HEMOGRAMA AUTOMATIZADO BQCO. GONZALO OJEDA HEMATOLOGÍA CLÍNICA FaCENA – UNNE 2013

AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA

Exactitud Precisión Rapidez Standarización Screening

TOMA DE MUESTRA Y PROCESAMIENTO

Sangre entera(EDTA-K3) Volumen requerido Procesamiento dentro de las 8 h Conservar refrigerada Temperatura ambiente

PRINCIPIOS DE MEDICION Impedancia Eléctrica Espectrometría de Absorción Citometría de Flujo Dispersión óptica Fluorescencia Citoquímica: Peroxidasa

EQUIPOS IMPEDANCIA + ESPECTROMETRÍA ABSORCIÓN : COULTER (RBC-INDICE HEMATIMÉTRICOS – PLT – WBC – HB) IMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA + ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN: 3 DIFF IMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA + ESPECTROMETRÍA + DISPERCIÓN DE LUZ/FLUORESCENCIA/ OTRA : EQUIPOS 5 DIFF

PRINCIPIO COULTER  Wallace Coulter (1913-1998)

IMPEDANCIA ELECTRÓNICA Y RADIOFRECUENCIA Impedancia electrónica o la resistencia a la corriente continua (cc) de bajo voltaje fue desarrollada por Wallace Coulter en la década de 1950 y es la metodología utilizada con mayor frecuencia La radiofrecuencia (RF) o la resistencia a la corriente electromagnética de alto voltaje a veces se utiliza junto con la impedancia electrónica de la CC.

IMPEDANCIA ELECTRÓNICA El principio de impedancia en el recuento de células se basa en la detección y medición de cambios en la resistencia eléctrica producida por las células cuando atraviesan una apertura pequeña Las células suspendidas en un diluyente conductor de la electricidad ,se arrastran a través de una apertura (orificio) en un tubo de vidrio

RECUENTO DE PLT Y RBCs

Impedancia Volumétrica N° Pulsos :proporcional al N° de células Amplitud del pulso :proporcional al tamaño de la célula

El numero de pulsos es proporcional al numero de células contadas El tamaño del pulso de voltaje es proporcional al tamaño de la célula (volumen) Lo que permite la discriminación y el conteo de células de tamaño especifico

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS.

CLASIFICACION DE LOS IMPULSOS ELECTRICOS GENERADOS POR RBC Y PLT.

RBC`s

Plaquetas.

Los pulsos se reúnen y ordenan (canalizan) según su amplitud mediante analizadores de la altura de pulsos Los datos se trazan en un grafico de distribución de frecuencias o histograma de distribución de tamaño con el numero relativo en el eje de las y el tamaño ( numero del canal equivalente al tamaño especifico) en el eje de las x El histograma producido representa la distribución del volumen de las células contadas

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS.

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS. Limite flotante para división de PLQ/RBC

Media

MCV

Ancho de Distribución

Conteo por impedancia: RBC y PLT

MCV PLQ's

Zona Microcitica. Zona Macrocitica. Linfocitos.

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: RBC y PLT.

PLQ's

Ancho de Distribución Eritrocítica.

50

100 150 200 250 300 350

ADE – RDW – INDICE DE ANISOCITOSIS La amplitud de distribución eritrocitaria (RDW) se calcula a partir del histograma como el coeficiente de variación de la distribución del volumen eritrocitario. Con valores de referencia de 11.5-14 % El RDW es un índice de anisocitocis, que en realidad refleja la relación entre la desviación estándar y el VCM El VCM es un promedio tomado de los datos de distribución eritrocitaria de tamaño.

¿Qué significa RDW? “RDW – Ancho de la distribución de la curva de los eritrocitos ”

 Dos

fórmulas matemáticas usadas para describir la variación de tamaño de los eritrocitos (Anisocitosis).

RDW-CV

Definición: Es el coeficiente de variación alrededor de la media (X) correspondiente a la curva de distribución del volumen de los glóbulos rojos VR: 11.5 – 14 %

RDW-SD Definición: Medida directa (en fl) del ancho de la curva de los glóbulos rojos (RBC) Tomada 20% arriba de la línea base El ancho es medido al 20% de la altura relativa. A esta altura es donde se encuentra la mayor variación de tamaños de las células

RDW-SD Histograma de Eritrocitos Altura relativa

La curva más ancha Representa a la población Con mayor anisocitosis

20% Tamaño de los Eritrocitos en fl

Conteo por impedancia: RBC y PLQ.

Macrocitosis.

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: RBC y PLQ.

Macrocitosis. MCV aprox. de 102 fl

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: RBC y PLQ.

Microcitosis.

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: RBC y PLQ.

Microcitosis.

MCV Aprox de 70 fl

50

100 150 200 250 300 350

FACTORES QUE PRODUCEN INTERFERENCIA FACTORES

PARÁMETRO AFECTADO

Crioaglutinina

GR ,VCM ,CHCM

Aglutinaciòn de GR

Lipemia ,ictericia ,quilomicrones

Hb

La turbidez afecta la lectura espectrofotomètrica

HbCM

Hemólisis

GR , Hto

Gr lisados y no contados

GR resistentes a la lisis con Hb anormales

GB , Hb

Gr (Hb : S,C,F) no pueden lisarse y se cuentan como GB

Microcitosis o esquistocitos

GR

El tamaño eritrocitario < que el umbral

GR nucleados ,fragmento de Megacariocitos

GB

Se cuentan como GB

Histograma de plaquetas.

Histograma de plaquetas.

Límite para la Zona para cálculo del zona de . VPM plaquetas.

2 fl

Plaquetas

Límite flotante para división de PLQ/RBC

35 fl

Histograma normal de plaquetas.

2

5

10

15

20

25

30

35

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS. Histograma normal de plaquetas. El punto de partida debe ser 2 fl en la base del histograma.

2

5

10

15

20

25

30

35

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS. Histograma normal de plaquetas. El VPM es la media aritmética de la población de plaquetas. No será calculado en presencia de alertas de plaquetas. 2

5

10

15

20

25

30

35

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS. Histograma normal de plaquetas.

El histograma debe hacerse asintótico con la horizontal hacia los 25-30 fl

2

5

10

15

20

25

30

35

ALARMAS PARA RBC Y PLT

RBC/MORPH LRI URI LURI

PSEUDOAGLUTINACIÓN CON EDTA

IMPORTANCIA DEL FROTIS DE PUNTA DE AGUJA RECUENTO VS ESTIMACIÓN

RECUENTO POR IMPEDANCIA DE WBC

RECUENTO DE LEUCOCITOS  El conteo se realiza en un transductor de Von Behrens.  Los impulsos eléctricos detectados son clasificados y almacenados en un histograma con canales de 1 fl de ancho

SOBREESTIMACIÓN POR PRESENCIA DE ERITROBLASTOS  Ej: WBC 30.000 /mm3 200 eritroblastos por cada 100 GB 300 (WBC+EB)-----------100 30.000 ---------------------x=10.000 Gb corregidos= Gb contador – (Gb contador x 100) (EB+100)

Conteo por impedancia: WBC.

Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia.

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: WBC.

Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia. LIM

50

MID

GRAN

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: WBC.

Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia. Ubicación Normal del pico LIM es entre 50-75 fl

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: WBC.

Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia. MID

50

La región MID debe ser un valle entre las regiones LIM y GRAN.

100 150 200 250 300 350

ALARMAS

DOSAJE DE HEMOGLOBINA Se utiliza el sobrante de la dilución con que se realizó el conteo de WBC. Método de la Cianmetahemoglobina Se realiza la lectura en la celda de hemoglobina a 540 nm con un blanco para cada muestra. El valor de absorbancia obtenido se interpola en la curva de calibración almacenada en el instrumento.

DISPERSIÓN ÓPTICA

Una corriente de muestra centrada en forma hidrodinámica se dirige a través de un cuarzo para flujo celular por el que pasa una fuente de luz centrada (un láser de helio neón polarizado en sentido vertical). La luz dispersada se divide en varios ángulos Se utilizan varias combinaciones de estas mediciones para diferenciar y cuantificar las cinco subpoblaciones leucocitaria principales :neutrófilos ,linfocitos ,monocitos , eosinófilos y basófilos

Enfoque hidrodinámico Minimiza la acumulación de proteínas Elimina la circulación retrograda Reduce la irregularidad de la altura de pulso Reduce la perdida por pasaje coincidente

Enfoque analítico Iluminado por medio de un laser helio neón Enfocado hidrodinámicamente a traves de una celda de flujo de diseño especial Medición de las carácteristicas de dispersión óptica de la luz para las celdas individuales

Separación por dispersión polarizada con múltiples ángulos (M.A.P.S.S). -La dispersión frontal de luz 0° :se usa para determinar el TAMAÑO CELULAR (FORWARD SCATTER) -La dispersión ortogonal de 90° : para determinar la LOBULARIDAD CELULAR. (SIDE SCATTER) -La dispersión de la luz en ángulo estrecho de 10°:se correlaciona con COMPLEJIDAD CELULAR (SIDE SCATTER) -La dispersión de luz despolarizada de 90° (90D) para evaluar la GRANULARIDAD CELULAR.

 El citograma MAPSS final muestra los eventos de celdas individuales los cuales se definen por medio del uso del color

TECNOLOGIA CVS

La muestra una vez tratada es dirigida a una celda de flujo (Flow cell) en la cual por el diseño hidrodinámico, los leucocitos se alinean y pasan formados uno a uno y en donde se realizan las siguientes mediciones

 Volumen  Mediante impedancia de baja frecuencia se determina el volumen de la célula  Impedancia (resistencia a la cc de bajo voltaje)

 Conductividad  La densidad interna de la célula es proporcional al tamaño del pulso o al cambio de la señal de Radiofrecuencia  RF(ola resistencia a la corriente magnética de alta voltaje)

 Scatter  La dispersión (scatter) de luz láser indica la estructura y forma de la célula

Los cambios de voltaje de CC y RF pueden detectarse en forma simultánea

Pueden graficarse en forma comparativa la impedancia y la conductividad :se forma Un citograma de distribución bidimensional ,este trazado de dispersión muestra poblaciones celulares como cúmulos Fe 3+ Grupos Hidrofílicos de SLS se unen a Fe --> SLS-Hb

Fe 3+

Fe 2+

SLS

Fe 3+

Sysmex XS-1000i Tecnología En los Xs el Hto se mide electrónicamente, basado en el principio de que el pulso producido cuando un Gr pasa a través de la apertura es proporcional al volumen de la célula El Hto se determina comparando el volumen total o acumulado de Gr con el volumen de sangre completa en la dilución

Por Citometría de Flujo se obtiene información acerca de la composición y madurez celular Fluorescencia

Información del contenido de RNA y DNA Dispersión lateral

Información de la estructura interna Láser Dispersión frontal

Tamaño de la célula

Sysmex XS-1000i Tecnología

Cuantificación de Gránulos Inmaduros Información útil sobre el diferencial extendido de leucocitos 

IG: promielocitos mielocitos metamielocitos

Maduración de neutrófilos Blastos

promielo

mielo

IG

metamielo

bandas

segmentos

Cuantificación de Gránulos Inmaduros IG Master Canal del diferencial

Normal IG % , #

Dispersión lateral

Detección de los RBC resistentes a la hemólisis

Conteo óptico nucleado NOC

Análisis óptico de las plaquetas  Por medio del uso de un enfoque de dispersión óptica de la luz con ángulo dual se logra una buena separación de los GR y las plq  Ademas , la presencia de los cúmulos de plq se puede detectar en forma confiable

Medida de los eritroblastos Los EB son contados y separados de los WBC basados en su tamaño y cantidad de fluorescencia

Recuentos de Reticulocitos Método de Referencia: Azul de Metileno Variación entre observadores Altos coeficientes de variación Laboriosos Métodos automatizados Azul de metileno Fluorescentes

Canal reticulocitos - Fluorescente RETSEARCH II (Diluyente + Colorante)

WBC

RET

Tinción: Polimetino: ARN Oxazina: ADN Fl muy alta

Fl alta

RBC Fl baja

Canal de los reticulocitos

.. .

Utilidad Clínica - FIR Confirmación de Anemia Aplástica Permite la clasificación de anemias por su capacidad eritropoyética

.. .

Talasemia vs. deficiencia de Hierro Anemia de los procesos crónicos Hipoproducción vs. respuesta eritroide temprana

Detección de implante correcto luego de transplante

Contenido de Hb de los reticulocitos Ret-He Reticulocitos con contenido de Hb