CÁTEDRA BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR TEMA V PARÁSITO DEL SISTEMA GENÉTICO CELULAR VIRUS

Virus (del latin virus, toxina o veneno) es una entidad biológica capaz de autorreplicarse utilizando la maquinaria celular.

Una cápside (o cápsida) de proteínas que envuelve al ácido nucleico, ( ADN o ARN). Esta estructura puede, a su vez, estar rodeada la envoltura vírica, por una capa lipídica con diferentes proteínas, dependiendo del virus

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El ciclo vital de un virus

Necesita de la maquinaria metabólica de la célula invadida para poder replicar su material genético

Produce muchas copias del virus original.

Allí reside la capacidad destructora de los virus, ya que pueden perjudicar a la célula hasta destruirla.

Eucariotas

infecta células Procariotas (bacteriófagos, o simplemente fagos).

Algunos virus necesitan de enzimas poco usuales por lo que las cargan dentro de su envoltorio como parte de su equipaje.

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Estructura básica de un virus Una molécula de ácido nucleico (ADN, ARN) Una envoltura proteínica. Transcriptasa reversa (retrovirus)

El ácido nucleico ADN o ARN Cuatro clases de virus:

ADN de cadena doble ADN de cadena sencilla ARN de cadena doble ARN de cadena sencilla

La envoltura proteínica recibe el nombre de cápside. Está formada por unas subunidades idénticas denominadas capsómeros.

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Ciclo reproductivo de los virus El ciclo vital de los virus consta de las siguientes fases:

Entrada en la célula Eclipse Multiplicación Liberación del virus

Entrada Consta a su vez de dos etapas: La adsorción o fijación del virus en la superficie celular La penetración a través de la membrana. Alta especificidad en la fijación de un virus a la membrana de su célula hospedadora, (unión entre determinadas proteínas de la cápside vírica y glicoproteínas de la membrana plasmática).

Cada virus tiene sitios de unión específicos para anclarse en la membrana de un determinado tipo celular.

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El virus completo, o bien solamente su ácido nucleico, logra invadir el citoplasma celular.

Por regla general, se necesita el concurso de muchos virus para que alguno de ellos logre penetrar en la célula.

Eclipse El virus parece desaparecer, pues no se advierte ningún indicio de su presencia ni de su actividad. Desensamblaje de las piezas del virus (si es que ha penetrado completo). Ácido nucleico queda asimilado en las estructuras celulares aptas para los procesos de replicación y transcripción. Fase variable de unos tipos de virus a otros Termina con la síntesis de los ARN mensajero necesarios para que se sinteticen las proteínas.

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Multiplicación Consiste en la replicación de su ácido nucleico, como en la síntesis de las proteínas de la cápside.

Los ácidos nucleicos y las proteínas recién sintetizadas se ensamblan rápidamente, produciéndose nuevas partículas víricas.

Liberación Consiste en la salida de las nuevas partículas víricas, que podrán infectar nuevas células iniciando un nuevo ciclo.

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Modalidades de penetración

Los virus complejos producen una rotura en la membrana bacteriana en uno de los puntos de anclaje, gracias a la presencia de enzimas hidrolíticas entre las proteínas de la cápside. El tubo central inyecta del ADN vírico La presencia de cápsides en la superficie bacteriana es un buen indicio de que la bacteria ha sufrido una infección vírica.

Virus sin envoltura lipídica se introducen en la célula con cápside y todo, lo cual puede realizarse de dos maneras:

Por penetración directa: después de la fijación, el virus abre una brecha en la membrana y se introduce en el citoplasma.

Por endocitosis: la membrana forma una invaginación en torno al virus, llegando a formar una vesícula que penetra en la célula.

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Formada la vesícula, se abre una brecha en la membrana de la misma con ayuda de algunas enzimas hidrolíticas, penetrando así en el citoplasma.

Los virus con envoltura lipídica burlan la barrera de la membrana celular porque su cubierta lipídica se funde con la membrana, ya que tienen la misma naturaleza.

Esta fusión de membranas puede realizarse en dos lugares distintos:

Fusión en la superficie celular: de manera que el virión penetra directamente en el citoplasma.

Fusión con un lisosoma: se forma una vesícula por endocitosis Se une un lisosoma para digerir la partícula introducida La cubierta lipídica del virus se funde con la membrana del lisosoma y el virión escapa hacia el citoplasma.

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Modalidades de fase de eclipse Se suelen distinguir dos modalidades de ciclo infeccioso de un virus Ciclo ordinario El ácido nucleico vírico procede inmediatamente a la transcripción de su mensaje genético en los mARN necesarios para su multiplicación y prosigue rápidamente el ciclo vital.

Este tipo de ciclo es el más extendido en la naturaleza.

Ciclo lisogénico: Descubierto por Lwoff en bacteriófagos. El ADN vírico se cierra por sus extremos generando un ADN circular. ADN se inserta en el ADN bacteriano en un lugar específico en el que la secuencia de nucleótidos bacterianos es semejante alguna región del ADN vírico.

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La bacteria prosigue sus funciones vitales sin que el virus realice ninguna acción

El ADN bacteriano se duplica también lo hace el ADN vírico El genoma del virus pasa a las dos bacterias hijas.

La multiplicación bacteriana puede seguir durante generaciones sin que el virus se manifieste.

Ante una alteración de las condiciones ambientales

El ADN vírico se separa del bacteriano y prosigue entonces las restantes fases de ciclo infeccioso Produciendo la muerte de la bacteria y nuevos ejemplares del virus.

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Algunos virus siguen también el ciclo lisogénico, como los virus de las verrugas y retrovirus que producen algunos tipos de cáncer.

En el caso de los retrovirus, el ácido nucleico es ARN monocatenario. La transcriptasa inversa ha de copiar el genoma vírico en forma de ADN antes de que pueda insertarse en el ADN celular.

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FAGO LAMBDA Definición Fago (abreviación de bacteriófago), o virus de bacteria. Un fago se hace reproducir por la célula a la cual infecta. El ADN se encuentra en la cabeza. El volumen de la cabeza limita el volumen de ADN y también la talla de inserto que el ADN del fago puede transportar.

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La Infección Se realizada básicamente en dos etapas: la adsorción la inyección del ADN La adsorción reversible a bajas temperaturas, pero resulta irreversible una vez que el ADN ha sido inyectado. El fago lambda infecta eficientemente 37°C. El proceso de infección requiere de energía metabólica del huésped. El producto del gen J del fago (extremo distal del tallo) , reconoce al receptor de maltosa LamB (membrana externa del huésped).

Requiere además

el producto del gen pstM, proteína relacionada en el transporte de fosfato y ubicada en la membrana interna.

La infección ocurre sin cambios contráctiles en la estructura del tallo, a diferencia de lo que sucede con el fago T4.

Los extremos del ADN son unidos en forma covalente por la ligasa del huésped.

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ADN linear y los extremos cos El ADN del fago lambda Contiene un ADN de aproximadamente 45.000 bp dos extremos adhesivos cos (constituídos por 12 nucleótidos); « secuencia cos», conteniendo 10 G ó C. Los cos permiten a la molécula de ADN de circularizarse cuando éste es introducido en una bacteria. El ADN del fago se sintetiza continuamente. Los genomas se forman y se unen los unos a los otros por los cos formando un polímero largo que se conoce como concatenario.

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El fago inyecta su ADN Maltosa en el medio: El fago λ adsorbido mediante receptores presentes, en la membrana externa de E. coli. Codificados por lamB. Normalmente lam B sirve para introducir maltosa en la célula (expresados en presencia de maltosa en el medio). Para infectar las bacterias: Se los cultivar una noche en un medio rico en maltosa. La adsorción de fagos por los receptores se mejora con iones de magnesio Mg++. La reacción se produce a los 20 minutos a 37°C.

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El ADN se circulariza En la bacteria, las extremidades cos del fago se aparejan para formar una molécula circular. Los enlaces diésteres se realizan por la ligasa y el ATP de la bacteria hospedadora del fago.

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En éste estado, el fago puede seguir la vía lítica o la vía lisogénica.

Fago lítico En la vía lítica, el ADN viral circular del fago es replicado de numerosas maneras. Replicación de Cairns ó en forma q

Durante la fase precoz de la infección, el ADN circular del fago l se replica en 2 direcciones a partir de un sólo punto de orígen (origen de replicación).

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círculo rodante « rolling-circle »: La replicación es en círculo rodante « rolling-circle » que produce moléculas largas de ADN linear constituídas de genomas de fagos unidos uno a uno (concatémero).

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Durante la fase tardía de la infección, se producen la expresión de proteínas que forman y ensamblan las cabezas y las colas de los fagos, y también las proteínas que lisan bacterias. La encapsulación: Las secuencias cos del concatémero precedidas por el círculo enrollante son reconocidas por el producto del gen. La proteína A corta el ADN polímero del fago en monómeros é introduce cada monómero en una cabeza viral. Las partículas nuevas del fago son enseguida ensambladas y la bacteria es finalmente lisada y rellenada de numerosas partículas virales.

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fago lisogénico El ADN del fago puede integrarse al genoma de la bacteria. La elección del fago por la vía lítica ó la vía lisogénica es todavía estudiado y poco conocido al presente. Recombinación En la vía lisogénica, una recombinación se produce entre el ADN circular del fago y el cromosoma de la E. coli gracias a una secuencia corta "att" presente a la vez en ambos genomas: bacteria y en el del fago.

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El gen cI codifica un represor del ciclo lítico: El ADN del fago insertado en el cromosoma bacteriano se denomina un profago. La bacteria + profago = lisógena. El genoma del fago es replicado y transmitido de una bacteria a la otra. A lo largo de la fase lisogena, el único gen de bacteriófago expresado es el gen cI que codifica un represor. bloquea la transcripción precoz de genes del ciclo lítico y por consecuencia también bloquea la expresión de los genes tardíos de ése ciclo.

El profago se integra bien justo hasta el momento en que una señal induce su expresión. Si se expone la bacteria a agentes como la luz ultravioleta, dañan el ADN y el represor cI La inactivación del represor permite la transcripción de genes precoces. Sufre una separación proteolítica por la proteína bacteriana RecA Se observa luego de la inducción una reversión del proceso de crossing-over que conduce a la escisión de ADN del fago que entra entonces en la vía lítica.

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TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA Se puede transferir cualquier trozo de genóforo bacteriano, con tal de que tenga un tamaño compatible con la capacidad de “empaquetado” de ADN de la cápsida del fago. La partícula transductora (pseudovirión) se forma por empaquetamiento anómalo de ADN genofórico bacteriano.

En el interior de la cabeza del pseudovirión sólo existe ADN bacteriano, sin ADN del fago.

Las partículas transductoras sólo se forman como consecuencia de infecciones líticas del fago.

1ª fase: producción de las partículas fágicas transductoras (=pseudoviriones): Por encapsidamiento ilegítimo de ADN cromosómico. De vez en cuando, el sistema fágico encargado de introducir su ADN en la cápsida (sistema pac), se “equivoca”, y en su lugar introduce un trozo de tamaño equivalente del genóforo de la bacteria donde está teniendo lugar la infección

El cromosoma bacteriano contiene secuencias que eventualmente pueden ser reconocidas de vez en cuando por el sistema del fago, de manera que puede introducirse un trozo de ADN de Salmonella en la cápsida.

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Al final de esta fase La célula hospedadora se lisa. El lisado (sobrenadante) contiene una mayoría de viriones auténticos y un pequeño número de pseudoviriones, cada uno con un trozo aleatorio distinto del genoma de la bacteria.

2ª fase: Destino del ADN del exogenote: Mezclemos el lisado obtenido en la fase anterior con un cultivo de la cepa receptora (dotada de marcadores genéticos adecuados). Cada pseudovirión inyecta de forma normal su ADN a una bacteria. Este ADN puede tener varios destinos posibles: a) puede ser destruido por exo- y endonucleasas citoplásmicas.

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b) Puede recombinarse con la región homóloga del genóforo del receptor, mediante la actuación del sistema de recombinación general dependiente de RecA.

Se produce una recombinación con dos sobrecruzamientos (“crossing-overs”), Conduce a la integración de doble cadena de ese exogenote, con eliminación de la zona homóloga del endogenote.

c) Puede ocurrir que el exogenote no sea ni destruido ni recombinado; este ADN puede persistir en la célula sin replicarse. -la célula que originalmente recibió ese ADN exógeno se divida, lo pasará solo a una de las dos células hijas, en la siguiente división, y así sucesivamente (se va diluyendo en el clon por transmisión unilinear)

A este fenómeno se le conoce con el nombre de transducción abortiva, y es más frecuente que la transducción completa derivada de recombinación (más de 90% frente a sólo 1-5%).

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La célula con el exogenote abortivo puede expresar los genes de éste: por lo tanto, la célula transductante abortiva contiene proteínas derivadas del exogenote. Parte de las proteínas (en principio la mitad), pasarán a la célula hija que no reciba el exogenote en la siguiente generación. Las hijas de la hija (“las nietas no herederas del original”) reciben la cuarta parte, etc... es decir, aparte de la célula hija que en cada generación hereda el exogenote, sus parientes no-herederos más cercanos reciben proteínas derivadas de la expresión previa de los genes del exogenote.

Esto significa que las células no herederas pueden poseer, durante unas pocas generaciones, la función o funciones del exogenote, hasta que el producto correspondiente se diluya o se inactive.

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Permite detectar fácilmente determinados tipos de transductantes abortivos, distinguiéndolos de los transductantes completos

Por ejemplo, selección de transductantes en base a la adquisición auxotrofía , de la versión silvestre del gen que tiene mutado, Se distinguen dos dos tipos de colonias: Colonias grandes, correspondientes a transductantes completos;

Microcolonias, correspondientes a los transductantes abortivos.

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Si el exogenote es un plásmido, al llegar a la célula receptora, puede replicarse autónomamente.

Si el exogenote contiene un transposón, éste puede insertarse en el genoma de la célula receptora.

Los fagos con capacidad transducción generalizada No degradan totalmente el ADN del hospedador inmediatamente después de entrar. (de otra manera, no habría ADN intacto que transducir). Además, su sistema de empaquetamiento NO debe ser muy específico: P22 ( S. typhimurium) P1 (E. Coli)

Mecanismo de empaquetado secuencial reconoce secuencias que también existen con cierta frecuencia en el genoma del hospedador.

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La transducción generalizada ha sido muy útil en el análisis genético de bacterias y la construcción de nuevas cepas.

TRANSDUCCIÓN ESPECIALIZADA (=RESTRINGIDA) Descubierta por el equipo de Lederberg (1956) POR experimentos de inducción de células de E. coli lisogenizadas con el fago λ. Consiste en la transferencia Mediatizada por fagos moderados producidos en la inducción de un cultivo lisogénico, Un número limitado de marcadores, correspondientes a los loci genéticos adyacentes al sitio de integración del profago. La transducción restringida nunca ocurre por infecciones líticas. El ADN transducido va unido a ADN del fago.

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Mecanismo de la transducción especializada promovida por el fago λ de Escherichia coli

1ª fase: Producción de los fagos transductores: E. coli K12 (λ+), lisogénica. Integrado entre los operones gal y bio. Inducimos artificialmente este cultivo lisogénico (con rayos UV, o con mitomicina-C).

El profago desreprime (va a entrar en un ciclo lítico). Con una baja frecuencia (10-5-10-6) se producen escisiones anómalas del profago: bucles anómalos

(dependiendo de los casos, o gal o bio), y en cambio, queda un trozo del genomio del fago. Se pueden formar fagos λ defectivos (λd) para alguna función fágica, pero con la “contrapartida” de ser portadores de material genofórico de la bacteria hospedadora.

Se obtiene un lisado (llamado lisado LTF, de baja frecuencia de transducción), donde existe una pequeña proporción (alrededor de 10-6) de partículas defectivas del fago portadoras de ADN cromosómico.

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Estos viriones, por sí solos no podrían establecer lisogenia, Pero si en una misma célula inyectaran su ADN un fago defectivo y otro silvestre, este último actuaría como fago auxiliador (“helper”) Así el defectivo sí podría entonces establecer lisogenia.

Ejemplo (vamos a suponer que las partículas transductoras portan el operón silvestre gal+, y que empleamos una cepa receptora mutante gal-).

2ª fase en el caso de infectar una cepa receptora con el lisado anterior a baja multiplicidad de infección: Mezclamos un cultivo de la cepa receptora con un lisado LTF, a una multiplicidad de infección (m.d.i., o en inglés, m.o.i) de alrededor de 1 (cada bacteria recibe una sola partícula de fago). Una partícula λgal+ inyectaría de forma normal su ADN en la bacteria gal-. El ADN lineal del fago se circulariza como de costumbre. Pero este ADN NO posee un sitio att normal, sino que presenta solamente el sitio BOP' (derivado de la escisión anómala producida en el ciclo anterior), al ser defectivo, cabe la posibilidad de que haya perdido el gen int que codifica la integrasa.

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La única posibilidad de integración del ADN es mediante recombinación homóloga simple (un solo crossing-over) propiciada por el sistema RecA de la bacteria receptora.

El resultado de la recombinación homóloga es la creación de un heterogenote gal+/gal- con un profago λ defectivo, que debido a ese carácter defectivo no es inducible (no provoca lisogenia). Observar que cada copia del gen gal es en realidad un “mosaico”, con una porción derivada del exogenote y otra del endogenote. Este heterogenote con fenotipo Gal+ es estable.

2ª fase en el caso de infectar la cepa receptora con el lisado LTF a una alta multiplicidad de infección: Mezclamos una media de 10 partículas de fago del lisado obtenido en la primera fase con 1 célula de la bacteria receptora (una m.o.i.=10). Algunas bacterias reciben el ADN del fago defectivo (λd gal+) junto con el ADN del fago silvestre. El ADN del fago silvestre se integraría de la forma habitual, recombinación específica de sitio (POP' X BOB'). ADN del fago silvestre es auxiliador respecto del defectivo: suministra sitios para la recombinación y la función de la integrasa.

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El resultado es un heterogenote gal+/gal- que es doble lisogénico (λ+/λd). Fenotipo será Gal+ y λ+, capaz de producir, por inducción partículas de fago silvestres y defectivas.

Resultado es un lisado donde existe un 50% de λ+ y un 50% de fagos portadores del gen gal+. Si este lisado lo usamos para infectar de nuevo una cepa gal-, la proporción de transductantes Gal+ será muy alta.

Por esta razón, al lisado obtenido por inducción del doble lisógeno λ+/λd se le denomina lisado HTF (alta frecuencia de transducción).

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La transducción especializada con el fago l permitió los primeros aislamientos (“clonaciones”) de genes in vivo,

Pero desde mediados de los años 70 la clonación de genes se realiza ya con métodos de ADN recombinante (ingeniería genética).

LISOGENIA

Lwoff razonó que en las cepas lisogénicas el fago se encuentra en forma de un precursor no infeccioso al que denominó profago.

La lisis ocurre solamente cuando estas células han sido estimuladas para producir fagos.

Lwoff y colaboradores observaron que la irradiación con luz ultravioleta (U.V.) era capaz de inducir la producción de fagos en una población de bacterias lisogénicas.

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Por lo tanto, una bacteria lisogénica posee la capacidad de heredar el fago a sus descendientes, muy pocos de los cuales se lisarán en forma espontánea.

Las bacterias infectadas por fagos temperados continúan dividiéndose por varias generaciones y son inmunes o resistentes a ser superinfectadas por el mismo tipo de fago que albergan o por otros fagos pertenecientes a clases emparentadas

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También actúa como un factor de inmunidad que impide la superinfección de la misma bacteria por otro fago l

El mantenimiento del estado de profago está representado por la concentración de la proteína represora en el citoplasma bacteriano.

Eventos que disminuyen la concentración del represor inducen la expresión del genoma viral completo.

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Virus oncogenico

La inducción del cáncer se denomina oncogénesis.

Cualquier cosa que pueda alterar el material genético de una célula es un agente potencialmente cancerígeno.

Actualmente se sabe que algunos tipos de cáncer están producidos por virus que se denominan virus oncogénicos.

Tanto virus con DNA como virus con RNA son capaces de inducir tumores en animales.

Cuando esto ocurre se dice que las células afectadas se han transformado,

Han adquirido propiedades distintas a las de las células no infectadas o a las de las células infectadas que no forman tumores.

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Una característica que distingue a todos los virus oncogénicos es que su material genético se integra en el DNA de la célula hospedadora y se replica con él sin llegar a lisarse la célula huesped.

Las células transformadas pierden una propiedad denominada inhibición por contacto.

Las células normales En cultivo presentan movimiento ameboide Se dividen repetidamente hasta que entran en contacto unas con otras. Se detiene tanto el movimiento como la división celular Forman una monocapa en el cultivo celular

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En las células transformadas No exhiben esta inhibición por contacto en cultivo celular Forman masas celulares de tipo tumoral Producen tumores cuando se inyectan en animales susceptibles Más redondeadas que las células normales Ciertas anormalidades cromosómicas (número inusual, cromosomas fragmentados).

Familia Retroviridae (RNA) pueden causar cáncer en animales: Virus de la leucemia humana de células T (HTLV-1) (leucemias y linfomas en humanos).

En contraste, dentro de los virus ADN pueden causar cáncer los miembros de 3 familias: 1.- Papovaviridae: Virus del papiloma (verrugas benignas y cáncer de útero) 2.- Herpesviridae: Virus de Epstein-Barr (EBV) (Linfoma de Burkitt, tiene afinidad por los linfocitos transformándolos) 3.- Adenoviridae

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Uso de a terapia Génica La Terapia Genética se basa en insertar genes dentro de la célula para lograr un nuevo paquete de instrucciones para estas, la inserción de genes podrá ser utilizado para corregir una herencia de genes defectuosos La medicina genética se ha centralizado básicamente en las mutaciones de los genes las cuales causan enfermedades, la anemia de células enfermas, la talasanemia, la fibrosis cistica y la Fenilcetonuria,

Pero ahora se tiene claro que tienen la misma importancia genéticamente hablando algunas enfermedades comunes como

el cáncer

los infartos

la diabetes

el mal de alzheimer. enfermedades hereditarias (anormalidades genéticas)

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Ejemplo La fibrosis cística es de las enfermedades hereditarias más fatales,

(una de cada 2500 nacimientos)

África y en América (una de cada 17 000 nacimientos)

Se pudo identificar el gen involucrado en la Fibrosis Cistica en el cromosoma 7

Más de 200 mutaciones del gen han sido descritos,

Es claro que la medicina ha avanzado cantidades,

Pero realmente hay que recalcar que la Ingeniería Genética será el futuro de ella, por medio de la Terapia Genética Prevenir cualquier enfermedad que pueda existir. Para los próximos 10 a 20 años esta estará en su furor y con ella la salud reinara en el mundo.

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Por otra parte puedo concluir que, en un futuro, las enfermedades mas graves como el SIDA, el cáncer, la Fibrosis Cistica La Distrofia muscular; el mal de Parkinson y hasta el Síndrome de Down podrán ser tratadas tan fácilmente como una simple gripe

Muchas gracias

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