Rev. Biol. Trop ., 28( 1 ) : 209-226, 1 980

Estructura y función de los cromosomas plumulados por Ana Mercedes Espinoza* , Pedro E. León*, Gabriel Macaya* , Ana Lucía Fuentes* y José María Gutiérrez* * . (Recibido para su publicación el 1 8 d e enero de 1 9 80) Abstraet: In this papee we review receJ)t work on the structure of chromomeres and loops in lampbrush chromosomes, and we discuss several of the hypotheses that attempt to explain lampbrush function. Regarding lampbrush structuee the fol­ lowing conc\usions are reached: many, but not all loops probably represent trans­ cription units, involving both unique and repeated sequences. Lampbrush chro­ momeres evidently contain more than one cistron and cannot be equated with polytene bands. The questions now raised address the functional or developmen­ tal relationships that may occur among the cistrons in individual chromomeres. In addition, each chromomere could conceivably contain similar repetitious DNA sequences as previously proposed by others or merely sequences with similar base ratios. Concerning lampbrush chromosome function, we discuss Master-Slave, se­ veral reprogramming hypotheses and Cavalier-Smith's recent proposa!. In situ hybridization autoradiographs of labelled DNA to nascent RNA in lampbrush loops indicate that loops are static structures with at least one promoter and that processing begins within the loop. This observation. along with the predominance of single copy sequences in transcripts, precludes the need for a corrector mecha­ nism . Reprogramming hypotheses implicitly view development as an algorithm with a temporal component which requires an initial ri.programming event or preprogramming. The mechanism mar involve the transfer of information that later participates in celular differentiation to localized regions in the cytoplasm. Changes at the level of the chromatin fiber remain a possibility, but under a static loop model could only involve a small fraction oí the total chromatin. The Cavalier-Smith proposal makes sorne interesting predictions that may resolve the C-value paradox. Concerning lampbrush chromosome structure the requirement of nuc\eoskeletal RNA predicts the intense transcription of untranslatable se­ quences but does not c\early tie this meiotic stage with embryogenesis.

En los ovocitos de anfibios y de muchas otras especies animales (incluyendo el hombre) ocurren transformaciones extraordinarias durante la primera profase meJótica (Callall, 1 956, 1 96 3 ; Davidson , 1 968; Macgregor, 1 977). El ovo cito au*

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Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica. ·Instituto Clodomiro Picado, Universidad de Costa Rica. 209

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menta notablemente de tamaño y entra en una fase de síntesis intensa de sustancIas necesarias para la embiogénesis temprana (Davidson, 1 968; Denis, 1 968 ; Kedes et al. , 1 972; Macgregor, 1 977). Además, los cromosomas diploténicos, localizados dentro de un núcleo gigantesco, adquieren forma plumulada, pudiendo aislarse ma- . nualmente y verse al microscopio de luz con contraste de fases (Callan & Lloyd, 1 960 , Macgregor, 1 977) o al microscopio electrónico (Miller et al. , 1 970; Mott y Callan, 1 975; Figs. 1 y 2). Los cromosomas plumulados son típicos del diplotene con las dos cromátidas sostenidas en los quiasmas. Cada cromátida presenta una fibra de desoxiribonuclo­ proteína (DNP) que a intervalos regulares se arrolla sobre sí para dar origen a los cromómeros (Callan, 1 963 ; Bishop, 1 977 ; Macgregor, 1 977, 1 980). A cada cro­ mómero se asocian dos o un múltiplo de dos asas (Fig. 3) de longitud variable que en la vitelogénesis temprana de salamandras alcanzan un tamaño de 5 a 1 00 ¡..tm . Los centrómeros y telómeros por lo general no presentan asas (Fig. 4 ; Callan, 1 963; Macgregor, 1 977; Kezer et al., 1 980). Cuando se separa un cromómero mediante tensión mecánica se rompe en dos mitades las cuales quedan unidas por dos asas for­ mando un puente doble (Callan , 1 963). Algunas observaciones indican que una sola fibra desoxiribonucleoprotéica (DNPica) se extiende desde una punta a otra de cada cromátida (Gall, 1 963; Kavenoff et al. , 1 973). Se cree que el cromómero se man­ tiene unido por fuerzas secundarias (Bishop, 1 977) y a través de puentes disulfuro (Hill et al., 1 973). Las asas por lo general son asimétricas, ya que muestran diferente grosor en los sitios de inserción en el cromómero (Callan, 1 963). Frecuentemente tienen una inserción fina que se ensancha en forma gradual (Fig. 5). Se ha visto que algunas asas gigantes presentan una secuencia característica en cuanto al período de máxima extensión durante la ovogénesis (Callan y Lloyd, 1 960; Callan, 1 963).

Fig. 1 .

Corte, fino de parte de un cromosoma plumulado del tritón Taricha granulosa, preparado según Kezer et al. , ( 1980) y visto al microscopio electrónico. La flecha indica la posición de un asa gigante que sale del campo.

Fig. 2.

Cromosoma plumulado visto con microscopía de contraste de fases, sin tinción, Las dos cromátidas son sostenidas en los sitios de quiasmas y cerca del centro del bivalente se presentan dos esferas que permiten identificar este cromosoma como el número 1 3 en la salamandra A mbystona macrodactylum. Los gránulos libres son nucleolos extracromosómicos.

Fig. 3.

Cromosomas plumulados de B. subpalmata centrifugados en una cámara circular con un vidrio cubreobjetos de fondo y observado por contraste de fases. De esta forma se obtienen las asas en un mismo plllno.

Fig. 4.

Fotografía por contraste de fases de parte de un cromosoma plumulado que presenta dos esferas a la par de cada centrómero (flechas). Nótese la ausencia de asas en el centrómero. Cortesía del Dr. James KezeI.

fig. 5 .

Ampliación que permite observar asas grandes con una inserción fina (flecha abierta) y una inserción gruesa (flecha sólida) . En un locus adyacente se presenta una esfera.

fig. 6.

Parte de un bivalente con una región de asas granulares (flechas) fotografiado con microscopía de contraste de fases. Cortesía del DI. James KezeI.

ESPINOZA . el al.: Estructura y función de cromosomas plumulados

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Una actividad de los cromosomas plumulados que los distingue de otros cro­ mosomas diploténicos es la intensa transcripción llevada a cabo en las asas. (Gall y Callan ,

1 962;

Snow y Callan,

1 969).

En general cada asa representa una unidad de

transcripción aunque en ¿¡ertas asas existe variación en la morfología de los com­ plejos ribonucleoprotéicos (RNPicos) (Angelier y Lacroix, 1 975). La posición fija de algunas asas grandes y otros marcadores permite en muchos casos identificar sin ambigüedad al cromosoma en cuestión (Fig. 5). Sin embargo, la mayoría tiene simi­ l it u d e n tre ellas, particularmente en salamandras tropicales como Bolitoglossa (Fig. 3). Se ha descrito también otras estructuras asociadas al eje de las cromátidas como los gránulos axiales, y las esferas, (Callan , 1 963 , Kez,er et al. , 1 980, Figs. 4-7) cuyo significado biológico se desconoce . Los espermatocitos de algunos insectos presentan durante la primera división meiótica cromosomas similares a los plumulados de los ovocitos (Hess, 1 973; Keyl, 1 975). En Drosophi/a se observa unas pocas asas en el cromosoma y y su presencia

se relaciona con factores de fertilidad. Se ha visto que los espermatocitos de diversos organismos presentan una etapa de cromatina difusa, que se cree resulta al desenrollarse la fibra DNPica fuertemente empacada en los cromó­ meros del paquitene (Ris, 1 945; Kezer y Macgregor, 1 97 1 ; K1aterská; 1 978). Se ha notado la similitud en la estructura y secuencia de aparición de la "eta­ pa difusa" en los espermatocitos de los machos y la etapa de cromosomas plu­ mulados. Sin embargo, se desconoce en detalle las transformaciones previas al diplotene plumulado; por esto se hace difícil establecer homologías entre estas dos etapas. La secuencia de las transformaciones profásicas se puede estudiar solamente en los machos de aquellos organismos cuyos procesos meióticos presentan algún tipo de sincronía natural, ya que es difícil distinguir entre la "etapa difusa", el lep­ totene y el preleptotene. Tal situación la presentan los testículos de salamandra, que ha permitido demostrar que en los cromosomas de la etapa difusa se incorpora gran cantidad de uridina tritiada (Fig. 8). Parece entonces que en esta etapa ocurre una transcripción muy intensa co�o en la etapa plumulada del ovocito. Sin. e,mbar­ go aún no existen estudios cuantitativos sobre los niveles endógenos de nucleótidos en las diferentes etapas de la meiosis, por lo que la suposición anterior debe tomar­ se con cautela. Otro hecho interesante es que 5 géneros de salamandras presentan cromoso­ mas supernumerarios, que también asumen forma plumulada pero no parecen ser indispensables desde el punto de vista del desarrollo normal y no tienen consecuen­ cias fenotípicas conocidas (Macgregor, 1 977). ORGANIZACION DE LOS CROMOSOMAS PLUMULADOS De los primeros estudios de Callan

(I 967) surgió la hipótesis de

"extensión y

retracción polarizada" que intentaba explicar la organización del complejo asa­ cromómero . Se basaba en observaciones como la asimetría de las asas, la existencia de una relación inversa entre el tamaño del cromómero y la longitud de éstas y la incorporación asimétrica de uridina tritiada en algunas asas gigantes. Esta hipótesis proponía que durante la ovogénesis los cromosomas plumulados exponen todo su ADN mediante el desenrollarse progresivo del asa por una de las inserciones, y su retracción por la otra, hasta que se transcribe la totalidad del ADN contenido en el cromómero. Según esta hipótesis las asas aumentan de longitud cuando su velocidad de extensión es mayor que la de retracción, mantienen su talla constante cuando se igualan ambas velocidades y disminuyen de tamaño cuando la tasa de retracción es

ESPINOZA , et al.: Estructura y [unción de cromosomas plumulados

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mayor que la d e extensión (Cailan , 1 963). Lo s resultados obtenidos por e l grupo de Callan (Old et al., 1 977) indican que las asas no se extienden y retraen, sino que son estáticas al menos en su inserción fina. Los estudios recientes de Sommerville y MaIcolm ( 1 976) y Old et al. , ( I 977) favorecen otro modelo para explicar la organización del par asa-cromómero . Dicho modelo supone que el promotor de la transcripción se encuentra en la inserción fina y que hacia la inserción gruesa se produce la transcripción de moléculas de ARN progresivamente más largas. Las asas: Con base en las consideraciones anteriores surgen varias preguntas: ¿cuáles son las secuencias de ADN presentes en las asas en relación a las que perma­ necen en el cromómero? ¿qué función cumplen las secuencias transcritas? ¿cuál es la organización de la fibra de DNP en relación a las histonas y a las proteínas ácidas del núcleo? En relación con esta última pregunta existen pruebas que la fibra de DNP en éstos, como en otros cromosomas, presenta el arreglo t ípico de "rosario" en que a cada cuenta se le llama un nucleosoma (Fig. 9). En los nucleosomas cuatro de las cinco histonas se asocian con 1 40 pares de bases en tetrámeros, dos de estos formarán el octómero que constituirá cada una de las cuentas del rosario (Olins y Olins, 1 974, Kornberg, 1 974; Oudet et al. , 1 975). Además se ha observado por microscopía electrónica estructuras supranucleoso­ males en núcleos aislados de ovocitos (Fig. 1 0) que posiblemente contienen 8 nu­ c1eosomas y otras proteínas (Hozier et al. , 1 97 7 ; Scheer y Zentgref, 1 978). Algunas proteínas ácidas del núcleo aparentemente participan en la estabilización de los nu­ c1eosomas y supranuc!eosomas. Aparentemente hay nucleosomas de conformación diferente en la fibra DNPica en transcripción (Flint y Weintraub , 1 977). Se ha descrito al menos cuatro tipos de ADN en los cromosomas de organis­ mos eucariónicos, que toman en cueríta el grado de repetición de las secuencias y su tamaño y función (Britten y Kohn , 1 968 ; Davidson et al., 1 975 ; Hood et al. , 1 975). La primera de las cuatro clases es el ADN satélite , altamente repetido , de localiza­ ción centromérica, no transcrito , y variable en cuanto a la longitud de su secuencia unitaria, aunque con frecuencia se repite un motivo corto de 6 a 1 4 nuc!eótidos. La segunda clase son las secúencias únicas que se cree incluyen los genes estructurales y cuyos productos de transcripción se traducen a polipéptidos funcionales. El tercer tipo lo constituyen algunos genes estructurales como los de las histonas y los genes de los ARN ribosomales y de transferencia, presentes de varios a cientos de veces en el genoma, por lo cual se consideran como ADN repetido funcional. La cuarta ca­ tegoría incluye una clase muy grande de secuencias llamadas secuencias intermedias o de mediana repetición , que probablemente no tienen una función desde el punto de vista transcriptivo-traductivo pues se aisla poco ARN complementario a ellas. Además, divergen rápidamente durante la especiación y contienen sólo de 200 a 5 0 0 pares de nuc!éotidos. Mizuno y Macgregor ( 1 974) estiman que cerca del 50% del genoma de la salamandra Plethodon cinereus y el 80% del genoma de P. vehiculum consiste de secuencias de mediana repetición. Dicha fracción representa del 90 al 95% del genoma del tritón Triturus cristatus (Rosbach y Ford, 1 974) También se ha descrito varios tipos de organización de las secuencias de ADN en diferentes organismos eucariónicos (Davidson et al. , 1 973). Uno de estos lo caracteriza el ADN de Xenopus y consiste en la alternancia de secuencias repetidas y secuencias únicas . Las secuencias únicas tienen una longitud de 800 a 1 . 500 pares de nucléotidos y los elementos repetidos, aproximadamente 300 pares. El otro patrón

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lo tipifica Drosophila y difiere del anterior en que las secuencias repetidas interca­ ladas forman bloques de 1 .600 pares de nucleótidos en promedio y sólo el 1 0% de las secuencias repetidas tienen menos de 500 pares . Además, los elementos en simple copia se extienden al menos 1 0 .000 pares de nucleótidos sin ser interrumpi­ dos por secuencias repetidas. Estudios posteriores que incluyen diversos organismos eucariónicos, parecen indicar que existe toda una gradación entre los tipos de organización presentes en Xenopus y Drosophila (Davidson el al. , 1 973 ; G. Macaya, datos no publicados) . E n los anfibios d e las subclases Anura y Urodela, s e h a encontrado especies cercanas que varían mucho en su valor e o sea la cantidad de ADN por núcleo haploide (Morescalchi , 1 973 ; Mizuno y Macgregor, 1 974; Sommerville y Malcolm , 1 976; Baldari y Amaldi , 1 977). Estas diferencias se deben a la gran variabilidad en la cantidad de secuencias de mediana repetición (Mizuno y Macgregor, 1 974; Bal­ dari y Amaldi , 1 977). Los datos de cinética de reasociación indican que el porcentaje de ADN de mediana repetición aumenta al incrementarse el valor C . Sin embargo , al comparar las dos subclases entre sí Baldari y Amaldi ( 1 977) encontraron que la diferencia en el contenido de ADN concierne a todos los tipos de secuencias, tanto las repetidas como las únicas. Se supone entonces que tanto las secuencias únicas como las de repetición intermedia divergen con el tiempo, aunque estas últimas lo hacen más rápidamente . Es probable que la duplicación de secuencias y su posterior divergen­ cia hayan sido eventos de gran importancia en la evolución de los eucariones (Ohno, 1 970). Estas cuatro clases de ADN aparentemente pueden formar parte de las asas, aunque en proporciones diferentes. El ADN satélite se concentra alrededor de los centrómeros, y por lo general forma cromómeros sin asas (Fig. 6). Sin embargo , existen algunas secuencias tipo satélite que sí se transcriben dando origen a asas (Gould el al. , 1 976; Hartley y Call�n, 1 978; Varley el al., 1 980). . Algunas secuencias funcionales repetidas como por ejemplo el ADN ribosomal en salamandras y tritones, forman un par conspicuo de asas que corresponden al organizador del nucleolo. En otras salamandras el organizador aparece como una colección de asas más complejas (Kezer y Macgregor, 1 973). En todo caso se cree que el ADN ribosomal del organizador no se transcribe en su totalidad; muchas

Fig. 7 .

Corte fino de una esfera, vista al microscopio electrónico en que se demuestra que son estructuras compuestas.

Fig. 8.

Autoradiografía de espermatocitos en meiosis, incubados en presencia de uridina tritiada. El núcleo en el centro se encuentra en la etapa difusa y ha incorporado la uridina. El núcleo superior en paquitene incorporó menos radioactividad.

Fig. 9.

Fibras de DNP preparadas de ovocitos de B. subpalmata en condiciones que disuelven muchas proteínas ' cromosomales (pH 10 con detergente fotoflow al 0,0 1 % ). En cromosomas plumulados se presenta también el arreglo de rosario, en que cada cuenta es un octómero de histonas, llamado un nucleosoma. Fotografía al microscopio electrónico .

Fig. l O.

Bajo condiciones menos rigurosas de aislamiento (pH 9 . 2 ; sin detergente) apa­ recen estructuras supranucleosomales cuyo diámetro indica que pueden contener ocho nucleosomas. Fotografía al microscopio electrónico. =

ESPINOZA . et al. : Estructura y función de cromosomas plumulados

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copias permanecen en el cromómero . Es evidente que gran parte del ARN ribosomal ( l 8S + 28S) se transcribe a partir de los nucleolos libres que son muy numerosos y de gran actividad sintética en esta etapa (Fig. 1 1 ) . Barsacchi et al. ( I 977) utilizaron la técnica de hibridación in situ con el fin de ubicar los genes ribosomales SS en los cromosomas plumulados del tritón Triturus vulgaris y encontraron que dichos genes constituyen un solo cromómero con su par de asas. En estudios recientes se ha localizado algunas secuencias repetidas en las asas del cromosoma 1 de T. vulgaris tales como las secuencias de los genes de las histonas y otras secuencias de repetición intermedia (Pukkila, 1 975). La técnica consiste en hibridar ADN marcado al ARN "naciente " de las asas. Old et al. (I 977) purificaron los genes de las histonas de ADN aislado de erizos de mar, los clonaron en vehículos bacterianos y obtuvieron marcaje en pocas asas que presentaban , cerca de la i.J1ser­ ción gruesa, una porción no marcada con una gran cantidad de matriz RNP. El hlbrido se localizó en un segmento corto del eje (a unos pocos micrómetros de la inserción fina), en asas de una longitud de 200 J.Lm . Por lo tanto en estas asas se transcriben otras secuencias además de los genes para las histonas. Se deduce tam­ bién que las asas no se desenrollan y retraen continuamente y que los mensajes para las histonas se cortan del extremo de la molécula que continúa transcribiéndose . Se supone que a esto último se debe la ausencia de marcaje en el extremo de la inserción gruesa en los hlbridos (Macgregor y Andrews, 1 �77 ; Old et al. , 1 977). Macgregor y Andrews ( I 977) localizaron en este mismo cromosoma secuencias de repetición intermedia aisladas por reasociación y marcadas in vitro. Además encon­ traron marcaje discontinuo en las asas , preferencialmente en el cromosoma número uno. Por simplicidad supusieron que ocurre una repetición en tandem de una sola secuencia en el eje de cada asa. Estos autores observaron también un marcaje rápido en cromosomas mitóticos en hlbridos ADN :ADN , lo que sugiere que hay otras secuencias que se repiten tanto como las anteriores pero no tienen un arreglo en tandem o no se transcriben durante la etapa plumulada. Es interesante notar que esta región del cromosoma 1 no forma quiasmas durante la meyosis lo que en' parte explicaría el confinamiento de dichas secuencias . Varios investigadores se han interesado en estudiar otros aspectos de la trans­ cripción en ovocitos de anfibios. En Xenopus y Triturus el mARN se transcribe preferencialmente de las secuencias únicas del genoma (Rosbach y Ford, 1 974) . Según estos investigadores la complejidad de la población de mARNs en ovo citos es tal que cada asa podría contener una secuencia informacional que al transcribirse generará una especie diferente de mARN. Los estudios de Sommerville y Malcolm ( 1 976) apoyan esta conclusión general ; sin embargo la organización de las secuencias en el producto primario de la transcripción, y por ende en las asas, parece ser más compleja. El hnARN de las gástrulas de erizo de mar presenta secuencias de repe­ tición intermedia intercaladas con secuencias únicas (Smith et al" 1 974). En Tritu­ rus sólo el 1 5% del hnARN tiene secuencias repetidas, la mayoría forma hlbridos moleculares con secuencias únicas (SommerviIJe y Malcolm , 1 976), Si la maduración de ARN "naciente " comienza en las asas, algunas secuencias no estarían represen­ tadas en el hnARN . Podría suponerse que ciertas asas contienen solamente secuen­ cias repetidas como algunas que codifican por ARN SS (Pukkila , 1 975) y las que no son digeridas por enzimas de restricción . Según Sommerville y Ma1colm ( I 976) la mayor parte del ADN del ovocito (más del 95% ) está inactivo en el cromómero, y del 2 al 4% se transcribe a hnARN. Si sólo el 3% del hnARN transcrito se constituye en mARN, se obtiene que las secuencias codificantes del ovocito representan de 0,05 a 0 , 1 % de la totalidad del genoma, Dicha cantidad de ADN podría codificar por 7 .500 a 1 5 .000 especies '

ESPINOZA , el al. : Estructura y función de cromosomas plumulados

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diferentes de mARN, valor similar al estimado para el número total de asas en el genoma haploide . Además )a cantidad de ADN cromosómico presente en forma de asas se aproxima a los valores obtenidos por hibridación . Estudios con microscopía electrónica (Miller et al. , 1 970) revelan la presencia de fibras laterales de RNP que emergen del eje de las asas y que originan estructuras similares a las plumas descritas por Miller en los genes ribosomales extracromosómicos (Fig. 1 1 ). Se supone enton­ ces que cada asa representa una unidad de transcripción aunque ocasionalmente se observan asas con asimetría doble (Angelier y Lacroix, 1 975-). En los casos estudia­ dos, se deducen dos aspectos de las asas : el gian tamaño de los productos primarios transcritos y la presencia frecuente de secuencias únicas . Es probable que las asas representen la forma que las unidades de transcripción adquieren al ser simultá­ neamente transcritas por muchas polimerasas.

Fig. 1 1 .

Las plumas de MiUer son genes ribosomales extracromosómicos repetidos en tandem, que son transcritos simultáneamente por muchas polimerasas. Entre cada "pluma" aparece una región no transcrita, de función desconocida.

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Los cromómeros: Son entidades estructurales evidentes durante la primera profase meiótica, y se cree que en cromosomas politénicos de dípteros forman las bandas, al alinearse lateralménte (Figs. 3-6). Los trabajos genéticos en dípteros indican que en general cada banda se identifica con un cistrón (Muller y Prokofyeva, 1 93 5 ; Judd et al. , 1 972; Hochman, 1 973), aunque la cantidad de ADN por banda potencialmente podría codificar por unos 30 genes (Rudkin, 1 965). Las bandas además, dan origen a "puffs"* y anillos de Balbiani, unidades transcripcionales cuya aparición, en algunos casos, se relacio­ na con la síntesis de proteínas específicas (Grossbach, 1 973). Existe , por lo tanto , una discrepancia en atribuirlé una función simple al cromómero y la cantidad de ADN contenida en él. Esto se puede conciliar si suponemos que la actividad sintética se restringe a ciertos segmentos del ADN y que el resto no participa en la codificación, o si lo hace su producto es degradado rápidamente . Judd et al. ( I 972) consideran al cromómero como una unidad gené­ tica . Proponen que contiene, además del gen estructural, ADN cuya función es regulad�ra, por lo que su tamaño estará determinado por la cantidad de ADN de regulación. Por otra parte , Callan ( I 967) en su hipótesis del "amo-esclavo" (Master­ Slave) consideraba que el cromó mero está formado por una sola secuencia repetida un gran número de veces, cuyo tamaño depende del número de copias de la secuen­ cia dada. Como se verá luego, dicha hipótesis ha sido descartada con experimentos efectuados por el mismo Callan. V1ad y Macgregor ( I 975) al estudiar organismos relacionados filogenética­ mente , pero con valor C muy diferente se preguntaron si muestran cromó meros más grandes o si tienen un mayor número de ellos. Utilizaron dos salamandras del género Plethodon cuyos cariotipos son casi idénticos encontrando que, Plethodon dunii con 38,8 pg de ADN por núcleo haploide , tiene de 60 a 70% más cromóme­ ros que P. cinereus con 20 pg/núcleo . Aparentemente la variación en el tamaño del genoma puede atribuirse a diferencias en la cantidad de ADN de repetición inter­ media (Mizuno y Macgregor, 1 974). Dichas secuencias se distribuyen en : torma equilibrada a través de todo el cariotipo, ya que el número y las dimensiones relativas de los cromosomas son similares en ambas especies. Como las secuencias de repetición intermedia constituyen la mayor parte del genoma (50% en P. cinereus y 80% en P. dunii), la mayoría del ADN cromomérico debería ser de repetición intermedia. Como además cerca del 90% del ADN total es cromomérico y el 40% del genoma de P. cinereus presenta secuencia única (Vlad y Macgregor, 1 975), los cromómeros deben también contener esta clase de secuencias. En estas dos especies la cantidad de secuencias únicas es muy similar y suponiendo que la inter­ calación es uniforme, se concluye que el espaciamiento de estas secuencias es sus­ tancialmente mayor en aquellas especies con valor C elevado . En estos organismos no puede establecerse una relación numérica directa entre cromómeros y secuencias únicas. Es probable que en cromosomas plumulados y en otros cromosomas meió­ ticos los cromómeros no correspondan a cistrones, como en el caso de las bandas en cromosomas politénicas. Sin embargo Callan ( I 973) determinó que el número de "replicones" en la fase pre-meiótica de síntesis de ADN es similar al número de cromómeros. Macgregor ( I 977) propone que cada cromómero contiene ADN rico en una familia de secuencias repetidas. Un modelo alterno sobre la organización de los cromómeros no requeriría una repetición estricta de secuencias sino similitud en

*

"puffs" �on ensancham ientos en el eje de los crom osomas politénicos que surgen a partir de un cromómero

ESPINOZA , et al.: Estructura y función de cromosomas plumulados

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e l contenido proporcional de bases a lo largo de grandes segmentos de l a fibra (Macaya et al. , 1 976). Parece inevitable que:al menos en cromosomas plumulados cada cromómero contiene varios cistrones. Difícilmente puede suponerse que un reptil como Bipes (Macgregor y Klosterman , 1 979), con LODO cromómeros por genoma haploide, sólo presente !DOO genes. Se abre entonces la posibilidad que el cromómero agrupe varios cistrones y surge entonces la pregunta sobre la relación temporal y funcional de estos cistrones. En un caso, varios genes en el cromómero podrían expresarse secuencialmente , por ejemplo varias iso enzimas que se expresen en diferentes perío­ dos del desarrollo . En el otro caso, varias funciones metabólicas relacionadas po­ drían asociarse en un cromómero y expresarse en sincronía. Por ahora la evidencia genética en eucariones es tan escasa que no permite evaluar estos modelos en forma definitiva. FUNCION DE LOS CROMOSOMAS PLUMULADOS Durante el diplotene plumulado de la meiosis los gametos femeninos se pre­ paran para desarrollo embriológico . Siendo la embriogénesis temprana una etapa muy desprotegida en muchos organismos, la selección natural posiblemente ha ope­ rado estableciendo mecanismos para acortarla. Es posible que la multiplicación génica del ADN ribosomal (Hourcade et al. , 1 973) represente uno de estos meca­ nismos. Se han planteado varias hipótesis acerca de la función de los cromosomas plumulados. Callan ( 1 967) propuso la hipótesis denominada "amo-esclavo", basada en el concepto ya descartado del cromómero como una estructura dinámica. Según esta hipótesis durante el desenrollamiento de las asas las secuencias repetidas se corrigen con base en una secuencia "amo". Sólo cuando esta secuencia muta se observa un efecto genético en la pregenie. Queda ahora claro que muchas asas no presentan secuencias repetidas exclusivamente, y que el producto de la tra�scrip­ ción proviene en gran parte de secuencias únicas , por lo cual dicha corrección es innecesaria. Como los cromosomas plumulados participan en la producción de mARNs de larga vida, las asas de estos cromosomas se podrían definir como un conjunto de estructuras especializadas en la s íntesis y en el empacamiento de gran cantidad de productos génicos precozmente (Davidson, 1 968). En esta hipótesis el énfasis recae en el producto de la transcripción . Una versión reciente por Davidson y Britten ( I 979) de regulación por medio de secuencias repetidas, supone que el ARN regu­ lador, que se transcribe de ADN repetitivo, se hibrida bajo condiciones fislológiéas con ARN pre-mensajero para permitir su exportación y/o procesamiento� La etapa plumulada podría participar en la producción de ARN regulador para el desarrollo (León , 1 975). Este autor también propuso que la fibra DNPica del asa interactúa con el nucleoplasma y tal exposición altera y re programa la fibra. Suponiendo que la extensión y retracción ocurra, todo el genoma sería afectado. Tal exposición permitiría por ejemplo la incorporación y/o liberación de moléculas reguladoras, la modificación química del ADN expuesto o de proteínas cromosomales. La natura­ leza estática de las asas implica que tal reprogramación afectaría una pequeña fracción del genoma (5% ) por lo que este tipo de mecanismo parece menos factible. Otra idea propuesta considera que el estado plumulado representa una liberación . general del genoma, que reprograma la aparición de estados diferenciados. Un dato congruente con esta hipótesis son los cambios cualitativos y cuantitativos en las proteínas cromosómicas durante el transcurso de la diferenciación y la embriogé-

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nesis (Bentinen y Comb, 1 97 1 ; Hill et al. , 1 97 1 ; Easton y' Chalkley, 1 972 ; Searle y Aronson , 1 973 ; Spiegel et al. , 1 97 3 ; Ruderman et al. , 1 974). Por otra parte Gurdon ( I 968) transplantó núcleos somáticos a ovocitos nu­ cleados o enucleados, y vio cómo éstos sufren un proceso de hinchamiento y transcripción, que se correlaciona inversamente con el estado de diferenciación del tejido del cual se obtuvo el núcleo. Tal hinchamiento va precedido por la incorpora­ cIón de proteínas citoplasmáticas recién sintetizadas (Merriman, 1 969) lo que parece indicar que dicho proceso es un requisito para la síntesis de ADN y para el desarro­ llo embriológico, posterior. Recientemente DeRobertis y Gurdon ( I 979), utilizando electroforesis de proteínas en dos dimensiones, han demostrado que núcleos de riñón microinyectados son reprogramados en el citoplasma del ovocito, a producir proteínas ovocitarias. Los experimentos de Gurdon no permiten decidir si las "substancias re programadoras" actúan solo en las etapas tempranas (hasta la blástu­ la). Es posible , que como en el caso de la substancia "0+ " del ajolote (Ambystoma mexicanum) existan otras substancias reprogramadoras que actúen tardíamente . Sin embargo , es probable que muchas de estas sustancias producidas en el ovocito tengan su efecto en las etapas tempranas de desarrollo embrionario. La hipótesis más reciente sobre la función de los cromosomas plumulados (Cavalier-Smith, 1 978) propone que estos participan en la producción de ARN nucleoesquelético , que permite inflar el núcleo y aumentar el área de intercambio con el citoplasma. Cavalier-Smith supone que el ADN del núcleo puede cumplir funciones de cOJ1trol , transcripción y traducción en cuyo caso se clasifica como ADN génico. Existe otro tipo de ADN que no codifica y cuya secuencia propiamen­ te no está sujeta a estricta selección natural. Sólo la cantidad de este tipo de ADN lo está, pues el valor C correlaciona directamente con el volumen del núcleo y con el volumen de la célula. En ADN nucleoesquelético, como Cavalier-Smith lo ha llama­ do , da origen al ARN nucleoesquelético, cuando es transcrito en el ovocito. Los trabajos con núcleo microinyectados (DeRobertis y Gurdon, 1 979) de­ muestran que algunos genes no son traducidos en el ovocito por lo que tal vez tampoco sean transcritos. Otra evidencia indica que algunos genes de hecho no son transcritos, por lo que probablemente no todos los promotores del genoma se encuentren activos durante el diplotene plumulado . Es notable, en todo caso, la tasa de transcripción durante el diplotene plumulado , que es al menos un orden de magnitud superior al de otras células (David son y Britten, 1 979). CONSIDERACIONES FINALES Las hipótesis de reprogramación propuestas (Gurdon , 1 968; León, 1 975 ; DeRobertis y Gurdon, 1 979) implícitamente conciben el proceso embriológico como un algoritmo cuyo componente temporal requiere de una reprogramación inicial, o preprogramación . DeRobertis y Gurdon( I 979) han demostrado que el citoplasma del ovocito suprime el programa sintético de núcleos diferenciados, cuando éstos son microinyectados, y activa genes ovocitarios aún en núcleos de especies dife­ rentes. Los estudios con la sustancia "0+ " en el ajolote también apoyan un tipo de preprogramación en que substancias sintetizadas por el ovocito determinan luego la diferenciación de algunas células. La forma en que esta preprogramación ocurre es desconocida . Evidentemente los núcleos somáticos inyectados en el citoplasma ovocitario remedan los eventos que efectúa el núcleo del ovocito, incluyendo una transcripción intensa . Aunque no existen aún pruebas formales definitivas, parece improbable que la re programación

ESPINOZA . et al. : Estructura y función de cromosomas plumulados

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involucre toda la fibra DNPica o que cambie la secuencia o composición del ADN. También se ha sugerido que, la producción de ARN regulador durante el diplotene plumulado es necesaria pata instituir el programa de desarrollo adecuado en los núcleos embrionarios (León, 1 97 5 ; Davidson y Britten, 1 979) . Debe notarse que la propuesta de Cavalier-Smith no es incompatible con la hipótesis de reprogramación, aunque resulta trivial si éstas son correctas. La utilidad de estas ideas depende del valor predictivo que tengan. A nuestro juicio las siguientes predicciones pueden ser sometidas a prueba: a)

b)

Si la propuesta de Cavalier-Smith es correcta , gran cantidad de ARN nucleoesquelético, no codificante , debe producirse en el núcleo del ovocito ; alternativamente el ADN nucleoesquelético debe aumentar proporcionalmente al tamaño del ovo cito y la transcripción per se no define el volumen nuclear y celular. Macgregor al final de su reciente artículo ( I 980) menciona algunas observaciones que favorecen esta segunda idea de Cavalier-Smith. Si las hipótesis de reprogramación son correctas, las sustancias repro­ gramantes deberían ser aislables, y su efecto podría demostrarse con técnicas de microinyección . Por ejemplo , si en la vesícula germinal se produce ARN regulador (Davidson y Britten, 1 979) éste podría aislarse y demostrar alguna actividad determinativa en el mismo sentido que la sustancia "O + del ajolote lo es. Si la fibra de ADN se modifica, por ejemplo , por metilación , las modificaciones deberían ser detectables comparando cromatina de otras etapas con los cromosomas del diplo­ tene plumulado. Si las modificaciones son importantes para el desarro­ llo, los núcleos microinyectados, capaces de dar origen a un organismo, deberían sufrir las modificaciones correspondientes. La activación del genoma podría meramente implicar una hiperactivación de ciertos .ge­ nes; esta idea predice modificaciones en los parámetros de la trans­ cripción , a saber, iniciación, terminación y atenuación en el progreso de las polimerasas. "

Es indudable que muchas de las dudas que persisten, pronto serán esclare­ cidas, y concordamos con las recientes observaciones de Macgregor ( I 980) sobre el continuo reto que representan estos cromosomas para aquellos que se interesan en la organización y expresión del material genético . AGRADECIMIENTO Agradecemos al Dr. J ames Kezer, de la Universidad de Oregón , U.S.A., por las fotografías de las Figuras 4 y 6, y al Dr. H.C . Macgregor de la Universidad de Leicester, Inglaterra, por.adelantarnos manuscritos en preparación. Parte de este trabajo fue efectuado gracias a la ayuda de la Viéerre ctoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica (02-07-03 -83); y al aporte del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas a los Drs. Macaya y León . RESUMEN Los cromosomas plumulados aparecen en los ovocitos de muchos organismos durante el diplotene de la meiosis . Cada una de las cromátidas de estos cromosomas

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consta de una fibra de desoxiribonucleoprote ína que a intervalos regulares se arrolla sobre sí dando origen a los cromómeros. Por lo general se asocian a cada cromó­ mero dos, o un múltiplo de dos asas, producto de una intensa transcripción . Cada cromómero contiene varios cistrbnes, en contraste con lo encontrado en cromoso­ mas politénicos de dípteros. Las asas representan unidades de transcripción donde se copian secuencias repetidas y únicas. Cada cromómero podría constar de una familia de secuencias repetidas o simplemente de secuencias con un contenido similar de bases. Se han planteado varias hipótesis acerca del funcionamiento de los cromoso­ mas plumulados, conocidas como la del "amo-esclavo ", las de re programación y las propuestas recientes de Cavalier-Smith. En esta revisión se discuten estas hipótesis y con base en ellas se establecen predicciones que experimentos futuros decidirían cuál de ellas explica en forma consistente el papel que juegan los cromosomas plumu­ lados.

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