MÉTODO COMPUTACIONAL PARA LA IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS SECRETADAS POR VÍA NO CLÁSICA
DANIEL RESTREPO-MONTOYA Código: 299714
Tesis presentada como requisito parcial para obtener el título de MSC. EN INGENIERÍA DE SISTEMAS Y COMPUTACIÓN INGENIERÍA DE SISTEMAS
Director: ING.LUIS FERNANDO NIÑO. PHD. Profesor Asociado.Ingeniería de Sistemas Codirector: MANUEL ALFONSO PATARROYO. M.D. PH.D. Fundación Instituto de Inmunología de Colombia FIDIC.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA DE SISTEMAS E INDUSTRIAL BOGOTÁ 2010
Aprobada por la Facultad de Ingeniería en cumplimiento de los requisitos exigidos para otorgar el título
MSc. en Ingeniería de Sistemas y Computación Ingeniería de Sistemas de:
Ing.Luis Fernando Niño. PhD.
Director de la Tesis
Manuel Alfonso Patarroyo. M.D. Ph.D.
Codirector
Leonardo Mariño Ramirez. Ph.D.
Jurado
Germán J. Hernández P. Ph.D.
Jurado
Universidad Nacional de Colombia Bogotá, Enero de 2010
RESUMEN
MÉTODO COMPUTACIONAL PARA LA IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS SECRETADAS POR VÍA NO CLÁSICA por DANIEL RESTREPO-MONTOYA MSc. en Ingeniería de Sistemas y Computación en Ingeniería de Sistemas UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA Director: Ing.Luis Fernando Niño. PhD.
Este trabajo propuso un método computacional innovador para la clasi cación de proteínas secretadas por vía no clásica. De forma especí ca se presenta una aproximación novedosa tanto en la comprensión y uso de los métodos basados en aprendizaje de máquina como en la solución a un problema complejo previamente reportado por la comunidad cientí ca. La nueva metodología fue validada con datos evaluados experimentalmente superando las aproximaciones previamente reportadas para la clasi cación de proteínas que cumplen con esta condición. Así mismo, se proponen transformaciones innovadoras a partir de procesos e caces, reportando excelentes resultados, lo cual se ve re ejado de manera directa en el área de las ciencias de la vida a nivel mundial, abriendo un espacio único para el Departamento de Ingeniería de Sistemas.
ABSTRACT
COMPUTATIONAL METHOD FOR THE CLASSIFICATION OF NON CLASSICAL SECRETED PROTEINS por DANIEL RESTREPO-MONTOYA MSc. en Ingeniería de Sistemas y Computación en Ingeniería de Sistemas UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA Advisor: Ing.Luis Fernando Niño. PhD.
This work proposed novel computational method for classifying Gram-positive proteins that are secreted via the nonclassical secretory pathway, denoted as SIG+SVM: secretion independent Grampositive supported vector machine.
SIG+SVM implements novel approaches, both in the use and
understanding of Kernel methods as well as for the solution of a biological problem. It is composed by 4 Kernel-based classi ers (frequencies, dipeptides, physicochemical factors and PSSM), each of which is based on dierent vectorial representations obtained by applying dierent amino acid sequence transformations to the input data.
The method performed better than previously reported
approaches proposed for classifying nonclassically secreted proteins when being tested with an experimentally validated protein dataset.
RECONOCIMIENTOS
Agradezco a la Facultad de Ingeniería de la Universidad Nacional de Colombia por permitir que un Biólogo hiciera parte de sus estudiantes de posgrado. Al soporte y la buena actitud de los profesores Luis Fernando Niño, Fabio González, Yoan Pinzón, Elizabeth León y Jonatan Gómez del departamento de Ingeniería de Sistemas e Industrial. A la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia FIDIC y en especial a Manuel Elkin Patarroyo por su constante interés en este trabajo y porque no ha perdido la maravillosa capacidad de preguntar. A mis compañeros y pacientes profesores Juan Carlos Galeano, Camilo Pino, David Becerra, Wilson Soto, Isabel Mahecha, Edwin Niño, Miguel Dussan, Oscar Sánchez y Leonardo Bobadilla. A todo el equipo de trabajo del Laboratorio en Sistemas Inteligentes LISI. Al soporte recibido del grupo de investigación ALGOS-UN. Agradezco especialmente a Juan Carlos Galeano, Camilo Pino, Nora Martínez y María Ximena Cárdenas por todos los aportes a aparte de los recibidos en el desarrollo de este trabajo. A Hackney-UK, Los Rickshaws, Jorge Salcedo, Rena Amaya, las 4 cuerdas y Delavil por cruzarce en mi camino.
vii
DEDICATORIA
A la hortelana y el pescador
ix
Contenido
Contenido
x
Lista de Figuras
xii
Lista de Tablas
xiii
1 Introducción 1.1
1
Justi cación del proyecto
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.1.1
Objetivo general
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.1.2
Objetivos especí cos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
1.1.3
Observaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
1.1.4
Limitaciones
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 Fundamentos y problemas 2.1
Aprendizaje de Maquina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
2.1.1
7
2.1.2 2.1.3
2.1.4
2.1.5 2.2
5
Representación de la información
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.1.1
Vectores basados en características . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
2.1.1.2
Vectores basados en similitud . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
Métodos de Kernel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
Selección del Kernel y su correspondiente modelo . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
2.1.3.1
Funciones Lineales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
2.1.3.2
Funciones Polinomiales
10
2.1.3.3
Funciones Gaussianas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
2.1.3.4
Normalización
11
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
2.1.4.1
Máquinas de Vectores de Soporte (SVM) C-SVC
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
2.1.4.2
nu-SVC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
Evaluación
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
Identi cación y localización de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
2.2.1
Secreción de proteínas en bacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
2.2.2
Secreción de proteínas por vía no clásica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
2.2.3
Secreción por vía clásica en otros grupos biológicos . . . . . . . . . . . . . . . .
16
3 Trabajo previo (otros autores) 3.1
19
Métodos entrenados para el reconocimiento de proteínas secretadas por vía no clásica
19
3.1.1
SecretomeP 2.0 server, clasi cador para bacterias Gram-positivas . . . . . . . .
19
3.1.2
Conjuntos de entrenamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
3.1.3
Construcción de vectores para el entrenamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
3.1.4
Construcción y evaluación del modelo de SecretomeP 2.0
20
x
. . . . . . . . . . . .
4 Métodos y proceso exploratorio
23
4.1
Diseño experimental del estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
4.2
Conjunto de entrenamiento
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
4.2.1
Proceso de selección de los conjuntos de entrenamiento . . . . . . . . . . . . . .
25
4.2.2
Método de ajuste de los conjuntos de entrenamiento y exploración
. . . . . . .
25
4.2.3
Conjunto positivo y negativo
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
4.2.4
Conjunto de exploración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
4.3
4.4
Diseño de vectores
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
4.3.1
Construcción y normalización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
4.3.2
Vectores de composición de aminoácidos (frecuencias)
. . . . . . . . . . . . . .
26
4.3.3
Vector de dipéptidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
4.3.4
Vector de factores estadísticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
4.3.5
Vector PSSM (PSI-BLAST) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
4.3.6
Procesamiento de vectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
Exploración de parámetros 4.4.1
4.4.2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
Parámetros explorados de las funciones de Kernel . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
4.4.1.1
Funciones Lineales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
4.4.1.2
Funciones Polinomiales
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
4.4.1.3
Funciones Gaussianas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
Entrenamiento de la Máquina de Vectores de Soporte y rangos de la exploración de parámetros.
4.5
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
nu-SVC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
Validación cruzada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
4.4.2.1
C-SVC
4.4.2.2
5 Resultados y evaluación
35
5.1
Frecuencias y vectores a partir de los conjuntos de entrenamiento . . . . . . . . . . . .
35
5.2
Pruebas de variables
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
5.3
Pruebas de exactitud para todas las variables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
5.4
Mejores clasi cadores para cada tipo de vector
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
5.5
Curva ROC para los mejores clasi cadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
5.6
Diagrama de resultados para la clasi cación del conjunto independiente de proteínas secretadas por vía no clásica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
6 Discusión de resultados
41
7 Conclusiones y recomendaciones
45
Publicaciones
46
Bibliografía
47 xi
Lista de Figuras
2.1
Clasi cación de las vías de secreción reportadas para bacterias Gram-positivas. . . . . . .
15
2.2
Estructura de péptidos conocidos presentes en bacterias Gram-positivas.
. . . . . . . . .
16
4.1
Modelo de conceptos y requerimientos fundamentales para el diseño de SIG+SVM. . . . .
24
4.2
Diagrama de selección de conjuntos de entrenamiento y exploración.
26
5.1
Comparación de las distribuciones de frecuencia de aminoácidos de los conjuntos de entrenamiento.
. . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
5.2
Curva ROC
5.3
Diagrama de clasi cación para las proteínas identi cadas por los diferentes tipos de clasi cadores desarrollados y contrastados con SecretomeP 2.0.
xii
. . . . . . . . . . . . . . . . .
40
Lista de Tablas
2.1
Clasi cación de la representación de los vectores construidos para los clasi cadores.
. . .
8
4.1
Puntajes de los factores de los aminoácidos.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
4.3
Ejemplo artici cial de una matriz PSSM.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
4.5
Matriz para la normalización
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
4.7
Matriz normalizada
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
4.9
Matriz resultante
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
5.1
Número de características por vector construido
5.2
Resultados de los mejores experimentos y variables por tipo de vector optimizando C-SVC.
36
5.3
Resultados de los mejores experimentos y variables por tipo de vector optimizando nu-SVC.
37
5.4
Mejores resultados para la variable exactitud de los diferentes tipos de vectores.
. . . . .
37
5.5
Mejores clasi cadores para cada vector con sus variables.
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
xiii
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
Capítulo 1 Introducción En la actualidad, los métodos de aprendizaje de máquina han permitido clasi car información biológica de diversas maneras, como es el caso de la localización de proteínas en membrana y/o en diferentes compartimentos subcelulares y de acuerdo a sus correspondientes mecanismos de secreción. Para tal n, diferentes tipos de herramientas predictivas han sido empleadas en diversos problemas de la biología computacional tales como las Redes Neuronales Arti ciales (de su sigla en inglés: ANNs), los modelos ocultos de Markov (de su sigla en inglés: HMMs) y las máquinas de Vectores de Soporte (de su sigla en inglé: SVM) [110]. La característica común de los anteriores métodos es que todos utilizan datos de entrada como referencia al problema para construir su modelo de representación, permitiendo ajustar gradualmente sus parámetros de libertad a partir de los conjutos de entrada y basado en estos, producir diferentes representaciones de manera generalizada [43][75]. Entendiendo la capacidad de los métodos computacionales para la clasi cación y el tipo de problemas que se presentan en biología, diferentes problemáticas se han intentado solucionar desarrollando algoritmos de clasi cación a partir de información biológica, uno de los casos más exitosos está relacionado con la idea de poder predecir la localización subcelular de una proteína que aporta información importante en la identi cación de blancos para el descubrimiento de nuevas drogas y particularmente para el desarrollo de vacunas [119][47][42]. Por esta razón, la predicción computacional de estas proteínas ha sido tarea importante de la bioinformática y una gran variedad de herramientas de clasi cación basadas en principios estadísticos han sido desarrolladas en las últimas tres décadas [110][75]. Para solucionar el problema de clasi cación de secreción y localización de proteinas, se han desarrollado dos aproximaciones, la primera basada en características y la segunda de predicción general o localización; para el primer caso, el objetivo directo ha estado relacionado con la identi cación de los motivos en secuencia que son responsables de los procesos de secreción y se ha utilizado en proteínas secretadas por vía clásica (SignalP 3.0 [11]) y para el segundo caso, el objetivo ha consistido en extraer los per les generales de subestructuras en secuencia y con estos construir algoritmos de predicción (SecretomeP 2.0 [8][9]). A partir de los métodos anteriormente descritos y teniendo en cuenta el crecimiento exponencial de información, se requieren cada día de más herramientas que esten en capacidad de catalogar y sintetizar datos que alimenten los procesos de anotación biológica, relacionando secuencias (nucleótidos y aminoácidos) con las estructuras y sus funciones biológicas [60]. En 1986, Gunnar von Heijne [57] publicó el primer método predictivo para la identi cación de sitios de hidrólisis Cleavage en la secuencia señal, desde entonces un conjunto amplio de métodos y aproximaciones diferenciales se han implementado intentando resolver los problemas intrínsecos de la clasi cación, tanto de la localización como de la identi cación de los mecanismos de transporte de proteínas, partiendo de la composición y estructura de los aminoácidos que conforman la secuencia. En la última década y con respecto a las diversas metodologías basadas en aprendizaje de máquina, la literatura reporta a las máquinas de vectores de soporte como un método efectivo para el reconocimiento de patrones de manera supervisada [134][114][106][20]. 1
Este proyecto se centró en la problematica de secreción por vía no clásica, que para el caso de bacterias sólo pudo corroborarse experimentalmente hasta 2003 [9], identi cando proteínas secretadas de
Mycobacterium tuberculosis
que a partir de la ruta de secreción no estaban siendo afectadas por
inhibidores para el reconocimiento experimental [127]. A la fecha, únicamente se ha reportado una herramienta para la predicción de proteínas secretadas por vía no clásica en bacterias Gram-positivas (SecretomeP 2.0 [9]), lo que da sustento a la aproximación de este proyecto proponiendo un método nuevo para identi car proteínas secretadas por vía no clásica. La propuesta inicial de este trabajo consistió en realizar una busqueda exhaustiva de información, identi cando los métodos de Kernel que estuvieran más explorados por la comunidad cientí ca, escalar los datos originales y realizar las tranformaciones adecuadas para construir los vectores. Además, se utilizaron las funciones de Kernel (lineal, polinomial y gaussiana), se empleó la técnica de validación cruzada para encontrar el mejor parámetro C y
γ
para entrenar el algoritmo con todo el conjunto
de datos, se identi caron los mejores parámetros y se propusieron 4 métodos con principios similares pero vectores diferentes para la clasi cación de proteínas secretadas por vía no clásica. Este documento está organizado de la siguiente manera: en la primera parte se incluye la justi cación, los objetivos, las observaciones y di cultades generales. En la segunda parte se tratan aspectos generales del aprendizaje de máquina y sus implicaciones en bioinformática, identi cando y plantenado el problema biológico a solucionar. En la tercera parte,se presentan las técnicas previamente publicadas que pretenden resolver el problema planteado de identi cación de proteínas secretadas por vía no clásica, haciendo especial énfasis en el clasi cador especí co SecretomeP 2.0 [9], frente al cual se está proponiendo una alternativa metodológica de clasi cación. En la cuarta parte se muestra y ejempli ca el proceso de exploración y la metodología planteada como propuesta alterna para solucionar el problema de clasi cación de proteínas secretadas por vía no clásica. En la quinta parte se presentan los resultados de la exploración. En la sexta parte se realiza una discusión de los resultados y nalmente, en la septima y última parte se plantean las conclusiones.
1.1 Justi cación del proyecto La clasi cación de proteínas a partir del reconocimiento de diferentes patrones identi cados sobre la secuencia de aminoácidos, ha permitido la extracción automática de información de gran valor biológico. Esto se deriva de la implementación de métodos basados en aprendizaje estadístico que han sido implementados y se encuentran disponibles a la comunidad cientí ca para la predicción de proteínas. Entre estos métodos se encuentra SignalP 3.0 [11], Gpos-Ploc [117], PA-SUB [83], PSORTb [46] entre otros, los cuales reportan resultados aceptables en la identi cación de mecanismos de secreción y localización de proteínas a partir de secuencias de aminoacidos [104]. A partir de la información publicada se han identi cado señales intrínsecas (tales como motivos o secuencias señal) que gobiernan el transporte y localización de las proteínas en las células de bacterias Gram-positivas [15]. En este sentido, la mayoría de los métodos predictivos están orientados hacia la identi cación de proteínas secretadas por vía clásica o a reportar la localización subcelular donde se ubica la misma, mientras que para la predicción de proteínas secretadas por vía no clásica (proteínas que aparentemente no poseen secuencia señal) sólo existe un método reportado [9]. Este proyecto implementó un modelo computacional para la identi cación, a partir de secuencias, de proteínas secretadas por vía no clásica basado en la teoria de los métodos de Kernel (funciones de Kernel y SVM), ya que se consideran como un método robusto para la clasi cación, tanto por sus características, como a partir de una medida de similitud.
1.1.1 Objetivo general Desarrollar un modelo computacional para la identi cación de proteínas secretadas por vía no clásica a partir de secuencias de aminoácidos. 2
1.1.2 Objetivos especí cos •
Formular un modelo para la identi cación de proteínas secretadas por vía no clásica basado en características.
•
Formular un modelo para la identi cación de proteínas secretadas por vía no clásica basado en similitud.
•
Proponer un modelo para la identi cación a partir de proteínas secretadas por vía no clásica a partir de secuencias de aminoácidos.
•
Implementar el modelo propuesto basado en similitud y características.
•
Validar el modelo propuesto mediante experimentación y comparar su desempeño con otros modelos.
1.1.3 Observaciones En el desarrollo de este trabajo y con respecto a la etapa de construcción de los conjuntos de entrenamiento se logró lo siguiente: 1. La metodología para la construcción del conjunto positivo de la aproximación de nuestros clasi cadores está basada en lo reportado por Bentsen y colaboradores [8][9]. Esta aproximación parte de la identi cación de proteínas secretadas por vía clásica, a las cuales se les extrae el mecanismo de exporte de la secuencia (primera región entre la posición 21 y la posición 55 de la cadena de aminoácidos) y la información restante es utilizada para extraer subestructuras posiblemente relacionadas con la secreción. 2. El tamaño de la muestra para construir los clasi cadores fue obtenida rigurosamente, maximizando la evidencia experimental de la información para entrenar el clasi cador aún con datos de alta dimensionalidad y con ruido (secuencias entre 50 y 10.000 aminácidos). De igual forma, se aplicaron técnicas para evitar la redundancia y se ajustó tanto el conjunto de entrenamiento como el de exploración nal con una identidad inferior al 25 %. 3. Al método de clasi cación desarrollado se le dio el nombre de SIG+SVM Sec-Independent Gram-Positive Support Vector Machine. Este método presenta 4 tipos de clasi cadores basados en el vector utlizado como entrada del modelo.Ingeniería
1.1.4 Limitaciones Entre los aspectos que pueden restringir el alcance de los resultados de este proyecto se destacan los siguientes: 1. El número de muestras en el conjunto de datos para la clase positiva fue reducido (82 proteínas >25 % identidad), por lo cual fue necesario emplear una aproximación indirecta para reconocer características intrínsecas en las proteínas que se secretan, tal como lo reporta Bentdsen y colaboradores [8, 9], y así de esta manera, poderlas clasi car, lo cual hace compleja la capacidad predictiva de las técnicas de aprendizaje estadístico. 2. El conjunto de datos que pertenece a la clase proteínas secretadas por vía no clásica presentó inconsistencias en los reportes experimentales reportados en la base de datos Swissprot, por lo cual estos datos no fueron utilizados para entrenar los clasi cadores. Sin embargo, se realizó una exploración directa probando este conjunto de datos con los métodos propuestos para contrastarlos con la capacidad de clasi cación de SecretomeP 2.0 [9].
3
Capítulo 2 Fundamentos y problemas De manera general, los métodos de aprendizaje de máquina presentan usualmente dos pasos en los procedimientos utilizados para realizar clasi cación de secuencias de proteínas. El primero corresponde a la transformación de la secuencia primaria de proteínas en un vector de características de longitud ja, y en la segunda etapa, los vectores se introducen en los métodos de aprendizaje para aprender y posteriormente realizar la predicción. En la primera etapa de desarrollo, los métodos de predicción computacional utilizaban la secuencia primaria de la proteína, empleando únicamente vectores de composición basados en el umbral de clases y por medio de métodos de análsis discriminante con una de nición simple de distancia, se realizaban los procesos de clasi cación. Algunos ejemplos de las distancias utilizadas corresponden a la distancia Euclidiana [91], la distancia de Hamming [76] y la distancia de Mahalanobis [34]. Posteriomente y teniendo en cuenta lo anterior, se utilizaron nuevos métodos predictivos utilizando algoritmos de clasi cación más complejos, pero con el mismo tipo de representación de los vectores, dentro de estos se encuentran los algoritmos maximun component coecient principle [144], Least correlation angle [33], Fuzzy clustering [145], ANN [87], Vector decomposition [41], The component coupled geometric classi cation [30], Bayesian classi cation [140] y de manera más reciente las SVM [19] y LogitBoosting [96]. Uno de los detalles más notables con respecto al progreso entre los diferentes algoritmos correspondió al efecto de emparejamiento entre los aminoácidos como lo reporta Chou en 1995 [26]. En trabajos recientes se han mejorado los métodos de predicción de clases a partir de representaciones alternativas de las secuencias; entre las metodologías reportadas se encuentran las funciones de autocorrelación basadas en la energía de residuos no enlazantes [21], composición de polipéptidos [85] y la composición de dominios funcionales [29]. Basados en las recomendaciones de Kurgan y Homaeian [80] y Kedarisetti y colaboradores [72] se debe deben tener en cuenta y evitar los siguientes problemas: 1. Frecuentemente los algoritmos anteriormente descritos son únicamente probados con conjuntos pequeños a los que no se les practican procedimientos de ajuste de sus conjuntos de entrenamiento y validación, obteniendo resultados sesgados (entrenamiento con datos muy similares). 2. Al publicar nuevos métodos no se realizan comparaciones con ables contrastantes con otros métodos anteriormente publicados. 3. El uso de diferentes tipos de representación de las secuencias es muy restringido.
2.1 Aprendizaje de Maquina Los métodos de aprendizaje de máquina pueden ser divididos en supervisados, semi-supervisados y no supervisados. Se dice que el aprendizaje es supervisado cuando a un algoritmo de aprendizaje se le proporciona un conjunto de ejemplos junto a la clase a la que pertenecen, y se prueba en un conjunto 5
de datos en los que no se conocen las clases a las que pertenecen. Para el caso de la identi cación de secuencias, se construyó una herramienta bajo la teoría de aprendizaje supervisado siguiendo sus parámetros, por esta razón no se dan detalles sobre el aprendizaje semi-supervisado y no supervisado [25][129]. Las técnicas anteriormente descritas, se han empleado extensivamente en el área de la bioinformática y particularmente en el análisis de datos y clasi cación, debido a que poseen ventajas tales como: robustez, exibilidad y e ciencia, por lo cual, los métodos estadísticos convencionales en algunos casos han sido sustituidos y en otros complementados, porque, en general se basan en presunciones muy fuertes que limitan su campo de acción y la signi cancia de sus resultados [12]. Para resolver problemas de clasi cación, inicialmente se realiza una partición del espacio de entrada, restringido a una muestra y se aplican técnicas de aprendizaje computacional tales como árboles de decisión, K vecinos mas cercanos
KNN ,
SVM , ANN , Naive Bayes ,
entre otras [39].
La aplicación de estas técnicas se efectúa en los procesos de ltrado, selección de características y en los pasos de minería de datos de las diferentes fuentes de información, así como en el desarrollo de sistemas de clasi cación. En estos pasos se incorporan herramientas estadísticas de análisis de datos y heurísticas que permiten el tratamiento y ltrado de la gran cantidad de información disponible [99]. El requisito fundamental para que los métodos predictivos sean e cáces, consiste en que el conjunto de datos con el que se les entrene sea idóneo. En otras palabras, la selección del conjunto de datos es muy importante para la construcción del método de predicción. Se debe tener en cuenta que aunque se tenga un algoritmo so sticado, si el conjunto de entrenamiento es pobre, sólo se obtendrán resultados regulares [93]. Por otro lado, la aproximación a la predicción de la localización subcelular de proteínas por medio de máquinas de aprendizaje se ha venido implementando en los últimos años a partir de la idea, ya con rmada, de que estos sistemas de predicción automática son con ables para el análisis de secuencias y se pueden escalar según las necesidades, teniendo en cuenta el tamaño de la información que suele manipularse (genes y proteínas) y las condiciones actuales en las que ésta es generada [60]. En los últimos años, la biología ha logrado generar y caracterizar información de manera económica y en gran volumen, lo cual ha desencadenado la necesidad de desarrollar métodos cada vez más e cientes para la representación, almacenamiento, procesamiento, análisis y extracción de conocimiento, generando de manera paralela, tanto el desarrollo de ténicas de extracción de información como de metodologías de gran nivel. De este conjuto de métodos, los métodos de Kernel, han obtenido en menos de 10 años un amplio reconocimiento y popularidad en los problemas relacionados con la clasi cación y análisis de datos de alta dimensionalidad o de gran complejidad [136]. Al respecto, los primeros investigadores en explorar estas ténicas en los problemas biológicos fueron Mukherjee y colaboradores en 1998 [88], Haussler y colaboradores en 1999 [56] y Jaakkola y colaboradores en 1999 [62]. Basados en resultados anteriores se han reportado dos motivaciones para considerar a las SVM en la biología computacional como una técnica adecuada para la clasi cación de información. La primera está relacionada con el hecho de que muchos de los problemas biológicos presentan alta dimensionalidad y sus datos presentan ruido. Sin embargo, las SVM han sido reconocidas como un método estable aún con este tipo de condiciones en comparación a otros métodos de aprendizaje de máquina. La segunda motivación que se contrasta con con la mayoría de los métodos de aprendizaje de máquina, es que las SVM pueden utilizar datos no vectoriales como por ejemplo grafos como entrada del modelo y comportarse de manera adecuada según el problema y el objetivo establecido para el mismo [95]. En los métodos de aprendizaje existe un concepto fundamental que debe sustentar la metodología de investigación que se plantee y es el hecho de que se deben buscar métodos que resuelvan los problemas de nidos de la manera más simple posible, sin perder la precisión, lo cual implica que un sistema de aprendizaje debe poder realizar búsquedas dentro de un espacio de información pequeño, bajo la de nición de hipótesis simples. Como se está de niendo un espacio pequeño, recorrerlo no debe generar problemas para que así el investigador pueda, según sus necesidades, ampliar los espacios de búsqueda y, complejizando las hipótesis de investigación, se puedan ajustar de ciencias metodológicas [59]. Para el problema que se presenta en este trabajo, juegan un papel fundamental la selección de los conjuntos de entrenamiento, las diferentes representaciones de los mismos como vectores de en6
trada para los clasi cadores, así como los métodos de Kernel y sus diferentes clases, que básicamente se derivan de modelos probabilísticos. En este sentido es fundamental tener presente que el objetivo primordial que describen los métodos de Kernel está de nido por la cercanía entre dos objetos cuando estos pueden compartir subestructuras raras pero comunes para los dos [135]. Por otro lado, es importante tener en cuenta que tal y como lo establece Vert [136], el proceso para decidir que metodología emplear generalmente resulta de la relación entre el desempeño del clasi cador y la capacidad computacional.
2.1.1 Representación de la información Un problema fundamental en bioinformática se encuentra directamente relacionado con la manera en que los datos se representan como objetos en el espacio. Este requerimiento se hace necesario para solucionar problemas tanto de clasi cación como de agrupamiento. Por ejemplo, en el caso de las secuencias de proteínas, estas presentan longitudes variables que hacen difícil lograr representarlas como vectores, pero pueden ser representadas como grafos [17] ó a partir de anotaciones que implican información biológica tal como su función, permitiendo así construir representaciones homogéneas más fáciles de procesar [101]. Uno de los mayores obstáculos reconocidos en los procesos rigurosos de análisis estadístico sobre información biológica, se encuentra directamente relacionado con la manera como las moléculas están representadas. A este problema se le conoce como problema de métrica en secuencia y se asocia a la problemática del uso directo de códigos alfabéticos debido a que las letras carecen de una métrica implícita natural para su comparación. Por ejemplo, el aminoácido leucina (L) es más similar con respecto a sus propiedades sicoquímicas a la valina (V) que lo que la leucina es a la alanina (A). Sin embargo, la distancia alfabética entre estas letras no re eja una relación directa por la estructura del alfabeto. Esto hace que el uso nominal de variables a partir de secuencias resulte en una notable perdida de resolución e información con respecto a las propiedades sicoquímicas de los aminoácidos cuando estos son comparados [5]. Por otro lado, para incrementar la representacion de los datos, se pueden utilizar diferentes fuentes que den información referente a éstos. En la medida en que se incrementan tanto la cantidad como la calidad de las fuentes de información referente a los datos, se facilita el proceso de toma de decisiones y en consecuencia la precisión de los resultados. Por el contrario, en muchos casos la representacion de los datos es diferente de los objetos, lo cual implica que no pueden ser representados signi cativamente de la misma manera, y causa pérdida en la información. En el proceso de representación de los datos, la idea abstracta de puntos en el espacio se puede asociar a pensar en los datos como objetos que representan conjuntos de características derivadas de las medidas estimadas para cada uno [7]. Como lo de nen Archley y colaboradores [5], para el caso especí co de secuencias de proteínas, su conformación está compuesta por largas cadenas alfabéticas más que por arreglos de valores numéricos, lo cual signi ca que en ausencia de una métrica natural implícita para comparar este tipo de datos alfabéticos, se inhibe el uso de sos sticados análisis estadísticos para el estudio de las secuencias, sus estructuras y aspectos funcionales [5]. En estudios previos, diferentes autores como Atchley y colaboradores [4], han trabajado directamente en los problemas relacionados con la métrica en secuencia, aportando diferentes maneras para resolver el problema. En algunos casos se han construido índices cuantitativos ad hoc para resumir la variabilidad de los aminoácidos, pero estos métodos generalizan sólo una parte del total de la variabilidad de los atributos de los aminoácidos [51]. Actualmente, la comunidad cientí ca por medio del uso de la teoría de la información ha aceptado caracteres alfabéticos, por ejemplo aplicando análisis de entropia e información mutua, para describir la variabilidad y covarianza entre los sitios donde están los aminoácidos [77]. 7
Table 2.1: Clasi cación de la representación de los vectores construidos para los clasi cadores. Vectores Característica de la
De nición
Frecuencias
Dipéptidos
Factores
PSSM
representación Secuencial [32][31].
Serie sucesiva de códigos
X
de aminoácidos acorde a un determinado orden. No secuencial o
Conjunto de números
discreto [32][31].
discretos.
Variables
Transformación de las
sicoquímicas y
secuencias por sus
propiedades biológicas
variables sicoquímicas.
X
X
X
X
X
[82][5]. Estructuras derivadas
Implica la composición
de secuencia [82].
extraida en frecuencias
X
X
X
de los K-meros. Similitud [66][31].
Información evolutiva
X
implicita en la representación
2.1.1.1 Vectores basados en características Los vectores de características se obtienen de la extracción directa de variables a partir de la secuencia misma y su estructura. Por ejemplo, los porcentajes de composición de los 20 aminoácidos forman el conjunto de parámetros del vector [38]. En este trabajo se encuentran incluidos en esta categoría los vectores de frecuencias, dipéptidos y factores y sus características generales se pueden observar en la tabla.
2.1.1.2 Vectores basados en similitud Existen diferentes métodos basados en similitud que permiten a partir de una proteína, construir per les mediante procesos comparativos y con transformaciones matemáticas, construir vectores que las representen. Dos de las ténicas más reconocidas correponden al método de construcción de per les de familias de proteinas [52] y a PSI-BLAST [2]. Este último incorpora información relacionada con la composición de aminoácidos, la posición especí ca de sustituciones y la información correspondiente a los residuos conservados evolutivamente [2], lo anterior se ve representado en la matriz PSSM (de su sigla en inglés: Position-speci c scoring matrix) con la que se construye el vector PSSM y sus características generales se pueden observar en la tabla 2.1. Se considera la conversión de la matriz al vector PSSM como uno de los métodos más satisfactorios para representar las secuencias, básicamente porque que a partir de secuencias homólogas de alta similitud permite detectar secuencias homólogas con baja similitud (homólogos remotos). El proceso se describe como un proceso de contraste entre la proteína candidata contra un conjunto de proteínas relacionadas que identi ca el algoritmo PSI-BLAST. Este tipo de esquema produce modelos generativos en el sentido en que construye un modelo a partir del conjunto de proteínas relacionadas y consecuentemente evalúa la manera en la que el modelo representa a la proteína candidata [102]. 8
2.1.2 Métodos de Kernel Las funciones de Kernel están inscritas dentro de un marco para el análisis de patrones por medio de métodos de aprendizaje estadístico que presentan dos módulos claramente de nidos según ShaweTaylo y Cristianini [116]. El primero esta relacionado directamente con la función de Kernel y establece un mapeo tácito de los datos de entrada en un nuevo espacio denominado espacio de características, también conocido como el espacio de Hilbert. Este mapeo está implícitamente establecido por medio de una función de nida sobre pares de datos del espacio de entrada en los reales y que, cumpliendo con ciertas propiedades, constituyen el producto punto de los datos de entrada en el espacio de características. El segundo, se re ere directamente a la adaptación de las técnicas de aprendizaje estadístico en función de los productos punto de los datos, que generalmente se toman en un principio como problemas lineales y se plantean luego como problemas duales. De esta manera se pueden expresar de manera lineal como combinaciones de productos punto, a partir de los datos de entrada [101]. Scholkopf y colaboradores [112] reportan que los métodos de Kernel tienen las siguientes propiedades:
•
Están en capacidad de desacoplar el algoritmo de aprendizaje de la representación de los datos, tomando la matriz de productos punto en el espacio de las características obtenidas por medio de la función de Kernel, lo que afecta directamente la complejidad algorítmica de la técnica haciéndola no dependiente de la dimensionalidad del espacio de características.
•
La capacidad conocida como Kernel
T rick
que se re ere a que los datos que sean obtenidos de
clases que no son linealmente separables en el espacio original, pueden formar clases linealmente separables en el espacio de características embebido. Los métodos disponibles para construir modelos computacionales asociados a la clasi cación de proteínas pueden ser de nidos teniendo en cuenta las siguientes características protéicas: composición de aminoácidos (métodos basados en el orden) y presencia de péptido señal (metodologías híbridas que usan diferentes fuentes de información como la homología y que se soportan con técnicas probabilísticas) [111]. Para el entrenamiento de modelos predictivos se debe enfatizar en la comprensión de las diversas características de las proteínas y en la interacción apropiada de los datos, lo que debe conducir a ajustar las anotaciones obtenidas para la información que se quiera identi car. Por otro lado, estas características están sujetas a los ambientes en los cuales las proteínas funcionan, controlando su acceso y disponibilidad para interactuar con otras moléculas [115]. Un paso fundamental en el proceso de uso de las funciones de Kernel se basa en la elección de la medida de similitud. La gran mayoría de los algoritmos utilizados para clasi cación son lineales, entre ellos las SVM, lo cual implica que las clases no pueden ser siempre separadas de manera lineal y obliga a utilizar métodos más complejos, tales como las funciones de Kernel que permiten cambiar la manera de representar los datos. Las funciones de Kernel utilizan los vectores de entrada en vez de utilizar las coordenadas de los vectores en el espacio para calcular matrices de similitud. En consecuencia, si una matriz de ne las similitudes de manera coherente, ésta se considera como una matriz de Kernel [99]. Una de las grandes ventajas de las funciones de Kernel se encuentra directamente relacionada con la facilidad para combinar datos, ya que la representación de los mismos es independiente de su estructura, debido a que para todos los objetos se utilizan vectores de similitud. Esto permite que si se tienen datos a partir de diferentes fuentes relacionadas al mismo objeto, fácilmente se puedan combinar sus funciones. Otra gran ventaja es que con este método también se pueden utilizar medidas de similitud no lineales, permitiendo que los objetos sean mapeados en un espacio implícito de nido de mayor dimensión, en el cual una separación lineal es posible. En el proceso de decisión acerca de que tipos de Kernel se deben tener en cuenta, existen dos recomendaciones reportadas por Vert [136]: 1. No existe una función de Kernel que de manera universal sea considerada como la mejor. 2. La escogencia de la función de Kernel depende del objetivo de la aplicación. 9
En muchos casos aplicados, los Kernels para clasi cación no lineal proveen mayor precisión, pero aún asi, los clasi cadores lineales presentan varias ventajas. Una de ellas es que estos métodos ofrecen un proceso de entrenamiento simple que se puede escalar bien, a partir del número de ejemplos [14]. Por otro lado y en general, los Kernels aplicados en bioinformática se pueden clasi car en tres tipos: los Kernels de evaluación real de datos, los Kernels para secuencias y los métodos desarrollados de manera especí ca como el PSSM-Kernel [102], entre otros. En el primer caso, generalmente los ejemplos que representan un conjunto de datos son vectores con una dimensionalidad. Los más comunes corresponden a las funciones lineal, polinomial y gaussiana. En el segundo caso, los Kernels más
Spectrum Kernel [81], los Kernel que Weighted Degree W D Kernel [121] y otros Kernels en secuencias tales Local Alignment Kernel, entre otros [137][7]. Para efectos de este trabajo se utilizaron los
frecuentes corresponden a los que describen el contenido l-mer usan información posicional como el
métodos de Kernel lineal, polinomial y gaussiano. De manera concluyente, se debe tener en cuenta que el área que comprende tanto la parte teórica como práctica y los fundamentos tanto de las funciones de Kernel como de las SVM se encuentra en pleno desarrollo y aún existen detalles pendientes por profundizar, relacionados directamente con la integración de diferentes funciones de Kernel, así como también en la generación de nuevos métodos más generales que sean positivamente de nidos. Lo anterior sugiriere que los desarrollos teóricos están progresando de manera rápida a la par con las necesidades aplicadas [136].
2.1.3 Selección del Kernel y su correspondiente modelo En el proceso de selección del Kernel, sus parámetros y la variable
C
de la margen suave, se debe
tener en cuenta que la escogencia es completamente independiente de los ejemplos utilizados para la evaluación del desempeño del método, ya que de lo contrario se podría sobreestimar la precisión del clasi cador para los datos nunca antes vistos por el modelo de clasi cación planteado. Para evitar lo anterior, se debe dividir el conjunto de entrenamiento en varias partes, tanto para entrenar como para evaluar y ajustar la SVM, y así obtener un clasi cador que esté en capacidad de clasi car las clases correspondientes sin perder la generalización. En el mismo sentido, técnicas como la validación cruzada
N − fold
pueden ayudar si las partes del conjunto de entrenamiento son muy pequeñas para
obtener una medida de con anza del desempeño de la predicción [129].
2.1.3.1 Funciones Lineales Se conocen como el método de Kernel más básico y se de nen:
K(x, y) = x · y
(2.1)
Cuando se utiliza esta función de Kernel, el espacio de los vectores y el espacio de características es el mismo [141]. En un proceso de selección de funciones de Kernel, este tipo de función normalmente se utiliza como primera medida y posteriormente, se aplican métodos más complejos. Este método se ha empleado en diferentes herramientas bioinformáticas presentando resultados excelentes, especialmente cuando la dimensionalidad de los datos de entrada al modelo es grande y el número de ejemplos es pequeño [7][44].
2.1.3.2 Funciones Polinomiales Este método presenta la siguiente función y se de ne:
K(x, y) = (1 + x · y)p
(2.2)
De manera implícita, el tipo de función mapea los datos de entrada en un espacio de características con una dimensionalidad
O(Dp ).
Se debe tener precaución con este tipo de función porque por su 10
exiblidad en el manejo de las variables se puede facilitar negativamente el sobreentrenamiento en conjuntos de gran dimensionalidad con un bajo número de ejemplos [7][44].
2.1.3.3 Funciones Gaussianas También conodido como
Radial basis function − RBF . K(x, y) =
Este método presenta la siguiente función:
− | x − y |2 e
2σ 2
(2.3)
Se debe tener precaución con este tipo de función porque por su exiblidad en el manejo de las variables se puede facilitar negativamente el sobreentrenamiento en conjuntos de gran dimensionalidad con un bajo número de ejemplos [7][44].
2.1.3.4 Normalización Los clasi cadores de margen amplio se caracterizan porque son sensibles a la manera como las características son escaladas, lo cual hace que sea esencial el proceso de normalización de los datos. La normalización puede ser aplicada en diferentes etapas del proceso, por ejemplo sobre las características de entrada o a la altura del Kernel (normalización en el espacio de características) o en ambas situaciones. Cuando las características son medidas en diferentes escalas y presentan diferentes rangos de valores posibles, es conveniente escalar los datos a un rango común. Los procesos de normalización hacen que los resultados di eran considerablemente cuando se utilizan las funciones lineales, polinomiales y gaussianas. En general, los procesos de normalización se asocian directamente con mejoras en el desempeño tanto en Kernels lineales como no lineales, acelerando los procesos de convergencia cuando se entrenan los clasi cadores [7].
2.1.4 Máquinas de Vectores de Soporte (SVM) Dentro de las técnicas basadas en aprendizaje con Kernels, se destaca el método de clasi cación denominado SVM, que funciona mediante la búsqueda de un hiperplano óptimo de separación, que se de ne en el espacio de características y que determina el margen de separación óptimo de los datos, por lo cual maximiza la capacidad de generalización del patrón detectado; este hiperplano de separación se entrena por medio de programación cuadrática [36]. Muchos de los problemas en biología computacional se deben soportar por medio de predicciones. Las SVM y las funciones de Kernel son muy efectivas para solucionar este tipo de problemas, ya que presentan gran precisión y gran capacidad para conjuntos de datos grandes y de gran dimensión, aparte de que están en capacidad de modelar de manera exible datos a partir de fuentes diversas [7]. La manera más simple de abordar los problemas de clasi cación es hacerlo de manera binaria, intentando discriminar objetos representados en dos categorías: positiva (+) y negativa (-). Las SVM están basadas en dos conceptos para resolver este problema. El primero, es el margen amplio de separación y el segundo se conoce como los métodos de Kernel. La base de la primera está motivada por la clasi cación de puntos en dos dimensiones. Es importante establecer que a pesar de los esfuerzos que se han realizado para desarrollar algoritmos e caces, el efecto de la selección de las características en la precisión de las SVM para clasi car aún genera debates. En algunos casos se reportan resultados positivos en la selección de características, mientras que en otros estudios se concluye que la selección de características de manera automática, con procesos como la eliminación de características de manera recursiva
RFE , actualmente no mejoran
la precision de las SVM. La relevancia de los algoritmos para la selección de características es un área de investigación en curso [136]. Por otro lado, el proceso de entrenamiento de las SVM incluye fundamentalmente conocer a profundidad las características y el comportamiento de los conjuntos de entrenamiento; la selección de las funciones de Kernel adecuadas con sus correspondientes parámetros y su proceso de regularización para el parámetro C en el caso c-SVC y nu en el caso nu-SVC [146]. 11
2.1.4.1 C-SVC Este tipo de SVM se encuentra dentro de la distribución de LIBSVM [24], fue propuesto por Cortés y colaboradores en 1995 [36]. Dado un conjuto de entrenamiento de los pares de las instancias etiquetadas
(xi , yi ), i = 1, ..., l
donde
xi Rn y y∈ {1, −1}l ←la
SVM requiere una solución para el problema de
optimización dado y se de ne:
l
mín
ω,b,ξ
X 1 T ω ω+C ξi 2
(2.4)
i=l
yi (ω T φ(xi ) + b ≥ 1 − ξi ξi≥0 La SVM encuentra un hiperplano lineal de separación con el máximo margen en un espacio de más dimensionalidad. Siendo
C >0
el parámetro de penalización utilizado para el error, la función
de decisión se de ne:
l X sgn( yi αi K(xi , x) + b)
(2.5)
i=1
2.1.4.2 nu-SVC Este tipo de SVM también se encuentra dentro de la distribución de LIBSVM [24] propuesta por Cortés y colaboradores en 2001 [113]. El parámetro
v ∈ (0, 1)
al igual que el límite superior sobre la
fracción en los errores de entrenamiento y el límite inferior en la fracción de los vectores de soporte. Proporcionando vectores de entrenamiento que
yi =∈ {1, −1}.
xi ∈ Rn , i = 1, ..., l
en dos clases y el vector
y ∈ Rl
tal
La forma primal se de ne:
l
mín
ω,b,ξ
1X 1 T ω ω − ϑρ + ξi 2 l i=1
(2.6)
yi (ω T φ(xi ) + b ≥ ρ − ξi ξi ≥ 0 , ρ ≥ 0 La función de decisión es:
sgn(
l X yi αi (K(xi , x) + b)
(2.7)
i=1
2.1.5 Evaluación Los métodos de predicción pueden llevarse a cabo estableciendo los parámetros del umbral de manera dependiente o independiente, cada método tiene sus limitaciones. Se pueden calcular cuatro parámetros dependientes del umbral: sensibilidad, especi cidad, precisión y el coe ciente de correlación de Matthews (MCC) para analizar el desempeño de la validación cruzada y evaluar la precisión para predecir las secuencias independientes del conjunto de datos. A continuación se describen los parámetros (VP: verdadero positivo, FN: falso negativo, VN: verdadero negativo y FP: falso positivo)
Sensibilidad(Sn) = 12
VP x100 V P + FN
(2.8)
La sensibilidad corresponde al porcentaje de proteínas que se predicen correctamente como secretadas o verdaderos positivos, como se muestra en la ecuación 2.8.
Especif icidad(Sp) =
VN x100 V N + FP
(2.9)
La especi cidad corresponde al porcentaje de proteínas no secretadas predichas correctamente como no secretadas, como se muestra en la ecuación 2.9.
P recisi´ on =
VP +VN x100 V P + V N + FP + FN
(2.10)
La precisión está relacionada con el porcentaje de proteínas predicho correctamente como proteínas secretadas por vía no clásica y no secretadas, del número total de secuencias de proteínas, como se muestra en la ecuacíon 2.10.
(V P xV N ) − (F P xF N ) M CC = p (V P + F P )(V P + F N )(V N + F P )(V N + F N )
(2.11)
Cuando el MCC corresponde a 1 signi ca que la predicción obtenida es perfecta mientras que 0 implica que la predicción se dá de manera completamente aleatoria. La ecuación está de nida en 2.11. Establecer el umbral de los clasi cadores es muy útil para el proceso de toma de decisiones, sin embargo, éste falla en el momento de re ejar el desempeño del clasi cador independiente del umbral. Para resolver este problema existen diferentes métodos que calculan el umbral independiente del desempeño, entre estos, una de las metodologías de medida más ampliamente usadas corresponde a las curvas ROC Receiver
Operating Characteristic
[120]. Este tipo de medida se obtiene de gra car todos los valores
de sensibilidad (fracción que corresponde a los verdaderos positivos) en el eje su equivalente de especi cidad en el eje
x
y
contra los valores de
(fracción que corresponde a los falsos positivos). El área por
debajo de la curva ROC se reconoce como AuROC Area
under Receiver Operating Characteristic
y
es considerada como un índice fundamental porque aporta una medida única sobre el umbral total independiente de la exactitud. Para el caso de la ROC, si el valor es igual o menor a 0.5, los puntajes de las dos clases no di eren mucho, mientras que valores cercanos a 1.0 indican que no se presentan solapamientos entre las distribuciones de los grupos de puntajes [49][1]. La ventaja de utilizar la curva ROC es que provee soporte tanto estadístico como grá co para caracterizar el desempeño de los clasi cadores, permitiendo así, establecer su comportamiento bajo diferentes condiciones de cambio, tales como los costos de una errada clasi cación o la distribución de clases, y tienen la capacidad de ser plenamente informativas, más que una medida de desempeño simple. Sin embargo, la variabilidad de los datos usados para construir los métodos generan problemas a la hora de realizar modelos comparativos, por esta razón es recomendable que los algoritmos puedan ser evaluados con conjuntos de validación bien controlados a partir de protocolos de comparación estandar. Es importante también aclarar que el análisis ROC caracteriza los rangos potenciales de los algoritmos más no el desempeño como tal del clasi cador. Por esta razón, es fundamental evaluar simultneamente el desempeño de los clasi cadores, incluyendo otros métodos de evaluación y medida dentro de los procesos de la investigación [120]. Como parte del proceso de ajuste para la construcción del modelo predictivo, se debe tener en cuenta que un modelo sin un adecuado proceso de validación, puede simplemente generar hipótesis de manera azarosa. El proceso de validación se debe realizar de manera objetiva a partir de criterios y procesos para evaluar y sustentar el modelo construido. Se debe tener en cuenta que para poder sustentar la capacidad de un modelo es fundamental tener presentes dos conceptos: el poder discriminante y su calibración. El primero, está directamente asociado con la manera como el modelo mismo está en capacidad de separar las clases para las que se construyó, mientras que en el segundo caso, la calibración está directamente relacionada con la manera como el modelo predictivo realiza sus predicciones sobre un nuevo conjunto de datos [124]. 13
2.2 Identi cación y localización de proteínas Dentro del conjunto de proteínas que se secretan, se encuentran las proteínas de membrana, las extracelulares y las ancladas a membrana ubicadas de manera extracelular, entre otras. Estas realizan diferentes funciones para la célula o el organismo, pero para llegar a localizarse en el compartimento celular donde desempeñan su función, se deben dar procesos diferenciales que van desde métodos de transporte de pequeñas moléculas hasta rutas altamente complejas con procesos de señalización intrínseca en secuencia. Gran parte de los esfuerzos en la actualidad con esta problemática se concentran en comprender cómo funcionan estos sistemas de transporte. En los últimos años, la identi cación de proteínas ubicadas a nivel de membrana ha permitido direccionar parte de las investigaciones en el desarrollo de drogas, desarrollando productos que presentan efectos especí cos sobre este tipo de proteínas [74][42]. El primer estudio publicado de secreción por vía no clásica en bacterias reporta la secreción de la glutamina sintetasa (GlnA) de la bacteria Gram-positiva
Mycobacterium tuberculosis.
Por varios
años, ha sido reconocido que éste organismo secreta proteínas antigénicas que carecen de péptido señal, característica fundamental para el reconocimiento de proteínas secretadas por vía clásica, lo cual evidencia la necesidad e importancia de desarrollar nuevas y mejores aproximaciones al análisis para analizar problemática [55]. El caso explícito y como ejemplo de proteínas que se han reportado para
M tuberculosis
como
secretadas por vía no clásica, está el mecanismo de translocación del sistema SNM (Snm1 Rv3870 , Snm2 Rv3871 and Snm3 3877 ) [123]. En la actualidad, la cantidad de proteínas reportadas como secretadas por vía no clásica hacen de este evento un problema interesante de caracterizar, teniendo en cuenta que ya se ha podido identi car que la mayoría de los factores de virulencia generalmente se secretan por medio de sistemas especializados independientes de la vía de secreción clásica [70][130].
2.2.1 Secreción de proteínas en bacterias El transporte y la localización de la mayoría de las proteínas de los procariotes, que en este caso correponde al origen de las proteínas utilizadas para construir el clasi cador, se produce a través de una cascada de acontecimientos dirigidos por la presencia de una secuencia señal o por el reconocimiento de motivos que puedan encontrarse incluidos dentro de la misma; las proteínas procesadas de esta forma son comunmente referidas como proteínas secretadas por vía clásica [86][75]. Por otro lado, se de ne exporte como el proceso de localización de proteínas no citoplasmáticas dentro de la envoltura celular en contaste con la de nición de secreción que esta directamente relacionado con proteínas extracelulares que se encuentran afuera o en la pared externa de la bicapa lipídica [40][98]. En bacterias Gram-positivas, la secreción de proteínas se puede clasi car al menos en 4 diferentes destinos: el citoplasma, la membrana citoplasmática, la pared celular y el medio extracelular. Estas localizaciones son el resultado de diferentes procesos tales como la síntesis de proteínas que tiene lugar en el citoplasma, pero para que las proteínas realicen sus procesos funcionales deben ser transportadas a la pared o a través de ésta por medio de un mecanismo conocido como translocación. Para el caso de la secreción por vía clásica, la translocación de proteínas se realiza por la síntesis del precursor de las proproteínas [22][100]. En general, las proproteínas son inicialmente reconocidas como factores objetivo a ser transportados a la membrana, donde son translocadas a través de los canales proteináceos, removiendose el péptido señal y dependiendo de sus características estructurales y funcionales localizandolas en la pared celular o extracelularmente [132]. La ruta de secreción sec dependiente ha sido bien de nida en bacterias y se encarga de transportar precursores no plegados [132]. El substrato de transporte conserva la estructura de la secuencia localizada en la región amino-terminal, la cual está caracterizada por la presencia de 3 regiones: en el extremo amino-terminal se encuentra una región positivamente cargada (Región N), seguida por una región hidrofóbica (Región H) y una última región polar hacia el extremo carboxi-terminal (Región C), lo anterior se puede observar en la gura 2.2 [18]. La SPasa remueve proteolíticamente la secuencia 14
Figura 2.1: Clasi cación de las vías de secreción reportadas para bacterias Gram-positivas. En la gura 2.1, modi cada de Zhou y colaboradores [147] se presenta la clasi cación de rutas. Las proteínas se pueden dividir en dos subgrupos: (i) con extremo anclado hidrofóbicamente (anclaje-N), (ii) con extremo anclado hidrofóbicamente C-terminal, (anclaje-C), (iii) con anclaje lipídico covalente, (iv) anclada a pared celular covalente/no covalente, (v) secretada (de nidas como secretada Sec/Tat e hidrolisada por la señal peptidasa I) y (vi) secretada por vía no clásica, reconocida como una vía de secreción menor [37][131]. Según la clasi cación de SwissProt, las proteínas pueden categorizarse así: en citoplasma, de membrana (multi-transmembranal, con anclaje N/C), de pared celular (ancladas LPxTG) y en el medio extracelular (anclaje lipídico, secretada, parecida a bacteriocinas) [147].
señal y esta modi cación permite que la proteína cambie al estado maduro y se ancle a la membrana citoplasmática [109]. Aparte del sistema de secreción sec dependiente existen otros sistemas de transporte como el de translocación Tat y el de transporte Lipobox. Para el caso de la ruta Tat Twin arginine translocation pathway se han realizado amplios estudios en
Escherichia coli
y el trasporte de proteínas
plegadas que presentan el motivo consenso S/T-RR-x-FLK en el extremo de la región N-terminal [108][97][9]. El transporte de lipoproteínas ocurre a partir del reconocimiento de la secuencia consenso llamada lipobox presente en la región carboxi-terminal de la secuencia señal. El lipobox dirige el procesamiento de la pro-lipoproteína a un estado maduro y sirve como anclaje sobre la super cie de la célula [69]. El motivo en secuencia está de nido como [LVI][ASTVI][GAS]C [105][100].
2.2.2 Secreción de proteínas por vía no clásica La secreción de proteínas bacterianas implíca que mecanismos complejos de translocación transporten proteínas a través de las membranas bacterianas de manera activa. Dada la complejidad de este tipo de sistemas de secreción, no es sorprendente que constantemente se descubran nuevos mecanismos de 15
Figura 2.2: Estructura de péptidos conocidos presentes en bacterias Gram-positivas. En la gura 2.2, modi cada de Zhou y colaboradores [147] se presenta la estructura de los péptidos señal conocidos y asociados a diferentes vías de translocación. La estructura completa de los peptidos señal Tat y sec-dependientes se conserva de manera consecutiva para las regiones N, H y C. La región N es el incio de la proteína que contiene residuos cargados positivamente. La región H sigue a la región N y corresponde a la subcadena consecutiva de residuos hidrofóbicos y presenta una helice-α en la membrana. La region C contiene la señal para la hidrólisis por parte de la señal peptidasa. Dentro de las señales de retención de hidrólisis se incluye la SPasa I tipo AxAA [131], el lipobox tipo L-x-x-C para el sitio de hidrólisis de la SPasa II [125] y el substrato de clivaje Tat AxA [122]. El motivo tipo LPxTG es un tipo de señal C-terminal que está involucrada en enlaces covalentes de las proteínas al peptidoglicano de la pared celular. Los péptidos señal de las proteínas objetivo en los casos de secreción menor no siguen la estructura N-H-C [133][58].
secreción. Así, las proteínas experimentalmente identi cadas como secretadas, pero para las cuales no se ha identi cado el mecanismo o ruta de secreción, se reconocen como proteínas secretadas de manera no clásica. Es importante resaltar que muchas de las proteínas que son secretadas por las vías alternativas se encuentran directamente asociadas con procesos de patogenicidad, lo que las convierte en un objetivo fundamental de identi cación para poder caracterizarlas y conocer más de sus procesos biológicos [10]. Por otro lado, es importante tener en cuenta que existen muchos mecanismos de secreción por caracterizar, lo cual evidencia problemas tanto experimentales como de análisis computacional para poder identi car nuevos mecanismos y rutas. Finalmente, se considera que de manera genérica la clasi cación secreción por vía no clásica no se debe considerar como un único mecanismo de secreción [92].
2.2.3 Secreción por vía clásica en otros grupos biológicos En contraste con la secreción de proteínas en procariotas (grupo biológico al cual pertenecen las bacterias), en células eucariotas las proteínas secretadas de manera no clásica (proteínas secretadas por vía no clásica por medio del retículo endoplasmático/Golgi-independiente) fueron descubiertas hace 16
aproximadamente 15 años, pero el mecanismo molecular y la identidad de los componentes implicados en este proceso no han sido aún completamente dilucidados. Mas allá de resolver los problemas directos relacionados con la biología celular, los análisis moleculares de estos procesos poseen un alto grado de importancia desde la perspectiva biomédica, pues estas rutas de exportación se consideran fundamentales para comprender muchos de los procesos celulares en inmunología, tales como el mecanismo de acción de las las citoquinas proin amatorias, los factores de crecimiento, los componentes de la matriz extracelular que regulan la diferenciación celular, su proliferación y apoptosis, proteínas virales y proteínas presentes en la super cie de parásitos que puedan estar potencialmente asociadas con procesos de infección al hospedero [9].
17
Capítulo 3 Trabajo previo (otros autores) 3.1 Métodos entrenados para el reconocimiento de proteínas secretadas por vía no clásica Se han construido diferentes métodos predictivos para determinar que una proteína se secreta por vía no clásica tales como SecretomeP 1.0 (entrenado con proteínas de mamíferos) [8], SecretomeP 2.0 (entrenado con proteínas de mamíferos y bacterias Gram-positivas y Gram-negativas) [9] y SRTPRED (entrenado con proteínas de mamíferos) [50]. Únicamente la versión de SecretomeP 2.0 ha sido entrenada con proteínas pertenecientes a bacterias y de manera independiente, por lo cual se escogió esta herramienta para contrastar nuestros resultados, teniendo en cuenta la versión entrenada con proteínas de bacterias Gram-positivas que está disponible al público y fue desarrollada por uno de los grupos
Center f or Biological Sequence Analysis, CBS Technical University of Denmark , DTU . Dentro de los diferentes métodos para la
de inmunoinformática más reconocidos del mundo el perteneciente a
predicción de localización e identi cación de proteínas y sus vías transporte se reconocen dos tipos de métodos, el primero es reconocido como basado en características y el segundo se reconoce como los predictores generales [47].
3.1.1 SecretomeP 2.0 server, clasi cador para bacterias Gram-positivas Está de nido como un método para la identi cación de proteínas que se secretan de manera independiente de la ruta de secreción clásica. En el trabajo de Bendtsen y colaboradores [9], se identi caron 33 proteínas de bacterias Gram-positivas reportadas para 2005 que se habían ubicado de manera extracelular sin presencia del péptido señal. Se aplicaron métodos para la identi cación de patrones sobre las secuencias para ver si se podían identi car motivos especí cos con la intención de identi car nuevas rutas de translocación Los autores reportan que no identi caron patrones característicos en el conjunto de datos, lo que permite concluir que evidentemente este grupo de proteínas son secretadas de manera novedosa y que el problema de su identi cación estaba abierto a 2005 [9] y permance abierto a 2009 [10].
3.1.2 Conjuntos de entrenamiento Como lo reportan Jensen y colaboradores [64], el paso crucial en el desarrollo de un método de predicción radica en obtener un conjunto de entrenamiento. Bendtsen y colaboradores [8][9], describieron que para la construcción del conjunto positivo se identi có un número considerable de proteínas que representaban a la clase a clasi car. En este caso, se realizó una búsqueda de proteínas que estuvieran reportadas como secretadas por vía no clásica, pero desafortunadamente no lograron obtener un conjunto de proteínas lo su cientemente amplio que cumpliera con esta condición, lo cual los condujo a plantear la hipótesis de la identi cación indirecta de características comunes entre las proteínas secretadas, esto es, que asumiendo que no sólo por la identi cación de los mecanismo explícitos (el 19
péptido señal) se pueden clasi car clases, plantearon la extracción en secuencia del péptido señal (primera región entre la posición 22 a 55 de aminoácidos implicada en la secreción por vía clásica) y con la secuencia resultante aplicar métodos de extracción de patrones comunes como evidencia de secreción para poder identi car proteínas secretadas por vía no clásica. Bajo esta aproximación, se identi caron proteínas correpondientes a los grupos biológicos por clasi car (proteínas de mamíferos, bacterias Gram-positivas y Gram-negativas) que fueron reportadas como secretadas por vía clásica y les extrajeron manualmente la región objetivo involucrada con el patrón reconocido como el péptido señal para que las mismas fueran secretadas. Las proteínas fueron obtenidas de la base de datos SwissProt 44.0. Para las bacterias Grampositivas, de los grupos biológicos Firmicutes y Actinobacteria. En el artículo de Bendtsen y colaboradores [9] se reporta la extracción de 690 proteínas ubicadas extracelularmente (conjunto positivo) y 1.084 ubicadas en el citoplasma (conjunto negativo). Posteriormente, extrajeron del conjunto las secuencias que estuvieran reportadas por anotación como fragmentos. El proceso para realizar el ajuste de la redundancia estuvo basado en el concepto del criterio de similitud estructural [84] y reportan que obtuvieron un conjunto nal de 152 proteínas positivas y 140 proteínas negativas.
3.1.3 Construcción de vectores para el entrenamiento Los autores de SecretomeP 2.0 [9] reportan en el artículo que siguieron las metodologías propuestas en Bendtsen y colaboradores 2004 [8] y Jensen y colaboradores [65][63][64], utilizando como entrada para el entrenamiento diferentes combinaciones de características previamente reportadas (de nidas por los autores anterioremente mencionados). La selección de características como entrada para el modelo parte del análisis discriminante de las categorías funcionales y de las clases de enzimas. Las características fueron: el coe ciente de extinción, el promedio de hidrofobicidad, el número de residuos negativos, el número de residuos positivos, las O-glicosilaciones, las S/T-fosforilaciones, las Yfosforilaciones, las N-glicosilaciones, las regiones ricas en PEST (secuencias de polipéptidos ricas en Prolina P, ácido glutámico E, Serina S y Treonina T que las convierte en proteínas de rápida destrucción), la estructura secundaria, la localización subcelular, las regiones de baja complejidad, el péptido señal y las helices transmembranales. Varias de estas características (9 en total) están basadas en las prediciones obtenidas a partir de diferentes métodos computacionales y algoritmos basados en aprendizaje de máquina tales como NetNGlyc [53](entrenado con proteínas humanas), NetOGlyc [54](entrenado con proteínas de mamíferos), NetPhos [16] (entrenado con proteínas de eucariotas), PSIPRED [66](entrenado con proteínas de origen múltiple), SEG lter [142] (método computacional para diferenciar proteínas globulares de no globulares), SIGNALP [94](entrenado con proteínas eucariotas y procariotas), PSORT [90](entrenado con proteínas eucariotas y procariotas) y TMHMM [78](entrenado con proteínas de origen múltiple).
3.1.4 Construcción y evaluación del modelo de SecretomeP 2.0 Para la construcción del predictor reportado por Bentsen y colaboradores [9] de proteínas secretadas por vía no clásica se utilizó el siguiente modelo: 1. Cálculo y asignación de características para cada secuencia de proteínas. 2. Codi cación de las características para el procesamiento de la ANN. 3. Entrenamiento de la ANN utilizando validación cruzada
N − fold
combinando las diferentes
características. 4. Determinación de la combinación de características que presentó el mejor desempeño basado en el coe ciente de correlación. 20
Bendtsen y colaboradores [9] reportan la construcción de un método de predicción extra, construido antes del proceso de entrenamiento de la ANN. La característica utilizada estuvo basada en la composición de aminoácidos de posición única, soportada por la metodología propuesta por Reinhardt y Hubbard [103], con el objetivo de diferenciar a partir de un único puntaje la información contenida para todos los aminoácidos, para así mantener la dimensionalidad de los datos de entrada en un espacio con pocas características. Empleando el esquema de validación cruzada
N − fold
[9]. Al método
predictivo se le asignó un puntaje para cada proteína entre 0 y 1, en el cual un puntaje mayor a 0.5 es considerado como indicador de secreción como umbral de la predicción.
21
Capítulo 4 Métodos y proceso exploratorio 4.1 Diseño experimental del estudio En este estudio se realizó una búsqueda para identi car proteínas que estuvieran reportadas como secretadas por vía no clásica, partiendo de las 33 poteínas de bacterias Gram-positivas, previamente identi cadas y reportadas como secretadas independientemente de la vía clásica [9]. En el proceso exploratorio en la base de datos SwissProt 53.1 [35] se identi caron 178 proteínas (uni cando las identi cadas por este estudio y las reportadas por Bentsen y colaboradores [9]) como proteínas secretadas en ausencia de péptido señal, las cuales terminaron constituyendo el conjunto para la exploración nal sobre los métodos predictivos. Utilizando el principio aplicado por Bendtsen y colaboradores en 2004 y 2005, el cual plantea que los procesos de secreción por vía no clásica se pueden reconocer como un proceso que se puede inferir por medio de características representadas en las subestructuras de las secuencias secretadas, más que de un tipo especí co de señal (mecanismo previamente identi cado para el transporte), se asume que posibles subestructuras que caracterizan a las proteínas secretadas pueden permitir la identi cación de proteínas que utilizan otros mecanismos para translocarse. Por esta razón, los autores plantearon el entrenamiento del método de clasi cación a partir de proteínas que fueran secretadas por vía clásica, pero realizando una modi cación especí ca sobre las mismas que consistía en retirarles la secuencia que corresponde especí camente a la región implicada en el mecanismo de secreción y así obtener un per l de los patrones característicos de las proteínas que se encuentran secretadas, e inferir de manera indirecta proteínas secretadas por otras vías independientes a la sec dependiente [8, 9]. Para el procesamiento de las secuencias como conjunto de entrada se desarrolló un algoritmo para el preprocesamiento de los datos y la construcción de los 4 tipos de vectores. Además, se utilizó LIBSVM [24] para emplear tanto las funciones de Kernel (lineal, polinomial y gaussiano), como las SVM para la clasi cación (C-SVC y nu-SVC).
4.2 Conjunto de entrenamiento Para la construcción del conjunto de entrenamiento se utilizó como punto de referencia la base de datos UniprotKB (15.5, 2009) [35] la cual agrupa varias bases de datos tales como PIR-PSD, TrEMBL y SwissProt (versión 53.1) [6]; esta última fue empleada para armar los conjuntos de entrenamiento porque además de ser una base de datos disponible al público, presenta un proceso de curaduría cuidadoso. Esta base de datos reportó un total de 10.424.881 proteínas para el mes de octubre de 2009, de las cuales según SwissProt, 512.994 corresponden a proteínas curadas y las restantes se encuentraban en proceso de ajuste [3]. El proceso de busqueda y ajuste para la construcción de los conjuntos de entrenamiento positivo, negativo y de exploración de puede observar en la gra ca 4.2. 23
Figura 4.1: Modelo de conceptos y requerimientos fundamentales para el diseño de SIG+SVM.
24
4.2.1 Proceso de selección de los conjuntos de entrenamiento Para el proceso de selección de las proteínas en la base de datos SwissProt (versión 53.1), se siguió la clasi cación sistemática de bacterias Gram-positivas que reporta ésta. Especí camente, se encuentran agrupadas en dos grandes clases conocidas como Actinobacteria (19.897 proteínas reportadas curadas) que son reconocidas por presentar una alta frecuencia de G+C y Firmicutes (66.861 proteínas reportadas curadas) el cual se reconoce por presentar bajas frecuencias de G+C [6]. En el proceso de identi cación para la construcción de los conjuntos, únicamente se escogieron proteínas que estuvieran reportadas como curadas por los revisores de SwissProt, lo que aumenta notablemente la con abilidad de los datos y que son ampliamente utilizadas por la comunidad cientí ca para armar conjuntos de entrenamiento y construir tanto métodos basados en aprendizaje de máquina como para analizar patrones en secuencia, o en procesos de validación externa de predictores previamente publicados[8, 9, 43, 47, 104]. Como criterios generales para el ajuste de los datos se estableció previamente que las secuencias escogidas presentaran una longitud mayor a 50 y menor a 10,000 aminoácidos y se excluyeron tanto del conjunto positivo como del negativo, las que estuvieran anotadas como
potential , hypothetical , putative, maybe,
y
fragment, probable, probably,
likely .
4.2.2 Método de ajuste de los conjuntos de entrenamiento y exploración Para el ajuste de los conjuntos (tanto en el caso del positivo como del negativo) se utilizó el algoritmo PISCES de reducción de redundancias [138][139], a partir de la medida de identidad. Este método compara las secuencias bajo un esquema todas contra todas comparando las matrices PSSM obtenida por medio de PSI-BLAST (los parámetros correspondieron a 3 iteraciones,
E − value :
0,0001 y
se utilizó la matriz BLOSUM 62). Dicho método extrae las secuencias a partir de un valor de identidad establecido por el usuario. Para este proyecto se utilizó un nivel de identidad >25 %, como lo recomienda Shen y colaboradores [117].
4.2.3 Conjunto positivo y negativo En SwissProt 53.1, para el conjunto de proteínas positivo se ajustó la busqueda por anotación teniendo en cuenta palabras tales como
integral membrane
signal , secreted , extracellular , periplasmic , periplasm, plasmamembrane, single pass membrane , dando como resultado 3.794 proteínas bacteri-
y nalmente
anas que cumplieron con todos los prerequisitos anterioremente descritos. A este conjunto de secuencias se le extrajo manualmente la primera región correspondiente al mecanismo de translocación, a partir de las anotaciones reportadas en SwissProt como lo reporta Bendtsen y colaboradores [8, 9]. Al nal, con el proceso de ajuste > 25 % identidad se obtuvieron 420 proteínas. Para el caso de las proteínas que conforman el conjunto negativo, se seleccionaron aquellas que estuvieran anotadas con las palabras
cytoplasm
y
cytoplasmic ,
obteniendo un total de 21.459 que
cumplieron con todos los prerequisitos anteriormente descritos. Las secuencias correspondientes al conjunto negativo se dejaron tal y como se reportan en las bases de datos, obteniendo con el proceso de ajuste > 25 % identidad un total de 443 proteínas.
4.2.4 Conjunto de exploración En el proceso inicial de búsqueda se identi caron en Swissprot 178 proteínas curadas, redundantes y reportadas como secretadas en ausencia de péptido señal. La clasi cación del mecanismo de exporte fue de nida por el método de predicción SignalP 3.0 [11] y en algunos casos fue validado por el evento experimental reportado en el artículo correspondiente a cada una de ellas. Por ser un conjunto tan pequeño y con el proceso de ajuste, solo quedaron 82 proteínas con una identidad >25 %. Se utilizó la aproximación de Bentdsen y colaboradores descrita en la sección 4.1. Sin embargo, este conjunto de 82 proteínas se aprovechó como exploración nal para observar la capacidad preditiva de los clasi cadores construidos en este proyecto y contrastarlos con SecretomeP 2.0 [8][9]. 25
Figura 4.2: Diagrama de selección de conjuntos de entrenamiento y exploración.
4.3 Diseño de vectores En la actualidad y de manera frecuente, características extraídas a partir de las secuencias, tales como información estructural o variables sicoquímicas, son utilizadas para construir modelos predictivos [82]. Dentro de los diferentes tipos de representaciones para armar vectores se encuentran la composición de aminoácidos [126][49], la composición de dipétidos [27][45][61], la composición de pseudoaminoácidos [118][28], los vectores PSSM [66], y los vectores de características sicoquímicas, entre otros [89].
4.3.1 Construcción y normalización Debido a los requerimientos de las metodologías, fue necesario transformar la longitud variable de las secuencias para obtener vectores de longitud ja. Este paso es fundamental para el procesamiento y clasi cación de proteínas mediante el uso de técnicas de aprendizaje de máquina, ya que, el entrenamiento de estos métodos requiere que los vectores de características tengan una misma longitud, lo cual también implica que los datos de entrada al nal deban ser preprocesados para poder ser clasi cados [107]. Por otra parte, la información de las proteínas puede ser encapsulada en vectores de N dimensiones utilizando los diferentes tipos de representaciones que, en este caso, corresponden a frecuencias en la ecuación 4.1, dipéptidos en la ecuación 4.2, factores por la ecuación 4.3 y PSSM por la ecuación 4.5.
4.3.2 Vectores de composición de aminoácidos (frecuencias) Se entiende como composición de aminoácidos a la fracción de cada tipo de aminoácido en una secuencia de nida tal que:
f (r) =
Nr r = 1, 2, 3 . . . , 20 N 26
(4.1)
Donde
Nr
corresponde al número de aminoácidos del tipo
r,
y
N
corresponde a la longitud de la
secuencia. Un total de 20 características de descripción son calculadas a partir de los 20 aminoácidos, obteniendo vectores de 20 características para cada secuencia de proteínas [126][49].
4.3.3 Vector de dipéptidos Los vectores construidos a partir de la composición de dipéptidos han sido ampliamente utilizados para representar secuencias de proteínas [27][45][61]. Este procedimiento convierta la proteína en un vector de 400 características. La composición de dipéptidos encapsula la información relacionada con las frecuencias de los aminoácidos así como el orden de los mismos de manera local. La composición de dipétidos de cada secuencia de proteínas se de ne:
f r(r, s) = Donde cidos tipo
r, s = 1, 2, 3, ..., 20 r y s [13][48].
y
Nij
Nrs N −1
(4.2)
corresponde al número de dipéptidos construidos con los aminoá-
4.3.4 Vector de factores estadísticos A partir del estudio descrito por Atchley y colaboradores en 2005, se realizó un análisis estadístico multivariado sobre 494 atributos sicoquímicos y biológicos predeterminados de los aminoácidos que se encuentra reportados en AAindex [71], que produjo un conjunto de factores altamente interpretativos de las características contenidas en la base de datos, para representar la variabilidad de los aminoácidos. Estos atributos de los datos de alta dimensión fueron resumidos en cinco tipos de factores que representan los patrones multidimensionales entre los aminoácidos, re ejando patrones de covariación que representan la polaridad, estructura secundaria, volumen molecular, diversidad de codones y carga electrostática. Los puntajes numéricos para cada aminoácido se pueden entonces transformar con el propósito de realizar análisis estadísticos sobre los mismos [5]. El análisis de factores sobre los 494 atributos evidenció que, como resultado del proceso anteriormente descrito, muchos de los datos eran redundantes. Un subconjunto de 54 atributos fue seleccionados por Atchley y colaboradores [5] basados en los coe cientes de magnitud de los atributos de los aminoácidos, propiedades estadísticas de distribución, facilidad de interpretación e importancia estructural. Los factores fueron descritos de la siguiente manera: 1. El Factor I o índice de polaridad: el cual re eja información de bipolaridad, presenta la distribución más amplia entre valores positivos y negativos, y re eja simultaneamente la porción de la covarianza de los residuos expuestos en contra de los residuos que se encuentran ocultos del medio, la energía libre versus la energía no enlazante, el número de donadores de enlaces de hidrógeno y la hidrofobicidad versus la hidro licidad. 2. El Factor II o factor de estructura secundaria: el cual re eja la relación inversa de la propensidad relativa para varios aminoácidos, a partir de diferentes con guraciones estructurales secundarias, tales como hélices Coil , giros Turn , o torsiones versus las frecuencias de las hélices-α. 3. El Factor III: el cual relaciona el tamaño molecular o el volumen con los coe cientes de abultamiento Bulkiness de alto factor, el volumen promedio de los residuos de borde, el volumen de la cadena lateral y el peso molecular. 4. El Factor IV: el cual re eja la composición relativa de los aminoácidos a partir proteínas, el número de codones que codi can para los aminoácidos y la composición de aminoácidos. Estos atributos varían de manera inversa con la refractividad y la capacidad de calor. 5. El Factor V: el cual re eja la carga electrostática con los altos coe cientes del punto isoeléctrico y la carga neta. En este factor representa una relación inversa entre la carga positiva y negativa. 27
Tabla 4.1: Puntajes de los factores de los aminoácidos.
Aminoácidos
Factor I
Factor II
Factor III
Factor IV
Factor V
A
-0.591
-1.302
-0.733
1.570
-0.146
C
-1.343
0.465
-0.862
-1.020
-0.255
D
1.050
0.302
-3.656
-0.259
-3.242
E
1.357
-1.453
1.477
0.133
-0.837 0.412
F
-1.006
-0.590
1.891
-0.397
G
-0.384
1.652
1.330
1.045
2.064
H
0.336
-0.417
-1.673
-1.474
-0.078 0.816
I
-1.239
-0.547
2.131
0.393
K
1.831
-0.561
0.533
-0.277
1.648
L
-1.019
-0.987
-1.505
1.266
-0.912
M
-0.663
-1.524
2.219
-1.005
1.212
N
0.945
0.828
1.299
-0.169
0.933
P
0.189
2.081
-1.628
0.421
-1.392
Q
0.931
-0.179
-3.005
-0.503
-1.853
R
1.538
-0.055
1.502
0.440
2.897
S
-0.228
1.399
-4.760
0.670
-2.647
T
-0.032
0.326
2.213
0.908
1.313
V
-1.337
-0.279
-0.544
1.242
-1.262
W
-0.595
0.009
0.672
-2.128
-0.184
Y
0.260
0.830
3.097
-0.838
1.512
Los puntajes corresponden al resultado del análisis multivariado que resume la correlación de 54 atributos sicoquímicos y biológicos para cada aminoácido reportados por Arcthley y colaboradores. [5]
Los factores anteriormente descritos de pueden observar en la tabla 4.1. Para convertir las secuencias de proteínas en vectores de longitud ja, las frecuencias de cada aminoácido son dadas para cada secuencia de proteínas y son calculadas por medio de la siguiente ecuación:
Fracción de aa(i)
=
#total de aa tipo i #total de aa en la proteína
(4.3)
Consecuentemente, los puntajes precalculados de cada factor son asignados para cada aminoácido y posteriormente son multiplicados por la respectiva fracción de los aminoácidos para una secuencia de proteína dada. Entonces, como ejemplo y utilizando los puntajes de factores solución reportados en la tabla 4.1, para la secuencia de aminoácidos ACVAV con un alfabeto A, V y C las fracciones para los aminoácidos corresponden de la siguiente manera: A=0.4, V=0.4 y C=0.2. Multiplicando estas fracciones por los correspondientes puntajes de los factores de los aminoácidos se obtiene:
A = (−0,2364 V = (0,5428
− 0,5208
− 0,2932 0,628
− 0,5812 0,5908 0,0452
C = (−0,2686 0,093
− 0,1724
− 0,204
− 0,0584) − 0,3348) − 0,051)
De esta forma, se obtiene el vector de características 4.4 que se utiliza como entrada para el entrenamiento: 28
Table 4.3: Ejemplo artici cial de una matriz PSSM.
A
V
C
100
200
50
V
50
150
25
A
150
25
100
C
300
75
75
C
200
20
150
V
30
75
300
C
10
100
25
A
50
50
150
A
20
250
100
V
75
25
100
A
Los valores reportados en esta tabla corresponden a un ejemplo de la matriz PSSM, no corresponden a los valores reales que puede producir una PSI-BLAST.
AV C = ( A | V | C )
(4.4)
Como se muestra en el anterior vector, los cinco puntajes de los vectores son incluídos en el vector nal para realizar la extracción de características. Sin embargo, dependiendo de los problemas particulares, se puede decidir si se excluyen o incluyen subconjuntos de estos factores dentro del vector de características [89].
4.3.5 Vector PSSM (PSI-BLAST) Los per les de información biológica con implicaciones evolutivas pueden ser extraídos a partir del uso de la herramienta PSI-BLAST [2] para construir per les a partir del cálculo de la matriz de puntaje de posición especí ca [66][67]. Básicamente, se realiza una consulta para cada proteína, utilizando PSI-BLAST, realizando 3 iteraciones sobre la base de datos no redundante (NR) que contienen las bases de datos de
GenBank CDS translations , PDB , SwissProt , PIR
y
PRF , los parámetros del PSIe − value corresponda a
BLAST deben ser ajustados de tal manera que el criterio discriminante del
0.001 y la matriz de sustituciones BLOSUM62. Lo anterior da como resultado una matriz PSSM que se utiliza para generar un vector de 400 características realizando un proceso de colapsamiento de las las sobre las columnas, a partir de la secuencia primaria original. Los elementos de estos vectores de entrada son subsecuentemente divididos por la longitud de la secuencia y son escalados a un rango entre 0 y 1 utilizando la función sigmoide [107, 89, 143]. De nida como:
f (x) =
1 1 + e−x
(4.5)
A continuación, se ejempli ca el proceso para la construcción de los vectores basados en la PSSM. El ejemplo es arti cial y los valores representados no corresponden a los valores reales que calcula una PSSM, como se puede observar en la tabla 4.3, para el ejemplo se utilizó un alfabeto de tamaño 3 que da como resultado un vector de 9 características (para efectos de aprovechar el espacio), pero en los casos reales se obtienen matrices de
20 × 20 , que producen vectores de 400 características. El proceso
para calcular los vectores a partir de las PSSM se da de la siguiente manera: a partir de una matriz con la estructura de una PSSM con un alfabeto (A, V y C) y con una proteína P, P = AVACCVCAAV, que tiene una longitud 10, se contruirá un vector de tamaño 9 29
3 × 3.
Table 4.5: Matriz para la normalización
máx
A
V
C
300
250
300
mín
10
20
25
máx-mín
290
230
275
Table 4.7: Matriz normalizada
A
V
C
A
0.31
0.78
0.09
V
0.14
0.57
0.00
A
0.48
0.02
0.27
C
1.00
0.24
0.18
C
0.66
0.00
0.45
V
0.07
0.24
1.00
C
0.00
0.35
0.00
A
0.14
0.13
0.45
A
0.03
1.00
0.27
V
0.22
0.02
0.27
Table 4.9: Matriz resultante
A
V
C
A
0.97
1.93
1.09
V
0.43
0.83
1.27
C
1.66
0.59
0.64
Lo primero es normalizar los valores de la matriz como lo reportan Mundra y colaboradores [89]. Este procedimiento consiste en calcular los valores máximos y mínimos por columna y luego, a cada valor restarle el mínimo de su columna. Este resultado se divide por la resta máxima-mínima de la misma columna, como se puede observar en la tabla 4.5. Los máximos y mínimos y la resta máximamínima por columnas para nuestra matriz de ejemplo son: Con lo cual se obtiene la matriz normalizada linealmente se puede observar en la tabla 4.7 Ahora, se suman por columna todos los valores que corresponden a un mismo aminoácido en la proteína, es decir, se suman las las 1, 3, 8 y 9 que corresponden a A; luego las las V que corresponden a 2, 6 y 10; y nalmente las las 4, 5 y 7 que corresponden a C, lo cual da como resultado la matriz que se muestra en la tabla 4.9. Una vez hecho esto, se forma nalmente el vector para la secuencia colocando una la tras otra, es decir que la proteína hipótetica AVACCVCAAV queda representada por el vector que se muestra en la referencia 4.6
P = (0,97 1,93 1,09 0,43 0,83 1,27 1,66 0,59 0,64)
30
(4.6)
4.3.6 Procesamiento de vectores Se construyeron 4 tipos de vectores: vectores de composición de aminoácidos, de dipétidos, de factores y de PSSM. Para la construcción de los vectores de composición de aminoácidos y dipéptidos se utilizaron de manera correspondiente las formulas 4.1 y 4.2, mientras que para los vectores de factores se realizó una exploración y optimización para identi car cuales de los vectores contenidos en los vectores precalculados nales eran más expresivos. Se exploró con 9 tipos diferentes de vectores. Para el vector PSSM se probaron diferentes tipos de normalización (sin normalizar, normalización lineal y normalización sigmoide) y se usaron las dos versiones disponibles de uso local Standalone para BLAST (Blastpgp y PSI-BLAST 2.2.21) produciendo 6 vectores para explorar su capacidad y rendimiento y los otros 3 correspondientes cada uno a frecuencias, dipéptidos y factores. El resultado nal de todo el procesamiento de vectores produjo 4 diferentes conjuntos de vectores para el entrenamiento de los diferentes modelos de clasi cación. Para el cálculo de los vectores PSSM, el proceso requiere más preprocesamiento que para el caso de los demás vectores, lo cual aumenta los costos computacionales y la etapa de construcción de cada uno de los mismos. Para poder calcular las PSSM de manera local se probaron las versiones disponibles de PSI-BLAST 2.2.21 [23] y Blastpgp [128] descargando la base de datos (NR) de BLAST que contiene 9.993.394 sequencias de proteínas. Para calcular cada sequencia el algoritmo debe recorrer toda la base de datos, con los parámetros adaptados para 3 iteraciones, un
e − value :
0.001 y una matriz
BLOSUM62. En un principio y como lo reporta Camacho y colaboradores [23] se utilizó PSI-BLAST 2.2.21 pero aunque se reporta como un algoritmo 4 veces más veloz con respecto a la versión anterior conocida (Blastpgp), la herramienta aún está en desarrollo y generó problemas de estabilidad en el cálculo en conjunto Batch . Por tal razón, se utilizó Blastpgp con la cual nalmente se calcularon tanto los vectores experimentales como la implementación para el algoritmo nal. En el proceso de experimentación se construyeron 3 tipos de vectores PSSM para realizar pruebas con los clasi cadores y observar su comportamiento predictivo: 1. Vectores directos (sin normalización). 2. Vectores normalizados por columnas (normalización lineal). 3. Vectores normalizados de manera clásica (normalización con función sigmoide). Con lo anterior se generaron 6 conjuntos de datos con los 3 vectores anteriormente descritos y se realizaron pruebas para cada uno con PSI-BLAST 2.2.21 [23] y con Blatspgp [128]. El formato de salida de los vectores corresponde a los estándares del paquete LIBSVM [24]. Es importante resaltar que el cálculo de los vectores de frecuencias, dipéptidos y factores normalmente tomaba 2 segundos para cada vector, pero en el caso de los vectores de la PSSM, la máquina tomaba aproximadamente 30 segundos para calcular cada vector (se presentan los tiempos de calculó por núcleo en una maquina de referencias Dell server, 8 core, 2.3 Ghz, 32 GB ram).
4.4 Exploración de parámetros Teniendo en cuenta las recomendaciones de Fan y colaboradores 2005 [44] para la exploración de parámetros de las funciones y métodos de Kernel, se debe tener una comparación e ciente bajo diferentes condiciones establecidas por el investigador para poder obtener un espectro de los diferentes comportamientos del clasi cador siguiendo dos recomendaciones: 1. Selección de parámetros que consiste en realizar validaciones cruzadas a los modelos por entrenar, para encontrar el mejor conjunto de parámetros que se ajuste a los datos, a la función de Kernel y al tipo de SVM y así obtener el modelo nal. 2. Entrenamiento nal que consiste en entrenar con todo el conjunto de datos a partir de los mejores parámetros obtenidos en la selección de parámetros para construir el clasi cador nal.
31
4.4.1 Parámetros explorados de las funciones de Kernel 4.4.1.1 Funciones Lineales Este tipo de función no presenta parámetros para explorar debido a las condiciones anteriormente descritas.
4.4.1.2 Funciones Polinomiales En las funciones se puede variar el grado del polinomio (6 posibilidades) En este caso se exploró con polinomios de 1 a 6 (1, 2, 3, 4, 5 y 6), así como también con la complejidad del modelo (8 posibilidades) que para efectos de la exploración del trabajo fue de nida entre 0 y 2 (0, 0.25, 0.50, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75 y 2).
4.4.1.3 Funciones Gaussianas En este tipo de funciones se puede variar la complejidad del modelo, para el cual se probaron 6 combinaciones.
1 #de características i
=1
×(máx-mín) =5 5
4.4.2 Entrenamiento de la Máquina de Vectores de Soporte y rangos de la exploración de parámetros. 4.4.2.1 C-SVC Este tipo de SVM presenta el parámetro C que implicó el costo de incluir un nuevo vector y varió el parámetro de la SVM entre 1 y 50.001 realizando los siguientes valores: 1, 10.001, 20,001, 30,001, 40.001, 50.001. En total se probaron 6 modi caciones para las tres funciones y los cuatro tipos de vectores. La sigla SV
C
corresponde a
Support Vector Machine Classification.
4.4.2.2 nu-SVC El parámetro variable en este tipo de SVM es el nu que corresponde a la variable de la partición del conjunto de entrenamiento y que se da entre 0 y 1 y se varió realizando los siguientes intervalos (0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 0.95). En total se probaron 5 modi caciones para las tres funciones y los cuatro tipos de vectores.
4.5 Validación cruzada El objetivo principal del uso de la validación cruzada consiste en identi car la estabilidad del clasi cador a partir de subconjuntos del conjunto mismo de entrenamiento [113]. Este procedimiento hace parte de la metodología del entrenamiento, como una etapa de ajuste para no sobreajustar los modelos [44]. Por esta razón, el desempeño de los algoritmos predictivos es frecuentemente evaluado por medio de pruebas
Jack − Knife (leave one out)
o validaciones cruzadas
N − fold .
En este trabajo el desempeño de todos los métodos fue evaluado por medio de validaciones 5-fold y 10-fold identi cando sus comportamientos; nalmente los resultados que se reportan correponden a la validación cruzada 5-fold por el tamaño y condiciones de los datos. En este caso y de manera aleatoria, se dividió el conjunto de entrenamiento en 5 subconjutos de manera equitativa, de los cuales 4 fueron utilizados para entrenar y el último para evaluar. Este procedimiento se repitió 5 veces de tal manera que cada subconjunto fuera evaluado 1 vez. El desempeño nal fue calculado sobre el promedio total 32
de los cinco subconjuntos y el desempeño del método fue evaluado con los parámetros estándar de sensibilidad, especi cidad, precisión y el cálculo de la curva ROC[107][44]. En esta etapa del proceso se utilizó la técnica de validación cruzada para evaluar el desempeño de los 4 clasi cadores desarrollados en el trabajo. Los dos conjuntos de entrenamiento se dividieron de manera aleatoria en 5 subconjuntos diferentes que contenían el mismo número de los dos tipos de proteínas del conjunto principal. Los tres clasi cadores fueron entrenados con los 4 subconjuntos y el desempeño fue evaluado con el último. Este proceso se realizó de manera iterativa 5 veces, de tal manera que cada subconjunto fue utilizado para entrenar y también para validar los clasi cadores que se iban construyendo consecutivamente [49].
33
Capítulo 5 Resultados y evaluación Se obtuvo un conjunto de entrenamiento de proteínas (420 positivas y 443 negativas) con parámetros ajustados de manera exhaustiva y a la vez se seleccionó un conjunto independiente de 82 proteínas secretadas por vía no clásica, utilizado para la exploración nal. A partir de la revisión de la literatura se escogieron las funciones de Kernel que estuvieran más exploradas por la comunidad cientí ca, se escalaron los datos originales y se realizaron las tranformaciones adecuadas para construir los vectores, utilizando las funciones de Kernel (lineal, polinomial y gaussiana). Adicionalmente, se utilizó la técnica de validación cruzada 5-fold para encontrar los mejores parámetros para entrenar con todo el conjunto de datos, proponiendo nalmente 4 métodos con principios similares pero entrenados con vectores diferenciales (frecuencias, dipéptidos, factores y PSSM), validados por medio de la curva ROC y nalmente se realizó una exploración del comportamiento predictivo de los métodos propuestos y se contrastó contra SecretomeP 2.0 server.
5.1 Frecuencias y vectores a partir de los conjuntos de entrenamiento Con los procesos de búsqueda reportados en la métodología en la sección 4.2 y tras eliminar las proteínas redundantes con una identidad >25 %, se obtuvo para el conjunto positivo y negativo, 420 y 443 secuencias de proteínas, respectivamente. La distribución porcentual de los aminoácidos de los tres conjuntos (positivo, negativo y de exploración) se representa en la gura 5.1. La longitud promedio (LP) y la desviación estándar (DS) para el conjunto positivo fue LP=401 y DS = 380.5, mientras que para el conjunto negativo fue LP=362 y DS=209.4. Como resultado del proceso de transformación de las secuencias para construir los clasi cadores se obtuvieron 4 tipos diferentes de vectores como representación de las proteínas y su correspondiente número de características se presentan en la tabla 5.1.
5.2 Pruebas de variables En total se entrenaron 2.420 clasi cadores para de allí extraer los 4 mejores (uno por cada vector), que son el resultado de multiplicar todas las posibles combinaciones de las variables que cada una de las metodologías permitía. Esto, con el n de hallar las mejores combinaciones de variables como se establece en la metodología en la sección 4.4. En este sentido, las variables se dividieron tanto para las funciones de Kernel como para los algoritmos disponibles para los clasi cadores basados en métodos de Kernel. Como se puede identi car en la tabla 5.2 y la tabla 5.3, los mejores resultados en términos de la exactitud se obtuvieron a partir de los vectores PSSM para los tres tipos de función. También es importante resaltar que se reportan los mejores clasi cadores para cada uno de los vectores construídos y para este caso, prácticamente todos presentaron una exactitud superior a 0.80. 35
Figure 5.1:
Comparación de las distribuciones de frecuencia de aminoácidos de los conjuntos de
entrenamiento. POS: Frecuencia de aminoácidos que conforman el conjunto de proteínas positivas, NEG: Frecuencia de aminoácidos que conforman el conjunto de proteínas negativas, VAL: Frecuencia de aminoácidos que conforman el conjunto de proteínas de exploración para la validación.
Table 5.1: Número de características por vector construido Vector
Número de características por vector
Frecuencia de aminoácidos
20
Dípeptidos
400
Factores sicoquímicos
100
PSSM
400
Table 5.2: Resultados de los mejores experimentos y variables por tipo de vector optimizando C-SVC. Función Lineal
de
Kernel
Polinomial
Gaussiano
Vector
ACC
C
ACC
C
D
R
ACC
C
G
1
0.8502
30001
0.8769
50001
5
1.75
0.8757
40001
0.4096
2
0.8026
10001
0.8548
30001
2
1
0.8525
20001
0.0025
3
0.8502
2001
0.8734
20001
6
1.5
0.863
20001
0.01
4
0.8955
10001
0.9361
50001
2
0.25
0.9338
20001
0.0025
Las variables para la identi cación de los clasi cadores con el tipo de SVM C-SVC. ACC=exactitud, C=costo de añadir un nuevo vector, D=Grado del polinomio, R=Número de polinomios que toma el Kernel, G=controla la complejidad de la función, Vectores 1=Frecuencias, 2=Dipéptidos, 3=Factores y 4=PSSM. Lineal n=24, Polinomial n=1.152 y Gaussiano n=144
36
Table 5.3: Resultados de los mejores experimentos y variables por tipo de vector optimizando nu-SVC. Función Lineal
de
kernel
Polinomial
Gaussiano
Vector
ACC
NU
ACC
NU
D
R
ACC
NU
G
1
0.849
0.5
0.8571
0.5
1
0.5
0.8537
0.5
0.1024
2
0.8502
0.5
0.8513
0.5
5
1.75
0.8537
0.5
0.0848
3
0.8537
0.5
0.8571
0.5
3
0.25
0.8757
0.25
2.698
4
0.9303
0.25
0.9338
0.25
4
1.25
0.922
0.1
0.3345
Las variables para la identi cación de los clasi cadores con el tipo de SVM nu-SVC, ACC=exactitud, NU=variable de partición, D=Grado del polinomio, R=Número de polinomios que toma el Kernel, G=controla la complejidad de la función, Vectores: 1=Frecuencias, 2=Dipéptidos, 3=Factores y 4=PSSM. Lineal n=20, Polinomial n=960 y Gaussiano n=120.
Table 5.4: Mejores resultados para la variable exactitud de los diferentes tipos de vectores. Tipo
de
SVM
C-SVC
nu-SVC
Vector
Lineal
Polinomial
Gaussiano
Lineal
Polinomial
Gaussiano
Frecuencias
0.8502
0.8769
0.8757
0.8549
0.8571
0.8537
Dipéptidos
0.8029
0.8548
0.8525
0.8502
0.8513
0.8537
Factores
0.8502
0.8734
0.863
0.8537
0.8571
0.8757
PSSM
0.8955
0.9361
0.9338
0.9303
0.9338
0.9326
5.3 Pruebas de exactitud para todas las variables En el proceso total de la exploración de parámetros, teniendo en cuenta los dos tipos de SVM utilizados, se presentaron comportamientos diferenciales a partir de las funciones de Kernel que se pueden observar en la tabla 5.4. En el caso de las funciones lineal y gaussiana, por las combinatorias de variables, el vector PSSM siempre obtuvo los mejores resultados en comparación con los otros 3 tipos de vectores (frecuencias, dipéptidos y factores). A diferencia de los anterior, para el caso de la función Gaussiana el proceso de exploración produjo indistintamente tanto buenos como malos clasi cadores para los 4 tipos de vectores.
5.4 Mejores clasi cadores para cada tipo de vector A partir de un proceso de optimización ponderando las variables por función de Kernel y teniendo en cuenta las variables de las SVM, se obtuvieron los mejores clasi cadores. A continuación, se buscó identi car los métodos que presentaran mayor precisión con la menor complejidad posible y a partir de estas variables, se implementaron 4 clasi cadores que se pueden observar en la tabla 5.5, para cada vector construído.
5.5 Curva ROC para los mejores clasi cadores En la gura 5.2 se presentan los comportamientos de los clasi cadores en el proceso de evaluación en función del proceso de entrenamiento. Los 4 tipos de clasi cadores muestran un alto grado de independencia en el proceso de clasi cación sobre el umbral, pero aún así, el clasi cador entrenado con los vectores PSSM fue el método que presentó mayores valores (mayor AuROC). 37
Table 5.5: Mejores clasi cadores para cada vector con sus variables. Vector
SVM
D
R
C
ACC
MCC
AuROC
Frecuencias
C-SVC-Polinomial
5
1.75
50000
0.8769
0.7219
0.9034
Dipéptidos
C-SVC-Polinomial
2
1
30000
0.8548
0.7077
0.9016
Factores
C-SVC-Polinomial
5
1.5
20000
0.8734
0.7288
0.9122
PSSM
C-SVC-Polinomial
2
0.25
10000
0.9361
0.8286
0.9589
Validación cruzada 5-fold.
Conjunto de entrenamiento 80%, conjunto de prueba 20%.
D=Grado
del polinomio, R=Número de polinomios que toma el Kernel y C=costo de añadir un nuevo vector, ACC=exactitud, MCC=Coe ciente de correlación de Matthews, AuROC=medida sobre el umbral total.
Figure 5.2: Curva ROC
38
5.6 Diagrama de resultados para la clasi cación del conjunto independiente de proteínas secretadas por vía no clásica Se obtuvo un conjunto de 82 proteínas las cuales corresponden de manera positiva a reportes de secreción por vía no clásica y constituyó el conjunto con el cual se realizó la exploración nal. Particularmente, el método que mayor número de proteínas identi có por sí solo fue el clasi cador basado en PSSM (54 proteínas), le siguio SecretomeP 2.0 (47 proteínas) y el clasi cador de frecuencias (47 proteínas), factores (46 proteínas) y por último dipéptidos (42 proteínas). Interesantemente, del total de 82 proteínas sólo 12 no fueron reconocidas por los métodos propuesto y SecretomeP 2.0. De las intersecciones del diagrama de Venn que se observa en la gura 5.3 se identi ca que del conjunto total de 82 proteínas, 24 fueron clasi cadas tanto por los métodos propuestos en este trabajo como por SecretomeP 2.0. Por otro lado, 11 proteínas fueron identi cadas por los clasi cadores entrenados en este proyecto, más no fueron clasi cadas por SecretomeP 2.0 como secretadas y, nalmente, esta herramienta clasi có 10 proteínas como secretadas por vía no clásica que ninguno de los métodos entrenados en este proyecto fue capaz de reconocer. De los clasi cadores entrenados, únicamente PSSM y factores reconocieron cada uno una proteína de manera independiente que ninguno de los otros métodos clasi có positivamente.
39
Figure 5.3:
Diagrama de clasi cación para las proteínas identi cadas por los diferentes tipos de
clasi cadores desarrollados y contrastados con SecretomeP 2.0. Para facilitar la lectura del diagrama se le asignó a cada herramienta una letra correspondiente de la siguiente manera: SecretomeP=A, Dipéptidos=B, Frecuencias=C, Factores=D y PSSM=E.
40
Capítulo 6 Discusión de resultados Como lo reporta Hua y colaboradores [60], una de las áreas más complejas en aprendizaje de máquina está directamente relacionada con el proceso de búsqueda y construcción de los conjuntos de datos para el entrenamiento y exploración, lo cual evidencia la di cultad que implica obtener un conjunto lo su cientemente heterogéneo, con able y con su cientes datos. En este sentido, por medio de la búsqueda en bases de datos que se describe en la sección 4.2, se obtuvieron 3.794 y 21.459 secuencias antes del ajuste por porcentaje de identidad para el conjunto positivo y negativo, respectivamente, y a partir del proceso de extracción de redundancia por medio de PISCES [138][139] se ajustaron los datos tanto para el conjunto positivo como negativo en 420 y 443 secuencias. Aún así, los datos provienen de la base de datos SwissProt que es pública y depende directamente de los reportes de diversos autores con diversas metodologías, lo que facilmente puede hacer que varie tanto la calidad como la cantidad de proteínas. Por otro lado, en el proceso de búsqueda de métodos predictivos, se identi có que en muchos casos se reportan nuevos métodos a partir de los conjuntos de entrenamiento de herramientas ya reportadas, como es el caso de STRPRED [50] (clasi cador de proteínas eucariotas secretadas por vía no clásica), que utilizó el conjunto de SecretomeP 2.0 aplicando diferentes técnicas de aprendizaje estadístico. Esto conlleva a que la gran diversidad de métodos predictivos reportados a la fecha, compartan sus conjuntos de entrenamiento y en este sentido, puede establecer una ventaja comparativa a la hora de proponer un nuevo método si se asegura no solo la utilización de técnicas de aprendizaje diferentes sino también la construcción de conjuntos de entrenamiento novedosos que diversi carían los resultados de las predicciones. Se debe tener en cuenta que la aproximación planteada en este proyecto asume que la predicción de proteínas secretadas por vía no clásica se da a partir de una modi cación de las proteínas secretadas por vía clásica, tal y como lo propusieron Bentdsen y colaboradores en el 2004 [8][9]. Aún así, este proyecto planteó tanto transformaciones sobre los datos, como métodos inovadores aún no empleados en la solución del problema de la clasi cación de este tipo de proteínas. Por otro lado, el hecho de que SecretomeP 2.0 [9] haya sido entrenada hace aproximadamente 5 años, pemitió asumir que para el caso de la problemática de secreción por vía no clásica y con el crecimiento acelerado de datos de proteínas reportadas en SwissProt, la extracción de información 5 años después permitiría obtener un conjunto robusto y heterogéneo, lo cual se logró. Por otro lado, no fue posible identi car si existían proteínas comunes entre los conjuntos especí cos de aprendizaje de SecretomeP 2.0 (los autores no lo reportan explícitamente) y con los conjuntos utilizados para construir los métodos de clasi cación del proyecto. Es importante resaltar que tanto para la construcción de SecretomeP 2.0 [8][9] como para este trabajo, los datos de entrada fueron extraídos de la base de datos SwissProt [6] (para SecretomeP los datos fueron extraidos de la versión 44.1 y para este trabajo de la versión 53.1), la cual mantiene unas políticas de con abilidad y curaduría sobre los datos que la han hecho ser considerada como punto de referencia fundamental para construir conjuntos de entrenamiento para herramientas basadas en 41
aprendizaje estadístico. Sin embargo, este hecho también permite intuír que la gran mayoría de las herramientas publicadas hasta el momento fueron desarrolladas usando el mismo origen de las secuencias, lo cual puede resultar en un solapamiento de los datos dentro de los conjuntos de entrenamiento, o en los procesos de construcción y preprocesamiento de información. Aún así, la creciente diversidad de métodos y el crecimiento constante de los datos y la identi cación de nuevos problemas hace que sea fundamental continuar con la tarea de analizar y extraer información. Para construir los vectores de características que representaban las secuencia de los conjuntos de entrada, se utilizaron diferentes técnicas de preprocesamiento, las cuales tienen detalles intrínsecos de cálculo que hacen que los vectores resultantes sean más expresivos, tal y como lo plantean Archley y colaboradores [5]. En el caso especí co de los vectores de dipéptidos y PSSM, ambos contenían 400 características para representar cada una de las secuencias de aminoácidos, pero fué evidentemente PSSM el que representó más e cazmente cada proteína y por lo tanto el clasi cador que permitió obtener mejores resultados. Los vectores PSSM han sido reportados como una de las maneras más expresivas de representar proteínas en aprendizaje estadístico [66] [31] [89] [107] [49] [68] [79]. Sin embargo, es importante destacar que en el caso de SecretomeP 2.0, los vectores están conformados por 14 características que son preprocesadas de manera compleja [64][63][65], pero estas variaciones en el preprocesamiento de los vectores permite que esta herramienta discrimine de manera e ciente proteínas que los métodos entrenados en este proyecto no clasi can positivamente. Es relevante establecer que tanto SecretomeP 2. 0 como los métodos presentados en este trabajo utilizan información perteneciente a dos clases biológicas de bacterias Gram-positivas (Firmicutes y Actinobacteria). Aún así, parte de las características que usaron en SecretomeP2.0 provienen de predicciones de métodos entrenados con secuencias de proteínas de grupos biológicos diferentes a bacterias Gram-positivas, lo que sugiere que la hipótesis de que mecanismos comunes de secreción son frecuentes entre las diferentes entidades biológicas es plausible, pero esta hipótesis tendría que ser corroborada experimentalmente, tal y como ya se ha caracterizado para la secreción por vía clásica para bacterias Gram-positivas [37][58][122][125][131][132][147]. En el caso especí co del preprocesamiento de los vectores PSSM, es importante resaltar que su cálculo computacional está directamente relacionado con la versión de la base de datos NR que se utilizó y que por lo tanto la calidad de los per les de entrada de la PSSM contra el clasi cador pueden cambiar sustancialmente dependiendo de la misma. Esto implica que la base de datos del clasi cador propuesto en este trabajo se debe revisar periódicamente para mejorar su desempeño. También debe tenerse en cuenta que el cálculo de los 4 tipos de vectores empleados por el clasi cador tiene costos computacionales variables (los vectores PSSM son aproximadamente 10 veces más costosos de calcular), por lo cual se requeriría de tiempo computacional adicional para para de nir si el clasi cador procesa los datos en grupo Batch o uno por uno, como es usual con otros métodos como SignalP 3.0 [11], Gpos-Ploc [117], PA-SUB [83], PSORTb [46] y SecretomeP [8][9], entre otros. En la etapa de selección de los procedimientos métodológicos, se escogieron a partir de la revisión de la literatura las funciones de Kernel más exploradas por la comunidad cientí ca [7][136][111], se escalaron los datos originales y se realizaron las transformaciones para construir los vectores, se utilizaron las funciones de Kernel (lineal, polinomial y gaussiana), se utilizó la técnica de validación cruzada para encontrar los mejores parámetros y se entrenaron los clasi cadores con todo el conjunto de datos [7]. Para identi car los mejores parámetros de los clasi cadores, se tuvieron en cuenta los problemas del tamaño del conjunto de entrenamiento para que la validación cruzada permitiera establecer la ubicuidad del conjunto de datos [44][24], teniendo presente siempre que para el proceso de exploración de parámetros es fundamental identi car los clasi cadores, porque, de la misma manera que se puede obtener un buen clasi cador para un conjunto de datos bien ajustado, una exploración de ciente puede producir clasi cadores inestables aún cuando se tengan datos y algoritmos apropiados. Para el caso especí co con la exploración de funciones y, según lo sugiere Keerthi y colaboradores [73], se realizó una primera exploración de parámetros con la función gaussiana. La ventaja que presenta esta función, a diferencia de la función lineal, es que esta función está en capacidad de mapear de manera no lineal las muestras en un espacio de mayores dimensiones, lo que hace que pueda manejar e cientemente las relaciones entre las diferentes etiquetas de los atributos de manera 42
no lineal. Aún así, debe tenerse presente que la función lineal es un caso especial de la función gaussiana, lo cual se evidencia cuando para la función lineal los parámetros de la función de Kernel gaussiana para sus parámetros
(C, γ).
C
presentan el mismo desempeño
De todos modos está reportado por
Scholkopf y colaboradores [111] y Fan y colaboradores [44], que cuando el número de características es muy grande, posiblemente una función lineal puede ser más efectiva. Aún así, la funcíon que mejor se comportó para el problema de la clasi cación de este trabajo fue la función polinomial para los 4 tipos de vectores construídos. Por otro lado, en el proceso de selección de los mejores métodos, se optimizó el resultado por parámetros a partir de la exploración, obteniendo la función de Kernel polinomial, pero es importante tener en cuenta que la función gaussiana presenta menores di cultades en comparación con la funcion polinomial porque la clave de la primera está en que
0 < Kij ≤ 1, en contraste con la función de Kernel (γxTi xj + r > 1) o cero (γxTi xj + r < 1) en la
polinomial en la que los valores pueden tender a in nito
medida en que el grado de la función sea más amplio [134]. Esto se evidencia en la naturaleza de las variables de la función polinomial, donde el número de experimentos realizados fue muchísimo mayor en comparación con los otros dos métodos (lineal y gaussiano). Particularmente, la exploración con la función polinomial arrojó tanto buenos como malos clasi cadores para todos los vectores construídos (frecuencias, dipéptidos, factores y PSSM), en contraste con la funcion lineal y gaussiana con las que siempre se obtuvo como mejor clasi cador a los clasi cadores entrenados con los vectores PSSM. En el proceso de experimentación de los vectores PSSM con los diferentes procesos de normalización, se exploró la ventaja que presentaban sobre los atributos en rangos amplios numéricos, los vectores con normalización (lineal y sigmoide). Esto facilitó los procesos de cálculo, como lo reportan Fan y colaboradores [44] que demuestran que los valores de los Kernels dependen de los productos punto de los vectores de características, y permitió evidenciar las ventajas de realizar un procedimiento por escalamiento lineal de los atributos entre 0 y 1. En la etapa del proceso de validación de los clasi cadores propuestos, los resultados obtenidos del cálculo de la curva ROC y la AuROC, evidencian que no se presentan solapamientos entre las distribuciones de los datos. Sin embargo, se debe tener en cuenta que como lo reportan Sonego y colaboradores [120], las curvas ROC caracterizan los rangos potenciales del algoritmo más no el desempeño como tal del clasi cador. Por esta razón, se planteó un proceso exploratorio del comportamiento de los clasi cadores a partir de la clasi cación por parte de los métodos algorítmicos del conjunto independiente de proteínas reportadas como secretadas en ausencia de péptido señal, el cual corresponde a un procedimiento indagatorio por la naturaleza propia y compleja del origen de los datos. Finalmente y teniendo en cuenta la metodología inicialmente planteada, se concluye que con el conjunto de exploración independiente no se entrenarían apropiadamente los clasi cadores, porque muchas de las proteínas incluidas en él aparecen reportadas en SwissProt como secretadas en ausencia del motivo de secreción por vía clásica, lo que corresponde a un proceso de inferencia estadística (similitud en secuencia o predicción computacional) más que a evidencia experimental [10]. Aún así, se consideró usar el conjunto de exploración independiente para probar la capacidad predictiva de los clasi cadores obtenidos en este proyecto y contrastar sus resultados con los resultados de SecretomeP 2.0 (de hecho 26 de las 33 proteínas reportadas como secretadas por vía no clásica por Bendtsen y colaboradores [9] están incluídas en este conjunto de 82 proteínas) y construir hipótesis relacionadas con los resultados obtenidos. Como tal, el anterior proceso corresponde a la clasi cación de verdaderos positivos y es puramente exploratorio, sin embargo y por los resultados del conjunto de exploración, el clasi cador que más proteínas identi có fue PSSM con 54 proteínas, en comparación con SecretomeP que clasi có 47, y de estas, 11 correspondieron a proteínas que ninguno de los métodos entrenados en este proyecto identi có positivamente, lo cual hace pensar que evidentemente este método reconoce patrones ignorados por dichos clasi cadores. Por otro lado y basados en los resultados exploratorios, no se puede descartar la idea de que de nitivamente el uso simultáneo de varios clasi cadores puede aumentar la capacidad de recononocimiento de variables a clasi car.
43
Capítulo 7 Conclusiones y recomendaciones Se proponen de manera novedosa 4 tipos diferentes de clasi cadores para proteínas de bacterias Grampositivas secretadas por vía no clásica a partir de la construcción de un conjunto de entrenamiento, los cuales estan basados en aprendizaje de máquina y utilizan diferentes tipos de vectores. Se propone denominar al método de clasi cación SIG+SVM. Teniendo en cuenta los resultados, el vector PSSM basado en similitud constituyó la manera más e ciente de representar las proteínas en comparación con los otros 3 clasi cadores, ya que este método presentó el mejor comportamiento, tanto para las diferentes funciones de Kernel, como para los dos tipos de SVM exploradas, siendo esto consistente con lo reportado en bibliografía, pues en la actualidad este tipo de transformación se considera como un método altamente e ciente para resolver problemas de clasi cación de información biológica. A partir de los resultados pertenecientes al conjunto de proteínas reportadas como secretadas en ausencia de péptido señal, así como de la aproximación indirecta para poderlas clasi car, se evidencia que los métodos planteados en este proyecto están en capacidad de identi car proteínas desconocidas, pero también se reconoce la capacidad predictiva del método SecretomeP 2.0, el cual utiliza información de predictores entrenados con grupos biológicos diferentes a bacterias Gram-positivas. A partir de la revisión que se realizó de proteínas reportadas como secretadas por vía no clásica, se puede envidenciar que nuevas proteínas están siendo reportadas cada día y, en la medida que aumente el conjunto de las mismas, podrán realizarse procesos de validación o reajustes a los métodos ya existentes, sin dejar de lado que es fundamental validar los resultados de estos clasi cadores a partir de procedimientos de validación experimental. Aún están por descubrirse, no sólo nuevos y diferentes procesos de secreción de proteínas, sino también los mecanismos que éstas utilizan para translocarse, lo cual comprende una de las áreas de mayor interés para las ciencias de la vida y en la que las técnicas, tanto computacionales como de aprendizaje de máquina, pueden juegar un papel fundamental para dilucidar procesos y descubrir nuevos mecanismos biológicos.
45
Publicaciones •
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•
Capitulo en libro nacional
Daniel Restrepo-Montoya, Diana Angel. Plegamiento y modi cación de proteínas. Capítulo en libro de Biología Molecular del Centro de Investigaciones Biomedicas CIB. (en preparación para publicación)
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