Automatización del Hemograma

Material recopilado por

Carbia C Fink N Lazarowski A

INTRODUCCION La automatización proporciona mayor exactitud y precisión que los métodos manuales. Durante los últimos 20 años la automatización reemplazó casi en su totalidad el recuento manual, con la posible excepción del recuento de plaquetas con contraste de fase como un procedimiento confirmador. Numerosos fabricantes de instrumentos desarrollaron y comercializaron analizadores hemáticos. En los casos típicos, estos analizadores proporcionan en menos de un minutos, los ocho parámetros hemáticos estándar del hemograma completo [HC], más un recuento diferencial de leucocitos de tres componentes (o cinco componentes en equipos más modernos), en 100 microlitos de sangre entera. Por esto, la automatización permite el manejo más eficiente de mayor volumen de trabajo (n° de muestras), así como el diagnóstico y el tratamiento más oportuno de la enfermedad. Principios generales del equipamiento A pesar de la cantidad de analizadores hemáticos disponibles de fabricantes diferentes y con los distintos grados de sofisticación y complejidad, para el funcionamiento se utilizan sobre todo dos principios básicos: la impedancia electrónica (resistencia) y la dispersión óptica. La impedancia electrónica, o la resistencia a la corriente continua (CC) de bajo voltaje fue desarrollada por Wallace Coulter en la década de 1950 y es la metodología utilizada con mayor frecuencia. La radiofrencuencia (RF), o la resistencia a la corriente electromagnética de alto voltaje a veces se utiliza junto con la impedancia electrónica de la CC. La marca Technicon Instruments introdujo el barrido óptico con campo oscuro en la década de 1960 y Ortho Diagnostics Systems siguió con un instrumento óptico basado en láser en la década de 1970. En el equipamiento hemático actual con frecuencia se emplea la dispersión óptica, que utiliza luz láser y no láser. Impedancia electrónica El principio de la impedancia en el recuento de células se basa en la detección y la medición de cambios en la resistencia eléctrica producida por las células cuando atraviesan una apertura pequeña. Las células suspendidas en un diluyente conductor de la electricidad, como solución fisiológica, se arrastran a través de una apertura (orificio) en un tubo de vidrio. En la cámara de recuento, o ensamblaje del transductor, se aplica la corriente eléctrica de baja frecuencia entre un electrodo externo (suspendido en la dilución celular) y uno interno (alojado dentro del tubo de apertura). La resistencia eléctrica entre los dos electrodos, o la impedancia en la corriente, se produce a medida que las células atraviesan la aper-

tura, que tiene sensores y produce pulsos de voltaje medibles (fig. 1). En algunos instrumentos, las pantallas del osciloscopio muestran los pulsos que generan las células cuando éstas interrumpen la corriente.

Figura 1. Principio Coulter para el recuento celular El número de pulsos es proporcional al número de células contadas. El tamaño del pulso de voltaje es directamente proporcional al tamaño (volumen) de la célula, lo que permite la discriminación y el conteo de células de tamaño específico mediante el uso de circuitos umbral. Los pulsos se reúnen y ordenan (canalizan) según su amplitud mediante analizadores de la altura de los pulsos. Los datos se trazan en un gráfico de distribución de frecuencia, o histograma de distribución de tamaño, con el número relativo en el eje Y y el tamaño (número del canal equivalente al tamaño específico) en el eje X. El histograma producido representa la distribución del volumen de las células contadas. En la figura 2 se ilustra la construcción de un gráfico de distribución de frecuencia. Los umbrales de tamaño separan las poblaciones celulares en el histograma, y el recuento corresponde a las células cuantificadas entre los umbrales fijos, inferior y superior, para cada población. Los histogramas de distribución por tamaño pueden utilizarse para la evaluación de una población celular o subgrupos dentro de una población. El uso de reactivos líticos de marca registrada, como el utilizado en el más antiguo Coulter S-Plus IV, STKR y el Sysmex E-5000 para controlar la contracción y la lisis de tipos celulares específicos, permite separar y cuantificar de los leucocitos en sangre en tres poblaciones (linfocitos, células mononucleares y granulocitos) para el “recuento diferencial de tres componentes” sobre el histograma de distribución de tamaño.

Fig. 2: Osciloscopio e histograma de distribución de frecuencia (Coulter ) Varios factores pueden afectar las medi ciones de tamaño o volumen en los instrumentos de desplazamiento de impedancia o volumen. El tamaño de la apertura es crítico; para los eritrocitos y las plaquetas (PL) es más pe queño que para la apertura de los leucocitos para aumen tar la sensibilidad del recuento plaquetario. La acumulación de proteínas en la apertura disminuye el ta maño del orificio, lo que reduce el flujo de células y au menta la resistencia eléctrica a medida que las cé lulas pasan. Esto produce recuentos celulares más bajos con volúmenes celulares con elevaciones falsas. Los equipos de impedancia más viejos re quieren la limpieza frecuente de las aperturas, pero los más nuevos incorporaron "circuítos de quemado" u otros sistemas internos de lim pieza para prevénir o reducir la velocidad de acumulación de proteínas. El remanente de células de una muestra a la siguiente también se minimiza por estos sis temas de limpieza internos. El pasaje coincidente de más de una célula en un momento dado a través del orificio causa pulsos artificialmente grandes, lo que produce volúmenes celulares aumentados falsos y recuentos celulares disminuidos falsos. Esta reducción del recuento o pérdida por pasaje coincidente, puede predecirse de ma nera estadística (y, por consiguiente, corregirse mediante cálculos matemáticos) debido a su relación directa con la concentración y el tamaño celular o un volumen eficaz de apertura. La corrección de la coincidencia se completa por el analizador de la computado ra antes del registro impreso final de los recuentos celulares del equipo. Otros factores que afectan la altura del pulso son la orientación de la célula en el centro de la apertura y la capacidad de deformación de los eritrocitos, que puede alterarse por la disminu ción en el contenido de hemoglobina. La recirculación de las células hacia atrás en la zona de sensores crea pulsos erróneos y proporciona re cuentos celulares con elevaciones falsas. Se agre gó un mecanismo de retrolavado o flujo de barrido para prevenir la circulación retrógrada de las células en la zona sensora y se eliminan en forma electrónica los pulsos anómalos. El uso del centrado hidrodinámico evita muchos de los problemas inherentes a un sistema de apertura rígido. La co rriente de la muestra está rodeada por un líquido de cubierta a medida que atraviesa el eje central de la apertura. El flujo laminar permite que la co rriente central de la muestra se estreche lo sufíciente para separar y alinear las células en una sola hilera para el pasaje a través de la zo na de

sensores. El líquido de cubierta externo minimiza la acumulación de proteínas y la formación de ta pones, elimina la circulación retrógrada de las cé lulas hacia atrás en la zona de sensores con la ge neración de pulsos espurios y reduce la irregularidad de altura del pulso, ya que se evita el pasa je celular fuera del centro y se obtiene una resolución mejor de las células sanguíneas. La pérdida por pasaje coincidente también se reduce, ya que las células sanguíneas se alinean una detrás de la otra en la dirección del flujo. Radiofrecuencia Como se describió antes, la impedancia de CC de bajo voltaje puede utilizarse junto con la resis tencia de RF, o corriente electromagnética de alto voltaje que fluye entre ambos electrodos, al mismo tiempo. Por cuanto el volumen total de la célula es proporcional al cambio en la corriente continua, la densidad interna celular (volumen nuclear, etc.) es proporcional al tamaño del pulso o el cambio en la señal de RF. La conductividad, medida por esta sonda electromagnética de alta frecuencia, se ate núa por la relación núcleo-citoplasma, la densidad nuclear y la granulación citoplasmática. Los cambios de voltaje de la CC y la RF pueden detectarse en forma simultánea y separarse por acción de dos circuitos de procesamiento de pulsos diferentes. En la figura 3 se ilustra el uso simult áneo de CC y corriente de RF. Pueden graficarse en forma com parativa dos propiedades celulares diferentes, la impedancia y la conducti vidad, para la formación de un citograma de distribución bidimensional un trazado de dispersión (fig. 3). Estos trazados muestran las poblaciones celulares como cúmulos, con el número de puntos en cada uno que representa la concentración de ese tipo de célula. Luego el aná lisis computarizado del cúmulo puede determinar los recuentos absolutos para poblaciones celulares específicas.

Figura 3: Métodos de detección de RF y CC . Uso simul táneo de corriente continua (CC) y radiofrecuencia (RF) .

El uso de varios métodos en u n equipo dado para la determinación de por lo menos dos propiedades celulares permite la separación diferencial de los leucocitos en cinco componentes (neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos). La detección de CC y de RF son dos métodos utilizados en los analizadores Sysmex pa ra realizar los recuentos diferenciales de los leuco citos. Dispersión Optica La dispersión óptica puede utilizarse como la metodología primaria o en combinación con otros métodos. En los sistemas de dispersión óptica (citómetros de flujo) una masa de muestra (centrada en forma hidrodinámica) se dirige por un canal de cuarzo que genera un “flujo celular” (de a una por vez), sobre el que impacta la luz también “centrada”. La fuente suele ser de luz halógena, de tungsteno, o laser de helio y neón. La luz laser denominada “monocromática” debido a que se emite con una longitud de onda individual, difiere de la producida por el “campo brillante”, por su intensidad y su cohesividad (circula o moviliza en fase), como así también por su divergencia o escasa diseminación. Esto permite la detección de “interferencia” en el haz de luz y posibilita su cuantificación, de modo tal de dar valores que “caracterizarán a cada tipo celular”. Este sistema de dispersión óptica permite identifica leucocitos, plaquetas y eritrocitos. A medida que las células circulan por la “región sensora”, la luz impacta sobre ellas y se interrumpe el flujo lumínico unidireccional. La luz se dispersa en todas direcciones con ángulos de desvío relativos a las características (densidad y tamaño) del cuerpo golpeado. Se generan a su vez procesos de absorción, difracción y de dispersión lumínica, que se convierten en señales eléctricas por fotoelectrodos, (fotodiodos y fotoamplificador [FTAm]) y en ángulos específicos. La luz dispersa se colecta con lentes se anula, así se genera un “saldo” neto de luz dispersa con diferentes ángulos que ingresan al detector. Mediante filtros y espejos se separan las distintas longitudes de onda, y se presentan a los fotodetectores, que traducen dichas longitudes de ondas y sus “cantidades” en señales eléctrónicas proporcionales. El FTA capta las señales más débiles, producidas por un ángulos de 90°. Las señales digitalizadas, son procesadas por sistemas computarizados. La dispersión frontal de luz (0°) se correlaciona con el volumen celular (tamaño), debido sobre todo a la difracción de la luz. En tanto, la dispersión ortogonal de la luz (90°), o dispersión “lateral”, es consecuencia de la refracción y reflexión lumínica, provenientes de las estructuras más grandes presentes dentro de la célula (núcleo) y se correlaciona con el grado de “complejidad” de dichas estructuras. La dispersión frontal de la luz, en ángulos bajos (2-3°), y en ángulos altos (5-15°), también se correlacionan con el volumen celular y el índice de refracción, o la complejidad interna respectivamente. De allí surge una dispersión diferencial que utilizan los sistemas H (Siemems), o los que otilizan los sistemas Cell-Dyn (Abbott), que generan citogramas o trazados de dispersión bidimensionales. La gráfica

puede realizarse en correlación con la absorción (Simens) o con el volumen (Coulter). El tamaño y volu-men celular con cambio de voltaje de la CC es com-parada con la me-dida y compleji-dad nuclear dada

El análisis por computación de los cúmulos de los citogramas puede brindar información cuantitativa y cualitativa. Principales instrumentos para el recuento de células Los analizadores hemáticos son fabricados por varias compañías; entre otras figuran Abbott Laboratories, ABX Diagnostics, Bayer Diagnostics," Beckman Coulter, Inc.," y Sysmex Corporation. La exposición que sigue se limita a los equipos de cuatro de estos proveedores. El énfasis no está puesto en el tamaño o el manejo de la muestra, la velocidad, el nivel de automatización o la comparación los equipos o fabricantes. Asimismo, como el avance de la tecnología continúa, es posible que no se mencionen los modelos más nuevos (o más recientes). En cambio, se da una descripción detallada de los principales métodos utilizados por estos fabricantes, para mostrar el uso y ampliar más los principios presentados antes, así como para permitirle al técnico interpretar los datos de los pacientes en el laboratorio de hematología, como los histogramas y los citogramas generados por el equipo. En el cuadro 1 se resumen los métodos utilizados para la determinación del hemograma en cuatro equipos fundamentales para hematología. En el cuadro 2 se sintetizan los métodos para la determinación diferencial de los leucocitos en los mismos cuatro analizadores. Los analizadores hemáticos tienen algunos componentes básicos comunes, como los sistemas hidráulicos, neumáticos y eléctricos. El sistema hidráulico incluye la unidad de aspiración, los dispensadores, los diluyentes, las cámaras de de mezclado, los baños de apertura, el flujo de células o ambos, y un hemoglobinómetro. En el sistema neu-mático se incluye el vacío y las presiones requeridas para que operen las válvulas y transporten la muestra a través del sistema hidráulico El sistema eléctrico controla las secuencias operacionales del sistema total e incluye analizadores electrónicos y circuitos computarizados para el procesamiento de los datos generados. Algunos instrumentos tienen pantallas en el osciloscopio, que muestran los pulsos eléctricos en tiempo real a medida que se cuentan las células. Una unidad de despliegue de datos recibe la información del analizador e imprime resultados, histogramas, citogramas o todos ellos.

Parámetro

Coulter STKS

Leucocitos

Impedancia

Eritrocitos

Impedancia

Centrado hidrodinámico; detección por CC

Hb

Cianometahemoglobina modificada (525 nm) (Eritrocitos x MCVJ/lO

Hemoglobina-SLS (555 nm) Detección de la altura de los puls os acumulados (Htojeritrocitos) x 10

Cianometahemoglobina modificada (540 nm) (HC x VCMl/lO Media del histograma de distribución del tamaño de los eritrocitos

Media del histograma de distribución del tamaño . de los eritrocitos

(Hbjeritrocitos) x 10

(Hbjeritrocitos) x 10

(Hbjeritrocitos) x 10

(HbjHto) x 100 Centrado hidrodinámico; detección por CC (= 2-30 tU

(HbjHto) x 100 Impedancia (= 2-30 tL)

(HbjHto) x 100 Centrado hidrodinámico; dis persión con láser de ángulo bajo (2-3°) y de ángulo alto (5-15°) (1-60 fU

RDW - DE (fU o RDW CV (%) dis ponible

Valor relativo, equivalente al CV

Coloración s upravital (auramina O); detección fluorescente

Coloración s upravital (azul de metileno nuevo N); dis persión óptica' de ángulos múltiples (10 y 90°) .

CV (%) del histograma de eritrocitos: (DE¡VCM) x 100 Coloración s upravital (Oxazina 750); dis persión óptica de ángulo bajo y de ángulo alto (2-3° y 5-15°) y abs orbancia

Hto VCM

HbCM CHbCM PL

RDW

Recuento de reticulocitos

Media del histograma de distribución del tamaño de los eritrocitos (Hbjeritrocitos) x 10 (Hbj Hto) x 100 Impedancia (2-20 fU: Adaptación de los cuadrados mínimos del histograma de distribución de tamaño (0-70 fU CV (%) del histograma de eritrocitos (DE y VCM) x 100 Coloración s upravital (azul de metileno nuevo); volumen, conductividad, dis persión óptica (tecnología VCS)

Sysmex SE-9000 Centrado hidrodinámico; detección por CC

Abbott CELl-DYN 3500 Dis persión óptica (recuento primario), impedancia . (recuento sec.undario) Impedanci.a

Bayer.ADVIA 120 Centrado hidrodinámico; dis persión óptica y abs orción Centrado hidrodinámico; dis persión con láser de , ángúlo bajo (2-3°) y de ángulo alto (5-15°) Cianometahemoglobina . ,modificada (546 nm) (Eritrocitos x VCMl/10

Abreviaturas: CHbCM, concentració n hemoglobinica corpus cular media; CC, corriente continua; CV, coeficiente de variación; DE, des viación estándar; Hb, hemoglobina; HbCM, hemoglobina corpus cular media; Hto, hematocrito; PL, recuento de plaquetas; RDW, amplitud de distribución eritocitaria; SLS, lauril sulfato' de s odio; V CM, volumen corpus cular medio. Abbott CELL -DYN 4000 utiliza una coloración de marca registrada (CD4K530), dis pers ión de ángulos múltiples y detección fluorescente para el recuento de reticulocitos.

El manejo de la muestra por cada equipo depende del grado de automatización. Los equipos varían desde los analizadores "paso a paso" a los sistemas fáciles de usar con capacidad de "carga frontend". Las funciones de la computadora también varían; los equipos más grandes tienen micro-procesador extenso y pueden manejar datos. Los contenidos del programa de computación (software) pueden incluir inicio y apagado automáticos, con autocontroles internos de diagnóstico y cierto grado de mantenimiento; control de calidad (QC), con revi-

sión automática de datos del QC, cálculos, gráficos, promedios dinámicos y almacenamiento de archivos del QC; almacenamiento y recuperación de datos del paciente con controles delta, señalización de los valores de emergencia o críticos, y la comprobación automática de los resultados de pacientes basados en algoritmos definidos del usuario; presentaciones interactivas con el sistema de información del laboratorio o del hospital para permitir la comprobación separada con acceso aleatorio; e incluso con un programa de computación basado en especies animales.

Paránietro

.. Coulter. ST KS

Sysmex SE-9OOO

Ábbott CELL-DYN 3500

Bayer ADVIA 120

Neutrófilos

Volumen, conductividad, dis persión (VeS)

Detección por ee y RF

Tinción con peroxidas a, dis persión óptica y abs orción

Linfocitos

ves

Detección por ee y RF

Separación por dis persión polarizada con ángulos múltiples (M.A.P.S.S.) (00, 90 0, 10 0,900 des polarizado) M.A.P.S.S.

Monocitos

ves

Detección por ee y RF

M.A.P.S.S.

Eosinófilos

ves

M.A.P.S.S.

Bas ófilos

ves

Lisis diferencial, contracción; detección por CC Lisis diferencial, contracción; detección por ee

M.A.P.S.S.

Tinción con peroxidas a, dis persión óptica y abs orción Tinción con peroxidas a, dis persión óptica y abs orción Tinción con pero)lidas a, dis persión óptica y abs orción Lisis diferencial, contracción; dis persión con láser de ángulo bajo (2.3 0) y de ángulo alto (5-15 0)

Equipos Coulter Beckman Coulter, lnc., fabrica una línea extensa de analizadores hemáticos, como la serie ONIX más pequeña, que proporcionan análisis completo de eritrocitos, plaquetas y leucocitos con recuento diferencial de tres componentes; los más grandes, MAXM y STKS, que realizan un RCS con recuento diferencial de cinco componentes y análisis de reticulocitos, que utiliza una preparación de la muestra independiente; el más nuevo GEN-S System, que proporciona un análisis de reticulocitos en línea automatizado por completo. Además, el GEN-S tiene capacidad para realizar recuentos de CD4 y CD8. El equipo Coulter tiene dos canales de medición en el sistema hidráulico para determinar los datos del hemograma. Se considera que los recuentos de eritrocitos y leucocitos, y la determinación de hemoglobina (HGB) se miden en forma directa. La muestra de sangre entera aspirada se divide en dos porciones y cada una se mezcla con un diluyente isotónico. La primera dilución se entrega a la cámara de apertura de eritrocitos y la segunda a la cámara de apertura de leucocitos. En el primer caso se cuentan los eritrocitos y las plaquetas, y se diferencian por la impedancia eléctrica a medida que las células pasan a través de cada una de las tres aperturas con sensores de 50 u de diámetro, 60 u. de longitud). Las partículas entre 2 y 20 femtolitros (fL) se cuentan como plaquetas y las de más de 36 fL, como eritrocitos. En la cámara de leucoci tos, se agrega un reactivo para lisar los eritrocitos y liberar la hemoglobina antes de contar los leucocitos en forma simultánea por la impedancia en cada una de las tres aperturas sensoras (100u de diámetro, 75u de longitud). Como alternativa, algunos modelos emplean recuentos consecutivos en la misma aper-tura de eritrocitos o leucocitos. Después de que se completan los ciclos de recuento, la dilución de leucocitos pasa al hemoglobinómetro para la determinación de la concentración de la hemoglobina (lectura de transmitancia de la luz a una longitud de onda de 525 nrn). Los pulsos eléctricos generados en los ciclos de conteo se envían al analizador para la revisión, corrección de la coincidencia y conversión digital. Dos de los tres recuentos obtenidos en los recipientes de eritrocitos y leucocitos deben concordar dentro de los límites especificados para los recuentos para que el equipo los acepte. Este procedimiento de conteo múltiple previene los errores de los datos por obstrucciones de la apertura o valores estadísticos extremos, y permite la reproducibilidad excelente en los instrumentos Coulter. La información digital obtenida de cada apertura se canaliza mediante los analizadores de altura de pulso; se utilizan 256 canales para el análisis de leucocitos y eritrocitos, y 64 canales para el análisis de las plaquetas. Se generan histogramas de distribución del tamaño de poblaciones de leucocitos, eritrocitos y plaquetas. El volumen corpuscular medio (VCM) eritrocitario es su promedio tomado de los datos de distribución de tamaño. El hematócrito (Hto), la hemoglobina corpuscular media (HbCM) y la concentración hemoglobínica corpuscular media (CHbCM) se calculan a partir de valores medidos y derivados. La amplitud de distribución eritrocitaria (en inglés, Red blood cell Distribution Wídth, RDW) se calcula directamente a partir del histograma como el coeficiente de

variación (CV) de la distribución del volumen eritrocitario, con valores de referencia de 1l,514,S%.G La RDW es un índice de anisocitosis pero puede estar sesgado, porque refleja la relación entre la desviación estándar y el VCM. Esto es, un histograma de distribución de eritrocitos con divergencia normal, pero con un VCM disminuido, puede implicar una RDW elevada, lo que indica un· aumento falso de la anisocitosis. El instrumento utiliza el VCM y la RDW para señalizar posibles anisocitosis, microcitosis y macrocitosis. Las plaquetas se cuentan dentro de los límites de 2 a 20 fL Y se construye un histograma de distribución del tamaño. Si ésta cumple los criterios especificados, a los datos en bruto se les aplica el ajuste estadístico por cuadrados mínimos, lo que los adapta a una curva logarítrnica normal. Esta última se extrapola de O a 70 fL Y el recuento final deriva de esta curva extendida. Este procedimiento de ajuste elimina las partículas que interfieren en la región del ruido, como los detritos, y en la región más grande, como los eritrocitos pequeños.

Figura 5: Normograma de plaquetas que muestra la relación inversa del tamaño con el n° de plaquetas

El volumen plaquetario medio (VPM), análogo al VCM eritrocitario, también deriva del histograma de plaquetaso Los valores de referencia para el VPM son de alrededor de 7,8 a 11 fL y aumentan ligeramente a medida que la muestra se asienta en el anticoagulante, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Por lo general, el tamaño de las plaquetas es inversamente proporcional al recuento de plaquetas, como se observó en el nomograma de plaquetas diseñado por Bessman y col (fig. 5). Muchos instrumentos Coulter más antiguos, como el STKR, y los modelos más nuevos y pequeños, como el ONIX, proporcionan análisis de las subpoblaciones de leucocitos en tres componentes, que los diferencian en linfocitos, células mononucleares y granulocitos. En el canal de leucocitos, un reactivo de lisis especial produce su contracción diferencial, lo que permite contar las distintas células y clasificarlas según el tamaño basado en su impedancia. Se construye un histograma de leucocitos de los datos canalizados. Las partículas entre 35 y 90 fL se consideran linfocitos, entre 90 y 160 fL, "mononucleares" (monocitos, blastos, granulocitos inmaduros y linfocitos atípicos), y entre 160 y 450 fL, para los granulocitos maduros; de esta forma es posible realizar el cálculo de las cifras relativas y absolutas de estas tres poblaciones. Los algoritmos computarizados de marca registrada permiten además señalizar aumentos de eosinófilos, basófilos o ambos, así como la interpretación diferencial del histograma

para incluir la señalización de células anormales, como linfocitos atípicos y blastos. Cuando las poblaciones celulares se superponen o no hay una separación neta de poblaciones, puede activarse una región de alarma (señalización R), que indica el área de interferencia en el histograma de distribución de tamaño. Por ejemplo, una señalización RI representa exceso de señales en la región más baja del umbral del histograma de leucocitos y un recuento leucocitario cuestionable. Esta interferencia se visualiza como un "despegue alto" de la curva y puede indicar la presencia de eritrocitos nucleados, plaquetas agrupadas, eritrocitos no lisados o ruido electrónico Y En la figura 6 se observan los registros impresos compuestos del Coulter STKR que incluye el "recuento diferencial interpretado".

Fig. 6. Tamaño de GB de Glóbulos Rojos y de plaquetas obsérvese la diferencia de fL de cada gráfica

Los instrumentos Coulter más recientes, STKS, MAXM y GEN-S, generan datos del hemograma (incluso el recuento leucocitario) exactamente como antes, pero utilizan tecnología de la marca registrada Coulter en un canal separado para evaluar la determinación diferencial leucocitaria en cinco componentes. La tecnología VCS permite la clasificación según el tamaño Volumétrico de las células mediante la impedancia, las mediciones de Conductividad de las células y la dispersión (Scatter) de la luz láser, todas realizadas en forma simultánea para cada célula. Después de lisar los eritrocitos y tratar los leucocitos con un reactivo estabilizador para mantenerlos en un estado "casi nativo", una corriente de la muestra centrada en forma hidrodinámica se dirige a través del paso del flujo celular por la zona sensora.

La CC de baja frecuencia mide el tamaño mientras una sonda electromagnética de alta frecuencia mide la conductividad, un indicador del contenido interno celular. La señal de conductividad se corrige para el volumen celular, lo que brinda una medición singular denominada opacidad. Cada célula también se analiza con luz láser monocromático que revela información sobre la superficie celular como su estructura, forma y reflectividad. El método singular de detección de la dispersión de la luz rotada (DLR) del Coulter permite la separación de células con tamaño similar pero características de dispersión diferentes. En cada muestra se analizan más de 8.000 leucocitos. Esta combinación de tecnologías proporciona un trazado tridimensional o citógrafo de las poblaciones de leucocitos que están separadas por análisis computarizados de cúmulos. Los trazados de dispersión bidimensionales de las tres mediciones representan imágenes diferentes del citógrafo. El trazado de dispersión de la función de discriminación 1 (DF1) del volumen (eje y) versus dispersión de la luz (eje x) muestra una separación clara de linfocitos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos. Los basófilos están ocultos detrás de los linfocitos en este trazado de dispersión, pero se separan por la conductividad debido a su granulación citoplasmática. El trazado de dispersión DF-2 de volumen (eje y) contra la conductividad (eje x) muestra linfocitos, monocitos y neutrófilos como poblaciones predominantes. Cuando se elimina la población de neutrófilos del trazado de dispersión DF-2, puede visualizarse la población de basófilos (DF-3). También se dispone de histogramas de parámetros individuales de volumen, conductividad y dispersión de la luz. La figura 7 representa un registro impreso del Coulter STKS de un paciente normal que muestra un trazado de dispersión DF-l. En todos los analizadores hemáticos se generan dos tipos de señalizaciones de anormalidad de leucocitos (alarmas o indicadores) que proporcionan un recuento diferencial: 1) definidas por el usuario, sobre todo para detectar anormalidades de distribución, como eosinofilia o linfocitopenia (basado en el recuento absoluto de eosinófilos o linfocitos, respectivamente), y 2) específicas del instrumento, en mayor medida por anormalidades morfológicas. Para las señalizaciones de distribución se establecen límites de referencia y programa el equipo para marcar cada parámetro como alto o bajo. Las señalizaciones sospechosas indican la posible presencia de células anormales cuando las poblaciones celulares quedan fuera de las regiones esperadas o se exceden las limitaciones estadísticas específicas. Las señalizaciones "sospechosas" específicas del instrumento en el Coulter STKS implican granulocitos inmaduros y en cayado, blastos, linfocitos variables, eritrocitos nucleados y cúmulos de plaquetas. La separación inadecuada de las poblaciones celulares puede rechazar el informe de resultados diferenciales por el equipo y después mostrar una leyenda: "revisar el extendido".

DF1 Fig. 7- Coulter STKS: Trazado de dispersión bidimensional que muestra el volumen determinado por la impedancia en el eje y con respecto a la dispersión de la luz (DF1) en el eje x Equipamiento Sysmex Sysmex Corporation, antes TOA Medical Electronics, Co., Ltd., fabrica una línea completa de analizadores hemáticos, como el KX-21 pequeño y el K-4500, que proporcionan análisis completos de eritrocitos, plaquetas y leucocitos con recuento diferencial de tres componentes; el SF-3000 más grande y el SE-9000 realizan un recuento diferencial de cinco componentes, y los sistemas más nuevos que proporcionan además un recuento de reticulocitos automatizado por completo. Se considera que los recuentos de leucocitos, eritrocitos, la determinación de hemoglobina (Hb), el hematocrito (Hto) y las plaquetas (PL) se calculan de forma directa. Para determinar el hemograma se utilizan tres subsistemas hidráulicos: el canal para leucocitos, el canal para eritrocitos/PL y un canal separado para Hb. En las cámaras del transductor de leucocitos y eritrocitos, las muestras diluidas se aspiran a través de aperturas diferentes y se cuentan por medio del método de impedancia (detección de CC) para el recuento y la determinación del tamaño celular. Dos características singulares refuerzan la tecnología de la impedancia: 1) El canal de eritrocitos utiliza una corriente laminada por centrado hidrodinámico para dirigir las células a través de la apertura, lo que reduce el pasaje coincidente, la distorsión del tama ño de las partículas y la recirculación de las células sanguí neas alrededor de la apertura, y 2) los canales de leucocitos y eritrocitos utilizan los umbrales "flotantes" para diferenciar cada población celular. Cuando las células atraviesan las apertu ras, las señales se transmiten en secuencias al cir cuito analógico y los circuitos de análisis de distri bución del tamaño de las partí culas (ADP) para la conversión a datos acumulados de distribución del tamaño celular. Se construyen las curvas de distri bución de tamaño de las partículas y se establece la posición óptima del nivel de auto discrimi nación (esto es, umbral) mediante el microprocesador para cada población celular. Por ejemplo, el umbral más bajo de las plaquetas se ajusta en forma automática en el límite de tamaño de 2 a 6 fl y el umbral superior en los 12 a 30 fl, sobre la base de la distribución del tamaño de las partí culas. Asimismo, los umbrales inferiores y superiores de los límites de tamaño eritrocitario pueden establecerse en 25 a 75 fl Y 200 a 250 fl, respec-

tivamente. Este circuito con "umbral flotante" per mite la discriminación de poblaciones celulares, sobre la base de muestra por muestra. Los re cuentos celulares presentan pulsos entre los niveles de autodiscriminación inferior y superior, con relación de dilución, volumen contado y el error del pasaje coincidente considerado en las cifras fi nales generadas por la computadora. En el canal de eritrocitos, el discriminador flotante tiene una utilidad particular en las separaciones de las plaquetas de los eritrocitos pequeños. El hematocrito también se determina en el canal de eritrocitos/PL, basado en el principio de que la altura del pulso generado por el eri trocito es proporcional al volumen celular. El he matocrito es entonces la altura del pulso acumulativa del eritrocito y se considera un volumen verdadero del porcentaje relativo de eritrocitos"· En la hemoglobina del flujo celular ésta se con vierte a metahemoglobina que se combina con lauril sulfato de sodio (SLS) para convertirse en una molécula hemicromática de SLS-hemoglobina, cuya concentración se mide como absor bancia a 555 nm. En el microprocesador se calculan los si guientes índices, que utilizan parámetros medidos en forma directa o derivados: VCM, HbCM, CHbCM, RDW-SD; RDW-CV, VPM y plaquetocrito (Pto). La RDW-CV es el ancho de la distri bución de aritmética de eritrocitos medida en el 20% de la altura de la curva eritrocitaria, infor mado en fl con un intervalo de referencia de 37 -54 fl. La RDW-CV es el ancho de la distribución de eritrocitos informada como coefi ciente de variación. El Pto es la proporción del volumen de las plaquetas, análogo al Hto. El VPM se calcula a partir del Pto y el recuento de PL así como el VCM de los eritrocitos se calcula a partir del Hto y el recuento de eritrocitos. La proporción de plaquetas mayor que 12 fl para un recuento total de plaquetas puede ser un indicador de posible agru pación plaquetaria, plaquetas gigantes, frág mentos celulares o cualquier combinación de el1os. El SE 9000/9500 utiliza cuatro cámaras de detección para analizar los leucocitos y obtener un recuento diferencial de cinco componentes: las cámaras DIFF, IMl, Ea y BASO. En la cámara de detección DIFF, los eritrocitos están hemolizados

y los leucocitos se analizan en fom1a simultánea mediante CC de baja frecuencia y corriente de alta frecuencia (método de detección CC y RF). Un diagrama de dispersión de las señales de detección de RF (eje y) contra las señales de detección de CC (eje x) permite separar los leucocitos en lin focitos, monocitos y granulocitos. Los discrimi nadores flotantes determinan la separación óptima entre estas poblaciones. Los granulocitos se analizan otra vez en la cámara de detecci ón IMI para establecer "información sobre (leuco citos) inmaduros". Los eritrocitos se lisan y los leucocitos distintos de los granulocitos inmaduros se contra en en forma selectiva por temperatura y reacciones químicas. El análisis de la muestra tratada que utiliza el método de detección CC y RF per mite la separación de células inmaduras en el diagrama de dispersión de IMI. En las cámaras Ea

y BASO también se utiliza un método similar de contracción diferencial y lisis. Esto es, los eosi nófilos y los basófilos se cuentan por impedancia (detección de CC) en cámaras separadas en las que los eritrocitos se lisan y los leucocitos distintos de los eosinófilos o los basóflios se contraen en forma selectiva por temperatura y reacciones químicas. Los eosinóflios y los basófilos se sustraen de los recuentos de granulocitos derivados del análisis del diagrama de dispersión DIFF pa ra la determinación del recuento de neutrófilos. Pue den ser determinadas las señalizaciones de distri bución definidas por el usuario y se activan las señalizaciones sospechosas específicas del equipo, similares a las descritas en el Coulter STKS, para detectar las posibles anomalías morfológicas. Se muestra un mensaje POSITIVO o NEGATIVO.

Resultados del Beckman -Coulter. Las flechas indican presencia de su puestas células que en realidad corresponden a grasa subcutánea obtenida por una mala extracción de sangre

El Sysmex XE-2100 tiene citometría de flujo fluorescente agregada para aumenar la capa cidad de análisis celular del equipo. Esta tecnología avanzada permite el recuento directo de eri trocitos nucleados, un recuento diferencial mejor de leucocitos y el recuento óptico de las plaquetas.

Equipamiento CELL-DYN Los equipos ofrecidos por Abbott Laboratories son el CELLDYN 1700 más pequeño, que proporciona análisis com pleto de eritrocitos, plaquetas y leucocito s con recuento diferencial de los tres componentes; los CELL-DYN más grandes 3500R y 3700, que realizan un HC con recuento diferencial de cinco componentes y análisis de reticulocitos mediante el uso de una preparación

independiente de la muestra; y el CELL-DYN 4000 más nuevo, que proporciona un análisis de reticulocitos automatizado por completo con acceso aleatorio. El sistema CELL-DYN 3500 tiene tres canales de medición independientes para determinar el he mograma y el recuento diferencial: 1) un canal óptico para el recuento leucocitario y datos diferenciales; 2) un canal de impedancia para los datos de los eritrocitos y plaquetas (PL), y 3) un canal de hemoglobina (Hb) para determinarla. Se utiliza un canal de impedancia adicional para de terminar un recuento por impedancia de leucocitos (RIL) como un con trol interno en oposición al recuento óptico de leucocitos primario (ROL). Cuando el RIL y el ROL difieren, un algo ritmo selecciona el valor más apropiado para los leucocitos informados. Se consideran que los valores de leucocitos, eritrocitos, hemoglobina y plaquetas se miden en forma directa. Se utiliza una apertura de 60 x 70 fL en el ensamblaje del transductor de eri trocitos/PL asamblea para la determinación del recuento y el tamaño de eritrocitos y plaquetas por el método de impedancia electró nica. Se coloca una placa de von Behrens en la cámara de conteo de eritrocitos para minimizar la recirculación de

células. Los pulsos se reúnen y ordenan en 256 canales según su amplitud: las partículas entre 1 y 35 fL se incluyen en los datos iniciales de plaquetas y las mayores de 35fL se cuentan como eritrocitos. Luego se utilizan los umbrales flotantes para establecer la mejor separación de la población de plaquetas y eliminar del re cuento la interferencia como el ruido, los detritos o los eri trocitos pequeños. La pérdida por pasaje coinci dente se corrige en los recuentos finales de eritrocitos y plaquetas. Antes de la derivación del VCM se aplica la revisión de pulso de eritrocitos para compensar los pulsos aberrantes producidos por el pasaje no axial de los eritrocitos a través de la apertura. El VCM es el volumen medio de los eritrocitos obtenido de los datos de distribución de su tamaño. La hemoglobina se mide en forma directa mediante el método de cianhemoglobina modificado que mide la absorbancia a 540 nro. El Hto, la HbCM y la CHbCM se calculan a partir de las mediciones directas o de parámetros derivados. La RDW, equivalente al coeficiente de variación, es un valor relativo, derivado del histograma de eritrocitos con los percentiles 20 y 80. Otros índices disponibles son el VPM y Pto (análogo al hematocrito). Los recuentos leucocitario y diferencial derivan del canal óptico que utiliza la separación por dispersión polarizada con múltiples ángulos (M.A.P.S.S.) patentado por CELL-DYN. Una corriente de la muestra centrada en forma hidrodinámica se dirige a través de un cuarzo para flujo celular, por el que pasa una fuente de luz centrada, un láser de helio-neón polarizado en sentido vertical. La luz dispersa se mide en varios ángulos: la dispersión frontal de la luz de 0° se utiliza para determinar el tamaño celular, la dispersión ortogonal de 90° para determinar la lobularidad celular, la dispersión de la luz en

ángulo estrecho de 10° se correlaciona con la complejidad celular, y la dispersión de la luz despolarizada de 90 (90ºD) para evaluar la granularidad celular. La dispersión ortogonal de la luz es hendida, con una porción dirigida a un TFM de 90° y la otra dirigida a través de un polarizador a un TFM 90ºD. La luz que cambió la polarización (despolarizada) es la única que puede detectarse por el TFM 90ºD. Se utilizan varias combinaciones de estas cuatro mediciones para diferenciar y cuantificar las cinco subpoblaciones leucocitarias principales: neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos. En la figura 9 se ilustra la tecnología MAP.S.S de Abbott.

Fig. 9. Tecnología M.A.P.S.S. (dispersión polarizada con múltiples ángulos) que muestra la medición e identificación de células media nte 'el estudio de dispersión de la luz en cuatro ángulos diferentes

Las señales de dispersión de la luz se con vierten en eléctricas, ordenadas en 256 canales sobre la base de su amplitud para cada ángulo de luz medida y se presenta en forma gráfica como un diagrama de dispersión. La información de la dispersión en ángulos diferentes se traza en varias combinaciones: 902 a 102, o lobularidad contra complejidad; 02 a 102, tamaño contra complejidad, y 90ºD a 902, granularidad contra lobularidad. La lobularidad (eje y) graficada con respecto a la complejidad (eje x) permite la separación de las

subpoblaciones mononucleares (MONO) y polimorfonucleares (POLY). (Los basófilos se agru pan con los mononucleares en este aná lisis porque los gránulos de los basófilos se disuelven en el reactivo de la cubierta y el basófilo desgranulado es una célula menos compleja.) Cada célula en los dos cúmulos se identifica como un MONO o POLY para la evaluación adicional. La subpoblación MONO se grafica en un trazado de dispersión, con el tamaño en el eje y y la complejidad en el x. Se observan con claridad tres

poblaciones (linfocitos, monocitos y basófilos). En este trazado de dispersión, los eritrocitos nucleados, los eritrocitos no lisados, las plaquetas gigantes y los cúmulos de plaquetas se incluyen con e! cúmulo de linfocitos y se excluyen de los recuentos leucocitario y diferencial. Para diferenciar estas partículas se utiliza la información adicional del canal de impedancia de leucocitos. La subpoblación POLY se grafica en un trazado de dispersión 90°D a 90°, con la granularidad en el eje y, y la lobularidad en el x. Debido a la naturaleza singular de los gránulos de los eosinófilos, éstos dispersan la luz más de 90°D, lo que permite la separación clara de eosinófilos y neutrófilos. Para obtener una separación mejor de las poblaciones diferentes en los distintos trazados de

dispersión se utilizan los umbrales dinámicos. Cada tipo celular se identifica con un color distinto de modo que, después de realizar todas las clasificaciones y graficar el tamaño (Oº) con respecto a la complejidad, el operador puede visualizar con facilidad cada población celular en la pantalla terminal de los datos. También se dispone de otros trazados de dispersión y pueden desplegarse a demanda del operador. Como en los instrumentos descritos antes, pueden establecerse las señalizaciones de distribución definidas por el usuario, y las señalizaciones sospechosas específicas del equipo pueden alertar al operador sobre la presencia de células anómalas. En la figura 10 se representa un registro impreso del paciente proveniente del CELL-DYN 3500.

a- Sactter 90° (lobularidad) vs Scatter 10° (Complejudad). Permite separa PMN de células mononucleares. b- Scatter 90D (depol) vs 90°, permite distinguir Eo (que depolarizan) de los PMN (no depol) c- Scatter 0° (tamaño) vs Scatter 10° (complejidad). Discrimina los diferentes tipos de células mononu-leares y separa Monocitos de linfocitos y basófilos degranulados. d- Scatter 0° (tamaño) vs 90° (lobularidad).

Cell-Dyn 3500

Eosinófilos

Diferentes tamaños celulares graficados en el Cell-Dyn 3500

Cell-Dyn 3500. Separación de leucocitos por sistema MAPSS

Equipamiento Bayer (Siemmens) Bayer Corporation fabrica el ADVIA 120 Hematology System.'" Este aparato utiliza gran parte de la tecnología de los sistemas Technicon H-1, H-2 Y H-3 más antiguos. Bayer simplificó la hidráulica y las operaciones del analizador mediante el reemplazo de los sistemas hidráulicos complejos múltiples con un montaje unificado de circuito de líquidos (Unified Fluids Circuit, UFC) o tecnología de líquidos unificados (Unifluidics). El ADVIA 120 proporciona un hemograma completo y un recuento leucocitario diferencial con un recuento de reticulocitos automatizado por completo. Se utilizan cuatro canales de medición independientes para determinar el hemograma y el recuento diferencial: 1) canal para eritrocitos y PL; 2) canal para hemoglobina; 3) canal para

peroxidasa (PEROX), y 4) canal para lobularidad de basófilos (BASO) para recuento leuocitario y datos diferenciales. Los leucocitos, los eritrocitos, la hemoglobina y las plaquetas se miden en forma directa. La hemoglobina se determina con el método de cianmetahemoglobina modificado, que mide la absorbancia en una cubeta de flujo por colorimetría a 546 nm. El método para eritrocitos y PL utiliza mediciones de dispersión de la luz por citometría de flujo determinadas a medida que las células pasan a través de un flujo de corriente laminar por un ensamblaje óptico de láser (la fuente de luz proviene de un diodo de láser). Antes de entrar en el flujo celular, los eritrocitos y las plaquetas se clasifican según la esfericidad por características isovolumétricas con el

fin de eliminar el ruido de la orientación óptica. En forma simultánea se determina la dispersión de la luz láser a dos intervalos angulares diferentes (ángulo bajo [2° a 3°], se correlaciona con el volumen celular

o e! tamaño, y e! ángulo alto [5 a 15°] se correlaciona con la cOinplejidad interna [esto es, índice de refracción o concentración de hemoglobina]) (fig. 11).

Esta técnica de "dispersión diferencial" singular, junto con las características de clasificación por esfericidad isovolumétrica, elimina el efecto adverso de la variación en la concentración de hemoglobina celular en la determinación del volumen eritrocitario (como se observa por las diferencias en la capacidad de deformación celular que afecta la altura del pulso generado en los equipos por impedancia).","'Se utiliza la teoría de Mie de dispersión de la luz de las esferas dieléctricas para trazar las señales de dispersión de intensidad proveniente de dos ángulos comparadas cada una con e! volumen de cada eritrocito (eje y) contra la concentración de hemoglobina (eje x) (fig. 12)." También se trazan histogramas independientes de volumen eritrocitario y concentración de la hemoglobina. En el Technicon HSystems las plaquetas se cuentan y clasifican según el tamaño a partir de señales de ángulo alto y se genera un histograma de distribución por tamaño de las plaquetas. El ADVIA 120 utiliza el análisis bidimensional (ángulos bajo y alto) de las plaquetas que permite distinguirlas de las partículas que interfieren como fragmentos de eritrocitos y eritrocitos pequeños. En consecuencia, las plaquetas más grandes pueden incluirse en el recuento. De las mediciones descritas derivan varios parámetros e índices. El VCM y el VPM son la media del histograma del volumen eritrocitario y el histograma de las plaquetas, respectivamente. El hematocrito, la HbCM y la CHbCM se computan en forma matemática a partir de los valores de eritrosis-tos, hemoglobina y VCM. La RDW se calcula como el CV del histograma de volumen eritrocitario, mien-tras que la amplitud de distribución de hemoglobina (HbDW), un índice análogo se calcula como la desviación estártdar del histograma de concentración de la Hb eritrocitaria.

El intervalo de referencia para la HbDW es 2,2-3,2 g/dL. La concentración hemoglobínica corpuscular media medida (CHbCM) deriva de la medición directa en cada célula de la concentración de hemoglobina. Las interferencias en el método colorimétrico para la Hb, como lipemia o ictericia, afectan la CHbCM calculada pero no alteran la CHbCM medida. Esta última, por lo general no se informa como un resultado del paciente pero el equipo la utiliza como un control interno con respecto a la CHbCM calculada y está disponible para el operador para cálculos posteriores de hemoglobina, si hay interferencias. Señalizaciones singulares de los eritrocitos derivadas de la CHbCM son la varianza de la concentración de hemoglobina (HbC VAR), hipocrornía (HYPO) e hipercrornía (HYPER). Los analizadores hemáticos de Bayer determinan el recuento leucocitario total y diferencial de seis componentes (neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosi-

nófilos, basófilos y células no coloreadas grandes [en inglés, large unstained cells, LUC]) por citoquímica y citometría de flujo óptica, utilizando los canales PEROX y BASO. Sistema PANDA

La actividad peroxidasa de la progenie mieloide es nula en los blastos indiferenciados, y se incremente paulatinamente a medida que dicha progenie avanza en su diferenciación, hasta alcanzar un máximo de actividad en el Pormielocitos, y luego declina pero manteniendo alta actividad en todos los estadíos de diferenciación. Gracias a esta particularidad, la correlación entre la intensidad de la reacción citoquímica (PEROX), con la complejidad nuclear, nos brinda una información muy valiosa a la hora de clasificar el tipo celular presente, de gran ayuda en los casos de leucemias agudas, y procesos mieloproliferativos. Canal de peroxidasa (PEROX) En el canal PEROX, los eritrocitos se lisan y los leucocitos se tiñen por su actividad de peroxidasa (PX). La reacción siguiente es catalizada por la PX celular, que convierte el sustrato a un precipitado oscuro en las células que contienen PX. Una porción de la suspensión celular se coloca en la corriente laminar de un flujo celular donde se utiliza un sistema óptico halógeno de campo oscuro con tungsteno para la medición de la absorbancia (proporcional al contenido de PX de cada célula) y la dispersión frontal (proporcional al tamaño de cada célula).

La absorbancia se traza en el eje x del citograma y la dispersión en el eje y. Se obtiene un recuento total de leucocitos (L-PEROX o LP) de las señales ópticas en este canal y se utiliza como un control interno del recuento leucocitario primario obtenido en el canal de basófilos-lobularidad (LBASO o LB). Si se produce una interferencia significativa en e! recuento de LB, el instrumento sustituirá el LP. El análisis computarizado del cúmulo permite la clasificación de las diferentes poblaciones celulares, entre las que se incluyen cúmulos anormales de eritrocitos nucleados y plaquetas. Los neutrófilos y los eosinófilos contienen la máxima cantidad de PX y un cúmulo a la derecha del citograma. Los monocitos adquieren una coloración débil y por consiguiente el cúmulo se observa en la región media del citograma. Los linfocitos, los basófilos y los LVC (que abarca los linfocitos atípicos y los blastos) no contienen PX y aparecen en la izquierda del citograma, con los LVC que aparecen sobre el área de los linfocitos. El cúmulo de basófilos se ubica con los linfocitos pequeños y requiere análisis adicionales para la correcta clasificación.

inmaduros (GO, eritrocitos nucleados o plaquetas grandes y cúmulos de plaquetas. En la figura 13 se representa un registro impreso de un paciente generado en el equipo ADVIA 120.

Sistema Perox del ADVIA-120. Permite pre-clasificar las Leucemias acordes a la densidad nuclear y la expresión de PX

Canal de lobularidad de basófilos (BASO) En el canal BASO las células se tratan con un re activo que contiene un surfactante no iónico en una solución ácida. Los basófilos tienen una resistencia particular a la lisis en esta reacción controlada por la temperatura, mientras que los eritrocitos y las plaquetas se lisan y otros leucocitos (no basófilos) se despojan de su citoplasma. El láser óptico, con el mismo sistema de dispersión frontal en dos ángulos (2°-3° y 5°-15°) del canal de eritrocitos y PL, se utiliza para analizar las células tratadas. La dispersión con ángulo alto (proporcional a la complejidad nuclear) se traza en el eje x y la dispersión con ángulo bajo (proporcional al tamaño de la célula), en el eje y. El análisis del cúmulo permite identificar y cuantificar cada población celular. Los basófilos intactos son identificables por su gran dispersión en ángulo bajo. Los núcleos restantes se clasifican como núcleos de mononucleares (MN), polimorfonucleares (PMN) y blastos según su complejidad (forma y densidad celular) y la dispersión en ángulo alto.

Los basófilos quedan comprendidos por encima de un umbral horizontal en e! citograma. Los núcleos despojados de su citoplasma quedan debajo de los basófilos, con los PMN a la derecha y los MN a la izquierda a lo largo de! eje x. El cúmulo de blastos se ubica debajo de las células mononucleares. La falta de' separación neta entre los cúmulos nucleares de PMN y MN indica inmadurez de los leucocitos o sospecha de una desviación de la fórmula a la izquierda. Como se indicó antes, este canal proporciona el recuento leucocitario primario, L-BASO o LB. Los resultados diferenciales (%) se computan al dividir los números absolutos de las clasificaciones celulares diferentes por el recuento leucocitario total. La información proveniente de los canales PEROX y BASO se utiliza para generar señalizaciones de morfología diferencial que indican la posible presencia de linfocitos atípicos (ATYPS), blastos, desviaciones a la izquierda, granulocitos

Recuento automatizado de reticulocitos El recuento de reticulocitos fue e! último de los procedimientos manuales de conteo celular en automatizarse y fue principal adelanto en los analizadores hemáticos durante los últimos años. La imprecisión y la inexactitud del recuento manual de reticulocitos se deben a numerosos factores, como variabilidad de la coloración, errores de distribución en el porta objeto, errores estadísticos de muestreo y errores surgidos entre los observadores." Todos ellos excepto quizá la variabilidad de la coloración, son corregibles con el recuento automatizado de reticulocitos. Al aumentar el número de eritrocitos contados aumenta la precisión. Esto se evidenció por el estudio piloto sobre competencia de los reticulocitos realizado por el College of American Pathologists en 1993 (Set RT-A, Sample RT- 01) en el que el CV para los resultados manuales informados fue del 3S% comparado con el 8,3% para el método por citometría de flujo." La precisión en los métodos automatizados cada vez es mayor. Los resultados por métodos manuales de reticulocitos para una muestra en el 2000 Retyculocite Survey Set RT/RT2-A mostró un CV de 28,7% comparado con el 2,8% para uno de los métodos automatizados.'" Los analizadores automatizados de reticulocitos pueden contar hasta 32.000 eritrocitos comparado con las 1.000 células del método manual habitual." Se dispone de los siguientes analizadores automatizados de reticulocitos: sistemas de citometría de flujo como el Becton Dickinson FACS o Culter EPICS; Sysmex R-3S00, R-SOO y SE9S00/9000+RAM-1; sistemas CELL-DYN 3500R, 3700 Y 4000; Coulter GEN-S, STKS y sistemas MAXM, y sistemas Bayer ADVIA 120 Y Technicon H-3 RTC y RTX. Todos estos analizadores evalúan los reticulocitos basados en la dispersión óptica o la fluorescencia después de tra-tar los eritrocitos con colorantes fluorescentes o la coloración del ácido nucleico para teñir el RNA residual en los reticulocitos. Dado que por lo general el FACS y el sistema EPIC no están disponibles en el laboratorio de hematología de rutina, la exposición se limita a los otros analizadores. El Sysmex R 3000/3500 es un analizador de reticulocitos independiente que utiliza Auramina O, un colorante fluorescente supravital y mide la dispersión frontal y la fluorescencia lateral cuando las células se dirigen a través de un flujo celular laminar por el que pasa un láser de argón. Las señales se trazan en un diagrama de dispersión con intensidad de dispersión frontal que se correlaciona con el tamaño, graficado con respecto a la intensidad de la fluorescencia, que es proporcional al contenido de RNA. La discriminación automática separa las poblaciones en eritrocitos maduros y reticulocitos. Estos últimos quedan comprendidos en las regiones de fluorescencia baja, fluorescencia media o fluorescencia alta, con los reticulocitos menos maduros que muestran fluorescencia más alta. La fracción de reticulocitos inmaduros (en inglés Irnmature Reticulcyte Fraction; IRF) es la suma de las relaciones de fluorescencia

media y alta, e indica la proporción de reticulocitos inmaduros con respecto al total en una muestra. Las plaquetas, que también se cuantifican, quedan comprendidas por debajo de una línea discriminadora más baja. El módulo Sysmex SE-95001 9000+RAM-1 utiliza la misma metodología de la citometría de flujo para el recuento de reticulocitos que el R-3500. No se requiere la preparación separada de la muestra. El Sysmex R-500 más pequeño utiliza citometría de flujo con un láser semiconductor como fuente de luz y el colorante fluorescente supravital Polyrnethine para proporcionar los recuentos automatizados de reticulocitos. El CELL-DYN 3500R realiza el análisis de reticulocitos midiendo la dispersión a 10° y 90° en el canal óptico (tecnología MAP.S.S.) después de lograr esfericidad isovolumétrica de las células para eliminar el ruido de la orientación óptica. Los eritrocitos se colorean con el colorante de tiazina azul de metileno N (nuevo) en una preparación independiente de la muestra antes de que ésta se introduzca en el equipo. El operador simplemente debe cambiar las funciones computarizadas en el instrumento antes de la aspiración de la preparación de reticulocitos." El CELL-DYN 4000 utiliza la tecnología M.A.P.S.S. pero agrega la detección fluorescente para permitir la comprobación de reticulocitos automatizada por completo y con acceso aleatorio. Los eritrocitos se colorean con un colorante fluorescente, que atraviesa la membrana, de marca registrada (CD4KS30), que se une de modo estequiométrico con el ácido uncleico y emite luz verde a medida que las células atraviesan un flujo celular laminar por el que pasa un láser del ion argón. Las plaquetas y los reticulocitos se separan de acuerdo con la intensidad de fluorescencia verde (dispersión medida a 7° y 90°) y se .determina el recuento de reticulocitos junto con la 1RF. El Coulter también incorporó métodos para reticulocitos en su instrumentación de conteo primario de células, éstos son, los sistemas GEN-S, STKS y el MAXM. Para el STKS y el l\1AXM se requieren coloraciones antes de introducidas en el aparato, pero se utilizan las mismas ópticas láser empleadas en el recuento de células para la cuantificación de retículocitos. El método de Coulter utiliza una coloración con azul de metileno nueva y la tecnología de VCS descrita antes. El volumen se grafica con respecto a la dispersión de la luz (trazado de dispersión DF 5) Y a la conductividad (trazado de dispersión DF 6), que se correlaciona con la opacidad del eritrocito. Los reticulocitos teñidos muestran mayor dispersión óptica y opacidad que los eritrocitos maduros. Se informan los recuentos relativos y absolutos de reticulocitos, junto con el volumen del reticulocito medio (VRM) y el índice de maduración (1M) o 1RF. Los sistemas Bayer ADVIA 120 y Technicon H-3 RTC o RTX cuantifican los reticulocitos en el mismo flujo de células óptico con láser utilizado en los canales eritrocitos y PL Y BASO descritos antes. Los sistemas H-3 requieren una preparación independiente de la muestra fuera del aparato. El reactivo para reticulocitos produce la esfericidad isovolumétrica eritrocitaria y colorea los reticulocitos con oxazina 750, un colorante que se une al ácido nucleico. Tres detectores miden la dispersión en ángulo bajo (2°-3°), la dispersión en ángulo alto (5°-15°) y la absorbancia en forma simultánea a medida que las células pasan a

través del flujo celular. Se generan tres citogramas: 1) dispersión en ángulo alto con respecto a la absorción; 2) dispersión en ángulo bajo con respecto a la dispersión en ángulo alto (citograma Mie o mapa eritrocitario), y 3) volumen con respecto a la concentración de hemoglobina. El citograma de absorción permite la separación y la cuantificación de los reticulocitos, con subdivisión adicional en células absorbentes bajas, medias y altas basadas en la cantidad de coloración. La suma de las células absorbentes medias y altas refleja el IRF. El volumen y la concentración de hemoglobina para cada célula derivan del mapa eritrocitario que utiliza la teoría de dispersión Mie. Se proporcionan varios índices de reticulocitos (VCMr, CHbCMr, RDWr, HDWr, CHbr y ADCHr). El contenido de hemoglobina (CHp) de cada célula se calcula como el producto del volumen celular y la concentración de hemoglobina celular. Se construye un histograma de un solo parámetro de CHp con una amplitud calculada de distribución correspondiente (ADCHr). Estos índices de reticulocitos no están disponibles en el registro impreso del paciente de rutina, pero lo están para el operador. En la figura 14 se observa un registro impreso de reticulocitos de un ADVIA 120 que muestra los citogramas y los índices de reticulocitos.

La automatización de los reticulocitos permitió mayor precisión y exactitud, así como un análisis mucho más amplio de los eritrocitos inmaduros, lo que propor-ciona parámetros nuevos e índices que pueden ser útiles en el diagnóstico y el tratamiento de las anemias. La IRF es un indicador confiable de cambios en la actividad eritropo-yética y una herramienta valiosa para el monitoreo terapéutico en los pacientes con insu-ficiencia renal crónica. La medición de la madurez de retículocitos también puede ser útil para evaluar la supresión de la médula ósea durante la quimioterapia, el monitoreo de la regeneración remato-poyética después del trasplante de médula ósea o células troncales, la supervisión de la aceptación del transplante renal y la supervisión de la eficacia del tratamiento para la anemia. Los otros índices de reticulocitos provenientes del ADVIA 120 son útiles en el seguimiento de la respuesta al tratamiento de eritropoyetina y CHbr, en particular son útiles en la detec-ción temprana y el diagnóstico de la eritropoyesis ferropénica en los niños. La utilización

Limitaciones e interferencias La automatización en el laboratorio de hematología requiere la evaluación crítica de los métodos, las limitaciones y los objetivos del rendimiento del equipo para cada laboratorio en particular. El National Cornmitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) aprobó un estándar para los objetivos del rendimiento para comprobar la calidad interna de los analizadores hemáticos multicanales60. Este estándar proporciona pautas de calibración del equipo y valoración de los criterios de rendimiento, como exactitud, precisión, linealidad, sensibilidad y especificidad. La exactitud clínica (sensibilidad y especificidad) de los métodos debe permitir que el instrumento identifique de manera adecuada a los pacientes enfermos y a los individuos sanos, respectivamente" Los sistemas de control de calidad deben reflejar los objetivos de rendimiento establecidos por el laboratorio y garantizar que el equipo trabaja dentro de sus límites especificados. Calibración La calibración es crítica para definir la exactitud (comparada con la precisión) de los datos producidos. La calibración, o el proceso de corregir un equipo electrónicamente para el sesgo analítico (diferencia numérica con el valor "verdadero") puede lograrse con el uso apropiado de métodos de referencia, materiales de referencia, calibradores preparados en forma comercial o cualquier combinación de ellos. Dado que pocos equipos están precalibrados por el fabricante, la calibración debe realizarse en el momento de la instalación inicial y debe verificarse al menos cada 6 meses según el Clinical Laboratory Improvement Act de 1988 (CLlA 88). Pueden requerirse calibraciones periódicas después de reparaciones importantes del equipo que requieren alineación óptica o 'reemplazo de partes. La calibración de muestras de sangre entera que utiliza muestras de sangre entera recientes precisa métodos, materiales y procedimientos de referencia para determinar los valores "verdaderos". El comité internacional para estándares en hematología estableció pautas para seleccionar un contador de células sanguíneas de referencia para este propósito,

pero el método de cianmetahemoglobina aún es el único estándar disponible en hematología para la calibración y el control de calidad6; La calibración de sangre entera que históricamente fue el método preferido para la calibración de analizadores hemáticos multicanales, se reemplazó casi por completo por el uso de calibrado res comerciales probados contra los métodos de referencia. El sesgo de la calibración es posible con el uso de estos calibradores debido a las diferencias inherentes en las suspensiones celulares estabilizadas y conservadas. En consecuencia, es esencial que las calibraciones se lleven a cabo de manera adecuada y verificadas mediante la comparación con métodos de referencia o la revisión de los datos del control de calidad después de la calibración y con estudios de comparación externos, como la comprobación de la competencia. Limitaciones del equipo Los avances continuos en automatización aumentaron la sensibilidad y la especificidad de las señalizaciones del equipo, con la detección de posibles interferencias en los datos. Sin embargo la optimización paralela de los equipos de fácil uso obligan al tecnólogo a conocer y comprender las limitaciones del equipo y a reconocer los factores que pueden' interferir y provocar resultados erróneos del laboratorio. Las limitaciones y las interferencias pueden relacionarse con la metodología o los problemas inherentes a la muestra de sangre. Cada instrumento tiene limitaciones relacionadas con la metodología que están definidas con claridad en los manuales de instrucción y en la bibliografía. Una limitación común del método es la incapacidad de un instrumento para distinguir las células de otras partículas o fragmentos de células del mismo tamaño de manera confiable. Por ejemplo, pueden contarse los fragmentos celulares como plaquetas en las muestras de pacientes tratados con quimioterapia con aumento de la fragilidad de los leucocitos. Asimismo, los esquistocitos o eritrocitos pequeños pueden interferir en el recuento de las plaquetas. Los cúmulos de plaquetas más grandes pueden contarse como leucocitos, lo que produce un recuento de plaquetas falsamente disminuido y un posible recuento aumentado de leucocitos. Los micromegacariocitos pueden contarse como eritrocitos nucleados o leucocitos. Los eritrocitos que contienen alguna variante de hemoglobina como S o C a menudo son resistentes a la lisis, con células no lisadas que se cuentan por error como eritrocitos uncleados o leucocitos, e interfieren en la reacción de Hb. Este fenómeno fue más evidente con los diluyentes y reactivos para la lisis menos potentes, de los analizadores con tecnología diferencial automatizada de los leucocitos. La ausencia de lisis también puede observarse en la enfermedad hepática grave, con el tratamiento con quimioterapia y en los recién nacidos (con niveles aumentados de hemoglobina F) en los instrumentos Sysmex más antiguos y con niveles séricos elevados de nitrógeno de la urea en los instrumentos Technicon H. Los sistemas Technicon H pueden proporcionar un recuentos leucocitario correcto del canal BASO (es decir, LB) con su reactivo lítico más potente. El ADVIA 120 informa ahora los LB como recuento primario de los leucocitos. En el CELL-DYN 3500 se puede utilizar un ciclo de lisis

extendido y los equipos más nuevos pueden proporcionar un recuento por impedancia de leucocitos (RIL), correcto cuando también hay pre-sencia de eritrocitos resistentes a la lisis. Los Sysmex SE-9000 y 9500 tienen un canal de impedancia de leucocitos adicional. La supresión de datos automatizados, en particular los datos de la fórmula diferencial de leucocitos, se puede producir cuando fallan los controles internos del equipo o la validez de los datos es dudosa. Algunos fabricantes dan a conocer resoltados con códigos de error o señalizaciones específicas pata una revisión más extensa. La tasa de rechazo de los diferentes equipos varía; en un estu-dio se observó que los instrumentos Coulter y Sysmex muestran la mayor supresión más alta de datos y los analizadores Bayer (Technicon) y CELL-DYN la menor. La supresión automatizada de datos diferenciales exige un recuento diferencial manual, mientras que la aparición de datos con señalizaciones adecuadas plantea la necesidad de una revisión cuidadosa de los datos y tal vez de un extendido de sangre. Esto sugiere una diferencia de criterios entre los fabricantes y obviamente repercute en el volumen de trabajo de maneras diferentes. Es importante destacar que cada laboratorio debe establecer sus criterios propios para la revisión dirigida de los extendidos de sangre, basada en los objetivos de rendimiento establecidos, las señalizaciones del instrumento y las limitaciones inherentes a él. En el cuadro 3 figura el algoritmo de los "criterios de revisión" para el Bayer ADVIA 120 utilizado en el Vanderbilt University Hematology Laboratory. Limitaciones debidas a la muestra Entre las limitaciones debidas a los problemas inherentes a la muestra se incluye la presencia de factores como crioaglutininas, ictericia y lipemia. Las crioaglutininas se presentan con un patrón clásico de VCM aumentado (con frecuencia mayor que 130 fL), recuentos de eritrocitos notablemente disminuidos y CHbCM aumentada (con frecuencia mayor que 40 gldL). El examen detallado de los histogramas y citogramas de los equipos puede brindar indicios de esta alteración."La ictericia y la lipemia afectan las mediciones de la Hb y los índices relacionados. El tiempo transcurrido desde la obtención de la muestra y el manejo inadecuado de la muestra pueden tener un gran impacto en la confiabilidad de los resultados de las pruebas hematológicas. Estos factores tienen una importancia aun mayor cuando los hospitales derivan las muestras, a los laboratorios de referencia que manejan grandes cantidades de muestras. Los problemas específicos con las muestras más viejas son el aumento de la fragilidad de los leucocitos, aumento del tamaño y posible lisis eritrocitaria así como alteración de las plaquetas. Deben realizarse los estudios de estabilidad antes de utilizar un equipo y es preciso establecer pautas específicas para el manejo y el rechazo de la muestra. Utilidad clínica de los equipos automatizados en hematología Los analizadores automatizados para los recuentos celulares afectaron de manera directa la disponibilidad, la exactitud y la utilidad clínica del HC y el recuento leucocitario diferencial. Algunos parámetros disponibles en los equipos de remato-

logía, pero no en forma manual, ofrecen otra visión en algunos cuadros clínicos. La RDW, una estimación cuantitativa de la anisocitosis de los eritrocitos, se utilizó junto con el VCM para la clasificación de las anemias. Se propusieron diversos discriminantes (fórmulas matemáticas o funciones discriminantes) que utilizan estos dos valores para la diferenciación entre la ferropenia y la talasemia menor, basada en el patrón típico de ferropenia que tiene un VCM bajo con una RDW alta y la -talasemia menor que presenta un VCM bajo con una RDW normal. Se demostró que la RDW no es un discriminador confiable si se los utiliza en forma aisladas en las anemias microcíticas. La medida directa de la CHb eritrocitaria en los sistemas Bayer mostró ser una herramienta valiosa en la detección temprana de las anemias ferropénicas y para diferenciarla de la talasemia menor. Si la CHb medida en forma directa también se utilizó en la detección de la eritropoyesis ferropénica en los sujetos con concentración de Fe elevada tratados con eritropoyetina recombinante. El VPM puede ser útil para determinar si la función de la médula ósea es correcta. Un VPM bajo puede indicar hipoproducción medular y un VPM elevado plantea la sospecha de un trastorno mieloproliferativo. Sin embargo, la metodología, la anticoagulación y el tiempo de almacenamiento influyen en el VPM, que reduce la utilidad de este parámetro. El recuento leucocitario diferencial automatizado tuvo un impacto importante en el volumen de trabajo del laboratorio porque el recuento diferencial manual es muy dificultoso. Se demostró que los recuentos diferenciales de tres componentes disponibles en los primeros equipos suelen ser apropiados para la detección sistemática diferencial de los leucocitos y para identificar las muestras que requerian otros estudios o un recuento diferencial manual. Sin embargo, se observó que los recuentos diferenciales parciales no sustituyen un recuento diferencial completo en las poblaciones anormales. Los recuentos automatizados de cinco componentes de los equipos más sofisticados se evaluaron de manera extensa y parecen tener sensibilidad y especificidad clínica aceptable para la detección de anomalías de distribución y morfológicas. Las células anormales (blastos y los eritrocitos nucleados) en concentración baja no pueden detectarse mediante los equipos, pero igual pueden omitirse en el recuento diferencial manual o visual de rutina realizado sobre 100 células. El CELLDYN 4000, con tecnología de detección fluorescente agregada, mostró tener sensibilidad y especificidad elevadas para la señalización de eritrocitos nucleados y cúmulos de plaquetas. Los avances tecnológicos disminuyen la necesidad de la revisión de extendidos de sangre para confirmar la presencia de cúmulos de plaquetas o eritrocitos nucleados y los recuentos exactos de leucocitos para la interferencia de cúmulos de plaquetas o eritrocitos nucleados. Las evaluaciones del instrumento basadas en los estándares H20-T o H20-A del NCCLS (Reference Leukocyte Differential Count [Proportional] y Evaluation of Instrumental Methods) que utilizan ya sea un recuento diferencial manual de leucocitos de 800 o 400 células, respectivamente, como método de referencia mostraron coeficientes de correlación aceptables para todos los tipos de leucocitos, con la posible excepción de los monocitos.

Otros estudios que utilizan anticuerpos monoclonales como método de referencia para cuantificar monocitos sugieren que los analizadores automatizados ofrecen una evaluación más exacta de las monocitosis que los métodos manuales. Los histogramas y los citogramas, junto con la señalización del equipo proporcionan información valiosa para el diagnóstico y el tratamiento de los trastornos de los eritrocitos y los leucocitos. En numerosos informes se indicó la eficacia de los histogramas y los citogramas para detectar algunas situaciones anormales, como trastornos eritrocitarios como crioaglutininas y enfermedades de los leucocitos como leucemias y trastornos mielodisplásicos. Los fabricantes principales de instrumentos publicaron libros de estudios de casos prácticos con histogramas y citogramas para ayudar al técnico en la interpretación de los datos del instrumento. Por último, los fabricantes están desarrollando puestos de trabajo integrados de hematología para la automatización y la eficacia máximas del laboratorio. Por ejemplo, el Sysmex Total Hematology Automation System (series HST) une de manera robótica el SE-9000, el R-3500 (analizador automatizado para reticulocitos) y el SP-100 (aparato para preparar en forma automática los portaobjetos y teñirlos) para automatización completa o sistematización de la evaluación hematológica, El SE-Alpha es una versión más pequeña que une el SE-9000 y el SP-lOO.3D Los otros fabricantes desarrollan sistemas similares. La selección de un analizador rematológico para cada laboratorio individual requiere la evaluación cuidadosa de las necesidades del laboratorio y conocer en forma exhaustiva el funcionamiento del equipo, incluso sus especificaciones y los requisitos del sistema, los métodos, los requisitos para el mantenimiento, el uso de reactivos, el manejo de datos, la respuesta del personal y los gastos a corto y a largo plazos. Las indicaciones de todos los instrumentos alegan mejorar la eficacia del laboratorio, ya sea a través de la mayor automatización que mejora el volumen de trabajo y obtiene resultados más rápidos, o mediante el agregado de parámetros nuevos que pueden tener importancia clínica. El equipo seleccionado debe "adaptarse" al trabajo y a la población de pacientes, y mejorar sus resultados. Por ejemplo, la selección para un centro oncológico puede ser diferente de la que se precisa para un hospital de la comunidad. No obstante, en la selección MATERIAL Hemolisado

Sangre entera preservada

CONTROL O CALIBRADOR Hemoglobina

Glóbulos rojos Hematocrito

Glóbulos rojos fijados

Glóbulos rojos

final del equipo pueden prevalecer las preferencias individuales.

Garantía de calidad en el laboratorio de Hematología : conceptos básicos La garantía de calidad comprende a todas aquellas acciones planificadas y sistemáticas necesarias para proporcionar adecuada confianza de que un producto, proceso o servicio cumple determinados requerimiento para la calidad. Es una herramienta para asegurar la confiabilidad de los datos de laboratorio y tiene como objetivo lograr exactitud y precisión. Para ello se basa en cuatro pilares fundamentales que son: 1234-

Control interno de calidad Evaluación externa de calidad Estándares y estandarización Vigilancia de la calidad. La exactitud se define como la medición de la concordancia entre el valor medido y el valor verdadero. Se expresa como error sistemático o sesgo. La precisión puede definirse como la concordancia entre repeticiones de una misma muestra. Se expresa comúnmente como desviación estándar y es una medida del error aleatorio. La imprecisión y/o la inexactitud ocurren como consecuencia de una mala estandardización o de reactivos dañados, de una incorrecta calibración instrumental o del uso de un método pobre desde el punto de vista analítico (poco específico, reacciones incompletas, etc). La precisión puede ser controlada mediante la duplicación de medidas, de pruebas de control en muestras cuantificadas previamente y por análisis estadísticos de datos. La exactitud solo puede controlarse si se posee un material de referencia. Un material de referencia se define como un material o sustancia con una o más características lo suficientemente homogéneas y perfectamente establecidas, usado para la calibración de un aparato, la valoración de un método de medida, o para asignar valores a los materiales. Este material no es lo mismo que un material de control que se define como una sustancia usada de forma rutinaria en el laboratorio para monitorear el desempeño de un proceso analítico. En la tabla 1 se detallan los materiales de control y/o calibradores empleados en HematoloMETODO

CV%

Nº DE REPETICIONES

HiCN