Categorías de Escherichia coli diarreigénico Clasificación Esta se basa en: •La interacción que establecen con la mucosa intestinal. •Los distintos factores de virulencia codificados en cromosomas, plásmidos , fagos, trasposones. •El síndrome clínico que producen •Los diferentes serotipos O:H dentro de cada categoría.

Escherichia coli diarreagénico


ETEC – E. coli enterotoxigénico




EPEC – E. coli enteropatogénico




EAEC – E. coli enteroagregativo




EIEC – E. coli enteroinvasivo




EHEC – E. coli enterohemorrágico




DAEC – E. coli de adherencia difusa

Mecanismo de la infección por Escherichia coli diarreigénico •Colonización de la mucosa intestinal

•Evasión de las defensas del huésped

•Multiplicación

•Daño celular del huésped

Escherichia coli enterotoxigénico (ETEC) Factores de colonización (CFs) Especificidad antigénica CFA (Antígeno factor de colonización)

Morfología •Fimbrias •Fibrillas

•CS (Antígeno de superficie de coli)

•Helicoides •Manojo (bundle-forming )

•PCF (Probable factor de colonización) •Longus

•Adhesinas no fimbriadas

Factores de colonización de ETEC

Enterotoxinas LT y ST de ETEC

LT

ST

Mecanismo de patogenia de ETEC

LT

ST

Áreas de riesgo de diarrea del viajero asociada a ETEC

Alto riesgo Intermedio Bajo riesgo

Mecanismo de patogenia Escherichia coli enteropatógeno EPEC

EPEC - Lesión A/E

EPEC Adherencia localizada

Mecanismo de patogenia Escherichia coli enteroagregativo EAggEC ADHESINAS FIMBRIAS • AAFI • AAFII EASTI

• AAFIII

Adherencia de EAggEC

Mecanismo de patogenia Escherichia coli enteroinvasivo EIEC

Mecanismo de patogenia Escherichia coli de adherencia difusa DAEC Factores de adherencia •Familia adehesinas afa •Adhesina AIDA-1

Adherencia difusa

Transmisión • Persona a persona por la vía fecal-oral

•Ingesta de alimentos contaminados

Dosis infectiva • Varía de 108-109 UFC (ETEC, EPEC) a 10-102 UFC (EHEC, EIEC)

Características clínicas de la diarrea por Escherichia coli diarreigénico




Diarrea acuosa o mucosa, vómitos y poca fiebre: ETEC, EPEC, EAEC, DAEC, EIEC, y EHEC en una primera etapa.




Diarrea hemorrágica: EIEC, EAEC, y EPEC EHEC, en una segunda etapa.

Escherichia coli diarreigénico Estrategias de detección

Flora normal

Categorías de E. coli diarreigénico

Factores de virulencia específicos

Detección de Categorías de DEC •Serotipificación •Ensayos con animales Asa ligada de conejo (ETEC) Sereney (EIEC) •Ensayos fenotípicos que correlacionan con factores de virulencia Adherencia cultivo celular (EPEC, EAEC, STEC, DAEC) ELISA (ETEC, STEC, EIEC) •Detección molecular Hibridación sondas genéticas (EPEC, EAEC, STEC, DAEC) PCR (EPEC, EAEC, STEC, ETEC, EIEC, DAEC)

Toma de muestra para el diagnóstico de la infección por DEC Muestra para realizar coprocultivo Evacuación espontanea •Recolectar 2 g de materia fecal con una espátula y colocarla en un recipiente estéril. Conservar refrigerada a 4ºC hasta su procesamiento. •Si la muestra no es procesada dentro de las 2 horas de recolectada, utilizar medio de transporte (Cary-Blair, Stuart,) conservar a 4ºC. Hisopado rectal • Tomar la muestra con hisopo, conservarlo en un medio de transporte y mantenerlo a 4°C hasta su procesamiento. •Si el niño usa pañal, tomar la muestra que queda en el mismo con hisopo o con espátula. Recomendaciones a)Recolectar la materia fecal lo antes posible después del establecimiento de la diarrea. b)El paciente no debe estar con tratamiento antibiótico. Recolectar la muestra después de suspender la antibioticoterapia por no menos de 48 horas.

Sistema de triple envase para el envío de material infeccioso

Las muestras deben ser enviadas según las Normas de Bioseguridad que corresponden al transporte de muestras clínicas.

Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de ETEC, EPEC, EAEC, EIEC, y STEC Materia fecal (suspensión) Agar MacConkey (MAC)

CTS Agar MacConkey Sorbitol (SMAC)

37ºC x 18 h Tamizaje PCR múltiple Nº1 eae / lt / st zona de confluencia colonias lactosa (-) y lactosa (+)

aggR / IpaH / stx1 / stx2 zona de confluencia colonias lactosa (-) y lactosa (+)

PCR Nº2 Positiva

PCR Nº1 Positiva eae (+) Aislamiento EPEC

lt / st (+) Aislamiento ETEC

37ºC x 18 h

Tamizaje PCR múltiple Nº2

aggR (+) Aislamiento EAEC

•PCR Confirmación •Identificación Bioquímica •Seroagrupamiento

IpaH (+) Aislamiento EIEC

stx1 / stx2 (+) Aislamiento STEC

CT-CTS

37ºC x 6 h

37ºC x 6 h

SMAC

SMAC

37ºC x 18 h

37ºC x 18 h

Continuar con los procedimientos de diagnóstico y caracterización de STEC O157 y no-O157 a partir de especimenes clínicos”

Estrategia de detección Cultivo y PCR múltiple

Hisopado rectal Siembra directa ..... .... Agar MAC Incubación a 37º por 18 hs

PCR

Toma de muestra para realizar PCR múltiple Nº1 (eae / lt / st) y Nº2 (aggR / IpaH / stx1 / stx2)

Placa de MAC

•Muestra de zona de cultivo confluente

•Pool de colonias no fermentadoras de lactosa .. ... .... •Pool de colonias fermentadoras de lactosa PCR Tamizaje

MAC Grillado

EPEC / ETEC PCR múltiple eae / lt / st Paso Nº

Primer

Secuencia del primer (5’-3’)

SK1 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC SK2 CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG LT-L TCTCTATGTGCATACGGAGC LT-R CCATACTGATTGCCGCAAT AL-65 TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG AL-125 CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC

Tamaño del fragmento de amplificación (pb) 864 322

Etapa

Temperatura ºC

Tiempo

1

Desnaturalización

94

5 min

2

Desnaturalización

94

30 seg

3

Pegado de primers ó annealing

56

1 min

4

Extensión

72

1 min

5

Extensión

72

2 min

6

Pausa

4

147

eae Referencias Toma C. 2003. (EPEC, ETEC, EAEC)

lt st

Va al paso Nº

Nº veces

2

29

STEC / EIEC / EAEC PCR múltiple aggR / ipaH / stx1 / stx2 Tamaño Primer

Secuencia del primer (5’-3’)

IpaH8B

GTTCCTTGACCGCCTTTCCGA

IpaH15B

GCCGGTCAGCCACCCTCTGAG

aggRks1

GTATACACAAAAGAAGGAAGC

aggRkas2

ACAGAATCGTCAGCATCAGC

stx1a

GAAGAGTCCGTGGGATTACG

stx1b

AGCGATGCAGCTATTAATAA

stx2a

TTAACCACACCCCACCGGGCAGT

stx2b

GCTCTGGATGCATCTCTGGT

del fragmento de

Paso

amplificación (pb)

Nº

619

254

130

Etapa

Temperatura ºC

Tiempo

1

Desnaturalización

94

5 min

2

Desnaturalización

94

30 seg

3

58

30 seg

4

Pegado de primers ó annealing Extensión

72

30 seg

5

Extensión

72

2 min

6

Pausa

4

Va al paso Nº

Nº veces

2

29

346

Referencias Toma C. 2003. (EAEC) Sethabutr O. 1994. (EIEC) Leotta G. 2005. (STEC)

stx1

stx2

ipaH aggR

Resultados posibles de la PCR múltiple Nº1 (eae / lt / st) y Nº2 (aggR / IpaH / stx1 / stx2) 1º grilla Confluencia y pool de colonias positivas

PCR de colonias individuales

Confluencia positiva y pool de colonias negativas

PCR seleccionando nuevas colonias 2º grilla

Confluencia y pool de colonias negativas

Muestra negativa

Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de ETEC, EPEC, EAEC, EIEC, y STEC Materia fecal (suspensión) Agar MacConkey (MAC) 37ºC x 18 h Tamizaje PCR múltiple Nº1 eae / lt / st zona de confluencia colonias lactosa (-) y lactosa (+)

Tamizaje PCR múltiple Nº2 aggR / IpaH / stx1 / stx2 zona de confluencia colonias lactosa (-) y lactosa (+)

PCR Nº2 Positiva

PCR Nº1 Positiva eae (+) Aislamiento EPEC

lt / st (+) Aislamiento ETEC

aggR (+) Aislamiento EAEC

•PCR Confirmación •Identificación Bioquímica •Seroagrupamiento

IpaH (+) Aislamiento EIEC

stx1 / stx2 (+) Aislamiento STEC

Identificación bioquímica Pruebas Bioquímicas

Categoría

Medio de cultivo

EPEC /ETEC/ EAEC

Fermentación de

+

(TSI)

glucosa Fermentación de

Agar triple azúcar y hierro

+

TSI

+

TSI

-

TSI

lactosa Fermentación de sacarosa Formación de H2S Producción de gas

+

TSI

Utilización del citrato

-

Citrato de Simmons

Producción de indol

+

Sulfuro, indol, movilidad (SIM)

Movilidad Actividad

Móvil / no móvil

SIM

+

Disco con glucurónido

+ (90) *

Lisina Hierro Agar (LIA)

+ (95)

Movilidad, indol, ornitina.

β-glucuronidasa Actividad lisina decarboxilasa Actividad ornitina decarboxilasa

(MIO)

Según Manual of Clinical Microbiology (7°ed). 1999

Pruebas Bioquímicas

Fermentación de

Microorganismo EIEC

Shigella spp

+(100)

+(100)

Medio de cultivo Shigella sonnei +(100)

Agar triple azúcar y hierro

glucosa Fermentación de

(TSI) +(25)

-

+(2)

TSI

+(15)

-

+(1)

TSI

Formación de H2S

-

-

-

TSI

Producción de gas

+(5)

(2)

-

TSI

Utilización del citrato

-

-

-

Citrato de Simmons

+(80)

+(50)

-

Sulfuro, indol, movilidad

lactosa Fermentación de sacarosa

Producción de indol

(SIM) Movilidad Actividad

+(5)

-

-

+(45)

+(2)

+(90)

β-galactosidasa Actividad lisina

SIM Disco con

o-nitrofenil-β-D-

galactósido (ONPG) + (40)

-

-

Lisina Hierro Agar (LIA)

+ (20)

+(1)

+(98)

Movilidad, indol, ornitina.

decarboxilasa Actividad ornitina decarboxilasa

(MIO)

Utilización del acetato

+(40)

+(2)

-

Prueba del acetato

Fermentación D-

+(75)

+(30)

+(2)

Fermentación azúcares

+(70)

+(2)

+(2)

Fermentación azúcares

+(40)

+(2)

-

Fermentación azúcares

+(30)

-

+(10)

Fermentación azúcares

+(10)

-

-

Fermentación azúcares

Sorbitol Fermentación de DXilosa Fermentación de Dulcitol Fermentación de Mucato Fermentación de salicina

Según Farmer JJ. et al. J. Clin. Microbiol. 1985. 21: 46-76.

Seroagrupamiento Incubar colonias caracterizadas en un medio de cultivo como agar TSA.

Realizar suspensión bacteriana con SF y hervir 1 hora.

Realizar seroagrupamiento con antisueros polivalentes y monovalentes según disponibilidad y categoría.

Recomendaciones para la detección de ETEC, EPEC, EAggEC, DAEC y EIEC
Tener en cuenta las características clínicas de la diarrea
Vía de transmisión o fuente de infección
Realizar la identificación bioquímica de E. coli
Identificar características bioquímicas de la cepa Ejemplo: Lactosa (-), Movilidad (-), LIA (-) , E. coli / Shigella ?
Técnicas de Biología molecular para detectar factores de virulencia
Enviar aislamiento, datos del paciente, y las características mencionadas, al Laboratorio de Referencia para la identificación final

DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE CEPAS DE Escherichia coli ENTEROINVASIVA POR PRUEBAS BIOQUIMICAS Y MOLECULARES Autores: Servicios Fisiopatogenia y Enterobacterias del INEI y Servicio de Sueros y antígenos del INPB “Carlos G. Malbrán”
Objetivo: Identificar y caracterizar cepas EIEC aisladas en el período 1994–2003 mediante la aplicación de pruebas bioquímicas diferenciales, seroagrupamiento y métodos moleculares.
Materiales y métodos: 102 cepas EIEC, PCR para la detección del gen ipaH, pruebas bioquímicas y seroagrupamiento con antisueros “O”.





Porcentaje de positividad (%)

Resultados:

PRUEBA BIOQUIMICA

El resultado de PCR ipaH fue positivo en las 102 cepas E. coli analizadas. Serogrupos EIEC Otros 8% O112 4%

ONT 10%

O28 38%

O136 5% O143 12%

O124 23%

Otros: O18, O44, O144

EIEC

E. coli *

Shigella spp.*

Triptofano

100

98,0

50,0

SH2 (SIM)

0

0

0

Producción de indol

80,0

98,0

50,0

ONPG

100

95,0

2,0

0

95,0

0

100

100

100

Movilidad Rojo de Metilo Voges-Proskauer

0

0

0

Citrato de Simmons

0

0

0

Citrato de Christensen

26,4

76,4

2,0

Acetato (utilización)

68,6

90,0

2,0

Mucato (fermentación)

0

10,8

10,8

Esculina (hidrólisis)

5,9

35,0

0

Arginina dihidrolasa

33,3

17,0

5,0

Lisina descarboxilasa

39,2

90,0

0

Ornitina descarboxilasa

59,8

65,0

1,0 60,0

O28

Arabinosa (fermentación)

96,1

99,0

O124

Dulcita (fermentación)

14,7

60,0

2,0

O143

Glucosa (ácido)

100

100

100

O136

Glucosa (gas)

100

95,0

2,0

O112

Lactosa (fermentación)

78,4

95,0

30,0

Maltosa (fermentación)

97,0

95,0

50,0

Rafinosa (fermentación)

29,4

50,0

50,0

Ramnosa (fermentación)

72,5

80,0

5,0

Sacarosa (fermentación)

16,7

50,0

0

Salicina (fermentación)

15,7

40,0

0

Otros ONT

* Datos obtenidos de Manual of Clinical Microbiology. Murray et al. 2003

Caracterización molecular de aislamientos de Escherichia coli diarreigénico en la Ciudad de Corrientes Autores: Patricia Esquivel et al (Cátedra de Microbiología UNNE) Lugar: Ciudad de Corrientes Objetivo: Caracterizar por PCR los aislamientos de E.coli diarreigénicos de casos ocurridos en la Ciudad de Corrientes Metodología: PCR múltiple para ETEC, EPEC, EIEC, EaggEC y STEC (Toma y col J Clin Microbiol 2003) Resultados: 40/ 104 muestras (61 niños y 43 adultos) positivas ETEC 10,5% ; EaggEC 8,8 %; STEC 7,0%; EPEC 5,3% y EIEC 3,5% . EaggEC más frecuente en niños (11,3%) y ETEC en adultos (11,6%)

Caracterización molecular de aislamientos de Escherichia coli diarreigénico recuperadas de fuentes de agua de la provincia del Chaco Autores: Losch et al (Cátedra de Microbiología UNNE) Lugar: Provincia del Chaco Objetivo: Determinar la distribución de los aislamientos de E.coli diarreigénicos en ambientes acuáticos (superficiales, subterraneas y de red) de la provincia del Chaco Metodología: PCR múltiple para ETEC, EPEC, EIEC, EaggEC y STEC (Toma y col J Clin Microbiol 2003) Resultados: 54 muestras de agua 7/ 54 EaggEC 13% (5 de aguas superficiales y 2 de fuentes subterráneas) 1 / 54 EPEC 1,8% (fuentes subterráneas)

Diarreas por E. coli: Agentes identificados por SE 100%

140 E. coli enteropatógeno (EPEC)

120

80% E. coli enteroinvasivo (EIEC)

100

E. coli No-O157 productor de toxina Shiga (STEC)

80

60%

E. coli O157

60 % Positivos bacterianas

40%

40 20% 20 0

0% 1

3

5

7

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 Semana Epidemiológica

% Positivos

Número de Muestras Positivas

2010 - Total país