UNIVERSIDAD DE COLIMA Maestría en Ciencias: Área Biotecnología Aislamiento y evaluación de hongos nematófagos asociados a quistes de Globodera rostochiensis (Woll.) en la región del Cofre de Perote

Tesis Que para obtener el grado de:

Maestro en Ciencias, Área Biotecnología Presenta: ANGEL ENRIQUE NÚÑEZ SÁNCHEZ

Asesores: DR. OSCAR REBOLLEDO DOMÍNGUEZ. M. en C. GLORIA LUZ LAURA CARRIÓN VILLARNOVO. Tecomán, Colima, México. Septiembre del 2002.

UNIVERSIDAD

DE

COLIMA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS OFICIO No. 440/2002.

C. ANGEL ENRIQUE NUÑEZ SANCHEZ EGRESADO DE LA MAESTRIA EN CIENCIAS AREA: BIOTECNOLOGIA PRESENTE.

Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área: de Biotecnología de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis de Maestría y en virtud de que efectuó las correcciones y acató las sugerencias que le habían indicado los integrantes del mismo, se le autoriza la impresión de la tesis " Aislamiento y evaluación de hongos nemátofagos asociados a quistes de Globodera rostochiensis (Woll) en la región Cofre de Perote ", misma que ha sido dirigida por los C.C. Dr. Oscar Rebolledo Dominguez y la M.C. Gloria Luz Laura Carrión Villarnovo, Profesor-Investigador de la Universidad de Colima e Investigadora del Instituto de Ecología de Xalapa, Veracruz. Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial para obtener el grado de Maestro en Ciencias; Area: Biotecnología y fue revisado en cuanto a forma y contenido por los C.C. Dr. Alfonso Pescador Rubio. Dr. Oscar Rebolledo Domínguez y la M.C. Edelmira Galindo Velasco, Profesores-Investigadores de la Universidad de Colima. Sin otro particular de momento. me despido de usted muy cordialmente.

ATENTAMENTE “ESTUDIA * LUCHA * TRABAJA” TECOMÁN, COL., A 27 DE AGOSTO DEL 2002.

ING. RODOLFO VALENTINO MORENTÍN DELGADO DIRECTOR

C.C.P. EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNO C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE. C.C.P. ARCHIVO. Of. No. 44012002. RVMD/Lety* *

Km 40 Autopista Colima-Manzanillo • Tecomán, Colima, México • C.P. 28100 Tel. 01 (313) 322 94 05 • Ext. 52251 • Fax 52252 • [email protected]

DEDICATORIA A mi esposa Conchita, mis hijos María del Carmen, Luisa Fernanda y Angel Enrique, por enseñarnos que este logro es el resultado de el esfuerzo conjunto, con todo lo que exige de renuncia y entrega, de lucha y de esperanza, de contagiar valores, de soñar utopias y generar proyectos, de señalar causes y seguir con constancia nuestro propio camino. A mis padres José Cruz y María del Carmen, por tanto ejemplo por tanto orgullo, por su invaluable apoyo y su lucha incansable para sacarnos adelante. A mis hermanos, María Araceli, Luis Carlos, Marco Antonio, Carmen Patricia, Mario Alberto, María Cristina, Edna Guadalupe, José Cruz y José Manuel, Angel Armando y Alma Angelina, Gerardo Alonso; por ese espíritu de lucha que los caracteriza y la seguridad de saber que nunca hemos estados solos. A mis cuñados y cuñadas, nuestros sobrinos por formar parte una gran familia. A Don Norberto y Lola Gámes de Ocoroni Sinaloa por demostrarme que la humildad es toda una virtud. A los amigos de ayer generación 1959-1965 de la Escuela Primaria Enrique Quijada de Nogales Sonora, por todas las vivencias de esa época que fuerte influencia género en mi formación. Donde quiera que estén, los recuerdo; desde siempre y hasta siempre.

AGRADECIMIENTOS A Dios, por permitir encontrar en mi camino a personas generosas y comprensivas, que con su apoyo pude alcanzar es meta....Gracias Señor A mí hija María del Carmen, por su apoyo, su dedicación y esfuerzo, deseando que este estudio sea muy significativo en tu formación profesional. Al Dr. Oscar Rebolledo Domínguez, Profesor investigador de la Universidad de Colima, a quien agradezco su invaluable asesoramiento, apoyo y dedicación para la realización de esta trabajo y por ser un autentico tutor y amigo. A la M. En C. Gloria L. L. Carrión V. Investigadora del Instituto de Ecología Xalapa A.C. por darme la oportunidad de superarme por su comprensión y valioso apoyo en el asesoramiento y realización de esta investigación eternamente agradecido. A la comisión revisora, integrada por el Dr. Alfonso Pescador Rubio, Dr. Oscar Rebolledo Domínguez y M. en C. Edelmira Galindo Velazco por su dedicación, observaciones y sugerencias al manuscrito del presente trabajo. A la Universidad Veracruzana, por otorgarme la oportunidad de participar en los programas de posgrado. A la Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación por su apoyo para llevar acabo esta etapa de capacitación. A la Universidad de Colima, por permitirme realizar con el apoyo de su personal académico y administrativo los estudios de Maestría en Ciencias en Biotecnología.

Al Instituto de Ecología Xalapa, A.C. por permitirme desarrollar el presente estudio en sus instalaciones mí reconocimiento al personal académica y administrativo por su apoyo en pro de la investigación. A Promep, por el apoyo económico y moral otorgado para proseguir estudio de posgrado. Al Dr. Jaime Molina Ochoa, por apoyar mi ingreso a la Universidad de Colima, por su amistad y ayuda desinteresada. Al Dr. Roberto Lezama Gutiérrez de la Universidad de Colima por su simpatía a este proyecto, sus acertado consejos y conocimientos para logar culminar este estudio. A la M. en C. Marycruz Abato Zarate de la Facultad de Ciencias Agrícolas de Universidad Veracruzana por su orientación y apoyo tan valioso para la realización de este trabajo, pero ente todo por su alegría y entusiasmo. Al Químico Jesús Gerrero de la Falcultad de Ciencias Agrícolas de Universidad Veracruzana por la ayuda durante el desarrollo de este estudio. A la M. en C. Irma López Guerrero,

al M. en C. Santiago Chacón Zapata,

investigadores del Instituto de Ecología por sus recomendaciones en la realización de esta Tesis. Al Técnico Tiburcio Laez Aponte, del Instituto de Ecología Xalapa A.C. por su ayuda en la toma de fotografías en el microscopio electrónico de barrido. Al Ing. José Regalado Aguayo, Jefe de Distrito de Desarrollo Rural Coatepec por su apoyo y autorización para continuar estudio de posgrado.

Al Lic. Mario Urbina de la Unidad de Capacitación de la Delegación SAGARPA en Veracruz, por su entusiasta apoyo. Al Ing. Arturo Paredes Tenorio, por la formación aportada sobre el nematodo dorado de la papa en Perote. A Doña Chepi, por su apoyo moral, pero sobre todo por su confianza y amistad. A mi compañero de Maestría en Ciencias Ing. Rubén Ramiro Sandoval por su apoyo y amistad. A todas aquellas personas que de alguna o otra manera contribuyeron a la realización de un sueño de tantos........

INDICE Página RESUMEN ABSTRACT

......................................................................................... ......................................................................................... I.- INTRODUCCIÓN ......................................................................................... HIPÓTESIS ......................................................................................... OBJETIVOS ......................................................................................... II.-ANTECEDENTES . ......................................................................................... 2.1. Síntomas y daño ocasionado por Globodera rostochiensis........................... 2.2. Clasificación taxonómica de Globodera rostochienis.................................... 2.3. Característica morfológicas de Globodera rostochiensis................................ 2.4.Biología..................................................................................................... 2.5. Métodos de control de nematodos fitoparásitos........................................... 2.5.1. Control químico.................................................................................. 2.5.2. Control físico....................................................................................... 2.5.3. Inundación Artificial y Natural............................................................... 2.5.4. Rotación de Cultivos............................................................................ 2.5.5. Control genético.................................................................................. 2.5.6. Plantas antagonistas y cultivos trampas................................................ 2.5.7. Legislación de control......................................................................... 2.6. Control biológico de nematodos fitoparásitos............................................. 2.6.1. La bacterias en el control biológico de nematodos fitopatogenos............. 2.6.2. Rickettisas.......................................................................................... 2.6.3. Nematodos Depredadores.................................................................... 2.6.4. Depredadores Heterogéneos................................................................ 2.7. Hongos parásitos de nematodos................................................................. 2.7.1. Los Hongos predadores o atrapadores de Nematodos........................... 2.7.2. Los Hongos endoparásitos.................................................................. 2.7.3. Productores de toxinas....................................................................... 2.7.4. Hongos facultativos antagonistas de nematodos................................... 2.7.5. Hongos parásitos de huevos, hembra y quistes..................................... 2.7.6. Distribución de hongos parásitos de nematodos.................................... III.- MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................ 3.1. Ubicación y descripción del área de estudio................................................. 3.1.1. Clima................................................................................................. 3.1.2. Geología............................................................................................. 3.1.3. Suelos................................................................................................ 3.1.4. Hidrografía.......................................................................................... 3.1.5. Topografía.......................................................................................... 3.1.6. Vegetación......................................................................................... 3.1.7. Toma de muestra............................................................................... 3.1.8. Extracción de quistes.......................................................................... 3.1.9. Densidad de la población de quistes.....................................................

1 2 3 7 7 8 11 15 16 18 20 21 22 22 22 23 24 24 25 26 26 26 27 28 28 31 34 34 35 39 42 42 42 42 44 44 44 44 47 47 48

Página 3.2. Aislamiento de hongos asociados a quistes................................................. 48 3.2.1. Identificación de hongos...................................................................... 49 3.2.2. Conservación de los aislamientos.......................................................... 49 3.3. Bioensayo del proceso de infección de hongos sobre quistes de Globodera rostochienis.............................................. .............................................. 50 3.3.1. Preparación del inoculo........................................................................ 50 3.3.2. Obtención de quistes sanos.................................................................. 50 3.3.3. Inoculación de los quistes de Globodera rostochiensis............................ 51 3.3.4. Pruebas de patogenicidad.................................................................... 51 IV.- RESULTADOS................................. ........................................................... 53 4.1. Densidad de población de Globodera rostochiensis en las localidades de estudio .................................................................................................. 53 4.2. Análisis de suelo........................................................................................ 56 4.3. Correlación entre materia orgánica y densidad de población ........................ 57 4.4. Hongos aislados de los quistes de Globodera rostochiensis en la región de Cofre de Perote....................................................................................... 58 4.5. Proceso de infección de tres hongos aislados de quistes de Globodera rostochiensis...... .............................................. ..................................... 60 4.6. Patogenicidad y esporulación de tres hongos sobre Globodera rostochiensis................. ......................................................................... 66 V.- DISCUSIÓN................................................................................................ 72 VI.- CONCLUSIÓN............................................................................................ 80 VII.- LITERATURA CITADA .............................................................................. 81

INDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Zonas más infestadas con nematodo dorado de la papa Globodera rostochienis en México.

Página 11

Cuadro 2. Hongos predadores y endoparásitos de larvas de nematodos.

33

Cuadro 3. Reportes de parasitismo naturales por hongos en hembras, huevos y quistes de nematodos en diferentes regiones en el mundo

41

Cuadro 4. Análisis de los datos de densidad de población de quistes en las localidades de estudio, con la Prueba ”G” de Bondad de Ajuste con Repetición

54

Cuadro 5. Proporciones de cada localidad en sus tres categorías.

55

Cuadro 6: Análisis de los datos de densidad de población de quistes en las localidades de estudio, con la Prueba ”G” de Bondad de Ajuste con Repetición.

56

Cuadro 7. Niveles de pH y contenido de materia orgánica en las muestras de las localidades estudiadas.

56

Cuadro 8. Resultado de la correlación entre la cantidad de materia orgánica, el pH, la cantidad total de quistes y las condiciones físicas de los quistes en las seis localidades estudiadas.

57

Cuadro 9. Hongos nativos asociados a quistes de Globodera rostochiensis en la región Cofre de Perote. 58 Cuadro 10. Clasificación taxonómica de los hongos aislados a quistes de Globodera rostochienis.

59

Cuadro 11. Análisis de varianza de la patogenicidad de hongos nativos sobre quistes de Globodera rostochiensis.

66

Cuadro 12. Porcentajes de quistes de G. rostochiensis con la esporulación de hongos nativos inoculados. 67

INDICE DE FIGURAS Página FIGURA 1. Dispersión Globodera rostochiensis en el mundo.

9

FIGURA 2: Cuello y puntuaciones del quistes 750x.

17

FIGURA 3: Corte transversal del quiste, corión y masa de huevos 750x.

17

FIGURA 4: Cono vulvar 500x.

17

FIGURA 5: Estrías del corión 1000x.

17

FIGURA 6. Ciclo biológico de Globodera rostochiensis.

19

FIGURA 7. Ubicación geográfica de zona de estudio.

43

FIGURA 8. Diagrama de flujo de Materiales y Métodos.

52

FIGURA 9. Total de quistes obtenidos por kilogramo de suelo en las localidades de estudio.

53

FIGURA 10. Clasificación de los quistes obtenidos de acuerdo a condiciones físicas por localidad.

55

FIGURA 11. Acremonium incrustatum esporas de sobre el corión 12 hrs después de la inoculación 2,000x.

61

FIGURA 12: Acremonium incrustatum Tubos germinativos vistos en la parte interna del corión 24 hrs después de la inoculación 1,500x.

61

FIGURA 13: Acremonium incrustatum tubos germinativos a las 48 hrs 1,500x.

61

FIGURA 14: Huevos de Globodera rostichienis con micelio de Acremonium incrustatum a las 72 hrs 1,000x.

61

FIGURA 15: Acremonium incrustatum micelio de saliendo del corión 96 hrs 1,000x.

61

FIGURA 16: Acremonium incrustatum conidióforo emergiendo del corión 120 hrs 2,000x.

61

FIGURA 17: Paecilomyces carneus grupo de esporas germinando 12 hrs después de la inoculación 3,500x.

63

FIGURA 18: Paecilomyces carneus esporas con tubos germinativos inmersos y superficiales 24 hrs después de la inoculación 1,500x.

63

FIGURA 19: Paecilomyces carneus micelio desarrollado sobre el corión a las 72 hrs 500x.

63

FIGURA 20: Paecilomyces carneus formación de fialides y conidióforos esporulando a las 96 hrs 1,500x.

63

FIGURA 21: Paecilomyces carneus cadenas de esporas sobre el corión 750x.

63

FIGURA 22: Huevos rodeados de micelio de Paecilomyces carneus 100x.

63

FIGURA 23: Phialophora malorum germinación de una espora 12 hrs después de la inoculación 3,500x

65

FIGURA 24: Phialophora malorum tubos germinativos 72 hrs 1,500x.

65

FIGURA 25: Phialophora malorum micelio desarrollándose sobre el corión a las 96 hrs 750x.

65

FIGURA 26: Phialophora malorum micelio sobre huevos 120 hrs después de la germinación 750x.

65

FIGURA 27: Parte interna del corión con micelio de a Phialophora malorum los 18 días 750x. 65 FIGURA 28: Quiste cubierto de micelio de Phialophora malorum a los 28 días.

65

FIGURA 29: Porcentaje de quistes infectados.

66

FIGURA 30: Acremonium incrustatum conidióforo y micelio sobre el corión 2,000x.

68

FIGURA 31: Huevo enrollado de micelio de Acremonium incrustatum 500x. 68 FIGURA 32: Micelio de Acremonium incrustatum interior del quiste 500x.

68

FIGURA 33: Quiste cubierto de micelio Acremonium incrustatum 100x.

68

FIGURA 34: Testigo quiste de Globodera rostochienis 750x.

68

FIGURA 35: Testigo huevos de en el interior del quiste de Globodera rostochiensis 500x.

68

FIGURA 36: Paecilomyces carneus conidióforo 2,000x.

69

FIGURA 37: Paecilomyces carneus cadenas de conidios y micelio sobre el quiste 750x.

69

FIGURA 38: Micelio de Paecilomyces carneus sobre la masa de huevos 750x.

69

FIGURA 39: Quiste cubierto por micelio y conidióforos de Paecilomyces carneus 150x.

69

FIGURA 40: Testigo quiste sano 100x.

69

FIGURA 41: Huevos de Globodera rostochiensis en el interior del quiste 500x.

69

FIGURA 42: Phialophora malurum grupo de esporas 1,500x.

70

FIGURA 43: Espora y micelio de Phialophora malurum sobre el quiste 100x. 70 FIGURA 44: Micelio de Phialophora malurum sobre el corión 200x.

70

FIGURA 45: Micelio de Phialophora malurum en la masa de huevos 750x.

70

FIGURA 46: Micelio de Phialophora malurum en la masa de huevos y corión 500x.

70

FIGURA 47: Quiste cubierto por micelio de Phialophora malurum 150x.

70

FIGURA 48: Testigos de Globodera rostochiensis 250x.

71

FIGURA 49: Conjunto de huevos de Globodera rostochiensis en el interior del quiste 500x. 71

Aislamiento y evaluación de hongos nematófagos asociados a quistes de Globodera rostochiensis (Woll.) en la región del Cofre de Perote. Núñez Sánchez, Angel Enrique. Facultad de Ciencias Biológicas Agropecuarias, Universidad de Colima.

RESUMEN El nematodo dorado Globodera rostochiensis es una de las principales plagas en el cultivo de la papa Solanum tuberosum a nivel mundial; en México se encuentra extendido prácticamente en toda las regiones donde se cultiva. Diversas especies de hongos funcionan en la naturaleza como reguladores de poblaciones, sin embargo sobre este nematodo pocas especies se conocen. Los objetivos de este trabajo fueron aislar y determinar los hongos parásitos de G. rostochiensis en cultivos de papa de la región del Cofre de Perote, Veracruz, México y describir el proceso de infección sobre los quistes de especies seleccionadas. Se tomaron muestras de suelo de seis localidades (Conejos, Tembladeras, Rancho Nuevo, Escobillo, Pescados y Los Altos). Los quistes se obtuvieron mediante la técnica del flotador de Fenwick, se cuantificaron. La cantidad de quistes obtenida fue de 300 hasta 2216 quistes/kg de suelo. De cada muestra se tomaron al azar 100 quistes jóvenes para aislar hongos parásitos. El parasitismo natural obtenido del total de muestras trabajadas fue de 3.5%. Se obtuvieron 21 cepas de hongos: Aspergillus sp. (1), Chetomidium sp. (1), Cladosporium sp. (3), Drechslera sp. (1), Fusarium sp. (1), Micelia sterilia (1), Pteroconium sp. (1), Trichocladium asperum (2), Ulocladium atrum (1), Acremonium incrustatum (1), Paecilomyces carneus (5), Phialophora malorum (1), Phialophora sp. (2). Acremonium incrustatum, Paecilomyces carneus y Phialophora malorum, fueron seleccionados para estudiar el proceso de infección. En los quistes inoculados con A. incrustatum y P. carneus se encontró evidencia de germinación, penetración y desarrollo del micelio sobre el corión y en los huevos, la capa vitalina se separó y se observó vacuolización en la superficie de los huevos y el mucílago desapareció; los conidióforos emergieron del quiste, y se formaron las primeras esporas a las 72hrs. Sin embargo, en los quistes inoculados con P. malorum no se observó la germinación de las esporas hasta 5 días después de la inoculación, el micelio dentro de los quistes continuó su crecimiento y 15 días después se encontraron algunos quistes negros, esto debido a que gran cantidad de micelio estaba desarrollado en el interior del quiste, posteriormente entre los 18-20 días se observó su esporulación. A. incrustatum y P. carneus pueden ser considerados buenos candidatos para usarlos en pruebas de control biológico a nivel de parcelas experimentales, por la velocidad para infectar y destruir los quistes. Palabras clave: Control biológico, papa, nematodo enquistado, Globodera rostochiensis, hongos nematofagos.

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Isolation and evaluation of nematophagus fungi associated to cyst of Globodera rostochiensis in the region Cofre de Perote. Núñez Sánchez, Angel Enrique. Facultad de Ciencias Biológicas Agropecuarias, Universidad de Colima.

ABSTRACT The golden cyst nematode Globodera rostochiensis is one of the main pest in the crop potato Solanum tuberosum to world level; in Mexico is extended practically in the whole regions where it cultivated. Diverse species of fungi work in the nature like controllers of populations, however on this nematode few species know. The objectives of this work were isolate and determine parasites fungi parasites of G. rostochiensis in cultivation potato of the region of Cofre de Perote, Veracruz, México and describe the process of infection on the cysts of selected species. Were taken samples of soil of six localities (Conejos, Tembladeras, Rancho Nuevo, Escobillo, Pescados and Los Altos). The cysts were obtained by means of the technique of the float of Fenwick, were quantified. The amount of obtained cysts was from 300 up to 2216 cysts/kg soil. From each sample taken 100 young cysts at random in order to isolate parasites fungi . The natural parasitism obtained of the total of worked samples was from 3.5%. 21 stumps were obtained: Aspergillus sp. (1), Chetomidium sp. (1), Cladosporium sp. (3), Drechslera sp. (1), Fusarium sp. (1), Micelia sterilia (1), Pteroconium sp. (1), Trichocladium asperum (2), Ulocladium atrum (1), Acremonium incrustatum (1), Paecilomyces carneus (5), Phialophora malorum (1), Phialophora sp. (2). Acremonium incrustatum, Paecilomyces carneus and Phialophora malorum, were selected to study the process of infection. In the cysts inoculated with A. incrustatum and P. carneus was evidence of germination, penetration and mycelium was development on the chorion and in the eggs, the vitelline membrane separated and was observed vacuolization in the surface of the eggs and the mucilage disappeared; the conidiophore emerged of the cyst, and they were formed the first spores to the 72hrs. However, in the cysts inoculated with P. malorum was not observed the germination of the spores up to 5 days after the inoculation, the mycelium inside the cysts continued its growth and 15 days later were some black cysts, this because great amount of mycelium was developed inside the cyst, later on between the 18-20 days their sporulation was observed. A. incrustatum and P. carneus could be considered good candidates to use them in tests of biological control to level of experimental parcels, for the speed in order to infect and destroy the cysts. Key words: Biological control, potato, golden cyst nematode, Globodera rostochiensis, nematophagus fungi.

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I.- INTRODUCCIÓN

La papa, Solanum tuberosum L., es originaria de Sudamérica de la región de los Andes y es uno de los cultivos más extendidos en el mundo (FAO, 1996). Entre los parásitos que la afectan, los nematodos son muy importantes; en Norteamérica más de 20 especies de nematodos han sido registrados asociados al cultivo de papa (MacGuidwin, 1993). Globodera rostochiensis (Woll.) es uno de los nematodos que causa más estragos en la mayoría de las zonas productoras de papa (Eppo, 1994). Globodera rostochiensis es un nematodo endoparásito sedentario, con alta capacidad de reproducción y sobrevivencia ya que las hembras están cubiertas por una capa dura (corión) formando un quiste, de manera que los huevos están bien protegidos. Los quistes permanecen normalmente en el suelo hasta 20 años. Cada quiste joven contiene entre 200-500 huevos (Evans y Trudgill, 1993; Franco, 1994). Este nematodo se ha registrado en más de 90 especies de Solanáceas, aunque los hospederos más susceptibles, además de la papa, son el tomate, Lycopersicum esculentum Mill. y la berenjena, Solanum melongena L. (Greco y Moreno, 1992). Afecta el sistema radicular de la planta, disminuyendo la cantidad de minerales absorbidos (fósforo, potasio, magnesio y calcio) y su translocación; además aumenta la concentración de sodio (Perry, 1996; Trudgill, 1991). De manera que al dañar a las membranas de la raíz de la planta, facilita la entrada de hongos y bacterias (Evans y Trudgill, 1992). El efecto de este nematodo en el rendimiento del cultivo, varía de acuerdo a la densidad de población. El límite de tolerancia establecido en Europa hacia los nematodos formadores de quistes, para no afectar el rendimiento, es de 1.9 huevos/g de suelo o de hasta 40 quistes/kg de suelo.

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Cuando el nivel poblacional del nematodo en el suelo alcanza 16 y 32 huevos/g de suelo, el rendimiento de la papa puede ser reducido entre 20 y 50% respectivamente; y puede disminuir completamente cuando la población inicial del nematodo es de 64 huevos/gr de suelo (EPPO, 1994; Perry, 1996; Greco, 1993). Debido a la fuerte infestación de G. rostochiensis, en la región de Perote, donde se han registrado en promedio 1000 quistes/kg de suelo, la Secretaria de Agricultura estableció la Cuarentena Interior Permanente No. 17 (SARH, 1987), que comprende 6,000 hectáreas dedicadas al cultivo de la papa. La alta densidad de la población del nematodo, obliga a la aplicación de agroquímicos, utilizando hasta 50 kg de nematicidas por hectárea al momento de la siembra; las consecuencias son: el incremento en los costos de producción, aumento de los riesgos de la salud humana por los residuos químicos (Gommers et al., 1992), la contaminación del suelo y mantos freáticos y el desarrollo de resistencia del nematodo a los nematicidas (Whitehead et al., 1994). El control de los nematodos enquistados sobre el cultivo de la papa, se realiza con el uso de los nematicidas químicos, sin embargo, por razones del peligro que representan para la salud y las dificultades en el desarrollo comercial han llevado a la búsqueda de alternativas de control que reduzcan los riesgos del uso de los productos químicos. Un acercamiento lógico a esta alternativa, es la implementación de prácticas que incluyan la aplicación de microorganismos antagonistas, que suceden de forma natural o que pueden ser establecidos en el desarrollo de un ecosistema (Sikora, 1992). El hecho, de que los niveles de parasitismo de hongos sobre los nematodos enquistados, donde son introducidos, sea mucho menor, que en los centros de origen, pareciera indicar, que estos fitopatógenos no tienen enemigos naturales y que el control biológico para ellos no tendría grandes expectativas (Sayre et al., 1991; Sikora, 1992; Dackman y Norbring-Hertz, 1992).

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Sin embargo en la naturaleza las poblaciones de los animales mantienen una fluctuación cíclica, cuyo número varia año con año y de generación en generación. Los nematodos son muy pequeños y sus hábitats han sido raramente estudiados. En este aspecto los nematodos no se diferencian de los animales (Varley et al. 1973; Knipling, 1979; Berryman, 1981). Hay dos factores que gobiernan la abundancia de los animales; una, que opera independientemente de la densidad y otra, que depende de la densidad. Pero en el suelo, la más común, son los factores que actúan independientemente de la densidad. Los factores que más influyen sobre las poblaciones de los nematodos fitoparásitos son la humedad y la temperatura, así como, las prácticas agrícolas, además de los parásitos facultativos y depredadores (Stirling, 1991; Varley et al., 1973; Knipling, 1979; Berryman, 1981). Estas fuerzas son impredecibles, pero juegan un importante papel en la determinación de las áreas ecológicas, en las cuales estos organismos pueden existir permanentemente, y determinan la fluctuación de la población (Stirling, 1991). Los factores densodependientes son la clave para los procesos regulatorios del tamaño poblacional de las especies. Esta acción tiende a crear un efecto estabilizador sobre una población que esta arriba de su punto de equilibrio, de manera que la reduce y si la población está por debajo de ese punto, la aumenta. Como consecuencia de lo anterior, los hongos habitantes del suelo de la Clase, Hyphomycetes, consistentemente colonizan quistes de nematodos fitoparásitos y que son, en gran medida, la causa del control de las poblaciones de estos nematodos, logrando penetrar al quiste, destruir los huevecillo y a las larvas, por varios medios (Dackman y Nordbring-Hertz, 1985; Gintis et al., 1983; Morgan-Jones y RodriguezKabana, 1988). Esto, hace suponer, que si bien es cierto, que el nematodo en quistado G. rostochiensis, no se le han reportado enemigos naturales fuera de su centro de origen,

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según Tribe (1980), no se puede concluir que este exento de microorganismos parásitos y depredadores. El uso de microorganismos para el control de plagas y enfermedades de las plantas por otros microorganismos es una alternativa al uso del control químico; y estimula la búsqueda de agentes de biocontrol (Inbar y Chet, 1997; Lindow y Wilson, 1998). Los organismos que abundan en el suelo, particularmente con potencial antagonista, han sido propuestos como un marcador biológico útil para la sanidad del ecosistema (Niles y Freckman, 1998; Stork y Eggleton, 1992; Yeates, 1994) y han impulsado el estudio de los enemigos naturales para el control de nematodos (Sayre et al., 1991), y que en alguna etapa del ciclo de vida los utilizan como una fuente de nutrientes, y desempeñan un importante papel en el reciclaje del carbono, nitrógeno y otros elementos de la biomasa. El aumento de la población de nematodos en el suelo va acompañada por epizootias de hongos antagonistas (Sikora, 1992; Stirling et al., 1990); de esta forma atacan a los nematodos continuamente en todos los suelos (Uziel y Sikora, 1992). Las plagas de la raíz son generalmente raras en los ecosistemas no perturbados o naturales, mientras que en los sistemas de producción convencionales, los patógenos del suelo y las enfermedades que causan, son severas y a menudo, un factor limitante de la producción (Cook y Baker, 1983).

Los hongos nativos son reconocidos como

contribuidores comunes para la supresión de plagas en sistemas de cultivo (Dackman y Norbring-Hertz, 1992). El control biológico es efectivo cuando un antagonista tiene un alto grado de adaptabilidad al medio donde se va a establecer (Lindow y Wilson, 1998). Generalmente, el suelo no estéril, es considerado un ambiente hostil para la introducción de microorganismos, incluyendo agentes de control biológico, ya que los microorganismos nativos frecuentemente son rivales superiores ó de lo contrario son antagonistas (Cook y Baker, 1983).

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El nematodo dorado de la papa Globodera rostochiensis representa un grave problema en la Región Cofre de Perote, sin embargo poco es el conocimiento, sobre la diversidad de especies de hongos nematofagos asociados y el potencial de estos como agentes de control biológico. De tal forma que la investigación parte de la siguiente hipótesis HIPÓTESIS Las poblaciones de hongos nativos de la zona productora de papa en el Cofre de Perote tienen actividad nematofaga contra G. rostochiensis. OBJETIVOS Evaluar el estado actual de la población de G. rostochiensis en las localidades de estudio en la región Cofre de Perote. Aislar e identificar hongos nativos parásitos de quistes de G. rostochiensis en la región del Cofre de Perote, Veracruz. Evaluar la patogenicidad de hongos nativos sobre quistes de G. rostochiensis, in vitro.

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II.-ANTECEDENTES El nematodo dorado se considera originario de los países andinos (Perú y Bolivia). Se detectó por primera vez en Alemania en 1881 y fue descrito en 1923 por Wollenweber (Franklin, 1971). La introducción original del nematodo a Europa fue muy probablemente durante el establecimiento del cultivo en 1850 y se dispersó a países de Asia (India, Pakistán Japón y Malasia), África (Egipto, Marruecos, Sierra Leona y Sudáfrica), Australia y centro y norte de América, probablemente con el comercio de tubérculos de papa para semilla. Actualmente se registra en 65 países (Jones, 1976) (Fig.1). Otro aspecto que influye en la magnitud del daño ocasionado por este nematodo, son los cinco patotipos identificados; (Ro1, Ro2, Ro3, Ro4, Ro5) a nivel mundial (Evans y Trudgill, 1993; Greco, 1993). Globodera pallida (Stone) es otra especie de nematodo que forma quistes, llamada quiste blanco de la papa y al igual que G. rostochiensis causa graves daños. Se ha registrado en el centro y oeste de Europa. En América se le conoce de Colombia, Ecuador y gran parte del Perú. (Evans y Trudgill, 1993; Greco, 1993). Seis patotipos se han determinado en G. pallida: tres en Europa (Pa1, Pa2, Pa3) y tres en la zona andina (P4A, P5A, P6A). Ambas especies se tienen registradas para el sur del Perú, Bolivia, y Argentina, donde han cohabitado con sus hospederos por cientos de años (Stone, 1986). Sin embargo solo se ha registrado G. rostochiensis en Chile, Venezuela, Centro América, México y EUA (Stone, 1979; Sosa-Moss, 1986).

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La papa que se produce en México se siembra en 25 estados de la República en tres ciclos agrícolas otoño-invierno, invierno-primavera y primavera-verano en este último se hace el 80% de la siembra. La superficie cultivada es de alrededor de 70 mil hectáreas aproximadamente, con una producción de 1’200,000 toneladas los principales estados productores de papa son: Chihuahua, Sinaloa, Sonora, Guanajuato, México, Nuevo León, Coahuila, Puebla y Veracruz (ASERCA, 1999). La producción comercial en la región montañosa de México se concentra entre los 2,000-3,000 m de altitud, en zonas de temporal y se distingue en seis áreas: Puebla, Toluca, Sierra Tarasca de Michoacán, La Malinche en Tlaxcala, Pico de Orizaba y Cofre de Perote, que en conjunto comprenden una superficie de 25,000 hectáreas aproximadamente (CONPAPA, 1994). Se tienen registros de Globodera spp. de muestras de suelo tomadas de un carro de carga americano utilizado para transporte de papas en el centro de México en 1953. Sin embargo la presencia de G. rostochiensis fue confirmada en Guanajuato por Iverson (1972); por lo cual se inició la inspección de las zonas productoras de papa. Hasta 1986 se tenía registrado el nematodo dorado en 46 zonas de 9 estados; México, Puebla y Tlaxcala son los estados más infectados (Sosa-Moss, 1986). Actualmente esta disperso en la mayoría de las zonas en las que se cultiva papa en México (Cuadro 1).

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Cuadro 1. Zonas más infestadas con nematodo dorado de la papa Globodera rostochiensis en México. ESTADO MUNICIPIO Coahuila Arteaga Distrito Federal

Delegación Tlalpan y Delegación Milpa Alta

Hidalgo

Metztitán

Guanajuato

León, San Francisco del Rincón, Silao, Romita, Purísima del Rincón.

Estado de México

Zinantepec, Temascaltepec, Calimaya, San Antonio de la Isla, Santa María Rayón, Amanalco de Becerra, San Bartolo Morelos, Naucalpan, Donato Guerra, Lerma, San Felipe del Progreso, Valle de Bravo, Joquincingo y Metepec.

Nuevo León

Galeana

Puebla

Ixtacamaxtitlán, Saltillo Lafragua, Tlapanala, Guadalupe Victoria, Atzitzintla, Tehuacan, Chalchicomula de Sesna, Huitzilán, de Serdán y Tlachichuca.

Tlaxcala

Cuapiaxtla, Altzayanca, El Carmen, Huamantla, Terrenate, Tlaxco y Santa Ana Chiautempan

Veracruz

Altotonga, Ayahualulco, Perote y Xico

2.1. Síntomas y daño ocasionado por G. rostochiensis El síntoma típico de la presencia de nematodo dorado de la papa en el suelo es la marchites temprana en las plantas de papa asociado con estrés hídrico (Evans y Stone, 1977). Como consecuencia de la alimentación del nematodo, el daño histológico es manifestado por necrosis de las células de las raíces, perforadas por los estados juveniles larvarios, cuando éstos se detienen en el lugar definitivo de alimentación, las células de las raíces alrededor de la cabeza del nematodo sufren una profunda transformación.

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La hembra se adhiere y alimenta cerca del cilindro vascular, dando origen a unidades multinucleadas denominadas sincitio (hiperplasia de las células) cerca de la cabeza del nematodo, las que se forman por incorporación de un conjunto de las células adyacentes cuyas paredes se han disuelto. La formación del sincitio ocasiona una interrupción de los vasos cribosos y leñosos limitando notablemente la funcionalidad de las raíces. Las plantas de papa atacadas por el nematodo presentan crecimiento y rendimiento reducidos, la senectud se anticipa y en suelos muy infestados, el follaje presenta un ligero amarillamiento; las hojas individuales de las plantas infectadas son pequeñas por la pobre división celular. Por consiguiente las plantas infestadas tienen una mayor proporción de materia en la pared celular, el volumen de materia seca es mayor que en las plantas sanas. La presencia de nematodos enquistados causa la reducción fotosintética (por la ruptura del translocamiento de nutrientes, la relación planta-agua); incrementa la materia seca, la adhesión de raíces y por consiguiente la producción de menos tallos y hojas pequeñas poco suculentas y mueren tempranamente, hay poca formación de nuevas hojas, el número de tubérculos decrece. Las altas densidades del nematodo reducen el rendimiento y es más difícil decir debido a que combinación, la reducción del crecimiento de la planta es causado por una reducción de la absorción, incrementando el contenido de materia seca, la necrosis del follaje y la muerte temprana del mismo. El decremento de agua absorbida por las plantas altamente infestadas por el nematodo debido al mal funcionamiento del sistema radicular, tiene como consecuencia el desprendimiento de las hojas. Finalmente la muerte ocurre cuando el nivel de agua continua decreciendo y se prolonga la resistencia estomática (Evans y Trudgill, 1992).

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Las larvas se vuelven activas a 10°C y la máxima invasión de las raíces se realiza a 16°C. Temperaturas del suelo de 26°C, en períodos prolongados limitan el desarrollo del nematodo y reducen su reproducción. El nematodo dorado de la papa se desarrolla bien en los suelos arcillosos medianos a pesados, bien drenados o arenosos con aireación, suelos sedimentados o de musgo con un contenido de humedad de 50 a 75% de capacidad de campo. El pH del suelo tolerado por la planta de papa, es aparentemente aceptado por los nematodos (Stone, 1979). En ausencia del cultivo de la papa, en zonas de clima templado, el nivel poblacional disminuye en un 50% cada año, mientras que en países con clima cálido, como Marruecos, puede ocurrir una reducción de casi 100% (Schuster y Sikora, 1992a). En países con clima cálido, la superficie del suelo, en el verano, se calienta mucho y los nematodos que se encuentran en los primeros 5-10 cm mueren naturalmente. Por lo tanto, las prácticas agrícolas en la preparación del suelo en esta época del año, reducen sensiblemente el nivel poblacional del parásito. Los huevos enquistados toleran la desecación y pueden sobrevivir 20 años o más en suelos bajo condiciones extremas del medio ambiente. Cuando la cosecha se realiza al final del ciclo biológico de la papa, todos los nematodos que han penetrado en las raíces alcanzan el estado de quiste, logrando un nivel poblacional muy alto. No ocurre así cuando se cosecha temprano la papa; de esta forma muchos nematodos se encuentran todavía en los estados juveniles y el nivel poblacional en el suelo permanece bajo. La diseminación local o a gran distancia se realiza por la movilización de suelo infestado, como por ejemplo el que se adhiere a la maquinaria, semillas o envases para almacenaje. Los tubérculos contaminados proporcionan durante la siembra, condiciones ideales para la diseminación y constituyen el factor principal en la distribución mundial del nematodo.

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En la ausencia de un hospedero viable en suelos infectados los quistes del nematodo de la papa pueden persistir por 20-30 años. Dentro del quiste pueden pasar al segundo estado juvenil (J2) o bien entrar en extrema inactividad conocida como letargo. Generalmente el letargo se presenta algunas veces antes del establecimiento del próximo cultivo de papa y la mayoría de los J2 solo entran en letargo durante el 1er año. Después de esta estimulación la mayoría de los juveniles eclosionará. Así las poblaciones del nematodo de la papa son introducidas a nuevas regiones y pueden adaptarse a diferentes etapas de desarrollo del cultivo hospedante con 2-3 años de establecimiento (Mulvey y Stone, 1976). La cantidad de J2 que eclosiona es variable. En la ausencia de una planta hospedante, algunos juveniles eclosionan espontáneamente en ciertas épocas del año, cuando la temperatura del suelo y la humedad sean adecuadas. En suelos de Europa estas eclosiones espontáneas son en promedio de 30-33% anualmente, pero esto es influenciado por las condiciones ambientales (Mulvey y Stone, 1976). En general se ha registrado mayor eclosión en suelos arenosos que en suelos de turba y arcilla (Berry et al., 1977). La textura de suelos arcillosos sedimentados puede estimular la eclosión de la población del nematodo en un 32%, cuando hay presencia de restos de raíces de un cultivo, pueden estimular la eclosión de los J2 en un 60-80%. Como parte de la estrategia de sobrevivencia del nematodo dorado de la papa, nunca eclosiona el 100% de las larvas de los quistes, algunos juveniles llegan a permanecer en letargo por varios años antes de eclosionar. La raíz de la planta hospedante también influye en las proporciones de multiplicación, generalmente sistemas radiculares grandes toleran altos niveles de invasión.

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En un campo, el primer foco de infección se manifiesta en una pequeña área circular que luego se agranda hasta afectar toda la superficie. El nematodo, por acción propia, puede moverse 1-2 m/año; sin embargo, el movimiento pasivo es más rápido. El suelo adherido a los implementos agrícolas, zapatos y patas de los animales, puede contener quistes, favoreciendo la diseminación de los nematodos dentro de la misma unidad de producción o a otras unidades. Todo sistema de riego que favorezca la escorrentía del agua, así como las inundaciones pueden ser importantes. Sin embargo, el comercio de la papa, y especialmente los tubérculos utilizados como semilla, son la forma más eficaz de diseminar los quistes entre estados, países y continentes. La limpieza de la maquinaria agrícola, uso de tubérculos-semilla sanos y medidas cuarentenarias son muy eficaces para evitar la diseminación de los nematodos (Matos y Canto-Sáenz, 1993). 2.2. Clasificación taxonómica de Globodera rostochiensis (Mulvey y Stone, 1976). Phylum: Nematelmintos Clase: Nematoda Subclase: Secernentea Orden: Tylenchida Suborden: Tylenchinae Superfamilia: Tylenchoidea Familia: Heteroderidae Género: Globodera Especie: rostochiensis

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2.3. Características morfológicas de Globodera rostochiensis Hembras cuerpo esferoidal a piriforme, sin cuello protuberante y carente de protuberancia en el cono terminal; diámetro longitudinal de 420-640 µm y ecuatorial de 270-430 µm. Longitud del estilete de 22-24 µm, con un ángulo del nódulo dorsal del estilete de 136°. Distancia del extremo de la cabeza al cono excretor de 105-175 µm. Altura vulvar de 6-11 µm. Distancia del ano al margen más cercano de la fenestra (áreas membranosas de pared delgada sobre el cono vulvar) de 39-80 µm. Quistes color café dorado a oscuro, superficie arrugada, formando patrones acanalados, lo cual puede ser diferente sobre el cono vulvar, circunfenestrados y con ano subterminal, diámetro longitudinal de 450-999 µm, diámetro ecuatorial de 250-810 µm, diámetro longitudinal/ecuatorial de 1-1.4 µm; distancia del ano al margen más cercano de la fenestra de 29-116 µm, y radio de Granek de 2-7 µm, con 16-31 estrías entre el ano y fenestra vulvar (Figs. 2 a 5). Huevos elipsoidales, hialinos de 95-115 x 42-48 µm. Larvas de 370-470 µm, cuya anchura a la mitad del cuerpo de 19-26 µm. Longitud del estilete de 21-23 µm, distancia de la base de los nódulos a la desembocadura de la glándula esofágica dorsal de 5-6.7 µm. Longitud de la cola de 44-57 µm, y la porción hialina de la cola 18-30 x 16-23 µm. Glándula esofágica dorsal 2.2-2.5 µm disco oral subcircular con sectores labiales. Machos con cuerpo vermiforme con torcedura axial de 890-1270 x 22-36 µm y de 3146 µm de ancho a la mitad del cuerpo, disco labial de bajo perfil. Estilete fuerte de 2527 µm con protuberancias bien formadas. Distancia de la base de los nódulos a la desembocadura de la glándula esofágica dorsal de 5-7 µm. Cola de 1.6-6.7 µm; una bolsa seminal, y una sola espícula en la punta (Franklin, 1971).

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Figs. 2-5. Globodera rostochiensis. 2:Cuello y puntuaciones del quistes 750x; 3: Corte transversal del quiste, corión y masa de huevos 750x; 4:Cono vulvar 500x; 5:Estrías del corión 1000x.

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2.4. Biología

Después de la siembra, las raíces de la planta de papa, producen exudados radicales que estimulan la eclosión de los huevos (cada quiste contiene de 200-500 huevos) de los cuales emergen los juveniles de segundo estadío. El nematodo al salir del huevo, se encuentra en un estadio infectivo, migra hacia el ápice radical y después de recorrer algunos milímetros de la raíz, el juvenil se fija a las raíces y continúa su desarrollo como sedentario, pasando por tres estados juveniles (segundo, tercero y cuarto) antes de lograr el estado adulto (Mulvey y Stone, 1976). El periodo de tiempo que el nematodo necesita para cumplir una generación, desde la penetración del juvenil de segundo estadío hasta la formación de quistes con huevos, es de 45-60 días, según las condiciones ambientales. Si se considera una temperatura de 10°C como la mínima a la cual el nematodo puede comenzar su desarrollo, puede desarrollarse una generación después de 40 días (Fig. 6). En Globodera rostochiensis existe un dimorfismo sexual muy marcado, el segundo estado juvenil es móvil y vermiforme; en las hembras el tercero y cuarto estado juvenil, así como las adultas, son inmóviles y abultadas. La hembra posee un aparato reproductivo muy desarrollado y después de ser fecundada produce gran cantidad de huevos que retiene en el interior del cuerpo. La hembra adulta adquiere una coloración amarillenta, luego se transforma en quiste. El macho adulto es móvil y su capacidad patogénica no ha sido demostrada. El tamaño de los individuos es afectado por el huésped y por el nivel poblacional del nematodo, siendo más pequeños cuando la población es elevada o el huésped se encuentra fuertemente dañado (Greco et al., 1982). Las hembras fecundadas aumentan de tamaño y se vuelven subesféricas, lo cual depende probablemente de las características de la planta hospedante y de la nutrición durante su desarrollo. En comparación con la hembra madura el quiste tiene una cutícula más gruesa y de color castaño oscuro para proteger los huevos contenidos. 18

Fig. 6. Ciclo biológico del nematodo Globodera rostochienis.

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Globodera rostochiensis posee un promedio de 21.6 estrías y G. pallida 12 (Stone, 1979). A veces, el número promedio puede ser de 15, lo cual causa confusión; en este caso, es necesario identificar la especie. A la madurez tanto G. rostochiensis como G. pallida se convierten en quistes redondeados de color castaño oscuro, con un diseño irregular de puntuaciones en la superficie del cuerpo. El largo del cuerpo de las larvas, del estilete y de la cola son generalmente mayores en G. pallida que en G. rostochiensis (Mulvey y Stone, 1976). Los quistes no se alimentan y se desprenden fácilmente de las raíces o de los tubérculos. Los huevos, al final del desarrollo embrionario, aproximadamente después de 2-3 semanas, contienen juveniles de segundo estadío. Las condiciones que lo favorecen son una temperatura de 20-26°C, una humedad en el suelo y pH de 2.6-4. Cuando las condiciones ambientales son desfavorables, como en casos de alta temperatura (28°C), sequías, cuando la planta se aproxima al final del ciclo, o bien las raíces están muy dañadas; las hembras se transforman temprano en quiste y el ciclo es más corto; en cambio si la temperatura del suelo es menor de 20°C, el ciclo de vida es más largo. Estudios comparativos han demostrado que G. pallida se desarrolla mejor que G. rostochiensis a bajas temperaturas (Greco et al., 1982). 2.5. Métodos de control de nematodos fitoparásitos Con el fin de evitar que el ataque de nematodos afecte el crecimiento y desarrollo de las plantas cultivadas, es necesario efectuar una evaluación de los niveles de población que desde un punto de vista económico y ecológico justifique, dependiendo de la condición específica de cada sistema productivo, la inversión que implica la utilización de uno o varios de los métodos de control.

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2.5.1. Control químico En países europeos donde se cultiva papa, la aplicación de nematicidas esta dirigida a los nematodos formadores de quistes (Mulder et al., 1990). Winslow y Willis (1972) indican que, en general, el tratamiento con nematicidas para el control de G. rostochiensis no ha sido económicamente recomendable, debido a sus altos costos, los implementos especiales requeridos para su aplicación y la fitotoxicidad de algunos de ellos. Muchos de los nematicidas inician su actividad cuando el crecimiento de la planta es avanzado, sin embargo, hacen notar que cuando el suelo esta mojado y frío los materiales o substancias aplicadas tienden a difundirse menos, a degradarse y a disminuir su efectividad aunque las condiciones sean óptimas, la eliminación de las larvas casi siempre es incompleta. Los principales nematicidas utilizados son el DD (1,3 dicloropropeno, 1,2diclopropano con hidrocarbono, el DB (etileno dibromo) y el DBCP (1,2 dibromo-3 cloropropano) los cuales son altamente tóxicos y solubles en agua. El DD ha sido el nematicida mas ampliamente utilizado y es fitotóxico. El uso del DBCP fue suspendido en California durante 1977 y cancelado su registro en diversos lugares de Estados Unidos, ya que se demostró que los mantos freáticos estaban contaminados con nematicidas como el EDP y el DD (Whitehead et al., 1994). En México los nematicidas que más se utilizan son los carbamatos, aldicarb (Temik) carbofuran (Furadan) y oxamyl (Vydate) (CONPAPA, 1994). Los nematicidas además de ser costosos sus residuos pueden permanecer en el tubérculo hasta después de la cosecha (Gommers et al., 1992).

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2.5.2. Control físico Una técnica no contaminante es el uso de la energía solar, la cual consiste en calentar el suelo hasta una temperatura letal para los estados móviles del nematodo. El efecto invernadero que se produce bajo el plástico permite que la temperatura del suelo alcance valores de 5-12°C, superiores a los del aire, esto es letal para los nematodos hasta 20-30 cm de profundidad. Este método es efectivo con niveles poblacionales medios-bajos del nematodo del quiste de la papa (25 huevos/g de suelo). Sin embargo es poco utilizado ya que se requiere que el terreno este libre de cultivos en el verano y que la temperatura sea muy elevada, lo cual no es factible donde se cultiva papa ya que las temperaturas a lo largo del año son muy bajas. El efecto detrimente en otros agentes de control biológico en el suelo tiene que ser también considerado (Mani et al., 1993). 2.5.3. Inundación Artificial y Natural Las inundaciones matan a los nematodos del suelo, pero las inundaciones artificiales resultan ser una herramienta costosa en el control de nematodos, aún para los productores comerciales, y no es recomendable para los pequeños productores (Bridge, 1996). En México, la mayoría de la superficie dedicada al cultivo de papa se localiza en zonas de montaña bajo régimen de temporal (CONPAPA, 1994). 2.5.4. Rotación de cultivos La rotación de cultivos es efectiva en la lucha contra G. rostochiensis, que tiene un rango de hospedantes limitado, se pueden lograr buenos resultados cultivando papa cada cuatro o cinco años en suelos infectados. Estudios dirigidos en Bolivia demostraron que la mejor secuencia después de cultivar papa para reducir densidades de quistes, fue cultivando cebada y frijol lima, por un año, posteriormente barbechar y sembrar papa otra vez (Canto-Sáenz y Mayer de Scurrach, 1993).

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Para poder recomendar una rotación efectiva, es necesario determinar el nivel poblacional de los nematodos (Trudgill, 1991). El ciclo de siembra primavera-verano es el más favorable para la reproducción del nematodo y ocasiona el daño más grave, la tasa de reproducción de G. rostochiensis es en promedio de 39% con siembra de primavera y el 8-9% con siembra en verano e invierno (Greco y Moreno, 1992). 2.5.5. Control genético El cultivar de papa juega un papel importante sobre la dinámica de Globodera pallida y G. rostochiensis. Se conocen cultivares susceptibles a ambas especies y cultivares resistentes o parcialmente resistentes a una sola de ellas, que afectan la tasa de reproducción de los nematodos. En presencia de cultivares resistentes los juveniles de segundo estadío salen del quiste, penetran en las raíces, pero no se desarrollan. A veces, la reducción poblacional, utilizando un cultivar resistente, puede ser mayor que utilizando un cultivo no huésped o dejando el suelo en barbecho. El uso de cultivares resistentes ejerce una presión selectiva sobre el nematodo, debido a que no existen cultivares resistentes a ambas especies o a todos los patotipos de la misma especie (Greco y Moreno, 1992). La resistencia a G. rostochiensis ha sido buscada en Solanum tuberosum, subespecies andigena y la resistencia de los híbridos resultantes de las cruzas con S. andigena, lo que ha hecho necesario continuar con las investigaciones teniendo en cuenta al patotipo presente en cada región, puesto que las variedades resistentes no se comportan de igual manera con todos los patotipos existentes (Kirkham y Marshall, 1996).

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Por otro lado, ambas especies o diferentes patotipos de ellas, pueden encontrarse en el mismo campo, de manera que el uso de un cultivar resistente puede reducir la incidencia de una especie o patotipo, pero favorece el desarrollo de la otra. Se ha determinado que el uso continuo de un mismo cultivar resistente ocasiona la selección de patotipos que antes no eran importantes. Las razas se diferencian por su patogenicidad o por la habilidad que tienen de multiplicarse en los clones con resistencia proveniente ya sea de S. tuberosum subsp. andigena, S. multidissectum, S. vernei y S. kutzianum (Evans y Stone, 1977). 2.5.6. Plantas antagonistas y cultivos trampas Muchas plantas poseen propiedades nematicidas; las más reportadas son las Tagetes spp. como las caléndulas africanas T. erecta, caléndula francesa T. patula, la caléndula sudafricana T. minuta, al igual que la mostaza y espárragos que al producir elementos tóxicos son factibles para el control o reducción de nematodos y otros en ciertas circunstancias (Sukul, 1992). Sin embargo pocas veces las legumbres son utilizadas por los productores, porque los abonos verdes no generan ganancia directa y al usarlos solo para el control de quistes de nematodos no será económicamente viable (Prot et al., 1992). 2.5.7. Legislación del control En los países donde se encuentra presente el nematodo dorado de la papa, una de las primeras prácticas llevadas acabo son las cuarentenas, ya que es la manera inmediata de prevención que impide la diseminación del parásito (EPPO, 1997).

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Es por ello que la Secretaria de Agricultura, con base en la Ley de Sanidad Fitopecuaria de los Estados Unidos Mexicanos y su Reglamento en materia de Sanidad Vegetal establece cuarentenas en regiones afectadas, la cual comprende aspectos oficiales que deben cumplirse para fomentar y proteger contra el ataque del nematodo dorado a la producción nacional de papa (siembra, cosecha, tratamiento, transporte y movilización de semillas, entre otras). Sin embargo, está cuarentena no se ha cumplido en la región del Cofre de Perote, ya que se continua sembrando papa en los campos abiertos y se siguen eliminando áreas de bosque para dicho cultivo. El quiste de la papa puede difundirse con los tubérculos utilizados como semilla, es necesario que la papa para semilla sea producida en áreas donde estos parásitos no estén presentes y debe ser certificada como libre de nematodos y otros patógenos. En muchos países el uso de semilla certificada es limitado; mucha semilla es producida por los mismos agricultores o por otros de la misma zona, sin ningún tipo de control fitosanitario (Trudgill, 1991). 2.6. Control biológico de nematodos fitoparásitos Varios aspectos del control biológico de los nematodos parásitos de plantas han sido revisados por Mankau (1981) y han impulsado, el estudio de los enemigos naturales para el control de nematodos (Sayre y Walter, 1991). El manejo apropiado de organismos antagónicos dispuestos a la protección de la

planta contra patógenos

constituyen una forma de control biológico y una alternativa para el control de nematodos (Azcon Aguilar y Barea, 1997). Organismos como hongos, bacterias, virus y protozoarios han sido identificados como parásitos o predadores de nematodos (Dackman et al., 1992; Adams, 1990; Deacon, 1991; Stirling, 1991). 25

2.6.1. Las bacterias en el control biológico de nematodos fitopatógenos No obstante que las bacterias son el grupo más abundante dentro de los microorganismos del suelo, poco esfuerzo ha sido dirigido a su estudio como agentes potenciales de control biológico para nematodos (Sayre y Walter, 1991). Diferentes bacterias se ha reportado asociadas con la cutícula, cavidad del cuerpo, aparato digestivo y las gónadas de nematodos; sin embargo como lo señala Sayre y Walter (1991) la naturaleza parasítica de tales asociaciones es dudosa debido a la ausencia de la aplicación rigurosa de los postulados de Koch (Stirling et al., 1990). Uno de los mayores problemas al utilizar bacterias como agentes de control biológico, es la dificultad de cultivarlas “in vitro” en cualquiera de los medios bacteriológicos estándar. Ni las células vegetativas ni las esporas del organismo pueden ser cosechadas en cantidades suficientes para examinarlas extensivamente en el laboratorio o para infestar suelos en los que se puedan realizar exámenes de campo a gran escala con el fin de determinar la viabilidad del organismo como un agente de control biológico contra nematodos (Mankau, 1981). 2.6.2. Rickettsias Son microorganismos intracelulares que fueron encontrados en especies de quiste de nematodos: Heterodera goettingiana (Woll.) y G. rostochiensis por Shepherd et al. (1972). 2.6.3. Nematodos Depredadores Son importantes en la dinámica de población de numerosas especies de nematodos del suelo puesto que su biomasa en algunos suelos son sustanciales, sin embargo, su papel en el control biológico de nematodos fitófagos es poco conocido. Los nematodos Monochida, Dorylaimida y Diplogasterroidea son considerados como predadores y posibles agentes de biocontrol de nematodos parásitos de plantas. El género Monochida ha llamado más la atención que cualquier otro depredador que

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vive en el suelo, hay observaciones de laboratorio sobre la alimentación de los monochidos que concluye que estos depredadores no tienen eficiente habilidad de alcance o tropismo hacia la presa (Nelmes y Mculloch, 1975). Ciertas especies de Dorylaimida son abundantes en suelos, aunque su diversidad de números y especies parecen declinar en suelos removidos por frecuentes operaciones agrícolas. Mientras muchas especies son omnívoras, un número sustancial de especies son depredadoras. En general los hábitos alimenticios de este grupo de nematodos son poco conocidos, su ciclo de vida tiende a ser relativamente largo y bajas tasas de productividad por individuo. 2.6.4. Depredadores Heterogéneos Otro grupo importante de depredadores de nematodos son los ácaros Sayre et al. (1991). Los colémbolos y ácaros están entre los más numerosos artrópodos del suelo, la mayoría de los colémbolos se alimentan de materia descompuesta de plantas, hongos, humus y a veces son depredadores de nematodos (Mankau, 1981). De manera similar, los ácaros de suelo muestran una variedad de hábitos alimenticios, incluyendo la depredación. Se ha demostrado que los colémbolos se alimentan vorazmente de Heterodera y nematodos que viven libremente (Gilmore, 1970). Además su distribución en el suelo difiere de la de los nematodos parásitos de plantas. Las densidades mas altas de microartropodos se encuentran en la capa superior del suelo, particularmente en basureros o en capas orgánicas en la superficie y también están restringidas, por su tamaño a suelos con aberturas de poros suficientemente grandes para que se puedan mover (Mankau, 1981).

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2.7. Hongos parásitos de nematodos Diversos investigadores han agrupado a los hongos según el modo de infectar o el estadío del nematodo que infecta: predadores o atrapadores de nematodos, endoparásitos, parásitos de huevos, hembras y productores de toxinas. 2.7.1. Los Hongos predadores o atrapadores de Nematodos Desarrollan

hifas,

ramificaciones,

redes

semejantes

a

una

telaraña

y

protuberancias pegajosas, o bien forman anillos que pueden ser constrictores o noconstrictores, con los cuales atrapan las larvas de nematodos (Dackman y NorbringHertz, 1992). Los mecanismos de adhesión de nematodos, las estructuras del hongo infecciosas y la competencia por infección han sido también investigadas (Barron, 1992). Después de la captura, los hongos desarrollan un apresorio, el cual se ramifica y crece a lo largo del cuerpo. Este tipo de hongos esta relacionado con los estados larvarios y las especies de hongos pertenecen a grupos diversos como Zygomycetes, Deuteromycetes y Basidiomycetes. Han sido considerados prometedores agentes biológicos para control de nematodos. Arthrobotrys

oligospora (Corda)

forma

redes

de

hifas,

Monacrosporium

cianopagun (Oudem) desarrolla ramificaciones, Dactylaria candida (Sacc.) produce protuberancias y también es considerada como un hongo no constrictor. Stylopage sp. y Cytopage sp. tiene hifas inmodificadas. Entre los formadores de anillos constrictores están D. brochopaga y A. dactyloides. En hongos endoparásitos los conidios también muestran sofisticadas adaptaciones morfológicas para habilitar su interacción con los nematodos. Su comportamiento predador en las placas de agar los convierte en fascinantes organismos de estudio y especialización. Algunos de los primeros exámenes en invernadero o en el campo probablemente tendieron a exagerar su potencial y no fueron diseñados para evaluar críticamente los efectos sobre los nematodos. La mayoría de esos experimentos consistieron generalmente en añadir un hongo en un suelo modificado con materia orgánica, con el objetivo de que los hongos aumentaran en la

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modificación y especialmente los parásitos atacan a los nematodos, antes o después de haber utilizado el sustrato. Todo lo que se conoce sobre el hongo examinado es que en algún punto, este había atrapado a los nematodos. El criterio general que se empleó para escoger a un hongo como agente de control fue que éste debía ser útil y fácilmente cultivado (Abawi y Thurston, 1992). Cook y Baker (1983) demostraron que la oportunidad de establecer especies “foráneas” en la fase predatoria es pequeña. Ninguno de los hongos que examinaron parecieron ser capaces de colonizar y explotar rápidamente el micro hábitat del suelo. Fueron considerados saprofitos poco competitivos y fueron susceptibles al antagonismo de otros organismos del suelo ; además demostraron persistencia en el suelo, incluso en la presencia de fuentes de energía. Así mismo Cook y Baker (1983) reexaminaron algunas de las relaciones ecológicas en que se incluyen a los hongos predadores e identificaron algunos de los problemas asociados al utilizarlos como agentes de control biológico antes de que suceda la depredación, el crecimiento micelial y la formación de la trampa. Ambos procesos requieren energía la cual puede ser proporcionada por una fuente de nutrientes fácilmente disponible. Por lo tanto la adición de modificaciones orgánicas en el suelo es seguida generalmente por un corto periodo, en el cual aumenta la actividad de los hongos predadores de nematodos. Cook y Baker (1983) indicaron que la captura de los nematodos podría ser un medio de actividad en el microhábitat con sustratos orgánicos fácilmente disponibles. También notaron que la depredación no se relacionó aparentemente con la densidad de la población del nematodo a pesar de que la adaptación de modificaciones

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orgánicas en el suelo resulta en un aumento de la población de nematodos disolutos; de hecho el incrementar el número de modificaciones podría resultar en una reducción en la actividad de depredación de los hongos. Esto sucede debido a la intensificación en la actividad de los microbios del suelo que compiten con los hongos predadores por los nutrientes. Obviamente, las interacciones complejas entre los hongos predadores, que descomponen sustancias orgánicas y el remanente de la población microbiana del suelo determinan el final de cada uno de ellos en el suelo. Las capacidades nutricionales de los predadores del nematodo siguen siendo un aspecto enigmático de su biología que se requiere de próximas investigaciones para comprender que es lo que inicia la actividad predadora y cuanto tiempo puede durar. El factor que requieren los hongos depredadores para ser activados cuando la materia orgánica es adicionada al suelo ha sido auxiliar para mantener a los hongos de interés como agentes biológicos (Mankau, 1981; Gray, 1988). Sin embargo los estudios sobre ecología nutricional tienen poco interés en este grupo de hongos como mayores contribuidores de un control biológico (Cook y Baker, 1983). Además la actividad trampa fue descrita como un mecanismo utilizado por el hongo para contrarrestar el estrés nutricional, asociados con efectos de competencia de otros organismos saprofitos usando la materia orgánica como su principal substrato (Quinn, l987).

Las adaptaciones de las hifas que hacen las trampas de hongos predadores son comunes, sin embargo, estudios recientes han demostrado que especies que producen

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trampas o clavijas de infección que penetran a los nematodos capturados, despiden una sustancia o toxina que inmoviliza al nematodo casi inmediatamente. Algunos hongos predadores tienen órganos que expulsan sustancias atractivas para los nematodos (Jansson, 1982). 2.7.2. Los hongos endoparásitos Estos hongos no forman hifas para atrapar los nematodos, en estos hongos las esporas hacen contacto con la cutícula del nematodo o por la ingestión de ellas, posteriormente germinan en el esófago y desarrollan su micelio en el interior del nematodo, hasta que las estructuras reproductoras de los hongos rompen su pared debido a la esporulación. Pueden parasitar larvas, hembras, quistes y huevos. Los grupos a los que pertenecen son Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes, Deuteromycetes y Basidiomycetes. La habilidad saprofitica/parasitica de los hongos nematófagos es importante en la relación de biocontrol de nematodos por hongos (Kerry y De Leij 1992; Barron, 1992). Esto sugiere que poseen similitudes que los habilitan para alimentarse sobre los nematodos y sobrevivir en el ecosistema del suelo (Nordbring-Hertz et al., 1993). Más que hongos endoparásitos son considerados como específicos para desarrollarse sobre nematodos, aunque varían en la especialidad del hospedero atacan quistes y huevos de nematodos (Barron, 1977; Bird, 1987). Los endoparásitos han sido estudiados principalmente en laboratorio e invernadero y aunque se han hecho aplicaciones de este tipo de hongos directamente en suelos para el control de nematodos, los resultados han sido variados (Jaffee y Zehr, 1982; Jansson, 1982; Kerry, 1990a; Schuster y Sikora 1992b; Sikora, et al., 1990; Uziel y Sikora, 1992; Roessner, 1987; Morgan-Jones et al., 1986).

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Aunque el interés en los endopatógenos ha sido poco por la búsqueda de antagonistas comercialmente viables; el potencial antagonista de los endoparásitos puede ser manejado. Las relaciones bioquímicas, parásitas y predadores con los nematodos han evolucionado entre los diferentes grupos de hongos del suelo (Gray, 1988). La función de estos hongos juega un papel en el control natural y también por el interés biológico y bioquímico asociado con los procesos de captura, penetración y digestión (Dackman et al., 1992; Barron, 1992). Las esporas de los hongos se han adaptado y especializado en la captura o penetración de los nematodos. Entre los hongos inferiores, las zoosporas móviles parecen tener tropismo positivo hacia los nematodos. La mayoría de las especies con zoosporas no móviles poseen propiedades adhesivas especiales para adherirse instantáneamente a las cutículas de los nematodos transeúntes. También parece ser buena evidencia que las hifas asimilativas o haustorios de los hongos predadores encontrados dentro del nematodo liberan un antibiótico que impide el desarrollo de microorganismos competidores en el nematodo capturado (Barron, 1977). El contenido de los cuerpos de los nematodos capturados es consumido solamente hasta que una cutícula llena de hifas asimilativas lisas, permanece. Existen aberturas naturales tales como la cavidad bucal, poro excretorio, vulva, y ano, a través de las cuales microorganismos secundarios pueden introducirse. No obstante, los organismos competidores rara vez se desarrollan en los nematodos capturados en las trampas de hifas de la mayoría de las especies de hongos predadores.

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Los conidios de los hongos predadores de nematodos son de mayor tamaño que la mayoría de saprofitos del suelo y tienen abundantes reservas de nutrientes que pueden ser utilizados para producir inmediatamente una o más trampas de las cuales los hongos dependerán para así alimentarse y desarrollarse en un medio predatorio. Muchas especies tienen conidios que no toleran la desecación y por lo tanto no son el escenario en el cual la mayoría de estos hongos sobrevive en condiciones adversas en el suelo, también parecen ser fácilmente disueltas o destruidas por acción de las lisinas, aparentemente los conidios proporcionan un método de propagación a más corto plazo y podría ser la manera en que el hongo puede convenientemente, cambiar de modo nutricional predatorio a saprofítico o viceversa. Los hongos mas estudiados han sido los que se presentan en larvas; Barron (1977) registró 19 especies de hongos predadores y 19 de hongos endoparásitos (cuadro 2). Cuadro 2. Hongos predatores y endoparásitos de larvas de nematodos (Barron, 1977). Predatores

Endoparásitos

Arthrobotrys anchonia A. arthrobotryoides A. conoides A. dactyloides A. fragans A. musiformis A. oligospora Dactilaria candida D. haptospora D. megalospora D. thaumasia D. brochopaga Dactylella bembicodes D. cionopaga D. gephyropaga Nematoctonus campylosporus N. concurrens N. haptocladus N. robustus

Acrostalagmus goniodes A. obocatus A. zeosporus Cephalosporium balanoides Gonimochaete horridula Haptoglossa heterospora Harposporium anguillulae H. baculiforme H. crassum H. diceraeum H. helicoides H. sicyodes Meria coniospora Nematoctonus leiosporus N. leptosporus N. pachysporus N. tylosporus Paecilomyces coccospora Verticillium sphaerosporum

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2.7.3. Productores de toxinas Son hongos que se desarrollan dentro de los tejidos de las plantas, como las endomicorrizas, y manifiestan tener influencia en la relación de parasitismo para nematodos endoparásitos sedentarios y migratorios. 2.7.4. Hongos facultativos antagonistas de nematodos Los hongos que infectan a los huevos de nematodos parásitos de plantas han sido clasificados como patógenos facultativos, u hongos facultativos oportunistas (Morgan-Jones y Rodríguez-Kabana, 1985; Sikora et al., 1990). Muchos hongos colonizadores de quistes y huevos de nematodos, también se han estudiado a nivel de laboratorio e invernadero, y en menor medida en pruebas experimentales de campo. (Jatala, 1986; Kerry, 1990a; Morgan-Jones y Rodríguez Kabana, 1988; Nicolay y Sikora 1989; Roessner, 1987; Schuster y Sikora 1992a; Sikora et al., 1990; Uziel y Sikora, 1992). El manejo de saprofitos facultativos es más complicado en el ecosistema del suelo porque son parásitos obligados, los saprofitos no dependen de los nematodos como una fuente de nutrientes. Obstáculos adicionales son el manejo, insuficiente conocimiento de la etiología, biología de muchos patógenos y los bajos métodos convenientes para determinar como manipular los efectos y sus niveles del potencial antagonista (Nicolay y Sikora, 1991; Jatala, 1986; Kerry, 1987).

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2.7.5. Hongos parásitos de huevos, hembras y quistes El descubrimiento de hongos parásitos en los huevos de nematodos parásitos de plantas ha sido reciente. Barron (1977) consideró que solo Rhopalomyces elegans (Corda) era un parásito de huevos declarado; sin embargo, este nunca ha sido relacionado con los huevos de nematodos plaga. Los huevos y quistes de nematodos de Heterodera spp. debido a su importancia como principales parásitos de plantas, han sido frecuentemente examinados y ocasionalmente buscados para ser infestados. La viabilidad de los huevos de Heterodera declina cuando el tiempo pasa y estos permanecen en el suelo, se sospecha que los hongos están implicados en esto. La mayoría de los hongos atacan a los huevos y parecen producir hifas internas bastante similares y solo pueden ser identificados después del aislamiento y la subsecuente esporulación (Kerry y De Leij, 1992). Las especies encontradas comúnmente asociadas con los quistes de Heterodera corresponden al género Exophiala spp., Fusarium spp., Gliocladium spp., Paecilomyces spp., Phoma spp. y Verticillium spp. (Dackman et al., 1992; Nigh et al., 1980). Goswami y Rumperhorst (1978) reportaron unos hongos no identificados junto con Fusarium oxysporum (Link) y F. solani (Mart) asociados con quistes de G. rostochiensis en Alemania Occidental, los cuales no fueron aislados de un cultivo puro: probablemente corresponden a Exophiala, posiblemente E. jeanselmei (Carmich.) E. mansonii (Castell) E. pisciplila (Mc Ginntis), los hongos fueron reportados por infectar varios patotipos de G. rostochiensis .

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Es importante hacer notar que Pseudoeurotium ovale y Humicola grisea (Traaen) también han sido reportados por encontrarse sobre quistes de H. glycines (Ichioche) (Gintis et al., 1983). Dos hongos zoosporicos los cuales son Catenaria auxiliaris (Sorokin), y Nemathophora gynophila (Kerry) Kerry y Crump no han sido encontrados en laboratorio en poblaciones de G. pallida. Las hembras adultas de nematodos parásitos de plantas son objeto de infección por hongos facultativos y parásitos obligados. De los parásitos obligados más importantes esta N. gynophila que parásita quistes de nematodos de Heterodera la densidad de N. gynophila pudo establecerse por los restos de la cosecha, manteniendo el incremento y la disponibilidad de hembras adultas en el suelo (Kerry, 1987). La patogenicidad más registrada ha sido en H. avenae y la patogenicidad del hongo no se extiende para G. rostochiensis (Jones, 1976; Kerry y Crump, 1980; Kerry, 1990b). En el caso de el parasitismo obligado tiene límites, las prácticas y el manejo de sistemas de cultivos favorecieron al nematodo. Aún cuando en Europa se realizan continuamente rotaciones de cultivos, la mezcla de Heterodera schachtii y H. avenae es común, ambos nematodos son hospederos, y los parásitos deben aumentar si las rotaciones de los cultivos han sido desarrollados con cierta tolerancia. En algunas rotaciones la irrigación puede ser usada para incrementar la actividad de las zoosporas que infectan a la hembra. Los parásitos facultativos de hembras pueden ser manejados efectivamente con una correcta integración de nematicidas, cultivos tolerantes y rotaciones de cultivos cortos. Estos componentes combinados pueden tener un control efectivo sobre la primera generación de H. schachtii con Verticillium chlamydosporium (Goddard) y la segunda generación con Cylidrocarpon destructans (Woll.) (Crump, 1989; 1991; Yu O y Coosemans, 1998).

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Verticillium chamydosporium

ha sido recientemente seleccionado por ser

competente en la rizosfera (De Leij y Kerry, 1991). Esta afinidad por las raíces pudo ser utilizada para intensificar el control sobre las hembras. La selección del cultivo y la manipulación, tratamientos físicos y biológicos del hospedero son factores que pueden incrementar la colonización y control en la rizosfera. La relación de los hongos con la patología del quiste fue reexaminado por Tribe (1980), quien enlisto a V. chlamydosporium y otros “hongos contorsionistas” no esporuladores. Como resultado de sus estudios Tribe (1989) encontró a C. destructans en quistes de Heterodera schachtii en Inglaterra y Alemania. Tribe, discutió también la relación de un número relativamente común de hongos en el suelo, que se reportan frecuentemente por estar en asociación con los quistes de Heterodera. Analizó 112 poblaciones de H. schachtii de varios países, un poco más de un cuarto de esta población constaba de hembras y quistes tomados de las raíces. En términos generales, el 14% de todos los quistes tomados del suelo estaban enfermos, sin embargo, en monocultivos de remolacha azucarera poco más del 50% estuvieron enfermos y observó una gran viabilidad entre las muestras con algunos que no contenían ningún quiste enfermo. Las hembras tomadas de las raíces tenían mas o menos porcentajes similares de ataque de hongos, pero fueron infestados por parásitos específicos en Catenaria auxiliaris y algunos de los parásitos de huevos ya mencionados estuvieron involucrados. Tribe reconoció dos clases de hongos en quistes y huevos, la primera se presenta en la raíz del hospedante entre las hembras y quistes jóvenes, la segunda en quistes en el suelo durante un largo periodo de tiempo.

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Muchos hongos que habitan el suelo colonizan constantemente quistes de Heterodera, sin embargo no se tiene una percepción en el control e influencia sobre la población (Morgan-Jones y Rodríguez-Kabana, 1988). Del pequeño y selecto grupo que son los patógenos de nematodos enquistados, Verticillium spp. es uno de los más importantes; más especies en este género, se han registrado ocurriendo en quistes y en huevos de Globodera, Heterodera y Meloidogyne (Morgan-Jones y Rodriguez-Kabana, 1988). Godoy et al. 1983, examinó in vitro 14 especies de Verticillium, sobre huevos de Meloidogyne arenaria (Ichonohe) los parásitos de huevos más efectivos fueron V. leamellicola y V. leptobactrum. Verticillium chlamydosporium es un importante parásito de quistes (Kerry y Crump, 1991); y es una de las principales causas de la disminución del número de quistes de nematodos de cereales (Schennk y Hinson, 1997). Coloniza frecuentemente a las hembras y al nematodo enquistado y reduce su fertilidad, dando paso a pequeños quistes conteniendo pocos huevos saludables (Kerry, 1990b; Schuster et al., 1992b). Algunas especies del género Paecilomyces, que penetra la cutícula de la cáscara del huevo por medio de hifas, produciendo un crecimiento ó hinchazón; por medio de un apresorio, se distribuye totalmente en el contenido del huevo; los mecanismos que se consideren para la habilidad del hongo pueden ser, primero una alteración enzimática que afecta la permeabilidad del huevo incluso causar desordenes fisiológicos antes de la penetración de la hifa, y segundo, toxinas fungosas, las cuales podrían afectar los huevos deteriorándolos y finalmente matar la larva. Paecilomyces nostocoides morfológicamente similar a P. lilacinus ha demostrado ser capaz de colonizar huevos de H. zeae in vitro (Godoy et al., 1983). Un antibiótico péptido puede ser responsable para la exitosa habilidad saprofitica del hongo (Davide y Zorrilla, 1995). P. lilacinus se ha encontrado provocando desordenes fisiológicos, que conducen a un crecimiento y maduración vacilante de etapas juveniles. Por lo tanto, es capaz de mantener contacto

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con nematodos parásitos de plantas por el establecimiento del mismo en las especies de nematodos de la raíz, pero ese comportamiento de colonización requiere confirmarse en un ambiente más natural. Hirsutella rhossiliensis (Minter y Brady) también ha sido reportado como un parásito común en el segundo estado juvenil de Globodera rostochiensis en Holanda (Velvis y Kamp, 1995). El valor de H. rhossiliensis radica en su capacidad de infestar nematodos

parásitos

de

plantas

como

Globodera,

Heterodera,

Meloidogyne,

Pratylenchus y Datylenchus , también parásita nematodos como H. schachtii (Jaffee et al., 1991) y otros nematodos parásitos más o menos específicos (Núñez-Fernández, 1992; Timper y Brodie, 1993; Jaffee et al., 1994). Hasta la mitad de la década de los setenta, no se tenían registros de hongos que parasitaran a quistes de G. rostochiensis, y se llegó a plantear que no tenía antagonistas fungosos en suelos agrícolas de regiones templadas como en Inglaterra, (Willcox y Tribe, 1974; Kerry y Crump, 1991), lo anterior debido a la reducida apertura del cono vulvar y la presencia de una capa de cutícula adicional que funcionan como barreras para la penetración de los hongos parásitos y depredadores (Tribe, 1980). 2.7.6. Distribución de hongos parásitos de nematodos Con los estudios realizados en muchas áreas del mundo se ha comprobado que las especies conocidas de los hongos endoparásitos, depredadores de nematodos son cosmopolitas. Lo que ahora se requiere con respecto a la distribución son investigaciones sobre: las relaciones de varías especies con los factores bióticos y abióticos en el suelo, efectos de cosecha, diferentes tipos de suelo y microhábitats. Se han observado algunas diferencias en la distribución vertical en el suelo; sin embargo, la mayoría de las especies parecen acontecer en las capas superiores de cualquier tipo de suelo (Kerry y De Leij, 1992).

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Algunos hongos depredadores asemejan ser organismos que habitan la rizósfera, mientras que otros pueden ser clasificados como no-rizósferos. Las relaciones con las plantas rizósferas podrían ser aspectos importantes de las capacidades de control biológico de dichos hongos. Las especies que suceden en la rizósfera pueden estar mejor situados para influir en las poblaciones de nematodos parásitos de plantas. Por

experiencia,

Arthrobotrys

dactyloides,

Dactylaria

brochopaga,

Monacrosporium ellipsosporum, y M. gephyropagum, que se encuentran entre las especies con capacidades saprofíticas restringidas, están todas estrechamente relacionadas con raíces de plantas muy consistentes y, por lo tanto, se encuentran en una posición favorable para atrapar los nematodos parásitos de plantas. Un resumen de los hongos encontrados sobre diferentes especies de nematodos parasitando hembras, huevos y quistes se presenta en el cuadro 3. En particular sobre las especies de G. pallida y G. rostochiensis se encontraron 28 especies en Perú, considerado como centro de origen (cuadro 3).

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Cuadro 3. Reportes de hongos parásitos de hembras, huevos y quistes de nematodos en diferentes regiones en el mundo. NEMATODOS

HONGOS PARASITOS

INTERACCIÓN

Heterodera avenae

Verticillium

Endoparásito

chlamydosporium

--Endoparásito ------Parásito de huevos Endoparásito

Microdochium bolleyi Catenaria auxiliaris Hongos no identificados Bispora spp. Periconia macroaphoneas Cylindrocarpon destructans Nematophthora gynophila Heterodera schachtii

Cylindrocarpon destructans

Endoparásito y parásito de huevos Endoparásito Parásito de huevos Parásito de huevos y hembras Endoparásito --------

Verticillium Chlamydosporium Acremonium strictum Fusarium oxysporum Caternaria auxiliaris Phialphora malorum Heterodera glycines

Heterodera

Parásito de huevos Parásito de huevos Parásito de huevos

Acremonium strictum Fusarium oxysporum Fusarium solani Phoma sp Exophiala pleociphila Stegonospora heteroderae Paecilomyces lilacunus mediterránea Cyliindrocarpon destructans

--------Parásito de huevos Parásito de huevos Parásito de huevos

AUTOR Willcox y Tribe (1980); Kerry (1990); Tribe (1980); Stirling y Kerry (1983) de Hoog y Hermanides-Nijhof (1977) Stirling y Kerry (1983) Keny (1990) Rogers (1987) Kerty (1990) Kerry y Crump (1980) Willcox y Tribe (1980) Bursnall y Tribe (1974) Nigh et al.( 1980)

Tribe (1980) Morgan-Jones y Rodríguez Kabana(1981;1984

Gintìs (1983); Cabanillas et al. (1989) Vovlas y Frisullo (1983)

Heterodera avanae H. cajani, H, graminis H. mothi, H. zeae

Catenaria auxiliaris C. vermicola

Endoparásito Endoparásito

Sharma y Swarup (1988)

Globodera rostochiensis Globodera rostochiensis y G. pallida

Quistes no enfermos Aspergillus sydiwii Cladosporium cladosporoides Cylindrocarpon destructans C. didymun C. gracile Drechslera australiensis Exophiala pisciphila Fusarium. oxysporum F. semitectum F. solani, F. moniliforme Gliocladium catenulatum G. roseum Humicola grisea Paecilomyces lilacinus P. variottii Penicillium chrysogenum P. restrictum P. rubrum Phoma americana Ramichloridium schulzeri Scolecobasidium tschawytschae Stachybotrys chartarum Trichocladium asperum Trichoderma harzianum T. longibrachiatum Ulocladium atrum

-----------------Parásito de huevos

Willcox y Tribe (1980) Morgan-Jones et al. (1986)

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III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Ubicación y descripción del área de estudio La presente investigación se llevó en los laboratorios de la Universidad Veracruzana y en de Fitopatología y control biológico del Instituto de Ecología en Xalapa, Veracruz. Con muestras de suelo tomadas de cultivos de papa en seis localidades: Los Pescados, Tembladeras, El Conejo, Rancho Nuevo, Escobillo y Los Altos de la Región del Cofre de Perote, ubicada en la parte central montañosa del Estado de Veracruz, el cual tiene una altitud de hasta 4,282 msnm. La región esta ubicada entre los 19º19’30’’-19º48’58’’ de latitud Norte y 01º40’00’’-02º24’58’’ de longitud Este. Comprende los municipios de Ayahualulco, Perote y Xico, en la vertiente oriental de la Sierra Madre Oriental (Medina y Angulo, 1990). (Fig. 7). 3.1.1. Clima El clima en el área de estudio se clasifica como C(W2”)B que varía

desde

templado subhúmedo a semifrío; que tiene una temperatura media anual entre 5 y 12ºC, con un verano fresco y subhúmedo, con lluvias en verano; la precipitación media anual es de 600 mm (Medina y Angulo, 1990). 3.1.2. Geología El Cofre de Perote es un volcán cuyo origen data posiblemente del Mioceno o Plioceno, formado en un solo periodo de erupciones y dependiendo de un foco volcánico importante. Hay rocas cretácicas y sobre las mismas se encuentra un grueso manto de material cinerítico de rocas riolíticas. El material madre de la zona de estudio es de la Era Cenozoica, Periodo cuaternario y la roca es ígnea extrusiva básica (INEGI, 1990a).

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Fig. 7 Ubicación geográfica de la zona de estudio.

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3.1.3. Suelos Predominan los andosoles húmicos, mólicos y feozem haplico y también se encuentran zonas cuya unidad principal es regosol calcáreo y luvisol crómico. (INEGI, 1990b). 3.1.4. Hidrografía Debido a las condiciones climáticas, topográficas y latitudinales en las que se encuentra la montaña, en ella se originan varias corrientes de agua, principalmente en la parte sur y oriental (ladera húmeda) que en ocasiones se convierten en grandes ríos y afluentes. Entre los principales ríos se encuentran el río Actopan, el cual se origina a una altitud de 3,000 msnm, cuya parte inicial de su recorrido se le conoce como río Sedeño. 3.1.5. Topografía En la región del Cofre de Perote se presentan acentuados cambios de altitud que van desde 1200 a 4240 msnm. Como consecuencia de los derrames del volcán sobre una porción de la Sierra Madre Oriental se ha conformado un paisaje abrupto con pendientes que varían de 5-30°. 3.1.6. Vegetación La vegetación original del área son: pinares (Pinus hartwegii, P. patula, P. ayacahuite), bosque de Oyamel (Abies religiosa y A. hickelii), bosques de encinos (Quercus crassifolia y Q. laurina), bosques caducifolios y sus respectivos ecotonos generalmente se desarrollan sobre suelos de tipo andosol (Narave, 1985). El bosque de oyamel A. religiosa se encuentra como un cinturón que rodea al Cofre de Perote de la cota de los 3000-3500 msnm, pero debido a que se desarrolla

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sobre suelos apropiados para el cultivo de la papa, Solanum tuberosum, se han talado grandes áreas para el cultivo. En la actualidad solo se encuentran manchones representativos del bosque alrededor de la montaña, mejor conservados hacia el noroeste, al sur de la congregación del Escobillo y en los alrededores de El Conejo. Conejos. Esta comunidad se localiza a una altura de 3140 msnm. El clima es subhúmedo semifrío; cuya temperatura media anual varía entre 5 y 12º C y la más fría se presenta entre -3 y 18º C; en un verano fresco con lluvias. La vegetación original dominante es Abies spp. (oyamel); el uso del suelo de los predios es agrícola y de pastoreo; el tamaño de la superficie destinada a uso agropecuario no es mayor de dos hectáreas; la actividad pecuaria esta principalmente destinada a la explotación ovina. Las labores culturales son realizadas con yunta (barbecho y surcado) y con azadón (limpias y atierres); la rotación de cultivos generalmente es papa, avena y en pequeña escala haba y ajo. Los factores limitantes en el cultivo de papa son las heladas y el tizón tardío causado por el hongo Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. El consumo de plaguicidas es considerado como moderado. Tembladeras. Se localiza a 3110 msnm; en comparación con los otros sitios de estudio son los suelos más húmedos; el clima predominante es frío húmedo; con una topografía irregular con inclinación que varía de 15 a 25º de pendiente. En el sitio de estudio el cultivo se encuentra intercalado con árboles de Abies spp. (oyamel). La variedad de papa más sembrada es San José, en esta localidad solo cultivan papa (monocultivo) y después de la cosecha se utiliza para pastoreo de ovejas; las labores culturales se realizan con arado de yunta y con azadón. Las enfermedades de la papa más importantes son el tizón tardío causado por el hongo Phytophthora infestans y la pudrición del tubérculo causado por el mixomiceto Spongosptera subterránea (Wall. Lag.). El consumo de agroquímicos es considerado alto. Rancho Nuevo. Se localiza a 3040 msnm; son frecuentes los vientos de suaves a moderados; los suelos presentan alta erosión con pendientes aproximadas de 20° con

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textura arenosa y alta pedregocidad. La vegetación arbórea que se localiza en los límites de los predios son pinos y encinos; aunque son considerados suelos pobres, ácidos y con poca fertilidad, se cultiva papa y se rota el cultivo con maíz o haba. El consumo de plaguicidas se considera moderado. Escobillo. Esta comunidad se encuentra a 3040 msnm; con presencia de vientos de leves a moderados; con buena iluminación solar; la característica de los suelos es su textura arenosa con alta pedregocidad y presentan fuerte erosión. La vegetación colindante es bosque de pino-encino; la rotación de cultivos posterior a papa es maíz o haba. Pescados. Esta localidad se ubica a los 2980 msnm; y los terrenos destinados a la agricultura en general tienen una topografía plana, son suelos con buen drenaje. El tipo de clima corresponde a un templado húmedo con lluvias casi todo el año; la vegetación dominante son especies de pinos. Los productores cultivan variedades de papas blancas y de color, como son: Alfa, Atlantic, Atzimba, Diamante, Gema, Gigant, Marciana y San José; la secuencia en la rotación de cultivos es papa, haba o maíz. En lo general los productores aplican elevadas dosis de agroquímicos. Los Altos. En esta comunidad el cultivo de papa se siembra desde hace mas de 50 años, se ubica a 2800 msnm. Aunque son considerados suelos pobres con poca fertilidad en ellos se puede cultivar papa, maíz y haba. La textura del suelo es franco arenosa con buen drenaje, son suelos con severa erosión eólica. La vegetación en este sitio esta severamente afectada, debido al cambio de uso de suelo de bosque a uso agrícola; las variedades de papa más utilizadas son Alfa, Gema y San José y el factor limitante es la falta de humedad. La utilización de fertilizantes y plaguicidas es elevada.

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3.1.7. Toma de muestras Para llevar acabo este trabajo de investigación se programo el siguiente diagrama de flujo de materiales y métodos (Fig. 8). En cada una de las localidades y de suelos cultivado con papa, se tomaron cinco submuestras (1 kg cada/una), distribuidas en forma de “cinco de oros”, durante el mes de octubre del año 2000. Las submuestras se tomaron de los primeros 20 cm de profundidad, con pala recta, eliminando la materia orgánica superficial. Cada muestra se etiquetó con los datos de la localidad, municipio, predio, nombre del productor, variedad de papa y fecha de colecta. En el laboratorio, las submuestras de cada localidad, se extendieron en charolas de poliuretano para su secado en la sombra. Posteriormente las submuestras se homogeneizaron y se obtuvo una sola muestra de cada localidad. Una parte del suelo se utilizó para la evaluación de la materia orgánica y el pH, la otra parte de la muestra sirvió para la extracción de los quistes del nematodo dorado de la papa. 3.1.8. Extracción de quistes La extracción de quistes se realizó por el método de Flotador de Fenwick (1940), el cual consiste, en vertir la muestra de suelo por un tamiz de 20 mallas/cm 2, para eliminar terrones y piedras al embudo, el cual debe de tener agua a dos tercios de su capacidad; con ayuda de agua corriente se provoca la salida de material que por su bajo peso flota, el cual es recuperado en un tamiz de 60 mallas/cm 2 para materia orgánica y 125 mallas/cm 2 para los quistes de G. rostochiensis. El material obtenido en el tamiz de 125 mallas/cm 2 se vierte a un vaso de precipitado el cual en su interior contiene una tira de papel filtro humedecido procurando no desprender la tira de papel. Finalmente se agrega un poco de detergente en polvo, para romper la tensión superficial y de esta manera los quistes se adhieran al papel filtro; una vez que el material se adhirió al papel, este se saca y se coloca en una tapa de caja Petri para observarla al microscopio estereoscopio (Fenwick, 1940).

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3.1.9. Densidad de la población de quistes Con el propósito de determinar la importancia del nematodo, G. rostochiensis, en la zona productora de papa de la región Cofre de Perote, Veracruz, México; de los quistes obtenidos y con ayuda de un microscopio estereoscopio, se cuantificaron y se expresaron, como número de quistes/kg de suelo; en cada localidad de estudio. De acuerdo a las condiciones morfológicas que presentaban los quistes obtenidos fueron separados en tres categorías con base en su apariencia física: quistes jóvenes (QJ): aquellos quistes con lozanía, al microscopio estereoscopio presentan brillo y se ve la masa de huevos; quistes maduros (QM): quistes sin lozanía, no tienen brillo y la masa de huevos presentaban diferentes manchas de color café oscuro-negro; quistes dañados (QD): aquellos cuyo corión estaba afectado por causas no determinadas Roessner, (1987). Con el propósito de determinar si la densidad de población de G. rostochiensis, es significativa entre las localidades estudiadas, a los datos de quistes, se les realizó un análisis no paramétrico, al aplicarles la Prueba “G” de Bondad de Ajuste con Repetición (Robert et al., 1995). 3.2. Aislamiento de hongos asociados a quistes Para cumplir con el primer objetivo (aislar e identificar hongos nativos parásitos de quistes de G. rostochiensis en la región del Cofre de Perote, Veracruz) se procedió de la siguiente manera: una vez seleccionados los quistes aparentemente jóvenes y sanos de cada localidad, se tomó un grupo de 100 quistes, se desinfectaron primero con hipoclorito de sodio al 3% y después con alcohol al 70%, ambos durante un minuto, posteriormente se lavaron tres veces con agua destilada estéril y se colocaron en papel estéril para secarlos. La metodología de lavado aquí usada difiere con la de MorganJones et al. (1986), ya que ellos desinfectaron la superficie de los quistes únicamente con alcohol al 70%. Cada quiste fue colocado en cajas Petri (56x15 mm) con placas de

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agar con dextrosa y papa (PDA) a la que se le agregó un antibiótico (tetraciclina al 5%) para evitar el crecimiento de bacterias Las cajas fueron selladas con cinta parafilm, se etiquetaron por localidad de estudio y numeradas del uno al 100 (n=100), de manera que se obtuvo una muestra total de 600 quistes de G. rostochiensis y se mantuvieron a temperatura ambiente 21+ 2°C. Los quistes fueron examinados diariamente para detectar la presencia de micelio. Aquellos quistes que presentaron desarrollo de micelio, se utilizaron para generar los cultivos puros en placas de PDA, para llevar cabo la determinación de los hongos y reproducirlos para su conservación. 3.2.1. Identificación de hongos Para la identificación taxonómica de los hongos se tomaron en cuenta las características morfológicas de las cepas: forma, posición, color y tamaño de sus estructuras (conidióforos, células conidiógenas y conidios) y se utilizaron claves especializadas (Ellis, 1971; Gams, 1971; Samson, 1974). Para la determinación de los colores de los micelios de las cepas aisladas se utilizó la carta de colores de Methuen (Kornerup y Wanscher, 1989). 3.2.2. Conservación de los aislamientos Las cepas obtenidas en cultivo puro se inocularon en granos de sorgo esterilizado, el cual fue colocado previamente en crioviales con capacidad de 2 ml. Una vez desarrollados los micelios sobre los granos de sorgo, se prepararon para su liofilización e incorporarlos al cepario del Instituto de Ecología.

49

3.3. Bioensayo del proceso de infección de hongos sobre quistes de Globodera rostochiensis Con el propósito de verificar el proceso de infección de algunos de los hongos aislados de quistes en este trabajo y con base en la literatura de géneros de hongos que tienen antecedentes nematófagos, se seleccionaron tres especies: Acremonium incrustatum Gams, Paecilomyces carneus Duché y Phialophora malorum Mc Colloch. 3.3.1. Preparación del inóculo Las cepas antes mencionadas se reprodujeron sobre placas de PDA, después de cuatro semanas de inoculadas, se preparó una suspensión de esporas (10ml) de cada una de las especies con agua destilada estéril al 0.01% de Tween 80. El conteo de esporas se hizo utilizando el hemacitometro de Neubauer. La suspensión de esporas utilizada fue de 1 X 106 de A. incrustatum, P. carneus y P. malorum como lo indican Crump y Irving (1992). 3.3.2. Obtención de quistes sanos Muestras de suelo de cada sitio de estudio fueron llevadas al laboratorio y se esterilizaron en autoclave durante más de 1 hr, una vez aireada se colocaron en 40 macetas de plástico con capacidad de un kg en las cuales se sembraron tubérculos de papas variedad San José, previamente lavadas y desinfectadas con hipoclorito de sodio al 3%. Al momento de la siembra las plantas de papas se inocularon en las macetas 20 quistes jóvenes. Todas las macetas se mantuvieron en un invernadero fijo, construido con tubo de acero de media pulgada y una cubierta de plástico calibre 16, en la región de estudio, con el fin de proteger las plantas de posibles heladas y excesos de humedad, durante 6 meses que comprendió el ciclo vegetativo de la planta. Los quistes fueron extraídos de las macetas, cuando la planta terminó su ciclo vegetativo. Los quistes se extrajeron con la técnica de Flotador de Fenwick antes descrita y se cuantificaron, posteriormente se depositaron en viales.

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3.3.3. Inoculación de los quistes de Globodera rostochiensis Los quistes sanos obtenidos de las macetas se lavaron con hipoclorito de sodio al 3% durante 1 minuto y se enjuagaron 5 veces con agua destilada estéril. Una vez desinfectados los quistes, se prepararon para cada especie de hongo seis cajas Petri con papel filtro esterilizado, en cada caja se colocaron seis grupos (cinco quistes/grupo) conjuntándose un total de 30 quistes por caja. Los quistes fueron inoculados asperjando 1ml de la suspensión de esporas con un atomizador manual de gota fina. Para cada hongo inoculado se colocó un testigo que fue asperjado con agua destilada estéril. Las cajas Petri se mantuvieron a temperatura ambiente (20±3°C). El proceso de infección se detuvo con lactofenol a las 12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas después de la inoculación (Crump y Irving, 1992), se observaron al microscopio compuesto y al microscopio electrónico de barrido con la técnica de oro paladio. 3.3.4. Pruebas de patogenicidad Con el propósito de determinar el efecto parasitico de los hongos sobre los quistes de G. rostochiensis se procedió de la siguiente manera: por cada hongo seleccionado se utilizaron cinco cajas Petri conteniendo 20 quistes sanos cada caja. A los quistes se les aplicó la concentración de esporas antes mencionada. Para observar el porcentaje de esporulación se preparó por cada hongo de prueba igual número de cajas con quistes que servirían como testigos. Para este experimento los quistes inoculados y los quistes testigos se mantuvieron en observación durante 30 días, registrando que los quistes presentaran desarrollo de micelio y esporulación. La evaluación se realizó diariamente para obtener el porcentaje y presencia de la esporulación durante un mes. El diseño experimental

51

utilizado fue completamente al azar con cuatro tratamientos y cinco repeticiones, haciendo un total de 15 unidades experimentales; los datos obtenidos, porcentajes, se les hizo la transformación al Arco-sen de la √x, y se lea hizo el análisis de varianza, ANOVA, y pruebas de medias de Tukey con 0.05 de probabilidad. Toma de Muestras

Extracción de los quistes

Análisis de Suelos

Materia Orgánica

pH

Número de quistes de G. rostochiensis /kg de suelo

Clasificación de los quistes

Extracción de hongos

Aislamiento de hongos Cultivos puros

Inoculación de macetas Obtención de quistes sanos Bioensayo Proceso de infección

Pruebas de Patogenicidad

Determinación de hongos

Selección de hongos

Fig. 8. Diagrama de flujo de Materiales y Métodos IV.- RESULTADOS 4.1. Densidad de la población de Globodera rostochiensis en las localidades de estudio

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La densidad de población de quistes G. rostochiensis fue muy alta en todo los sitios estudiados. La cantidad obtenida de quistes totales de quistes/kg de suelo en cada localidad fueron los siguientes: Conejos 1220, Tembladeras

2216, Escobillo 360,

Rancho Nuevo 1856, Pescados 1656, Los Altos 1140. Estas cantidades son superiores al límite de tolerancia considerado por EPPO (1997) que indica que hasta con una densidad de 40 quistes/kg de suelo no hay pérdidas o afectación en el desarrollo del cultivo (Fig. 9). La Prueba “G” de Bondad de Ajuste con Repetición mostró, que la densidad de población en cada localidad es significativamente diferente (Cuadro 4).

No. de quistes/kg. de suelo

2500

2000

1500

1000

500

AL TO S LO S

S O AD SC PE

LO

S

R .N U EV O

CO NE JO TE S M BL AD ER AS ES C O BI LL O

0

Fig. 9. Total de quistes obtenidos por kilogramo de suelo por cada localidad de estudio en el Cofre de Perote. Cuadro 4. Análisis de los datos de densidad de población de quistes en las localidades de estudio, con la Prueba ”G” de Bondad de Ajuste con Repetición. PRUEBA Datos agrupados Heterogeneidad TOTAL

g. l. 2 10 12

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G. 775.556* 185.8069* 961.3629

* Significativo x 20.05 (3-1)= X 20.05 (2)= 5.9915

De acuerdo a las condiciones físicas que presentaron los quistes, el número de quistes dañados (QD) fue mayor en todas la localidades (Figura 10), y el porcentaje varió de 40.6% a 50.3% (Cuadro 5). El número de quistes jóvenes (QJ) fue mayor en las localidades de Escobillo y Los Altos, que la de los quistes maduros (QM), con valores de 99 y 300, respecto a 87 y 266 respectivamente, (Figura 10); mientras que el número de quistes maduros (QM), en las localidades de Tembladeras, Pescados, Rancho nuevo y Conejos fue mayor que la de los jóvenes, con valores de 696, 557, 468 y 331, respecto a 620, 228, 451 y 317, respectivamente (Figura 10).

1000

600

400

200

LO S

AL TO S

S O AD SC PE

R .N U EV O

BI O C ES

TE

M

BL

AD

ER

LL

AS

O

0

CO NE JO S

No. de quistes/kg. de suelo

800

QJ Quistes Jóvenes

QM Quistes Maduros

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QD Quistes Dañados

Fig. 10. Clasificación de los quistes obtenidos de acuerdo a condiciones físicas por localidad. Cuadro 5. Porcentaje de quistes en suelo en las localidades estudiadas, separadas en categorías de acuerdo a su condición física. Comunidad

Quistes Jóvenes %

Quistes Maduros %

Quistes Dañados %

Conejos Tembladeras Escobillo R. Nuevo Pescados Los Altos

25.98 27.97 27.50 24.29 13.76 26.31

27.13 31.40 24.16 25.21 33.63 23.33

46.88 40.61 48.33 50.48 52.59 50.35

El análisis de los datos mostró que existen diferencias significativas entre todas las localidades y, que son independientes (Cuadro 6). Cuadro 6. Análisis de los datos de densidad de población de quistes en las localidades de estudio, con la Prueba ”G” de Bondad de Ajuste con Repetición. Localidades g.l. G Conejos Tembladeras Escobillo R. Nuevo Pescados Los Altos TOTAL * Significativo x20.05 (3-1)= X20.05 (2)= 5.9915

2 2 2 2 2 2 12

4.2. Análisis de suelo

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96.055* 55.6516* 35.2618* 231.622* 401.472* 141.914* 961.9764

De las muestras de suelo de las localidades de estudio se determinaron los siguientes niveles de pH y contenido de materia orgánica (M O). El nivel de pH en los suelos de estudio varió de 4.54 a 6.0 en las localidades de Los Pescados y Los Altos respectivamente. (Cuadro 7). El contenido de materia orgánica de los suelos varió de 1.47% en la localidad de Los Altos y 13.80% en Tembladeras (Cuadro 7). Cuadro 7. Niveles de pH y contenido de materia orgánica de las muestras de cada localidad. LOCALIDAD Conejos Tembladeras Escobillo Rancho Nuevo Los Pescados Los Altos

pH

MO

5.61 4.90 5.60 5.00 4.54 6.00

5.89 13.80 3.88 5.29 4.82 1.47

4.3. Correlación entre materia orgánica y densidad de quistes Para verificar si existe correlación entre la materia orgánica, ph y la cantidad total de quistes, quistes jóvenes, quistes maduros, quistes dañados (Quistes jóvenes, Quistes maduros, Quistes Dañados), de las seis localidades estudiadas se realizó mediante la prueba de correlación de Pearson del paquete estadístico SAS (1997). La Hipótesis planteada fue la siguiente: H0 : No existe relación entre la cantidad de materia orgánica, el pH, la cantidad total de quistes, quistes jóvenes, quistes maduros, quistes dañados en las seis localidades estudiadas. H1 : Existe relación entre la cantidad de materia orgánica, el pH, la cantidad total de quistes, quistes jóvenes, quistes maduros, quistes dañados en las seis localidades estudiadas.

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Los resultados obtenidos en la correlaciones nos indican que no hay correlación entre la cantidad de materia orgánica, el pH, la cantidad total de quistes, quistes jóvenes, quistes maduros, quistes dañados en las seis localidades estudiadas (Cuadro 8). Cuadro 8. Resultado de la correlación entre la cantidad de materia orgánica, el pH, la cantidad total de quistes, quistes jóvenes, quistes maduros, quistes dañados en las seis localidades estudiadas. Variable Variable Coeficiente probabilidad dependiente independiente de correlación Total quistes Materia orgánica 0.067104 0.1445 ns pH - 0.67642 0.1401 ns Quistes Jóvenes Materia orgánica 0.77391 0.0709 ns pH - 0.33985 0.5098 ns Quistes Maduros Materia orgánica 0.73506 0.0960 ns pH - 0.75246 0.0658 ns Quistes Dañado s Materia orgánica 0.46710 0.3503 ns pH - 0.711152 0.1128 ns ns= no significativo con una confiabilidad del 95%

4.4. Hongos aislados de los quistes de Globodera rostochiensis en la región Cofre de Perote La presencia de hongos en los quistes se manifestó en el 3.5% del total de la muestra (n=600 quistes). Se obtuvieron 21 cepas asociadas con los quistes. Una sola especie de hongos se encontró en cada una de los quistes con micelio. Los 21 hongos obtenidos de los quistes corresponden a 16 especies (Cuadro 9). Cuadro 9. Hongos nativos encontrados asociados a quistes jóvenes de G. rostochiensis en la región Cofre de Perote. Localidad de Estudio

Especie Aislada

CONEJOS

Chaetomidium sp. Cladosporium sp. (1)

TEMBLADERAS

Phialophora sp. (1)

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ESCOBILLO

Cladosporium sp. (2) Fusarium sp.

RANCHO NUEVO

Phialophora sp. (2) Phialophora malorum Kidd. *

LOS PESCADOS

Aspergillus sp. Paecilomyces carneus Duché* Trichocladium asperum Harz Paecilomyces carneus Duché* Drechslera sp. Pteroconium sp. Paecilomyces carneus Duché* Acremonium incrustatum Gams* Paecilomyces carneus Duché* Micelia sterilia

LOS ALTOS

Paecilomyces carneus Duché * Cladosporium sp. (3) Trichocladium asperum Harz Ulocladium atrum Preuss

* (géneros reportados como nematófagos) Las cepas numeradas (1) (2) (3) corresponden al mismo género pero diferente especie.

Es probable que las tres cepas de Cladosporium sp. correspondan a diferentes especies, ya que hay diferencia en el color del micelio de cada una; estas cepas se han marcado con diferentes números. En el caso de las cepas de Phialophora sp. la cepa de localidad de Tembladeras tiene micelio verde oliva, y la de Rancho Nuevo es color crema, ambos totalmente diferente a Phialophora malorum que es de color café-negro, por esta razón se han marcado con números diferentes. La especie con mayor frecuencia fue Paecilomyces carneus Duché (cinco cepas), seguida de Cladosporium sp. (tres cepas), Phialophora sp. (dos cepas) y Trichlocladium asperum Harz (dos cepas), de los demás hongos se obtuvo una cepa Acremonium incrustatum Gams, Aspergillus sp., Chetomidium sp., Drechslera sp., Fusarium sp.,

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Phialophora malorum Kidd, Pteroconium sp., y Ulocladum atrum. En el cuadro 10, se presenta la a clasificación taxonómica de los géneros de las especies obtenidas. Cuadro 10. Clasificación taxonómica de los hongos aislados de quistes de G rostochiensis en la región del Cofre de Perote. Clase Hyphomycetes

SUBDIVISIÓN DEUTEROMYCOTINA Subclase Orden Familia Monilialies Moniliaceae

Género Acremonium Aspergillus Paecilomyces Dematiaceae Pteroconium Cladosporium Drechslera Phialophora Trichocladium Ulocladium Turberculariaceae Fusarium

SUBDIVISIÓN ASCOMYCOTINA Clase Subclase Orden Familia Género Euascomycetes Pyrenomycetidae Chaetomiales Chaetomiaceae Chaetomidium 4.5. Proceso de infección de tres hongos aislados de quistes de Globodera rostochiensis Los tres hongos seleccionados para estudiar el proceso de infección parasitaron los quistes. Para hacer notar la diferencia entre los procesos de infección de las especies trabajadas se midieron las estructuras que los hongos iban formando tales como la longitud, anchura de los tubos germinativos y células conidiógenas. Acremonium incrustatum. Se observaron a las 12hrs de la inoculación algunas esporas sobre el corión que desarrollaron tubos germinativos de 2 x1 µm, pero la mayoría sin evidencia de tubos germinativos. Sin embargo, al observar la pared interna del quiste a las 24 hrs con el microscopio electrónico de barrido (MEB) tubos germinativos habían traspasado el corión (Figs. 11-12). Estos micelios se desarrollaron en los huevos de los quistes entre las 48 y 72 hrs (Figs. 13-14). En la pared externa se

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observaron a las 96 hrs, las hifas emergiendo desde el interior del mismo. Finalmente a las 120 hrs había hifas y conidióforos esporulando en el exterior del quiste (Figs. 15-16). Proceso de Infección de Acremonium incrustatum sobre quistes de G. rostochiensis

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Figs. 11-16: Acremonium incrustatum. 11: Esporas sobre el corión 12 hrs después de la inoculación 2,000x; 12: Tubos germinativos vistos en la parte interna del corión 24 hrs después de la inoculación 1,500x; 13: Tubos germinativos a las 48 hrs 1,500x; 14: Huevos con micelio a las 72 hrs 1,000x; 15: Micelio

61

saliendo del corión 96 hrs 1,000x; 16: Conidióforo emergiendo del corión 120 hrs 2,000x.

Paecilomyces carneus. Las esporas germinaron a las 12 hrs sobre los quistes, en general desarrollaron tubos germinativos cortos 2 X 1 µm (Fig. 17), así mismo en algunas esporas se observaron apresorios después de desarrollar un pequeño tubo germinativo. El tamaño de los tubos germinativos fue menor sobre los quistes que los observados provenientes de la suspensión de esporas sobrante (5 X2 µm). A las 24 hrs se continuó observando los apresorios, la mayoría de las esporas formaron hifas ramificadas de 46 X 3 µm; en esta etapa hubo mayor desarrollo micelial en la zonas de la boca y cono vulvar, que son aberturas naturales del quiste (Figs. 18-19). A las 48 hrs hubo mayor desarrollo micelial en la parte externa e interna del quiste. El micelio desarrollado en la parte media del quiste empezó a formar una célula conidiogena (fialide) de 10 X 3 µm a las 72 hrs (Fig. 20) y posteriormente se diferenciaron las estructuras reproductoras, se encontraron conidióforos con 3 fiálides de 20 X 3 µm ya estaban esporulando. En un corte transversal del quiste se pudo observar el desarrollo micelial en la masa de huevos así como en larvas que estaban apunto de eclosionar (Fig. 22). A las 96 hrs se manifestaron los siguientes cambios, la capa vitelina se separó, también se observó la vacuolización en la superficie de los huevos y el mucílago desapareció. Se observaron también cambios análogos en la cutícula de algunos huevos con larvas en estado J2. Las hifas endógenas en los huevos reemergieron pasando por ambos lados, en cuya superficie se encontraron esporas provenientes de conidióforos maduros. Los quistes se cubrieron de conidióforos maduros a las 120 hrs (Figs. 17-22). Con esta prueba queda comprobada la capacidad nematofaga de P. carneus.

62

Proceso de infección de Paecilomyces carneus sobre quistes de G. rostochiensis

Figs.17-22: Paecilomyces carneus. 17: Grupo de esporas germinando 12 hrs después de la inoculación 3,500x; 18: Esporas con tubos germinativos inmersos y superficiales 24 hrs después de la inoculación 1,500x; 19: Micelio desarrollado sobre el corión a las 72 hrs 500x; 20: Formación de fiálides y conidióforos esporulando a las 96 hrs 1,500x; 21: Cadenas de esporas sobre el corión 750X; 22:Huevos rodeados de micelio 100x.

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Phialophora malorum. Se encontraron pocas esporas que germinaron a las 12 hrs (Fig. 23); la mayoría de las esporas germinaron a las 48 hrs y se empezó a desarrollar micelio. Los quistes cambiaron de color de sus tonalidades de café claro y brillantes a café opaco ennegrecido a 72 hrs. Algunas esporas todavía estaban en proceso de germinación a las 96 hrs y las que habían germinado desarrollaban su micelio sobre el corión. El micelio invadió la masa de huevos a las 120 hrs. Después de este tiempo el micelio siguió desarrollándose en el interior y fuera del quiste, sin ser conspicuo. El crecimiento del micelio fue bastante lento; a los 18 días de haber sido inoculados se observó en la parte bucal y el cono vulvar, mayor desarrollo de micelio (Fig. 28). Se mantuvo en observación hasta los 28 días cuando los quistes estaban completamente negros por el color del micelio (Figs. 23-28).

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Proceso de infección de Phialophora malorum sobre quistes de G. rostochiensis

Figs. 23-28 Phialophora malorum. 23: Germinación de una espora 12 hrs después de la inoculación 3,500x; 24: Tubos germinativos 72 hrs 1,500x; 25: Micelio desarrollándose sobre el corión a las 96 hrs 750x; 26: Micelio sobre huevos 120 hrs después de la germinación 750x; 27: Parte interna del corión con micelio a los 18 días 750x; 28: Quiste cubierto de micelio a los 28 días.

65

4.6. Patogenicidad y esporulación de tres hongos sobre quistes de Globodera rostochiensis El ensayo de patogenicidad demostró que los tres hongos probados A. incrustatum, P. carneus y P. malorum lograron infectar a los quistes de G. rostochiensis. Los tres grupos de quistes utilizados como testigos se mantuvieron libres de los hongos

% Quistes con esporulación

probados (Fig. 29). Ningún hongo fue encontrado como contaminante sobre los quistes. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

4

7

11

14 Días

Acremonium incrustatum Paecilomyces carneus

18

22

30

Phialophora malorum Testigo

Fig. 29. Porcentaje de quistes infectados por hongos nematofagos. Para este trabajo el diseño experimental utilizado fue completamente al azar; quedando de la siguiente manera el concentrado de datos (cuadro 11). Cuadro 11. Análisis de varianza de la esporulación de hongos nativos presentada sobre quistes de Globodera rostochiensis. F.V. G. L. S.C. C.M. F Cal. Pr > F Tratamientos

2

392.933

196.466

Error Exp.

12

116.400

9.700

Total

14

509.333

R2 = 0.7713 66

CV= 23.3586

MSE= 3.114482

66

20.25

0.0001

La prueba de Tukey nos indicó que el desarrollo de Acremonium incrustatum y Paecilomyces carneus es similar pero difieren del desarrollo de Phialophora malorum (cuadro 12). Cuadro 12. Porcentajes de quistes de G. rostochiensis con la esporulación de hongos nativos inoculados. TRATAMIENTOS Acremonium incrustatum

X 19.0 a

Paecilomyces carneus

14.4 a

Phialophora malorum

6.6 b

Medias seguida de la misma literal son estadísticamente iguales. Tukey (P>0.05).

67

A. incrustatum. El 100% de los quistes fueron infectados. A los 7 días después de la inoculación, el hongo esporuló sobre el 35% de los quistes; a los 11 días el 61 % de los quistes estaban cubiertos por condióforos, aumentando a los 14 días a 64% y a los 18 días a 65%. La esporulación aumentó en el 82% a los 22 días, finalmente el 95% de los quistes estaban cubiertos a los 30 días (Figs. 33-35).

Figs. 30-35: Acremonium incrustatum. 30:Conidióforo y micelio sobre el corión 2,000x; 31: Huevo enrollado de micelio 500x; 32: Micelio interior del quiste 500x; 33: Quiste cubierto de micelio 100x; Testigos 34: Quiste sano 750x; 35: Huevos en el interior del quiste 500x.

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P. carneus. El 100% de los quistes inoculados, estuvo infectado por el hongo. La esporulación se observó en el 20% de los quistes a los siete días, posteriormente la esporulación aumentó lentamente a los 11 días a 32%, el 61% a los 14 días, el 63% a los 18 días, 66% a los 22 días y 72% a los 30 días (Figs. 36-41).

Figs. 36-41 Paecilomyces carneus. 36: Conidióforo 2,000x; 37: Cadenas de conidios y micelio sobre el quiste 750x; 38: Micelio sobre la masa de huevos 750x; 39:Quiste cubierto por micelio y conidióforos 150x; Testigos 40: Quiste sano 100x; 41: Huevos en el interior del quiste 500x.

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P. malorum. El micelio sobre los quistes inoculados con este hongo inició su desarrollo hasta los 11 días, la esporulación se presentó en 8% a los 22 días y 33% a los 30 días (Figs. 42-51).

Figs. 42-47 Phialophora malurum. 42: Grupo de esporas 1,500x; 43: Espora y micelio sobre el quiste 100x; 44: Micelio sobre el corión 200x; 45: Micelio en la masa de huevos 750x; 46: Micelio en la masa de huevos y corión 500x; 47: Quiste cubierto por micelio 150x.

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Pruebas de Patogenicidad de Phialophora malorum sobre quistes de G. rostochiensis

Figs. 48-49 Globodera rostochiensis. Testigos 48: Quiste sano 250x, 49: Conjunto de huevos en el interior del quiste 500x.

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V. DISCUSIÓN Los resultados obtenidos muestran que la densidad poblacional de quistes de Globodera rostochiensis fue estadisticamente diferente en todas las localidades. Esto puede ser debido a que en las localidades se realizan diferentes prácticas culturales (Stirling, 1991); así tenemos, que en las comunidades de Tembladeras y Escobillo, donde las poblaciones de quistes son de 2216 y 360 quistes/kg de suelo, respectivamente; las prácticas culturales son: años de cultivo, 50 y 30; la rotación de cultivo, monocultivo y rotación; aplicación de nematicidas químicos de 60 y 20 kg/ha respectivamente. Esta variación en las prácticas culturales del cultivo, podrían explicar las diferencias en las poblaciones de quistes de G. rostochiensis en la región de Cofre de Perote, Ver. La población de quistes de G. rostochiensis en la localidad de Tembladeras, según nuestros datos, es de 2216 quistes/kg de suelo, mientras que en año 1987, esta misma localidad, eran de 1000 quistes/kg de suelo (SARH, 1987). Sin embargo, se reporta que en los suelos cuando las poblaciones de Heterodera avenae aumentan y disminuyen, se debe a que el nematodos se reproduce normalmente y la causa parece ser debido a las prácticas culturales (Kerry y Crump, 1977). También se ha considerado el efecto del ataque de los hongos a las hembras (Kerry et al., 1982). Los datos muestran que no existe correlación entre el número de quistes con la materia orgánica y el pH del suelo. Este resultado no es raro ya que se menciona que este factor no tienen efecto significativo sobre las poblaciones de los fitonematodos enquistados (Stirling, 1991). La infestación natural de nematodos enquistados por hongos, se reporta como los hongos encontrados en hembras jóvenes y que pueden ser considerados como parásitos (Stirling, 1991). Sin embargo, al parecer, los quistes de G. rostochiensis, fuera de su centro de origen, no son atacados por hongos nematofagos (Willcox y Tribe, 1974;

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Kerry y Crump, 1977; Jones, 1976; Willcox y Tribe, 1980; Stirling, 1991), lo anterior debido a la reducida apertura del cono vulvar y la presencia de una capa de cutícula adicional que funcionan como barreras, para la penetración de los hongos parásitos y depredadores (Tribe, 1980). Los resultados muestran, que los quistes de G. rostochiensis presentan una infestación natural, por hongos nativos, del 3.5%. En Perú, que es el centro de origen de este nematodo, se reportaron 32% de infestación natural sobre quistes de G. pallida y G. rostochiensis (Morgan-Jones y Rodríguez-Kabana, 1986). En estudios similares realizados por Willcox y Tribe en 1980 en quistes de G. rostochiensis procedentes de 20 campos de papa, en Inglaterra, y uno de Bolivia, no encontraron quistes enfermos, ni tampoco quistes con huevos muertos; de la misma manera, los reporta Jones (1976) en Inglaterra, por lo que se consideró, que G. rostochiensis no tenía enemigos naturales fuera de su centro ce origen (Stirling, 1991). Sin embargo, en la zona productora de papa de la Región, Cofre de Perote, Ver., el cultivo de la papa fue introducido y por consiguiente el nematodo. Los resultados muestran, que los quistes de G. rostochiensis presente en esta zona, están infectados por hongos oportunistas nativos. Esto contrasta con reportes anteriores (Willcox y Tribe, 1974; Kerry y Crump, 1977), ya que se consideraba, que en Europa, donde el nematodos fue introducido, no se le han encontrado enemigos naturales y que solo se le reportan en el Perú y Sudamérica, donde este nematodo es originario (Morgan-Jones, et al., 1986). Diversas investigaciones han sido enfocadas sobre la asociación entre los hongos nativos, llamados oportunistas, en el suelo, y quistes de Heterodera específicamente H. avenae; H. glycines, y H. schachtii (Tribe, 1980; Jones, 1976; Morgan-Jones, et al., 1981; Gintis et al.,1983; Dackman, et al., 1985), pero investigaciones de la actividad de hongos nematofagos sobre quistes de especies de Globodera, eran mínimas, comparativamente (Stirling, 1991), sin embargo, a la fecha se puede decir que la

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situación no ha cambiado, debido al uso de los nematicidas químicos, el problema de resistencia de los fitonematodos a esos productos y la contaminación ambiental activará los estudios sobre estos tópicos (Stirling, 1991). La inclusión de organismos del suelo en teorías ecológicas es una moderna aproximación que podría potencialmente proporcionar una mejor comprensión de la estructura y función de los ecosistemas subterráneos (Lindow y Wilson, 1998). Todos los organismos tienen enemigos naturales o antagonistas, que de alguna manera regulan la densidad de las poblaciones de organismos; existen mecanismos reguladores en el suelo, que mantienen las poblaciones de nematodos fitoparásitos, dentro de ciertos niveles; los cuales están determinados por el equilibrio dinámico existente entre las poblaciones de los organismos (Rodríguez-Kabana, 1991; Cook, 1993). Pero Cook y Baker (1983) menciona que, cuando un microorganismo fitopatógeno es introducido en un ambiente donde no se manifiestan enemigos naturales, éstos se desarrollan sin competencia, y los límites del tamaño de su población es su propia capacidad de adaptación al nuevo ambiente. Sin embargo, a los nematodos enquistados, parece ser, que las prácticas culturales, como la rotación de cultivos, la cantidad de años de cultivo y la aplicación de nematicidas químicos, son determinanates en el desarrollo y control de las poblaciones de este tipo de fitonematodos (Stirling, 1991). El haber obtenido solo el 3.5% de infestación natural de quistes por hongos en la zona de Perote, Ver., demuestra una baja incidencia de quistes infectados de G. rostochiensis lo que contrasta con los resultados reportados en Perú (Morgan-Jones, et al., 1986) y pudiera asemejarse a lo encontrado en Inglaterra (Willcox y Tribe, 1974), donde se considera niveles de infestación relativamente bajo. Sin embargo, en ningún reporte se mencionan las pruebas de patogenicidad que nos darían los elementos suficientes, para determinar, si estos hongos, con los nivel de

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infestación mencionados, podrían tener potencial, como agentes de control biológico de este nematodo. Estos resultados indican, que en los suelos de la zona productora de papa del Cofre de Perote, los quistes del nematodos dorado G. rostochiensis están asociados a hongos nematofagos habitantes del suelo, y estos hongos pertenecen, en su mayor parte, a la clase Hyphomycetes. En otros reportes se menciona, que los quistes de G. pallida y G. rostochiensis, están asociados a varios hongos oportunistas, al menos a 28 especies (Morgan-Jones, et al., 1986); resultados similares se obtuvieron en otros estudios (Morgan-Jones et al.,1988). En este estudio, se aislaron los siguientes hongos nativos asociados a quistes de G. rostochiensis: Paecilomyces carneus, Acremonium incrustatum, Phialophora malorum, Fusarium sp., Aspergillus sp., Chaetomidium sp., Cladosporium sp., Drechslera sp.,Micelia sterilia, Pteroconium sp., Trichocladium asperum y Ulocladium atrum. Ninguna de estas especies de hongos nematofagos había sido reportada como asociada a quistes de G. rostochiensis. La especie Paecilomyces carneus, se encontró asociado a quistes de G. rostochiensis. El género está estrechamente relacionado a Penicillium, es uno de los principales géneros en estudios de control biológico (Godoy et al., 1983); típicamente, este es un hongo habitante del suelo, pero también se conoce por colonizar esclerosios, larvas de insectos, y también tejidos animales y humanos (Godoy et al., 1983). Otras especies de Paecilomyces se reportan asociadas con quistes de nematodos del género Heterodera en muchas localidades geográficas (Dackman y Nordbring-Hertz, 1992; Stirling, 1991; Davide y Zorrilla, 1995; Rodríguez-Kabana et al., 1986). La especie Paecilomyces lilacinus se aisló de quistes de H. glycines, de huevos de M. arenaria (Cabanillas et al., 1989; Gintis, 1983; Morgan-Jones, 1984; Davide y Zorrilla, 1995); y se emplea como agente de control biológico, de Tylenchus semipenetrans (Jatala, 1983). 75

También, parasita huevos (Jatala et al., 1983; Dunn, 1983) y hembras de M. incognita (Godoy et al., 1983), y quistes de G. pallida, (Rodríguez- Kabana, 1986). En una revisión exhaustiva de literatura no se encontró ningún reporte de este hongo asociado a quistes de G. rostochiensis, por lo que al parecer, este es el primer reporte. En este estudio se aisló, también a la especie Acremonium incrustatum cabe destacar que, en una búsqueda exhaustiva de literatura, no se encontró ningún reporte de esta especie asociado a quistes de G. rostochiensis; sin embargo, varias especies de este género ya se han reportado como hongos oportunistas asociados a quistes de Heterodera spp.. A. strictum Gams sobre huevos y quistes de Heterodera schachtii, (Nigh, 1979); Acremonium sp. fue aislado de quistes de H. avenae en Suiza (Dackman y Norbring-Hertz, 1985); A. persicinum Nicot y Gams, fue aislado en el segundo estado juvenil de Meloidogyne javanica (Klopper, 1980); y A. coenophiclum sobre nematodos ectoparásitos y endoparásitos, M. meryland, y Pratylenchus scribneri (Pedersen, 1988; Yu O y Cooserman, 1998). En esta investigación otro hongo aislado fue Phialophora malorum, asociado a quistes de G. rostochiensis; de esta especie no se encontró ningún reporte que la mencionara asociado a quistes de G. rostochiensis; sin embargo, esta especie ya ha sido reportada como un parásito importante sobre quistes de Heterodera schachtii, en diferentes países: Alemania, Bélgica, Checoslovaquia, Dinamarca, Holanda, Inglaterra, Italia, Noruega y Suiza (Van der Laan, 1986; Dove, 1969; Bursnall y Tribe, 1974). Al parecer este es el primer reporte de P. malorum asociado a G. rostochiensis. La especie Fusarium oxysporum

se encontró asociado a quistes de G.

rostochiensis. Las especies de Fusarium spp. también han sido reportadas como parásitos de huevos y quistes de H. schachtii (Nigh et al., 1980 Morgan-Jones et al., 1981; West et al., 1988), sobre quistes y huevos de H. glycines (Gintis et al., 1983; Morgan-Jones et al., 1984); también, se ha encontrado atacando huevos de varias

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especies de nematodos sobre placas de agar in vitro, y creciendo saprofiticamente sobre huevos muertos. Sin embargo en diversos estudios han concluido, que otro saprofito facultativo común era causante de la afectación de algunos huevos de H. schachtii bajo ciertas condiciones en los campos (Nigh, 1979). Aunque F. oxysporum y F. solani

están asociado con quistes y huevos de

nematodos fitoparásitos en varios países del mundo, también se reporta asociados a quistes de G. rostochiensis (Goswami y Rumpenhorstt, 1978). Sin embargo, se señala que aunque Fusarium sp. es un parásito de las plantas, éste no puede ser considerado, para el uso de posibles prácticas de control biológico, contra quistes de Heterodera (Tribe, 1980); no obstante este señalamiento, el género Fusarium spp. es tan variable en sus formas especiales que difícilmente la especie que se asocia con lo quistes de G. rostochiensis sea fitopatógeno. Se reporta que en una exploración microscópica de huevos provenientes de quistes, donde Fusarium está presente, arroja resultados confusos, principalmente en su capacidad para penetrar el corión (Nigh et al., 1980), estos mismos autores documentaron la habilidad de los hongos aislados de H. glycines, sin embargo, esto no significa que los aislamientos de está especie logran la penetración de la cáscara del huevo; ya que algunos quistes invadidos por Fusarium sp., contenían huevos que aparentemente no son afectados por el hongo. Las demás especies de hongos habitantes del suelo, asociados a lo quistes de G. rostochiensis en la zona productora de papa de la región del Cofre de Perote, Ver., están reportadas como especies de hongos oportunistas que se asocian a los quistes de Heterodera spp. o Globodera spp. (Morgan-Jones, et al., 1986; Morgan-Jones et al.,1988).

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El hecho de que estas especies de hongos, estén asociados con quistes de G. rostochiensis en la región Cofre de Perote, están adaptados a las condiciones ecológicas de esos suelos y son un potencial para usarse en el manejo integrado del nematodo dorado de la papa. Es poca la literatura científica que aborda el tema de los hongos nematofagos asociados a los quistes de nematodos fitoparásitos, sobre todo, de los géneros Heterodera spp. y Globodera spp.; lo anterior puede deberse a, que las estructuras de las paredes, tanto de los quistes como de los huevecillos, de estos fitonematodos, les permiten mantenerse casi invulnerables al ataque de enemigos naturales (Stirling, 1991); sin embargo, en los centros de origen de los nematodos enquistados, Heterodera spp. y Globodera spp., se reportan varias especies de hongos asociados a quistes de nematodos fitopatógenos (Morgan-Jones, et al., 1986; Morgan-Jones et al.,1988), y en Inglaterra (Willcox y Tribe, 1974), sin embargo, en ningún reporte se mencionan el grado de parasitismo, que los hongos presentan sobre los huevecillos y los quistes. Los datos de nuestro estudio demuestran que las especies, Acremonium incrustatum, Paecilomyces carneus y Phialophora malorum, presentaron infección sobre los quistes de G. rostochiensis. Los tres géneros de hongos ya han sido reportados, que contienen especies con características nematofagas; Acremonium spp. (Night, 1979; Klopper, 1980; Pedersen, 1988; Yu O y Cooseman, 1998); Paecilomyces spp. (Godoy et al., 1983; Dackaman y Nordbring-Hertz, 1992; Stirling, 1991; Davide y Zorrilla, 1995; Rodríguez-Kabana et al., 1986; Cabanillas et al., 1989; Jatala, 1983); y Phialophora spp., (Van der Laan, 1986; Dove, 1969; Bursnall y Tribe, 1974). Sin embargo, las especies estudiadas en este trabajo, no han sido reportadas, infectando quistes de G. rostochiensis.

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En la literatura científica, se consideraba que este fitonematodo no tenía enemigos naturales, excepto en los ambientes de su zona de origen (Tribe, 1980; Stirling, 1991), aunque en Inglaterra, fuera de su centro de origen, ya se habían reportado hongos asociados a los quistes de este fitopatógeno, y no se demostró patogenicidad (Willcox y Tribe, 1974); en este estudio se demuestra que lo quistes de G. rostochiensis son atacados por hongos nativos de la región del Cofre de Perote, Ver. La patogenicidad mostrada por las tres especies de hongos nematofagos sobre los quistes de G. rostochiensis, nos permiten suponer que estas especies tienen potencial como agentes de control biológico para este fitonematodo y que es necesario realizar mas estudios a este respecto, con el propósito de evaluar la virulencia de estos hongos sobre el fitonematodo, y el potencial como agentes de control biológico del mismo en la zona productora de papa del la Región, Cofre de Perote, Ver. En revisiones exhaustivas de la literatura científica, no se encontró ningún reporte de la patogenicidad de estas tres especies de hongos sobre quistes de Globodera rostochiensis. Consideramos a éste, como el primer reporte.

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VI. CONCLUSIÓN Los datos soportan la hipótesis de que existen hongos nativos que parasitan a quistes de Globodera rostochiensis en los suelos de la zona productora de papa del Cofre de Perote, Veracruz. La densidad de población de quistes de Globodera rostochiensis es alta, en todas las localidades estudiadas. de la zona productora de papa del Cofre de Perote, Veracruz. Las especies de hongos asociados a los quistes de G. rostochiensis en la región del Cofre de Perote, Veracruz, México, son las siguientes: Paecilomyces carneus, Cladosporium sp., Phialophora sp. Trichocladium asperum, Acremonium incrustatum, Aspergillus sp., Chaetomidium sp., Drechslera sp., Fusarium sp., Micelia sterilia Phialophora malorum, Pteroconium sp, y Ulocladium atrum. Las especies de hongos, Acremonium incrustatum, Paecilomyces carneus y Phialophora malorum, tienen capacidad para infectar quistes de G. rostochiensis. Este es el primer reporte de hongos nativos patógenos de quistes de G. rostochiensis en ambientes fuera de su centro de origen. En este estudio, se aportan las bases, para continuar estudios de hongos, que parasitan quistes de G. rostochiensis y el potencial de éstos, como agentes de control biológico.

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INSTITUTO DE ECOLOGIA, A.C. DIVISIÓN DE SISTEMÁTICA

Xalapa, Ver. 7 de Junio de

2002

DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA COORDINADOR DEL POSGRADO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS UNIVERSIDAD DE COLIMA COLIMA, COLIMA Estimado Dr. Aguilar: Por medio de la presente le comunico a Ud. de la manera más atenta, que el trabajo titulado “Aislamiento y Evaluación de Hongos Nematofagos Asociados a Quistes de Globodera rostochiensis (Woll.) en la Región Cofre de Perote”, realizado por el C. Ángel Enrique Núñez Sánchez, alumno del posgrado en Biotecnología para optar por el grado de Maestro en Ciencias, ha sido terminado satisfactoriamente desde mi punto de vista. Por esta razón, considero que puede continuar con los trámites correspondientes. que marca el reglamento del posgrado que Ud. dirige. Sin otro particular agradezco de antemano su atención y aprovecho la oportunidad para enviarle un cordial saludo.

ATENTAMENTE

M. en C. Gloria L. L. Carrión Villarnovo

Departamento Hongos Km 2.5 Antigua carretera a Coatepec, A.P. 63 Xalapa 91000, Veracruz, México Tel. (228) 8-42-1 8-29 Fax (228) 8-18-78-09 Email: [email protected]

DR. SERGIO AGUILAR ESPINOSA COORDINADOR PROGRAMA DE POSGRADO DE LA FCBA PRESENTE

Anexo a la presente. el manuscrito de Tesis de Maestria titulado: “AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE HONGOS NEMATOFAGOS ASOCIADOS A QUISTES DE Globodera rostochiensis (WOLL) EN LA REGION COFRE DE PEROTE”. dicho documento es presentado por el alumno del Progama de Maestría en Biotecnología: Angel Enrique Núñez Sánchez. Además informa a usted. que académicamente, este documento cumple con los requisitos suficientes. como tesis de maestría. Asimismo. autorizo para que este documento sea sometido a revisión por expertos y se prosigan los tramites de titulación correspondientes. Sin más por el momento. aprovecho para saludarle afectuosamente y le reitero la mas alta de mis consideraciones.

ATENTAMlENTE Tecomán Colima., a 07 de Junio de 2002.

DR OSCAR REBOLLEDO DOMÍNGUEZ Asesor de Tesis

c.c.p.-Ing. Rodolfo V. Morentin Delgado.- M. Director de la FCBA. c.c.p.-Interesado c.c.p. -Archivo

UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS

Dr. SERGIO AGUILAR ESPINOSA COORDINADOR DEL POSGRADO PRESENTE.

Por este conducto, los abajo firmantes profesores-investigadores de la F.C.B.A. de la Universidad de Colima, hacemos de su conocimiento, que después de haber revisado el borrador de tesis titulado “AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE HONGOS NEMATOFAGOS ASOCIADOS A QUISTES DE Globodera rostochiensis (WOLL) EN LA REGION COFRE DE PEROTE”, que presenta el C. Angel Enrique Núñez Sánchez, alumno del posgrado de esta Facultad, consideramos que reúne los elementos suficientes de contenido y forma de un documento de Maestría. Por ello, expresamos nuestra aprobación para que se imprima y se sigan los trámites académicos que correspondan. Sin otro particular, le saludamos cordialmente ATENTAMENTE Tecomán, Colima., a 23 de Julio de 2002

Dr. Alfonso Pescador Rubio Docente de la FCBA.

ccp.- Ing. Rodolfo V. Morentín Delgado.- Director de la FCBA. ccp.- Interasado ccp.. Archivo personal ccp.- Expediente correspondiente

Km 40 Autopista Colima-Manzanillo, Tecomán, Colima, México, Cp 28100 Tels. (3) 324 42 37, 324 46 42 • [email protected]