPA/600/R-94/111. May 1994. EPA-300.0.

(1993).

Environmental

Protection

Agency.

Environmental

Monitoring systems laboratory. Office of research and development, USEPA Method 300.0, Determination of inorganic anions by ion chromatography, EPA600/R-93-100. August 1993. EPA-8082.

(1997).

Polychlorinated

Environmental

biphenyls

Protection

(PCBs)

by

Agency. gas

Method

8082:

chromatography.

http://www.epa.gov/eoaoswer/hazwaste/test/pdfs/8082.pdf EPA-sw. (1997). Environmental Protection Agency, solid waste. Method 8021B, Aromatic and halogenated volatiles by gas chromatography using photoionization

and/or

electrolytic

conductivity

detectors.

http://www.epa.gov/epaoswer/hazwaste/test/pdfs/8021b.pdf. EPA-sw-8260. (1997). Environmental Protection Agency, solid waste. Method 8260B,

Volatile

organic

compounds

by

gas

chromatography/mass

spectrometry

(GC/MS).

http://www.epa.gov/epaoswer/hazwaste/test/pdfs/8260b.pdf.

61

Fan, S. and K. M. Scrow. (1993). Biodegradation of trichloroethylene and toluene by indigenus microbial populations in soil. Applied Environmental Microbiology, 59:1911-1918. Ferrera-Cerrato, R. (1997) Impacto de la contaminación por hidrocarburos sobre el desarrollo de las plantas y de los microorganismos de la raíz. En: Simposium sobre Biorremediación de Suelos y Acuíferos. CINVESTAV-IPN. México D. F. 13-25 p. Fogel, S.; R. Norris; E. Crockett and M. Findlay. (1988). Enhanced Bioremediation Techniques for in situ and on-site treatment of petroleumcontaminated soils and groundwater. In Proceedings of the 3rd conference on environmental and public health effects of soils contaminated with petroleum, Amherst, MA, Sept. Gallego, L. R.; J. Loredo; J. F. Llamas.; F. Vázquez and J. Sánchez. (2001). Bioremediation of diesel-contaminated soils: Evaluation of potential in situ techniques by study of bacterial degradation. Biodegradation, 12: 325-335. Goldsmith, C. and R. Balderson. (1989). Biokinetic constants of a mixed microbial culture with model diesel fuel. Hazardous Waste, 6: 145-154. Gonzalez, F. J. (1998). The study of xenobiotic-metabolizing enzymes and their role in toxicity in vivo using targeted gene disruption. Toxicology Letters, 102: 161-166. Guengerich, F. P. (1993). Cytochrome P450 enzymes. American Science, 81: 440-447. Gunther, T.; U. Dornberg and W. Fritsche. (1996). Effects of ryegrass on biodegradation of hydrocarbons in soil. Chemosphere, 33: 203-215.

62

Holm, P. E.; P. H. Nielsen; H. J. Albrechtsen and T. H. Christensen. (1992). Importance of unattached bacteria and bacteria attached to sediment in determining potentials for degradation of xenobiotic organic contaminants in an aerobic aquifer. Applied Environmental Microbiology, 58: 3020-3026. Horvath, R. S. (1972). Microbial co-metabolism and the degradation of organic compounds in nature. Bacteriol. Rev., 36: 146-155. Huling, S. G.; B. E. Bledsoe and M. V. White. (1990). Enhanced bioremediation utilizing hydrogen peroxide as a supplemental source of oxygen: a laboratory and field study; U.S. Enviromental Protection Agency, Report No.600/S290/006; Johnson, P. C.; M.W. Kemblowski and J. D. Colhart. (1990). Quantitative analysis for the cleanup of hydrocarbon-contaminated soils by in-situ soil venting. Groundwater : 28: 156-167. Kanaly, R. A.; R. Bartha; S. Fogel and M. Findlay. (1997). Biodegradation of [14C] benzo [a] pyrene added in crude oil to uncontaminated soil. Applied Environmental Microbiology, 63: 4511-4515. Kanaly, R. A.; R. Bartha; K. Watanable and S. Hrayama. (2000). Rapid mineralization of benzo [a] pireno by a microbial consortium growing on diesel fuel. Applied Environmental Microbiology, 66: 4205-4211. Karickhoff, S. W. (1984). Organic pollutant sorption in aquatic systems. Journal Hydrology Engineering, 7: 110-707. Kjaergaard, K.; J. K. Sorensen; M. A. Schembri and P. Klemm. (2000). Sequestration

of

zinc

oxide

by

fimbrial

Environmental Microbiology, 66: 10-14.

63

designer

chelators.

Applied

Konopka, A.; T. Zakharova; M. Bischoff; L. Oliver; C. Nakatsu and R. F. Turco. (1999). Microbial biomass and activity in lead-contaminated soil. Applied Environmental Microbiology, 65: 2256-2259. Kuei-Jyum, Y. C.; Y. Kao and C. Cheng. (2002). Oxidation of chlorophenols in soil at natural pH by catalyzed hydrogen peroxide: the effect of soil organic matter. Chemosphere, 46: 67-73. Lawes, B. C. (1991). Soil-Induced descomposition of hydrogen peroxide, Insitu bioreclamation: Applications and investigations for hydrocarbon and contaminated site remediation. (Eds.), Butterworth-Heinemann, Stoneham, Mass., 143-156 p. Leahy, J. G. and R. R. Colwell. (1990). Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. ASM Microbiol. Rev. : 305 – 315. Leal-Castillo, M.; J. M. Sánchez-Yañez.; J. J. Peña-Cabriales. (1994). Efecto de biocidas en un fluido de corte. En: VII Congreso Nacional de la Sociedad Polimérica de México. (Academia Mexicana de Ciencia de Materiales A.C.). Cancun, México, 2 p. Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente. (2001). Diario Oficial de la Federación. SEMARNAT, México 31 de diciembre. Lin, Q.

and

I.

A.

Mendelssohn.

(1998).

The

combined

effects

of

phytoremediation and biostimulation in enhancing habitat restoration and oil degradation of petroleum contaminated wetlands. Ecological Engineering, 10: 263-274. Lorraine, A. S. (1973). Microbiology Laboratory Manual and Workbook. Mosby Co. Saint Louis, U.S.A., 57-68 p.

64

Macnaughton, S. J.; J. R. Stephen; A. D. Venosa; G. A. Davis; Y. Chang and D.C. White. (1999). Microbial population changes during bioremediation of an experimental oil spill. Applied Environmental Microbiology, 65: 3566-3574. Margesin R. and F. Schinner. (2001). Bioremediation (natural attenuation and biostimulation) of a diesel-oil-contaminated soil in an alpine glacier skiing area. Applied Environmental Microbiology, 67: 3127-3133. Masaphy S.; D. Levanon; Y. Henis; K. Venkateswarlu and S. L. Kelly. (1996). Evidence for cytochrome P-450 and P-450 mediated benzo(a)pyrene hydroxylation in the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. FEMS Lett., 135: 51-55. Mehmood Z.; D. E. Kelly and S. L. Kelly. (1997). Cytochrome P4503A4 mediated metabolism of 2,4-Dichlorophenol. Chemosphere , 34: 2281-2291.

Michael, F. (1999). Microbe of the month: Phanerochaete chrysosporium. International Society for Microbial Ecology, http://www.microbes.org/microbes/ phanero.htm Millburn, P. (1995). The fate of xenobiotics in mammals: biochemical processes. Progress in pesticide biochemistry and toxicology, 8: 1-86. Mishra, S.; J. Jyot; R. C. Kuhad and B. Lal. (2001). Evaluation of inoculum addition to stimulate in situ bioremediation of oily-sludge-contaminated-soil. Applied Environmental Microbiology, 67: 1675-1681. Morgan, P. and R. J. Watkinson. (1992). Factors limiting the supply and efficiency of nutrient and oxygen supplements for the in situ bioteatment of contaminated soil ang gruwndwater. Water Research, 26: 73-78. Nelson, M. J. K.; S.O. Montgomery; E. J. Ö‫׳‬Neil and P. H. Pritchard. (1986). Aerobic metabolism of trichloroethylene by a bacterial isolate. Applied Environmental Microbiology, 52:383-384. 65

NMX-AA-005-SCFI-2000.

(2000).

Norma

Mexicana

calidad

del

agua-

determinación de grasas y aceites recuperables en aguas naturales, residuales y residuales tratadas. Diario Oficial de la Federación, México, 18 de diciembre . NMX-AA-008-SCFI-2000.

(2000).

Norma

Mexicana

calidad

del

agua-

determinación de pH. Diario Oficial de la Federación, México, 18 de diciembre. NMX-AA-026-SCFI-2001.

(2001).

Norma

Mexicana

calidad

del

agua-

determinación de Nitrógeno total Kjeldahl en aguas naturales, residuales y residuales tratadas. Diario Oficial de la Federación, México, 17 de abril. NMX-AA-072-SCFI-2001.

(2001).

Norma

Mexicana

calidad

del

agua-

determinación de dureza total en aguas naturales, residuales y residuales tratadas. Diario Oficial de la Federación, México, 13 de agosto. NOM-052-ECOL-SEMARNAT-93. (1993).Norma Oficial Mexicana para la Protección Ambiental. Características de los residuos peligrosos, listado y límites que hacen a un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente. Diario Oficial de la Federación, México, 22 de Octubre. Ogino, H.; K. Miyamoto and H. Ishikawa. (1994). Organic solvent-tolerant bacterium which secrete organic-solvent-stable lipolytic enzime. Applied Environmental Microbiology, 60:3884-3886. Qiu, X.; T. W. Leland; S. I. Shah; D. L. Sorensen and E. W. Kendall. (1997). Grass remediation for clay soil contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons. Phytoremediation of Soil and Water Contaminants. American Chemical Society: Washington, D.C. ACS Symposium Series, 664: 186-199.

66

Radwan, S.S.; H. Al-Awadhi; N. A. Sorkhoh and I. M. El-Nemr. (1998). Rhizospheric hydrocarbon-utilizing microorganisms as potential contributors to phytoremediation for the oily Kuwaiti desert. Microbiological Research, 153: 247-251. Ramanand, K. ; M. Sharmila and N. Sethunathan. (1988). Mineralization of carbofuran by a soil bacterium. Applied Environmental Microbiology, 54: 21292133. Reddy, C. A. (1993). An overview of the recent advances on the physiology and molecular biology of lignin peroxidases of Phanerochaete chrysosporium. Journal Biotechnology, 30: 91-107. Richards, J. W.; G. D. Krumholz; G. D. Chval and L. S. Tisa. (2002). Heavy metal

resistance

patterns

of

Frankia

strains.

Applied

Environmental

Microbiology, 68: 923-927. Roane, T. M.; K. L. Josephson and I. L. Pepper. (2001). Dual-Bioaugmentation strategy to enhance remediation of cocontaminated soil. Applied Environmental Microbiology, 67: 3208-3215. Rojas, A.N.; V. R. Rodríguez; B. S Saval y G. F. Esparza. (1997). Tratamiento por bioestimulación de un suelo altamente contaminado con el arocloro 1260 (bifenilos policlorados). En: Symposium Biorremediación de Suelos y Acuíferos. CINVESTAV-IPN. México D.F., 50-59 p. Sauge-Merle, S.; S. Cunié; P. Carrier; C. Lecompte-Pradines; L. Doan-Trung and G. Peltier. (2003). Enhanced toxic metal accumulation in engineered bacterial cells expressing Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase. Applied Environmental Microbiology, 69: 490-494.

67

Schnoor, J. L.; L. A. Licht; S. C. McCutcheon; N. L. Wolfe and L. H. Carreira. (1995). Pytoremediation of organic and nutrient contaminants. Environmental Science and Technology, 29: 318-323. Siciliano, S. D. and J. J. Germida. (1998). Mechanisms of phytoremediation: biochemical and ecological interactions between plants and bacteria. Environmental Review, 6: 65-79. Siciliano, S. D.; N. Fortin; M. Anca; G. Wisse; S. Labelle; D. Beaumier; D. Ouellette; R. Real; L. G. Whyte; M. K. Banks; P. Schwab; K. Lee; C. W. Greer. (2001). Selection of specific endophytic bacterial genotypes by plants in response to soil contamination. Applied Environmental Microbiology, 67: 24692475. Siciliano, S. D.; J. J. Germida; K. Banks; C. W. Geer. (2003). Changes in microbial community composition and function during a polyaromatic hydrocarbon phytoremediation field trial. Applied Environmental Microbiology, 69: 483-489. Sims, R. C. and R. M. Overcash. (1983). Fate of polynuclear aromatic compounds (PNAs) in soil-plant systems. Residue Reviews,.88: 1-64. Spencer, C. J.; P. C. Stanton and R. J. Watts. (1996). A central composite rotatable analisis for the catalyzed hydrogen peroxide remediation of dieselcontaminated soils. Journal of the Air & Waste Management Association, 46: 1067–1074. Swannell, R. P.; K. Lee. and M. McDonagh. (1996). Field evaluations of marine oil spill bioremediation. Microbiol Review, 60: 342-365. Topal, A.; N. Adams; E. Hodgson and S.L. Kelly. (1996) In vitro metabolism of atrazine by tulip cytochrome P450. Chemosphere, 32: 1445-1451.

68

Thomas, J. and C. Ward. (1989). In situ Biorestoration of organic contaminants in the subsurface. Environmental Science and Technology, 23: 7-14. Vance, D. B. (1996). Phytoremedition: enhancing natural attenuation processes. National Environmental Journal, 6: 30-31. Van den Wijngaard, A. J.; R. D. Wind and D. B. Janssen. (1993). Kinetics of bacterial growth on chlorinated aliphatic compounds. Applied Environmental Microbiology, 59: 2041-2048. Verrhiest G.J.; B.Clément; B. Volat; B. Montuelle and Y. Perrodin. (2002). Interactions between a polycyclic aromatic hydrocarbon mixture and the microbial communities in a natural freshwater sediment. Chemosphere, 46: 187-196. Volc, J.; E. Kubatova; G. Daniel and V. Prikrylova. (1996). Only C-2 specific glucose oxidase activity is expressed in ligninolitic cultures of the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Archives of Microbiology, 165: 421-424. Walker, J. D. and R. R. Colwell. (1974). Microbial petroleum degradation: use of mixed hidrocarbon substrates. Applied Environmental Microbiology, 27: 1053-1060. Walpole, E. R. and R. H. Meyers. (1992). Experimentos generales de un solo factor y Experimentos factoriales En: Probabilidad y Estadística. Tercera edición. Mc Graw-Hill, México. 565-570 p. Wilson, S. and R. Brown. (1989). In situ bioreclamation: a cost-effective technology to remediate subsurface organic contamination. Ground Water Monitor Review, 9: 1-25. Xu, J. G. and R. L. Johnson. (1997). Nitrogen dynamics in soils with different hydrocarbon contents planted to barley and field pea. Canadian Journal of Soil Science, 77: 453-458. 69

Yadav, J. S.; J. F. Quensen III; J.M. Tiedje and C. A. Reddy. (1995). Degradation of polychlorinated biphenil mixtures (aroclors 1242, 1254, and 1260) by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium as evidence by congener-specific analysis. Applied Environmental Microbiology, 61: 25602565. Yoshitomi, K. J. and J. R. Shann. (2001). Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on

14

C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry,

33: 1767-1776. Zappi, M.; D. Gunnison; J. Pennington; M. Cullinane; C. Teeter; J. Brannon and T. Myers. (1997). Technical approach for in situ biotreatment research: bench scale experiments; WES Report No.IRRP-93-3; USAE Waterways Experiment Station: Vicksburg, MS. Zappi, M.; K. White and H. Hwang. (2002). The fate of hydrogen peroxide as an oxygen source for bioremediation activities within saturated aquifer systems. Journal of the Air & Waste Management Association, 50: 1818-1830.

70

ANEXO I ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA PRODUCCIÓN DE CO2 EXPRESADA EN PPM EN LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS Efecto de la solución mineral No.1 sin agitación (SM1sa), en diferentes aceites Aceite residual industrial (ARI) 1 2 3 4.6 4.7 4.5 4.9 5.7 6.1 5.9 6.8 5 6.8 7.1 7.5 7.7 7.5 7.6 Aceite residual automotriz (ARA) 1 2 3 3.4 2.9 3.5 3.9 3.5 4 4.5 4.9 5 4.9 5.1 5.0 5.4 4.9 4.9 Suelo Impactado (SI) 1 2 3 4.64 4.8 4.7 5.3 5.6 5.8 6 6.6 6.3 7.1 7.2 6.9 7.5 7.6 7.7 Control absoluto 1 2 3 0.314 0.3 0.36 0.32 0.34 0.36 0.29 0.32 0.33 0.33 0.35 0.29 0.36 0.37 0.34

FV Tratamientos Error Total

GL 3 16 19

4 4.8 4.5 6.7 6.7 8.2

5 4.9 6.3 6.6 6.9 8.5

suma 23.5 27.5 31 35 39.5

media 4.7 5.5 6.2 7 7.9

4 2.8 3.7 4.8 4.8 5.5

5 3.4 3.9 4.3 5.2 5.3

suma 16 19 23.5 25 26

media 3.2 3.8 4.7 5 5.2

4 4.6 5.9 6.2 7.5 7.8

5 4.66 6 6.5 7.4 7.9

suma 23 28.6 31.6 36.1 38.5

media 4.68 5.72 6.32 7.22 7.7

4 0.29 0.36 0.28 0.35 0.35

5 0.26 0.38 0.34 0.33 0.34

suma 1.524 1.76 1.56 1.65 1.76

media 0.3048 0.352 0.312 0.33 0.352

ANÁLISIS DE VARIANZA SC CM 185.060608 61.686871 1.160645 0.072540 186.221252 C V = 5.09%

71

F 850.3809

P>F 0.000

Tabla de Medias Tratamiento 1 2 3 4

rep 5 5 5 5

Media Nivel de significancia 0.01 α = 0.99 7.900 A Tukey = 0.6251 5.200 B Nivel de significancia 0.05 α= 0.95 0.352 C Tukey = 0.8100 7.700 A valores de tablas (0.05), (0.01)= 4.05, 5.19

Los tratamientos 1 y 4 son semejantes DMS = 0.4976 Tratamientos 1 = ARI 2 = ARA 3 = Ctrl 4 = SI REGRESIÓN ARI TABLA DE DATOS Y X1 4.700 1.000 5.500 2.000 6.200 3.000 7.000 4.000 7.900 5.000 MATRIZ X'X 5 15 15 55 MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000 MATRIZ X'Y 31.300000 101.800000

VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 3.890000 0.790000

72

FV REGRESION ERROR TOTAL

ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM F 1 6.241000 6.241000 1702.0909 3 0.011000 0.003667 4 6.252000

P>F 0.000

ARI COEFICIENTE DE DETERMINACION = 0.9982

MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.004033 -0.001100 -0.001100 0.000367 VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS

Coeficiente tc p B0 61.251615 0.000050 B1 41.256404 0.000080

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 3.890000 3.691345 4.088655 B1 0.790000 0.730103 0.849897

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 99% DE CONFIANZA

Coeficiente

B

L.I.

B0 B1

3.890000 0.790000

3.519047 0.678153

73

L.S. 4.260953 0.901847

T A B L A D E D A T O S ARA --------------------Y X1 --------------------3.200 1.000 3.800 2.000 4.700 3.000 5.000 4.000 5.200 5.000 MATRIZ X'X 5 15 15 55 MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000 MATRIZ X'Y 21.900000 70.900000 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 2.820000 0.520000 ANALISIS DE VARIANZA FV GL SC CM REGRESION 1 2.704000 2.704000 ERROR 3 0.184000 0.061333 TOTAL 4 2.888000

F P>F 44.0870 0.006

ARA COEFICIENTE DE DETERMINACION = 0.9363 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.067467 -0.018400 -0.018400 0.006133

VALORES DE OBSERVADOS

t

CALCULADA

Y

NIVELES

Coeficiente tc p B0 10.856866 0.001360 B1 6.639801 0.005830

74

DE

SIGNIFICANCIA

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 2.820000 2.007522 3.632478 B1 0.520000 0.275029 0.764971

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 2.820000 1.302838 4.337162 B1 0.520000 0.062559 0.977441

SI TABLA DE DATOS Y X 1____ 4.680 1.000 5.720 2.000 6.320 3.000 7.220 4.000 7.700 5.000 MATRIZ X'X 5 15 15 55 MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000

SI MATRIZ

X' Y 31.640000 102.460000 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 4.066000 0.754000

75

ANALISIS DE VARIANZA FV

GL

REGRESION ERROR TOTAL

1 3 4

SC 5.685160 0.078520 5.763680

CM

F

P>F

5.685160 0.026173

217.2119

0.001

SI COEFICIENTE DE DETERMINACION = 0.9864 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.028791 -0.007852 -0.007852 0.002617 VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 23.963018 0.000210 B1 14.738111 0.000610 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 4.066000 3.535247 4.596753 B1 0.754000 0.593972 0.914028 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 4.066000 3.074910 5.057090 B1 0.754000 0.455175 1.052825

Ctrl. TABLA DE DATOS Y X1 --------------------0.300 1.000 0.350 2.000 0.310 3.000 0.330 4.000 0.350 5.000

76

MATRIZ X'X 5 15 15 55 MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000 MATRIZ X'Y 1.640000 5.000000 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 0.304000 0.008000 ANALISIS DE VARIANZA FV GL SC CM REGRESION 1 0.000640 0.000640 ERROR 3 0.001440 0.000480 TOTAL 4 0.002080

F P>F 1.3333 0.333

Ctrl. COEFICIENTE DE DETERMINACION = 0.3077

MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.000528 -0.000144 -0.000144 0.000048

VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 13.229902 0.000800 B1 1.154701 0.332600 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 0.304000 0.232124 0.375876 B1 0.008000 -0.013671 0.029671

77

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 0.304000 0.169784 0.438216 B1 0.008000 -0.032468 0.048468 Efecto de la solución mineral No.2 sin agitación (SM2sa), sobre la flora microbiana presente en diferentes tipos de aceites ARI 1.6 1.5 1.4 1.8 1.2 7.5 1.5 1.8 1.95 1.77 2.3 2.5 10.32 2.064 2.18 2.3 2.4 2.1 2.3 11.28 2.256 2.4 2.1 2.32 2.3 2.28 11.4 2.28 2.3 2.6 2.7 2.4 2.5 12.5 2.5 ARA 2.89 3.25 3.38 3.2 2.99 15.71 3.142 3.9 4.4 4.4 4.3 4.2 21.2 4.24 3.9 5.0 4.8 4.2 4.7 22.6 4.52 4.9 4.5 5.0 5.0 4.6 24 4.8 4.8 5.2 4.7 5.3 5.0 25 5.0 CTRL 0.29 0.28 0.33 0.32 0.34 1.56 0.312 0.28 0.29 0.32 0.34 0.33 1.56 0.312 0.27 0.30 0.33 0.35 0.32 1.57 0.314 0.3 0.27 0.28 0.34 0.29 1.48 0.296 0.31 0.26 0.29 0.35 0.30 1.51 0.302

ANALISIS DE VARIANZA FV GL SC TRATAMIENTOS 2 55.254028 ERROR 12 0.364273 TOTAL 14 55.618301 C.V. = 6.70 %

TABLA TRATA. 1 2 3

DE MEDIAS REP. MEDIA 5 2.500000 5 5.000000 5 0.302000

CM 27.627014 0.030356

ARI ARA CTRL

78

F 910.0980

P>F 0.000

RESULTADOS DE LA COMPARACION DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 2 5.0000 A 1 2.5000 B 3 0.3020 C

NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05 VALORES DE DMS dms( 2 1 ) = 0.2401 dms( 2 3 ) = 0.2401 dms( 1 2 ) = 0.2401 dms( 1 3 ) = 0.2401 dms( 3 2 ) = 0.2401 dms( 3 1 ) = 0.2401

NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.01 VALORES DE DMS dms( 2 1 ) = 0.3366 dms( 2 3 ) = 0.3366 dms( 1 2 ) = 0.3366 dms( 1 3 ) = 0.3366 dms( 3 2 ) = 0.3366 dms( 3 1 ) = 0.3366 NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05

0.01

TUKEY = 0.2938 VALORES DE TABLAS (0.05), (0.01) = 3.77, 5.04

0.3927

REGRESIÓN ARI TABLA DE DATOS Y X1 1.500 1.000 2.064 2.000 2.256 3.000 2.280 4.000 2.500 5.000 MATRIZ X'X 5 15 15 55

79

MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000 MATRIZ X'Y 10.600000 34.016000 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 1.455200 0.221600

FV REGRESION ERROR TOTAL

ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM F 1 0.491066 0.491066 17.3386 3 0.084966 0.028322 4 0.576032

P>F 0.023

ARI COEFICIENTE DE DETERMINACION = 0.8525

MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.031154 -0.008497 -0.008497 0.002832

VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 8.244482 0.003030 B1 4.163962 0.023380

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B0 B1

B 1.455200 0.221600

L.I. 0.903089 0.055132

L.S. 2.007311 0.388068

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 99% DE CONFIANZA

80

Coeficiente B0 B1

B 1.455200 0.221600

L.I. 0.424229 -0.089250

L.S. 2.486171 0.532450

ARA TABLA DE DATOS Y X1 3.142 1.000 4.240 2.000 4.520 3.000 4.800 4.000 5.000 5.000 MATRIZ X'X 5 15 15 55 MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000

MATRIZ X'Y 21.702000 69.382000

VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 3.057600 0.427600

ANALISIS DE VARIANZA FV GL SC CM REGRESION 1 1.828418 1.828418 ERROR 3 0.296386 0.098795 TOTAL 4 2.124803

F P>F 18.5072 0.021

ARA COEFICIENTE DE DETERMINACION = 0.8605

81

MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.108675 -0.029639 -0.029639 0.009880 VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 9.275053 0.002140 B1 4.301994 0.021300

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 3.057600 2.026428 4.088772 B1 0.427600 0.116690 0.738510

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 3.057600 1.132065 4.983135 B1 0.427600 -0.152971 1.008171

Ctrl. TABLA DE DATOS Y X1 0.312 1.000 0.312 2.000 0.314 3.000 0.296 4.000 0.302 5.000 MATRIZ X'X 5 15 15 55

MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000

82

MATRIZ X'Y 1.536000 4.572000

VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 0.318000 -0.003600 ANALISIS DE VARIANZA FV REGRESION ERROR TOTAL

GL 1 3 4

SC 0.000130 0.000115 0.000245

CM 0.000130 0.000038

F 3.3750

P>F 0.163

COEFICIENTE DE DETERMINACION = 0.5294 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.000042 -0.000012 -0.000012 0.000004

VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 48.928868 0.000070 B1 -1.837117 0.163110

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 0.318000 0.297670 0.338330 B1 -0.003600 -0.009730 0.002530

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 0.318000 0.280038 0.355962 B1 -0.003600 -0.015046 0.007846

83

Efecto de la solución mineral No.1 con agitación (SM1ca), en diferentes aceites ARI 1 2 3 4 5 Suma media 8.12 7.93 8.3 7.4 7.23 38.98 7.796 10 11.3 10.4 8.99 9.8 50.49 10.098 11.5 11.5 12.5 12 10 57.5 11.5 12.5 13.4 12.88 12.9 13 64.68 12.936 14.2 15.7 15.5 14.6 14.5 74.5 14.9 ARA 1 2 3 4 5 suma media 5.9 6.8 6.3 6.82 6.8 32.62 7.84 7.6 7.8 7.5 8.1 8.2 39 7.84 9.5 8.4 9.9 9.8 9.1 46.7 9.34 10.6 11.7 11.6 11.8 11.8 57.5 11.5 13.3 13.5 12.9 13 12.5 65.2 13.04 SI 1 2 3 4 5 suma media 5.9 6.6 6.8 5.9 6.5 31.7 6.34 9.2 8.7 8.6 8.9 9.2 44.6 8.92 10.6 10.7 9.9 10.8 10.6 52.6 10.52 13.2 14 13.5 13.8 14 68.5 13.7 14.9 15.6 15.9 14.8 15.4 17.6 15.32 Ctrl. 1 2 3 4 5 suma media 0.314 0.3 0.36 0.29 0.26 1.524 0.3048 0.32 0.34 0.36 0.36 0.38 1.76 0.352 0.29 0.32 0.33 0.28 0.34 1.56 0.312 0.33 0.35 0.29 0.35 0.33 1.65 0.33 0.36 0.37 0.34 0.35 0.34 1.76 0.352

Análisis de Varianza FV GL SC CM F Tratamientos 3 756.8813 252.2937 1261.1033 Error 16 3.2009 0.2000 Total 19 760.0822 C.V. = 4.10% TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 3 15.3200 A 1 14.9000 A 2 13.0400 B 4 0.3520 C

84

P>F 0.000

NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.01 TUKEY = 1.0380

0.05 0.8100

VALORES DE TABLAS (0.05), (0.01) = 4.05, 5.19 REGRESIÓN ARI TABLA DE DATOS ppm de CO2 Y X 1 semanas 7.790 1.000 10.090 2.000 11.500 3.000 12.930 4.000 14.400 5.000 MATRIZ X'X 5 15 15 55 MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000

MATRIZ X'Y 56.710000 186.190000 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 6.524000 1.606000

FV REGRESION ERROR TOTAL

ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM F P>F 1 25.792360 25.792360 266.8911 0.000 3 0.289920 0.096640 4 26.082280

ARI COEFICIENTE DE DETERMINACION = 0.9889 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.106304 -0.028992 -0.028992 0.009664

85

VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 20.009634 0.000300 B1 16.336803 0.000470

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 6.524000 5.504138 7.543862 B1 1.606000 1.298500 1.913500

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 6.524000 4.619583 8.428417 B1 1.606000 1.031797 2.180203

ARA TABLA DE DATOS Y X1 6.520 1.000 7.840 2.000 9.340 3.000 11.500 4.000 13.040 5.000 ----------------------------------------------MATRIZ X'X 5 15 15 55

MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000

MATRIZ X'Y 48.240000 161.420000

86

VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 4.638000 1.670000

ANALISIS DE VARIANZA FV GL SC CM REGRESION 1 27.889000 27.889000 ERROR 3 0.194680 0.064893 TOTAL 4 28.083680

F P>F 429.7668 0.000

ARA COEFICIENTE DE DETERMINACION = 0.9931

MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.071383 -0.019468 -0.019468 0.006489

VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 17.359386 0.000410 B1 20.730818 0.000280

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 95% DE CONFIANZA

Coeficiente

B

L.I.

B0 B1

4.638000 1.670000

3.802276 1.418020

L.S. 5.473724 1.921980

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 4.638000 3.077429 6.198571 B1 1.670000 1.199470 2.140530

87

SI T A B L A D E D A T O S Y X1 6.340 1.000 8.920 2.000 10.520 3.000 13.700 4.000 15.320 5.000 MATRIZ X'X 5 15 15 55 MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000 MATRIZ X'Y 54.800000 187.140000 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 4.138000 2.274000 ANALISIS DE VARIANZA FV GL SC CM REGRESION 1 51.710760 51.710760 ERROR 3 0.506040 0.168680 TOTAL 4 52.216800

F P>F 306.5613 0.000

SI COEFICIENTE DE DETERMINACION = 0.9903 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.185548 -0.050604 -0.050604 0.016868 VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 9.606437 0.001930 B1 17.508892 0.000400

88

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 4.138000 2.790605 5.485395 B1 2.274000 1.867745 2.680255

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 4.138000 1.621973 6.654027 B1 2.274000 1.515389 3.032611 Ctrl. T A B L A D E D A T O S Y X1 0.305 1.000 0.352 2.000 0.312 3.000 0.330 4.000 0.352 5.000 MATRIZ X'X 5 15 15 55 MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000 MATRIZ X'Y 1.650800 5.024800 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 0.308440 0.007240 ANALISIS DE VARIANZA FV REGRESION ERROR TOTAL

GL 1 3 4

SC 0.000524 0.001403 0.001927

89

CM 0.000524 0.000468

F 1.1210

P>F 0.369

Ctrl. COEFICIENTE DE DETERMINACION = 0.2720 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.000514 -0.000140 -0.000140 0.000047 VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 B1

13.600254 0.000740 1.058793 0.368730

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B0 B1

B 0.308440 0.007240

L.I.

L.S.

0.237500 -0.014149

0.379380 0.028629

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 B1

0.308440 0.007240

0.175972 -0.032701

0.440908 0.047181

Efecto de la solución mineral No.1 con H2O2 (SM1cp), en diferentes tipos de aceite ARI 1 2 3 4 5 SUMA MEDIA 10.38 10.5 10.4 10.6 10.06 51.94 10.388 12.9 12.8 12.3 12.57 12.35 62.92 12.584 13.4 13.9 13.5 13.7 13.6 68.1 13.62 15.89 15.76 16 15.55 15.5 78.7 15.74 17.65 17.8 17.9 17.25 17.5 88.1 17.62 ARA 1 2 3 4 5 SUMA MEDIA 9.8 10.4 9.5 9.8 10.2 49.7 9.94 10.7 10.5 10.2 10.6 10.5 52.5 10.5 12 11.8 12.2 11.9 11.8 59.7 11.94 13.7 14.5 13.8 14.4 14 70.4 14.08 15.9 16.3 16.2 15.8 16.6 80.8 16.16

90

SI 1 9.9 12.99 14.99 16.4 19.5 Ctrl. 1 0.29 0.199 0.35 0.25 0.48

2 10.6 12.5 15.5 16.8 18.9

3 10.6 13.4 15.6 16.7 19.3

4 10.7 12.8 15.2 16.5 19.0

5 10.5 12.9 15.3 16.7 19.5

SUMA 52.3 64.59 76.5 83.1 96.2

MEDIA 10.46 12.918 15.3 16.62 19.24

2 0.32 0.2 0.29 0.3 0.56

3 0.32 0.25 0.36 0.39 0.51

4 0.34 0.21 0.29 0.27 0.5

5 0.28 0.26 0.4 0.5 0.49

SUMA 1.54 1.119 1.69 1.71 2.54

MEDIA 0.308 0.2238 0.3338 0.342 0.508

ANALISIS DE VARIANZA FV GL SC

CM

TRATAMIENTOS ERROR TOTAL C.V. =

3 16 19

1128.669189 0.991211 1129.660400

1.86%

5 5 5 5

17.619999 16.160000 19.240000 0.508000

TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 3 19.2400 A 1 17.6200 B 2 16.1600 C 4 0.5080 D NIVEL DE SIGNIFICANCIA = TUKEY = VALORES DE TABLAS

0.05 0.01 0.4508 0.5777 (0.05), (0.01) = 4.05, 5.19

91

P>F

376.223053 6072.9443 0.000 0.061951

TABLA DE MEDIAS TRATA. REP. MEDIA 1 2 3 4

F

TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 3 19.2400 A 1 17.6200 B 2 16.1600 C 4 0.5080 D REGRESIÓN ARI TABLA DE DATOS Y X1 10.388 1.000 12.584 2.000 13.620 3.000 15.740 4.000 17.620 5.000

MATRIZ X'X 5 15 15 55 MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000 MATRIZ X'Y 69.952000 227.476000 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 8.704400 1.762000 ________________A N A L I S I S D E V A R I A N Z A______________ FV GL SC CM F P>F REGRESION 1 31.046440 31.046440 331.3397 0.000 ERROR 3 0.281099 0.093700 TOTAL 4 31.327539 COEFICIENTE DE DETERMINACIÓN ARI = 0.9910 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.103070 -0.028110 -0.028110 0.009370

92

VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA _____________________OBSERVADOS_______________________ Coeficiente tc p B0 27.112734 0.000160 B1 18.202738 0.000370 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 8.704400 7.700172 9.708628 B1 1.762000 1.459214 2.064786

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 8.704400 6.829178 10.579622 B1 1.762000 1.196599 2.327401

ARA TABLA DE DATOS Y X1 9.940 1.000 10.500 2.000 11.940 3.000 14.080 4.000 16.160 5.000 MATRIZ X'X 5 15 15 55

MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000

MATRIZ X'Y 62.620000 203.880000

93

VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 7.718000 1.602000

FV REGRESION ERROR TOTAL

ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM F P>F 1 25.664040 25.664040 70.4875 0.003 3 1.092280 0.364093 4 26.756320

COEFICIENTE DE DETERMINACION ARA= 0.9592 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.400503 -0.109228 -0.109228 0.036409

VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 12.195569 0.000990 B1 8.395685 0.002870 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S.___ _ B0 7.718000 5.738436 9.697564 B1 1.602000 1.005139 2.198861 --------------------------------------------------------------------------------------------------

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 7.718000 4.021507 11.414493 B1 1.602000 0.487465 2.716535

SI TABLA DE Y 10.460 12.910 15.300 16.620 19.240

94

DATOS X1 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000

MATRIZ X'X 5 15 15 55 MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000 MATRIZ X'Y 74.530000 244.860000 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 8.525000 2.127000 ANALISIS DE VARIANZA FV GL SC CM F P>F REGRESION 1 45.241290 45.241290 351.4069 0.000 ERROR 3 0.386230 0.128743 TOTAL 4 45.627520____________________________ COEFICIENTE DE DETERMINACION SI= 0.9915 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.141618 -0.038623 -0.038623 0.012874 VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 22.653519 0.000230 B1 18.745849 0.000340 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 8.525000 7.347867 9.702133 B1 2.127000 1.772081 2.481919 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 8.525000 6.326908 10.723092

95

B1

2.127000

1.464250

2.789750

Ctrl. TABLA DE DATOS Y X1 0.308 1.000 0.224 2.000 0.338 3.000 0.342 4.000 0.508 5.000 MATRIZ X'X 5 15 15 55 MATRIZ INVERSA DE X'X 1.100000 -0.300000 -0.300000 0.100000 MATRIZ X'Y 1.719800 5.677600 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 0.188500 0.051820 ANALISIS DE VARIANZA FV GL SC CM F P>F REGRESION 1 0.026853 0.026853 5.0900 0.109 ERROR 3 0.015827 0.005276 TOTAL 4 0.042680__________________________ COEFICIENTE DE DETERMINACION Ctrl.= 0.6292 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.005803 -0.001583 -0.001583 0.000528 VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 2.474444 0.088770 B1 2.256109 0.108600

96

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 95% DE CONFIANZA_____________________________ Coeficiente B L.I. L.S. B0 0.188500 -0.049787 0.426787 B1 0.051820 -0.020026 0.123666 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESIÓN AL 99% DE CONFIANZA ____Coeficiente B L.I. L.S.__________ B0 0.188500 -0.256460 0.633460 B1 0.051820 -0.082340 0.185980

Efecto de diferentes soluciones minerales y condiciones de oxigenación en la producción de CO2 por la flora microbiana presente en al ARI (Aceite Residual Industrial). SM1sa 1 4.6 4.9 5.9 6.8 7.7 SM2 sa 1.6 1.8 2.18 2.4 2.3 SM1ca 1 8.12 10 11.5 12.5 14.2 SM1 cp 1 10.38 12.9 13.4 15.89 17.65

2 4.7 5.7 6.8 7.1 7.5 1.5 1.95 2.3 2.1 2.6

3 4.5 6.1 5 7.5 7.6 1.4 1.77 2.4 2.32 2.7

2 7.93 11.3 11.5 13.4 15.7 2 10.5 12.8 13.9 15.76 17.8

4 4.8 4.5 6.7 6.7 8.2 1.8 2.3 2.1 2.3 2.4

3 8.3 10.4 12.5 12.88 15.5 3 10.4 12.3 13.5 16 17.9

5 4.9 6.3 6.6 6.9 8.5 1.2 2.5 2.3 2.28 2.5

4 7.4 8.99 12 12.9 14.6 4 10.6 12.57 13.7 15.55 17.25

97

5 7.23 9.8 10 13 14.5 5 10.06 12.35 13.6 15.5 17.5

suma 23.5 27.5 31 35 39.5 7.5 10.32 11.28 11.4 12.5 Suma 38.98 50.49 57.5 64.68 74.5 SUMA 51.94 62.92 68.1 78.7 88.1

media 4.7 5.5 6.2 7 7.9 1.5 2.064 2.256 2.28 2.5 media 7.796 10.098 11.5 12.936 14.9 MEDIA 10.388 12.584 13.62 15.74 17.62

Ctrl. 1 0.29 0.199 0.35 0.25 0.48

2 0.32 0.2 0.29 0.3 0.56

3 0.32 0.25 0.36 0.39 0.51

4 0.34 0.21 0.29 0.27 0.5

5 0.28 0.26 0.4 0.5 0.49

SUMA 1.54 1.119 1.69 1.71 2.54

MEDIA 0.308 0.2238 0.3338 0.342 0.508

A N A L I S I S D E V A R I A N Z A____________________________________ FV GL SC CM F P>F TRATAMIENTOS 4 1118.294434 279.573608 1957.8278 0.000 ERROR 20 2.855957 0.142798 TOTAL 24 1121.150391

C.V. =

4.35%

TABLA DE MEDIAS TRATA. REP. MEDIA 1 5 7.900000 2 5 2.500000 3 5 14.900000 4 5 17.590000 5 5 0.508000______

TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 4 17.5200 A 3 14.9000 B 1 7.9000 C 2 2.5000 D 5 0.5080 E________________________

NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05 =0.01 TUKEY = 0.7149 =0.8940 VALORES DE TABLAS (0.05), (0.01) = 4.23, 5.29 REGRESIÓN SM1sa Efecto de diferentes medios de cultivo y condiciones de oxigenación en la producción de CO2 por la flora microbiana presente en al ARA

98

SM1sa 1 3.4 3.9 4.5 4.9 5.4 SM2sa 2.89 3.9 3.9 4.9 4.8

2 2.9 3.5 4.9 5.1 4.9

3.25 4.4 5.0 4.5 5.2

SM1ca 1 5.9 7.6 9.5 10.6 13.3 SM1cp 1 9.8 10.7 12 13.7 15.9

2 6.8 7.8 8.4 11.7 13.5

3 3.5 4 5 5.0 4.9

4 2.8 3.7 4.8 4.8 5.5

3.38 4.4 4.8 5.0 4.7

3.2 4.3 4.2 5.0 5.3

3 6.3 7.5 9.9 11.6 12.9

5 3.4 3.9 4.3 5.2 5.3

2.99 4.2 4.7 4.6 5.0

4 6.82 8.1 9.8 11.8 13

suma 16 19 23.5 25 26

15.71 21.2 22.6 24 25

5 6.8 8.2 9.1 11.8 12.5

suma 32.62 39 46.7 57.5 65.2

media 3.2 3.8 4.7 5 5.2

3.142 4.24 4.52 4.8 5.0

media 7.84 7.84 9.34 11.5 13.04

2 10.4 10.5 11.8 14.5 16.3

3 9.5 10.2 12.2 13.8 16.2

4 9.8 10.6 11.9 14.4 15.8

5 10.2 10.5 11.8 14 16.6

suma 49.7 52.5 59.7 70.4 80.8

media 9.94 10.5 11.94 14.08 16.16

2 0.32 0.2 0.29 0.3 0.56

3 0.32 0.25 0.36 0.39 0.51

4 0.34 0.21 0.29 0.27 0.5

5 0.28 0.26 0.4 0.5 0.49

suma 1.54 1.119 1.69 1.71 2.54

media 0.308 0.2238 0.3338 0.342 0.508

Ctrl. 1 0.29 0.199 0.35 0.25 0.48

ANALISIS DE VARIANZA FV GL SC TRATAMIENTOS 4 836.533691 ERROR 20 1.584717 TOTAL 24 838.118408 C.V. = 3.54 %

CM F 209.133423 2639.3792 0.079236

99

P>F 0.000

TABLA DE MEDIAS TRATA. REP. MEDIA 1 5 5.200000 2 5 5.000000 3 5 13.039999 4 5 16.160000 5 5 0.352000

RESULTADOS DE LA COMPARACION DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 4 16.1600 A 3 13.0400 B 1 5.2000 C 2 5.0000 C 5 0.3520 D

NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05 RESULTADOS DE LA COMPARACION DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 4 16.1600 A 3 13.0400 B 1 5.2000 C 2 5.0000 C 5 0.3520 D

NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.01 TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 4 16.1600 A 3 13.0400 B 1 5.2000 C 2 5.0000 C 5 0.3520 D

NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05 =0.01 TUKEY = 0.5325 = 0.6659 VALORES DE TABLAS (0.05), (0.01) = 4.23, 5.29 Efecto de diferentes medios de cultivo y condiciones de oxigenación en la producción de CO2 por la flora microbiana presente en al SI (Suelo Impactado).

100

SM1sa 1 4.64 5.3 6 7.1 7.5 SM1ca 1 5.9 9.2 10.6 13.2 14.9 SM1cp 1 9.9 12.99 14.99 16.4 19.5

2 4.8 5.6 6.6 7.2 7.6

3 4.7 5.8 6.3 6.9 7.7

4 4.6 5.9 6.2 7.5 7.8

5 4.66 6 6.5 7.4 7.9

suma 23 28.6 31.6 36.1 38.5

media 4.68 5.72 6.32 7.22 7.7

2 6.6 8.7 10.7 14 15.6

3 6.8 8.6 9.9 13.5 15.9

4 5.9 8.9 10.8 13.8 14.8

5 6.5 9.2 10.6 14 15.4

suma 31.7 44.6 52.6 68.5 17.6

media 6.34 8.92 10.52 13.7 15.32

2 10.6 12.5 15.5 16.8 18.9

3 10.6 13.4 15.6 16.7 19.3

4 10.7 12.8 15.2 16.5 19.0

5 10.5 12.9 15.3 16.7 19.5

SUMA 52.3 64.59 76.5 83.1 96.2

MEDIA 10.46 12.918 15.3 16.62 19.24

2 0.3 0.34 0.32 0.35 0.37

3 0.36 0.36 0.33 0.29 0.34

4 0.29 0.36 0.28 0.35 0.35

5 0.26 0.38 0.34 0.33 0.34

suma 1.524 1.76 1.56 1.65 1.76

media 0.3048 0.352 0.312 0.33 0.352

Ctrl. 1 0.314 0.32 0.29 0.33 0.36

ANALISIS DE VARIANZA FV GL SC TRATAMIENTOS 3 1048.031494 ERROR 16 1.744873 TOTAL 19 1049.776367 C.V. = 3.11% TABLA DE MEDIAS TRATA. REP. MEDIA 1 5 07.700000 2 5 15.240000 3 5 19.240000 4 5 0.352000

101

CM 349.343842 0.109055

F 3203.3857

P>F 0.000

TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 3 19.2400 A 2 15.3200 B 1 07.7000 C 4 0.3520 D NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05 =0.01 TUKEY = 0.5981 =0.7665 VALORES DE TABLAS (0.05), (0.01) = 4.05, 5.19

Degradación en ppm de diferentes aceites residuales en dos soluciones minerales y diferentes condiciones de oxigenación en 5 semanas

VARIABLE = degradaARA_____________________________________________ TRATA. 1 140.0000 146.0000 139.0000 138.0000 135.0000 SM2 2 288.0000 287.0000 288.0000 289.0000 287.0000 SM1sa 3 528.0000 528.0000 526.0000 527.0000 526.0000 SM1ca 4 630.0000 631.0000 629.0000 632.0000 630.0000 SM1cp 5 0.8700 0.8800 0.8900 0.8700 0.8900 CTRL

A N A L I S I S D E V A R I A N Z A____________________________________ FV GL SC CM F P>F TRAT 4 1372873.250000 343218.312500 88859.1094 0.000 ERROR 20 77.250000 3.862500 TOTAL 24 1372950.500000

C.V. =

0.62%

TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 4 630.4000 A 3 527.0000 B 2 287.8000 C 1 139.6000 D 5 0.8800 E NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05 =0.01 TUKEY = 3.7178 =4.6495 VALORES DE TABLAS (0.05), (0.01) = 4.23, 5.29

102

Degradación en ppm de diferentes aceites residuales en 2 soluciones minerales y condiciones de oxigenación, por la flora microbiana presente en al ARI en 5 semanas

TABLA DE DATOS VARIABLE = degAI Aceite Industrial_____________________________________ TRATA. 1 200.0000 195.0000 197.0000 195.0000 198.0000 2 400.0000 396.0000 397.0000 398.0000 399.0000 3 663.0000 669.0000 670.0000 671.0000 688.0000 4 880.0000 885.0000 889.0000 890.0000 887.0000 5 0.9000 0.8800 0.8900 0.8700 0.880000 __________________A N A L I S I S D E V A R I A N Z A__________________ FV GL SC CM F P>F TRATAMIENTOS 4 2531146.000000 632786.5000 28600.5195 0.000 ERROR 20 442.500000 22.1250 TOTAL 24 2531588.500000 C.V. = 1.09% TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 4 886.2000 A 3 668.2000 B 2 398.0000 C 1 197.0000 D 5 0.8840 E NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05 = 0.01 TUKEY = 4.8322 =6.0431 VALORES DE TABLAS (0.05), (0.01) = 4.23, 5.29 TABLA DE DATOS Degradación en ppm de diferentes aceites residuales en dos soluciones minerales y condiciones de aireación en 5 semanas VARIABLE = degradaSI suelo impactado________________________________ TRATA. 1 348.0000 346.0000 345.0000 347.0000 349.0000 SM1sa 2 576.0000 575.0000 579.0000 576.0000 578.0000 SM1ca 3 680.0000 687.0000 686.0000 685.0000 686.0000 SM1cp 4 0.8600 0.8500 0.8800 0.8700 0.8900 CTRL

103

A N A L I S I S D E V A R I A N Z A____________________________________ FV GL SC CM F P>F TRAT 3 1372303.250000 457434.406250 142115.5469 0.000 ERROR 16 51.500000 3.218750 TOTAL 19 1372354.750000 C.V. = 0.45% TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 3 684.7900 A 2 576.7999 B 1 347.0000 C 4 0.8700 D NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05 =0.01 TUKEY = 3.2894 =4.1699 VALORES DE TABLAS (0.05), (0.01) = 3.96, 5.02 Producción de CO2 generada por un suelo agrícola contaminado con aceite residual, tratado con la SM3 y H2O2 a 50 ppm, durante 8 semanas TABLA DE DATOS: VARIABLE = CO2 SUELO________________________ TRATA.___________________________________________________________ 1 46.0000 44.0000 43.7000 44.9000 45.0000 46.0000 47.0000 46.0000 2 57.0000 58.9000 59.5000 58.6000 58.0000 58.2000 58.0000 58.6000 3 77.0000 76.8000 77.9000 78.6000 79.0000 75.8000 78.4000 77.6000 4 1.8000 1.9000 1.5000 1.4000 1.2000 1.3000 1.5000 1.9000_______________________________________________ A N A L I S I S D E V A R I A N Z A____________________________________ FV GL SC CM F P>F__ _ TRATAMIENTOS 3 25026.281250 8342.093750 11061.0674 0.000 ERROR 28 21.117188 0.754185 TOTAL 31 25047.398438________________________________ C.V. = 1.90% TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 3 77.6300 A 2 58.3500 B 1 45.3200 C 4 1.5600 D

104

NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05 TUKEY = 1.1851 VALORES DE TABLAS (0.05), (0.01)= 3.86, 4.84 TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 3 77.6300 2 58.3500 1 45.3200 4 1.5600

A B C D

NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.01 TUKEY = 1.4850 VALORES DE TABLAS (0.05), (0.01)= 3.86, 4.84

X 1 2 3 4 5 6 7 8

sm 20.4 23.03 25.03 30.01 35 40 43.15 45.32

sm+ARA 25.23 30.06 33.52 35.11 40.75 47.16 52.22 58.28

REGRESIÓN sm+ARA+H2O2 25.32 35.16 40.13 48.06 55.08 68.03 70.93 77.61

sm TABLA Y 20.400 23.030 25.030 30.010 35.000 40.000 43.150 45.320

DE DATOS X1 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000

MATRIZ X'X 8 36 36 204

105

Ctrl 1.47 1.53 1.63 1.52 1.56 1.56 1.57 1.58

MATRIZ INVERSA DE X'X 0.607143 -0.107143 -0.107143 0.023810 MATRIZ X'Y 261.940000 1341.200000

VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 15.335000 3.868333

FV REGRESION ERROR TOTAL

GL 1 6 7

ANALISIS DE VARIANZA SC CM F P>F 628.488117 628.488117 400.8116 0.000 9.408233 1.568039 637.896350______________________________

COEFICIENTE DE DETERMINACION SM = 0.9853

MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.952024 -0.168004 -0.168004 0.037334

VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 15.716648 0.000080 B1 20.020279 0.000050

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 15.335000 12.947421 17.722579 B1 3.868333 3.395522 4.341145

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 15.335000 11.718017 18.951983 B1 3.868333 3.152064 4.584603

106

SM+ARA TABLA DE Y 25.300 30.600 33.520 35.110 40.750 47.160 52.220 58.280

DATOS X1 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000

MATRIZ X'X 8 36 36 204 MATRIZ INVERSA DE X'X 0.607143 -0.107143 -0.107143 0.023810

MATRIZ X'Y 321.350000 1640.860000

VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 19.298929 4.637738

FV REGRESION ERROR TOTAL

GL 1 6 7

ANALISIS DE VARIANZA SC CM F P>F 903.361815 903.361815 259.7251 0.000 20.868873 3.478145 924.230687___________________________________

COEFICIENTE DE DETERMINACION SM +ARA = 0.9774

107

MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 2.111731 -0.372658 -0.372658 0.082813 VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 13.280483 0.000110 B1 16.115990 0.000070 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 19.298929 15.742998 22.854859 B1 4.637738 3.933559 5.341917 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 19.298929 13.911992 24.685866 B1 4.637738 3.570966 5.704511 SM+ARA+H2O2 TABLA DE DATOS Y X1 25.320 1.000 35.160 2.000 40.130 3.000 48.060 4.000 55.080 5.000 68.030 6.000 70.930 7.000 77.610 8.000 MATRIZ X'X 8 36 36 204 MATRIZ INVERSA DE X'X 0.607143 -0.107143 -0.107143 0.023810 MATRIZ X'Y 420.320000 2209.240000 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B)

108

18.490000 7.566667

FV REGRESION ERROR TOTAL

GL 1 6 7

ANALISIS DE VARIANZA SC CM F P>F 2404.686667 2404.686667 566.4009 0.000 25.473333 4.245556 2430.160000

COEFICIENTE DE DETERMINACION SM+ARA+H2O2= 0.9895 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 2.577659 -0.454881 -0.454881 0.101085 VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 11.516598 0.000160 B1 23.799179 0.000040

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 18.490000 14.561320 22.418680 B1 7.566667 6.788672 8.344661 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 18.490000 12.538379 24.441621 B1 7.566667 6.388070 8.745263

SM+ARA+estéril TABLA DE DATOS Y X1 1.470 1.000 1.530 2.000 1.630 3.000 1.520 4.000 1.560 5.000 1.560 6.000 1.570 7.000 1.580 8.000

109

MATRIZ X'X 8 36 36 204 MATRIZ INVERSA DE X'X 0.607143 -0.107143 -0.107143 0.023810 MATRIZ X'Y 12.420000 56.290000 VECTOR DE COEFICIENTES DE REGRESION (B) 1.509643 0.009524

FV REGRESION ERROR TOTAL

ANALISIS DE VARIANZA GL SC CM F P>F 1 0.003810 0.003810 1.9469 0.211 6 0.011740 0.001957 7 0.015550____________________________

COEFICIENTE DE DETERMINACIÓN SM+ARA ESTÉRIL= 0.2450 MATRIZ DE VARIANZAS Y COVARIANZAS DE B 0.001188 -0.000210 -0.000210 0.000047 VALORES DE t CALCULADA Y NIVELES DE SIGNIFICANCIA OBSERVADOS Coeficiente tc p B0 43.798732 0.000020 B1 1.395302 0.211180

INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 95% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 1.509643 1.425300 1.593985 B1 0.009524 -0.007179 0.026226 INTERVALOS DE CONFIANZA PARA LOS COEFICIENTES DE REGRESION AL 99% DE CONFIANZA Coeficiente B L.I. L.S. B0 1.509643 1.381871 1.637415 B1 0.009524 -0.015779 0.034826

110

Biodegradación de ARA en un suelo agrícola, bajo diferentes factores fisicoquímicos, expresada en ppm, durante 8 semanas. TABLA DE DATOS VARIABLE = degsuelo_____________________________________ TRATA._________________________________________________ 1 800.0000 821.0000 816.0000 818.0000 815.0000 2 2800.0000 2873.0000 2856.0000 2863.0000 2852.0000 3 18.0000 17.7000 19.0000 19.6000 18.0000 A N A L I S I S D E V A R I A N Z A____________________________ FV GL SC CM F P>F_ TRATAMIENTOS 2 21307350.0 10653675.00 36526.8867 0.000 ERROR 12 3500.0 291.666656 TOTAL 14 21310850.000 ______ C.V. =

1.39%

TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 2 2848.0000 A 1 814.0000 B 3 18.4200 C NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05 TUKEY = 28.7938 VALORES DE TABLAS (0.05), (0.01) = 3.77, 5.04 TABLA DE MEDIAS TRATAMIENTO MEDIA 2 2848.0000 A 1 814.0000 B 3 18.4200 C Nivel de Significancia = 0.01. TUKEY = 38.4936

Valores de tablas (0.05), (0.01) =3.77, 5.04

111

No 6 = SUELO CON ARA + SM TODO ESTÉRIL REPETICIONES 5.1 5.5 5.2 5.5 5.3 5.6 5.3 5.6 5.4 5.7 5.4 5.5 MONITOREO DURANTE 2 SEMANAS 5.5 5.6 5.6 5.6 5.5 5.6 5.6 5.7 5.5 5.6 5.6 5.7 4semanas 5.7 5.8 5.7 5.8 5.8 5.8 5.8 5.7 5.6 5.6 5.7 5.8 6 semanas 5.6 5.7 6 5.9 5.9 5.8 6.1 5.4 5.9 5.8 5.9 5.9 8 semanas 6 6 5.8 5.9 6.1 6 5.7 5.8 6 6 5.8 5.9 10 semanas 5.9 5.7 6 6 6.2 6.2 5.9 5.8 5.8 6.1 5.7 6.2 12 semanas

5.3 5.5 5.6 5.7 5.6 5.6

5.7 5.7 5.7 5.6 5.6 5.6

5.8 5.8 5.7 5.6 5.6 5.7

5.7 5.7 5.7 5.8 5.7 5.8

5.6 5.7 5.8 5.9 5.8 5.9

5.7 5.7 5.9 5.9 5.8 6

5.9 5.9 5.9 5.8 5.6 5.7

5.9 5.9 6 5.9 5.6 5.8

6 6 6 6 5.6 5.8

5.8 5.9 5.7 5.6 5.7 5.9

5.9 6 5.9 5.7 5.8 5.9

6 6 5.8 5.8 5.9 6

6 5.9 5.9 5.9 5.9 6

6 6 5.8 6 6.1 5.9

5.9 5.8 6 6.1 6 5.9

5.9 6 5.9 5.7 5.8 5.9

6 6.1 5.8 6.2 5.9 5.8

6 6.1 5.7 6.1 6 6.2

117

MEDIAS TOTALES 5.48 5.55 5.54 5.7 5.58 5.8 5.56 5.84 5.58 5.93 5.56 5.95 5.55 34.77 TOTAL 5.62 5.66 5.7 5.78 5.68 5.8 5.706667 5.86 5.86 5.9 5.84 5.6 5.76 5.803333 5.8 5.96 5.82 5.72 5.82 5.92 5.84 5.98 5.88 5.96 5.9 6 5.9 5.936667 5.9 6.04 5.96 5.94 5.92 5.96 5.953333

PRODUCCIÓN DE CO2 GENERADA POR LA MICROFLORA DE UN SUELO AGRÍCOLA CONTAMINADO CON ARA Y TRATADO CON SM3 Y H2O2 A 50 PPM Análisis de regresión a X b 3.8 1 15.3 3.8 2 15.3 3.8 3 15.3 3.8 4 15.3 3.8 5 15.3 3.8 6 15.3 3.8 7 15.3 3.8 8 15.3 a 7.56 7.56 7.56 7.56 7.56 7.56 7.56 7.56 X 1 2 3 4 5 6 7 8

X 1 2 3 4 5 6 7 8

b 18.49 18.49 18.49 18.49 18.49 18.49 18.49 18.49

Y 19.1 22.9 26.7 30.5 34.3 38.1 41.9 45.7

SM3 19.1 22.9 26.7 30.5 34.3 38.1 41.9 45.7

SM3+ARA+H2O2 Y 26.05 26.05 33.61 33.61 41.17 41.17 48.73 48.73 56.29 56.29 63.85 63.85 71.41 71.41 78.97 78.97

S S+A S+A+P 19.1 23.92 26.05 22.9 29.55 33.61 26.7 33.18 41.17 30.5 37.81 48.73 34.3 42.44 56.29 38.1 47.07 63.85 41.9 51.7 71.41 45.7 56.33 78.97

Ctrl 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

a 4.63 4.63 4.63 4.63 4.63 4.63 4.63 4.63

X 1 2 3 4 5 6 7 8

b 19.29 19.29 19.29 19.29 19.29 19.29 19.29 19.29

a 0 0 0 0 0 0 0 0

X 1 2 3 4 5 6 7 8

b 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Y SM3+ARA 23.92 23.92 28.55 29.55 33.18 33.18 37.81 37.81 42.44 42.44 47.07 47.07 51.7 51.7 56.33 56.33 Y 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Ctrl 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Coeficientes de determinación S = 0.9853 S +A= 0.9774 S+A+P= 0.9895 S+A ESTÉRIL= 0.2450

ppm

Lineas de regresión de la producción de CO2 generada por la microflora de un suelo agrícola contaminado con ARA y tratado con solución mineral y peróxido

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

S S+A S+A+P Ctrl

0

2

4

6

8

Semanas S=Solución mineral 3. A= ARA.aceite residual automotríz. P= H2O2 50ppm Ctrl.=S+A todo estéril

125

10