COMPUESTOS FENÓLICOS – VÍA DEL ÁCIDO SHIQUÍMICO Los vegetales acumulan compuestos fenólicos como parte de su adaptación evolutiva a la tierra. Dichos compuestos cumplen diversas funciones:   

Función estructural a nivel de pared celular. Moléculas de defensa. Pigmentos y aromatizantes de flores. Cerca del 40% de los compuestos fenólicos derivan principalmente del metabolismo fenilpropanoide y fenilpropanoide-acetato. No puede usarse una especie vegetal única para ilustrar la extraordinaria diversidad de metabolitos secundarios que existen en el reino vegetal ya que estos no son generales a todas las especies. Los compuestos fenólicos pueden clasificarse de acuerdo a su esqueleto básico en: Clasificación de los compuestos fenólicos según su grado de complejidad C6

Fenoles simples

C6-C1

Ácidos Benzoicos y relacionados

C6-C2

Acetofenonas, ácidos fenilacéticos

C6-C3 C6-C3 C6-C3-C6

Fenilpropanoides y relacionados

C6-C1-C6

benzofenonas y estilbenos

C6-C2-C6

xantonas

(C6-C3)n

lignanos, ligninas

Cumarinas y relacionados Flavonoides y derivados

La vía del ácido shiquímico es el principal camino biosintético de compuestos aromáticos. Esta secuencia metabólica convierte los metabolitos primarios fosfoenolpiruvato (PEP) y eritrosa-4-fosfato (E4P) hasta corismato, el precursor común para los tres aminoacidos aromáticos: fenilalanina, tirosina y triptofano y para los ácidos p-aminobenzoico y phidroxibenzoico. Estos no son sólo precursores de proteínas sino también precursores para derivados fenilpropanoides e indólicos. Este camino se encontró en bacterias, hongos y plantas. En animales monogástricos la fenilalanina y el triptofano son aminoácidos esenciales y se incorporan con la dieta y la tirosina deriva directamente de la fenilalanina. En las plantas superiores los aminoácidos aromáticos son los precursores de una gran variedad de metabolitos secundarios (MS) que representan aproximadamente el 60% de la masa seca de la planta.

En las plantas esta vía metabólica tiene lugar en dos compartimientos:  Plástidos: responsable de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos.  Citosólico: responsable de la producción de corismato para la síntesis de metabolitos secundarios. Las mitocondrias pueden sintetizar proteínas mediante el ingreso de aminoácidos a través de transportadores. Descripción de la vía Existen siete enzimas involucradas en la vía desde PEP y E4P hasta ácido corismico, siendo las más importantes la primera y la sexta; a continuación se describen las enzimas y su reacciones. Primera enzima: 3-deoxi D arabinoheptulosonato-7-fosfato sintetasa (DAHPS) es la que controla el flujo de carbono en la vía. Cataliza la condensación de la E4P (proveniente de la vía de las pentosas) con PEP (proveniente de la glicólisis) para generar 3-deoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato (DAHP). Se trata de una metaloenzima dependiente de Mn+2 y Co+2. En las plantas los aminoácidos aromáticos no son considerados primariamente como destinados a la biosíntesis de proteínas sino como intermediarios en la biosíntesis de MS, lo s cu a le s regularán la actividad de esta enzima, por lo que esta enzima no es controlada por retroinhibición de los aminoácidos aromáticos. Es una enzima histerética (es decir que sufre cambios muy lentos en sus propiedades cinéticas después de la adición o remoción de determinados ligandos). Es activada por Triptofano y Tirosina, e inhibida por arogenato (un intermediario pos-corismato de la biosíntesis de Fenilalanina y Tirosina). Segunda enzima: 3-dehidroquinato sintasa. Cataliza la desfosforilación e isomerización del DAHP hasta 3-dehidroquinato. Es también una metaloenzima dependiente de Co+2 y utiliza NAD+ como coenzima. Tercera y cuarta enzima: 3-dehidroquinato dehidratasa y shiquimato deshidrogenasa. Catalizan la deshidratación del 3-dehidroquinato hasta dehidroshiquimato y la reducción de éste hasta shiquimato. Hay evidencias de que las dos actividades están presentes en un solo polipéptido (enzima bifuncional). Quinta enzima: Shiquimato quinasa. Cataliza la fosforilación del shiquimato hasta shiquimato-3fosfato con gasto de ATP. Presenta inhibición por los productos de la reacción (shiquimato -3fosfato y ADP), así como modulación por luz en organelas aisladas. Sexta enzima: 5-enolpiruvil-shiquimato-3- fosfato sintetasa (EPSP sintasa). Es la que cataliza la transformación de shiquimato-3-fostato en 5-enolpiruvil-shiquimato-3- fosfato ( E P S P ) , q u e es el blanco de un herbicida como el glifosato (N-fosfonometilglicina, análogo del PEP) y por lo tanto al bloquearla se bloquea la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, de proteínas y compuestos fenólicos, con lo que cesa el crecimiento y acontece la muerte del vegetal. Por supuesto, como esta enzima está ausente en mamíferos el glifosato tiene baja toxicidad para los animales. Esta enzima está localizada principalmente en cloroplastos y es sintetizada como un precursor en el citoplasma. La inhibición por glifosato es competitiva respecto al PEP y nocompetitiva con respecto al shiquimato-3- fosfato. Existen especies donde esta enzima ha sufrido una mutación puntual conservativa de un residuo de glicina por uno de alanina, lo que la hace

insensible al glifosato. Séptima enzima: Corismato sintetasa. Cataliza la 1,4 trans eliminación de fosfato (del EPSP) para producir corismato. Esta reacción es inusual ya que requiere como FMNH2 típicamente asociado a reacciones redox.

La vía del ácido shiquímico – detalle de reacciones

Inhibición de la ESPS sintasa por acción del glifosato

El corismato es el producto final de la vía. El corismato es el metabolito común a dos rutas metabólicas conducentes a los aminoácidos aromáticos, conocidas como:  Vía del arogenato: para síntesis de Fenilalanina y Tirosina.  Vía del antranilato: para síntesis de Triptofano. Vía del arogenato La Corismato mutasa (CM) es la enzima encargada del reordenamiento de la cadena lateral enolpiruvil del corismato para producir prefenato, y es la enzima clave de la biosíntesis de fenilalanina y tirosina. Detalle de las reacciones de la vía del arogenato

En algunas plantas superiores, esta actividad existe en dos isoformas, CM1 y CM2. CM1 tiene una localización plastídica y un comportamiento alostérico. Es retroinhibida por los productos finales (fenilalanina y tirosina) y es activada por triptofano (producto de la otra rama del metabolismo). Además el triptofano es capaz de revertir la inhibición por fenilalanina y tirosina. Este esquema sirve para regular el flujo por competencia entre las dos vías (arogenato y antranilato), incrementando la síntesis de fenilalanina y tirosina cuando hay mucho triptofano, y suprimiendo la síntesis de fenilalanina y tirosina cuando el suministro de estos aminoácidos es el adecuado. Control alostérico de CM1

Respecto a CM2, su actividad no está regulada por ningún aminoácido aromático, es citosólica y la proteína codificada por el ADNc en tomate (Lycopersicum esculentum) y Arabidopsis thaliana pierde la secuencia N-terminal que la dirige al plástido. Teniendo en cuenta estos datos CM2 puede no estar involucrada en la biosíntesis de aminoácidos, su KM

para corismato es más bajo que el de CM1. La prefenato aminotransferasa, cataliza la formación de arogenato a partir de prefenato, es una enzima estable al calor que utiliza glutamato y aspartato como dadores de grupos aminos. No está regulada por retroinhibición. La arogenato deshidrogenasa cataliza la conversión de conversión de ácido arogénico a tirosina. Esta enzima dependiente de NADP+ es fuertemente inhibida por tirosina, por lo que es una enzima clave. La arogenato deshidratasa, enzima que cataliza la transformación de arogenato en fenilalanina es inhibida por fenilalanina y activada por tirosina. Regulación enzimática Las enzimas que intervienen en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en plantas son reguladas por señales ambientales vinculadas al estrés, tales como:  Lesiones: esto está muy bien estudiado en papa (Solanum tuberosum), donde las lesiones a nivel del tubérculo producen incremento en el ARNm codificante de DAHP sintetasa, cuya actividad se incrementa. Hay también co-inducción con otras enzimas de la vía, tales como shiquimato quinasa, EPSP sintetasa, corismato sintetasa y la enzima PAL (Fenilalanina amonio liasa).

Infecciones con patógenos bacterianos o fúngicos: en Arabidopsis thaliana se ha comprobado que la infección foliar con microorganismos fitopatógenos produce un incremento en los niveles de enzimas como la antranilato sintasa, y las α y β triptófano sintasas, responsables de la síntesis de triptofano (vía antranilato), precursor de la fitoalexina “camalexina”, de estructura indolica, que presenta fuerte absorción al UV.

Vía del antranilato – detalle de reacciones

Biosíntesis fenilpropanoide Los compuestos fenólicos fenilpropanoides derivan principalmente de la fenilalanina o de

la tirosina. La primera enzima en el metabolismo fenilpropanoide es la Fenilalanina Amonio Liasa (PAL), que cataliza la eliminación del grupo amino de la fenilalanina para dar ácido transcinámico, un intermediario clave en este metabolismo. También puede usar la tirosina como sustrato, actividad conocida como Tirosina Amonio Liasa (TAL), lo que genera ácido-p-cumárico. En la mayoría de las plantas vasculares la fenilalanina es el sustrato preferencial pero en las monocotiledóneas puede usar fenilalanina y Tirosina. Reacciones catalizadas por actividades PAL y TAL

El grupo amino es eliminado como amonio y este es recapturado dentro de la planta. Una ruta posible para recapturar el amonio es mediante la acción de la glutamina sintetasa ( GS) y la glutamato sintetasa (GOGAT). Una vez asimilado en glutamato el grupo amino puede ser donado al prefenato, dando arogenato, un precursor de la fenilalanina y tirosina. Con este proceso ciclico del nitrógeno se asegura un suministro constante de aminoacidos aromáticos de los cuales derivan los compuestos fenólicos en las plantas. La incorporación de amonio en aminoácidos puede ser realizada por la via de las pentosas fosfato, aún en plástidos no fotosintéticos. Reciclado del amonio – detalle de reacciones

PAL es una familia de isoenzimas o complejo s multienzimáticos que no requieren cofactor para actuar. Se puede regular en sus niveles (inducción genética) o bien en su actividad. Inducción genética: el mRNA de la PAL aumenta por estrés abiótico, lesiones, elicitores fúngicos, radiación UV y ataque por patógenos. Control sobre la actividad: la actividad de la PAL está regulada por el sistema Ferredoxina-tioredoxina en los cloroplastos. El estimulo básico regulador es la luz. La acción de la luz se efectúa a nivel del Fotosistema I. El flujo de electrones ocasionado por la luz llega hasta la ferredoxina soluble. Por acción de la enzima FerredoxinaTiorredoxina reductasa, el electrón de la ferredoxina es utilizado para reducir a la tiorredoxina. La tiorredoxina contiene un residuo de cistina que se reduce reversiblemente generando los correspondientes residuos de cisteína (con g rupos sulfhidrilo reducidos). Finalmente esta puede reducir a la PAL, cuya forma reducida es activa. En la oscuridad esta enzima se desactiva por un oxidante como el glutatión oxidado o el ácido dehidroascorbico.

Ácidos fenilpropanoides Son ácidos carboxílicos derivados fenilpropanoides con estructura C6-C3. La biosíntesis implica formación de un tioéster de la Coenzima A a partir de ácido cinámico. Los más comunes son el ácido cafeico, el ácido ferúlico y el ácido sinápico. La ruta biosíntética de los mismos involucra: 1.- Hidroxilación aromática: involucra tres conversiones a nivel de microsomas: Cinamato 4- hidroxilasa: El ácido cinámico es hidroxilado por la cinamato 4 hidroxilasa (C4H) para formar ácido 4-hidroxicinamico o ácido-p-cumarico. Esta enzima es una monooxigenasa ligada al citocromo P-450, dependiente de NADPH, que requiere también oxigeno, por lo que actúa como una oxidasa de función mixta, pues oxida dos sustratos (NADPH y ácido cinámico) y reduce uno (el O2). Cumarato 3-hidroxilasa: El ácido cinámico puede ser hidroxilado en posición 3 para dar ácido cafeico. Este paso es catalizado por la Cumarato-3-hidroxilasa. Esta enzima es una fenolasa con alta especificidad hacia el p-cumarato. Ferulato 5- hidroxilasa: El ácido ferulico puede ser hidroxilado por la ferulato 5- hidroxilasa (F5H) para formar ácido-5-hidroxiferulico. La F5H es también una oxidasa de función mixta. El grupo 5 hidroxilo del ácido 5-hidroxiferulico puede ser metilado por una O-metil transferasa (OMT) para producir ácido sinapico. La F5H a sido implicada en las diferencias en composición en ligninas entre angiospermas y gimnospermas. Los derivados hidroxilados del ácido cinámico (ácidos 4-hidroxicumarico, cafeico, ferulico, sinapico) son transformados a un segundo nivel de intermediarios claves por 4 mecanismos: elongación de la cadena y substitución, elongación de la cadena y ciclización,

acortamiento de la cadena, reducción. Este segundo nivel de intermediarios sufre un mayor grado de diversificación por reacciones especificas de: hidroxilación, O-metilación, Deshidrogenación, Fenol- oxidación, esterificación, glicosilación. 2.- O-metilaciones: Las OMT actúan sobre ácidos libres o esteres de CoA, metilan los grupos HO meta pero no en posición para. La enzima cataliza esta transformación usando Sadenosilmetionina (Ado-Met) como un cofactor que cede grupos metilo.

Monolignoles Son alcoholes derivados de los ácidos fenilpropanoides, que se biosintetizan a partir de los ácidos cinámicos. Los más importantes son el alcohol sinapílico, el alcohol coniferílico y el alcohol-p-cumarílico.

La biosíntesis de estos implica una reducción de los tio-esteres de ácidos fenilpropanoides con la coenzima A inicialmente a aldehídos y finalmente en los alcoholes correspondientes.

La conversión de los ácidos fenilpropanoides en alcoholes requiere por lo tanto de la participación de la siguientes enzimas: 4-Cumarato CoA ligasa (4CL): es una enzima cuya actividad depende del ATP. El p-cumarato se une a la Coenzima A para formar un precursor tioester activado, p-cumaril-CoA a traves de la acción de la 4CL. El p- cumaril-CoA es el precursor para la síntesis de flavonoides, estilbenos y otros fenilpropanoides, así como del monolignol alcohol p- cumarilico. La 4CL cataliza la formación de tioesteres CoA de ácidos cinámicos en la biosintesis de una gran variedad de derivados fenólicos, incluyendo taninos condensados, ácidos benzoico, flavonoides y alcoholes cinamilicos. Cinamil - Coenzima A reductasa (CCR): Esta enzima cataliza la reducción de los tioesteres hidroxicinamil-CoA a sus correspondientes aldehidos. La CCR no exhibe mucha especificidad de sustrato pudiendo actuar sobre cualquiera de los tioesteres hidroxicinamil-CoA. Se considera que juega un rol clave y regulatorio en la biosíntesis de lignina por cuanto cataliza el primer paso en la producción de monolignoles desde los metabolitos fenilpropanoides. Cinamil Alcohol deshidrogenasa (CAD): cataliza la reducción de hidroxicinamilaldehidos a hidroxicinamil alcoholes. Las preparaciones de CAD de angiospermas muestran igual actividad sobre coniferilaldehido que sobre sinapilaldehido, mientras que preparaciones de CAD de angiospermas son generalmente más activas sobre coniferilaldehido. Esta reducción tiene lugar en el aparato de golgi o en el reticulo endoplasmatico.

Glicosilación, almacenamiento y transporte de Monolignoles Los monolignoles, alcohol p-hidroxicinamilico, coniferilico y sinapilico son relativamente tóxicos e inestables. Una reacción de glicosilacion sobre el grupo hidroxilo fenólico, realizada por la UDP-glucosa-coniferil alcohol glucosil transferasa, forma los glucosidos monolignoles. Estos glucosidos se acumulan en algunas especies de plantas especialmente en coniferas (esto no sucede en las angiospermas). Son almacenados en las vacuolas y transportados desde la vacuola a la pared celular durante la diferenciación del xilema. El mecanismo de este transporte es poco conocido así como cuales son los factores que lo regulan. Por estudios ultraestructurales se han detectado vesículas que transitan entre el citosol y el plasmalema en traqueidas en diferenciación. En la pared celular tiene lugar la polimerización.

Lignanos y neoligananos Los monolignoles son principalmente convertidos en dos diferentes clases de metabolitos vegetales: lignanos y ligninas. La mayor parte del flujo metabólico de la vía de los fenilpropanoides está dirigido a la producción de las ligninas, que son constituyentes estructurales de la pared celular vegetal. Los radicales libres participan en las reacciones que producen tanto lignanos como ligninas, así como también aquellos polímeros vegetales de los tejidos suberinizados. Los lignanos resultan del ligamiento de 2 unidades derivadas de fenilpropanos (unión 88’). Los lignanos utilizan alcohol coniferílico predominantemente, solo o con otros monolignoles. Se forman por acoplamiento estereoselectivo de dos moléculas de alcohol coniferílico. Los lignanos se encuentran en la madera de las gimnospermas y en todos los

tejidos en las angiospermas. La reacción es regio y estereoselectiva, y el mecanismo involucra radicales libres. El ejemplo más estudiado es la biosíntesis de (+)-pinoresinol en Forsythia intermedia, que involucra oxidación del sustrato por acción de una lacasa que forma los radicales libres, que son orientados de modo vectorial por una proteína dirigente que impide acoplamientos al azar. La primera demostración del acoplamiento fue la síntesis in vitro del (+) pinoresinol: Una lacasa cataliza la formación d el correspondiente radical libre y una proteína dirigente o guía orienta al sustrato radical libre para evitar un acoplamiento al azar, favoreciendo solo la formación de acoplamiento 8-8'. La forma óptica (+) o (-) varía con la especie vegetal en cuestión. El pinoresinol puede ser enantioespecificamente convertido en lariciresinol y secoisalariciresinol, seguido por deshidrogenación para dar matairesinol. Este último es el presunto precursor del ácido plicatico, que se deposita formando el “corazón rojo” de ciertos árboles, tales como Thuja plicata (cedro rojo), así como de la podophylotoxina en Podophyllum hexandrum y P.peltatum. Podophylotoxina es usada para tratar condilomas acuminados típicos de enfermedades venereas, mientras su derivado semisíntetico, tenipósido es usado para el tratamiento del cancer. La Podophylotoxina es también un antineoplasico, ya que actúa a nivel de los microtúbulos, inhibiendo la polimerización de la tubulina y frenando la división celular al comienzo de la metafase. El pinoresinol es también precursor y de moléculas de importante aplicación agroalimeticia, como la sesamina (antioxidante que previene el enranciamiento del aceite de las semillas de sésamo durante su almacenamiento).

Biosíntesis de (+) pinoresinol en Forsythia intermedia - Proceso enantioselectivo

Conversión de (+) pinoresinol en otros liganos

Lignanos con uniones 8-8’

Los neolignanos son dimeros de fenilpropanoides o alilfenoles (isoeugenol) unidos por cualquier otro tipo de enlace (por ej. 8-1’, 8-3’, 3-3’, 8-4’). Algunos neolignanos tienen acción antirreumatica, antialergicos, inhibidores del factor de agregación plaquetaria (Ginkgo). Estos neolignanos inhiben la desgranulación de los neutrófilos. Recientemente autores japoneses han postulado que el di-O-D-D glucósido del siringoresinol podría ser el responsable de la actividad atribuida al Ginseng siberiano, ya que sus raíces se usan como adaptógenos (aumentan la resistencia al stress). El Silybum marianum (Asteraceae) es usado como hepatoprotector ya que contiene flavol-lignanos, alcohol fenilpropanoide , alcohol coniferilico, 2-3 dihidroflavonol, taxifolin. Los términos lignanos y neolignanos se usan como sinónimos en la actualidad. Lignina El termino lignina se refiere a la sustancia no-celulósica incrustante presente en tejidos leñosos. Luego de la celulosa, las ligninas constituyen los productos orgánicos naturales de mayor abundancia, llegando a constituir entre el 20 y 30% de todos los tejidos de plantas vasculares. El depósito de lignina da lugar a la formación de tejidos xilemáticos leñosos en arboles, así como también el refuerzo de tejidos vasculares en plantas herbáceas y pastos. Confiere a las paredes de estas estructuras una elevada resistencia a la compresión, factor decisivo para el desarrollo de las estructuras rígidas de las plantas leñosas a la vez que reduce la permeabilidad de las paredes. Es un proceso característico de las plantas vasculares, no encontrándose ligninas en categorías taxonómicas inferiores a la de los helechos ( musgos, algas, hongos y bacterias ).

Al día de hoy no se han descripto métodos de aislamiento de ligninas de formas nativas que no alteren significativamente la estructura original de los biopolímeros durante la disolución. A diferencia de los lignanos, las ligninas suelen ser mezclas racémicas (es decir que carecen de actividad óptica). Las ligninas de gimnospermas derivan principalmente del alcohol coniferílico (y en menor proporción del alcohol p-cumarílico) y se denominan coniferil o guaiasil-ligninas, mientras que las ligninas de angiospermas contienen alcoholes coniferílicos y sinapílicos en casi idénticas proporciones. Las gimnospermas no poseen la enzima ferulato-5-hidroxilasa, por lo que no sintetizan alcohol sinapílico. El mecanismo más aceptado para la biosíntesis de las ligninas involucra el transporte de los monolignoles hasta la pared celular, su oxidación por acción de enzimas tipo peroxidasas y lacasas hasta radicales libres, y polimerización de los mismos. Se propuso que los precursores fenólicos son polimerizados en la pared celular por un mecanismo oxidativo involucrando radicales libres intermediarios. Las enzimas tipo peroxidasas (hemoproteinas dependientes de H2O2 y Mn2+ ) y lacasas (oxidasas oxigeno dependientes) fueron propuestas para realizar la polimerización de los monolignoles en lignina. Las enzimas son capaces de oxidar monolignoles hasta radicales libres fenoxilos. El H2O2 necesario para este proceso se produce en la pared celular por oxidación del NAD(P)H, generado por la oxidación del malato con O2 . Tipos de radicales libres generados a partir del alcohol cinamílico

La lignificación se inicia en la lámina media y las regiones angulares de las paredes primarias, progresando en sentido centrípeto en las distintas capas de la pared secundaria. El contenido en lignina del leño oscila entre el 15 y el 35%, es más elevado en la lámina media que en las paredes secundarias. Polimerización in vitro de alcohol coniferílico en ligninas

Cuando se realiza la polimerización espontánea (no enzimática) in vitro del alcohol coniferílico se generan ligninas donde predominan las uniones tipo 8-8’ y 8-5’, lo que sugiere que dichas uniones serían las de mayor estabilidad, y por lo tanto las de mayor abundancia en las ligninas naturales, si el proceso fuese solo vía radicalario y espontáneo; sin embargo los resultados in vivo demuestran que tales uniones son las menos abundantes (llegando a ser trazas en algunos casos), mientras que predominan las del tipo 8-O-4’. Esto da lugar a hipotetizar el rol de proteínas dirigentes de los radicales libres que favorecerían ciertas polimerizaciones por sobre otras.

El mecanismo que controla la abundancia relativa de las subunidades p-hidroxifenil, guaiacil y siringil en la lignina no es bien conocido. Se considera que la especificidad enzimática es la que determina las proporciones relativas de cada uno de ellos. La composición en monómeros de lignina varía entre los diferentes tipos de células de una misma planta y también entre las diferentes regiones de la pared de una única célula, por otra parte hay diferencias en la composición de monómeros de lignina entre angiospermas y gimnospermas. El control espacial específico de la composición de monómeros en la pared celular podría ser determinado por diferencias en las especificidades de sustrato de las enzimas que actúan en la biosíntesis de monolignoles. La guaiacil-siringil lignina que es típica en las angiospermas es más fácilmente removida que la guaiacil lignina que es típica de las coniferas. Las enzimas hidroxilasas son los puntos claves para determinar la abundancia relativa de los diferentes tipos de monomeros: C3H regula la relación de subunidades p-hidroxifenil a guaiacil y siringil, y la F5H para regular la relación de subunidades guaiacil a siringil. Por otra parte se ha sugerido que la canalización de sustratos puede jugar un rol en el control de las concentraciones intracelulares de intermediarios tóxicos. En gimnospermas las ligninas están formadas por unidades guaiacil y menor cantidad de p- hidroxifenil, esto se debe probablemente a que la enzima ferulato 5 hidroxilasa (F5H) está en muy escasa propoción. En angiospermas en cambio hay unidades guaiacil y siringil. En dicotiledóneas hay guaiacil y siringil en igual proporción mientras que en monocotiledoneas hay cantidades significativas de alcohol p- hidroxicinamico. La lignificación puede ocurrir en las plantas en respuesta a la infección por patógenos. La composición de lignina depositada en las márgenes de la lesion (lignina guaiacil y siringil) difieren de la lignina de los tejidos sanos (lignina guaiacil).

Acido Clorogénico

Es un éster del ácido quínico (un derivado de la vía del ácido shiquímico) y un ácido fenólico (como el ácido cafeico o el p-cumárico). El ácido clorogénico es abundante en el café a tal punto que la fracción soluble del café puede contener hasta un 13% en peso del ácido clorogénico. En papa constituye aproximadamente el 90% del total de compuestos fenólicos presentes en el tubérculo. Biosíntesis de ácido clorogénico – detalle de reacciones

La presencia de ácido clorogénico en las plantas está ligada a mecanismos de defensa tanto de insectos como de fitopatógenos. Su modo de acción exacto no se conoce pero in vitro se comprobó que daña los cromosomas y después de la oxidación por una fenol oxidasa puede formar un intermediario o-quinona que puede reaccionar con varios aminoacidos nutricionalmente esenciales llevando a una disminución de su valor nutritivo y posible formación de compuestos tóxicos. La luz induce cambios en el contenido de ácido clorogénico, clorofila y glicoalcaloides de papa. El ácido clorogénico posee aran actividad depuradora de radicales libres, actividad ansiolítica y se hipotetiza sobre su posible actividad hipotensora.

Compuestos C6-C1

A partir de los ácidos fenilpropanoides las plantas pueden generar compuestos aromáticos C6-C1, formando inicialmente el tioéster de la coenzima A del correspondiente ácido, el cual puede sufrir degradación de la cadena lateral, mediante un proceso enzimático similar a la β oxidación de los ácidos grasos. Biosíntesis de compuestos C6-C1 – esquema de reacciones

Acido Salicílico Es un compuesto C6-C1 cuya biosíntesis se incrementa durante las interacciones plantapatógenos, dado que se halla involucrado en los mecanismos de defensa sistémicos; el proceso involucra:

123456-

Formación de H2O2. Lignificación. Producción de fitoalexinas. Entrecruzamiento oxidativo de las proteínas de la pared celular. Peroxidación de lípidos. Producción de proteínas relacionadas a la patogénesis.

El H2O2 induce la acumulación del ácido benzoico libre y del ácido salicílico debido a que activa a la benzoico 2-hidroxilasa. Esta enzima cataliza la conversión de ácido benzoico en ácido salicílico. El ácido salicílico actúa como una señal sistémica. El ácido salicilico inhibe los niveles de catalasa incrementándose los niveles de peróxido de hidrógeno e incrementándose la expresión de genes relacionados a la patogénesis. A su vez el ácido salicílico puede metabolizarse a catecol a través de la enzima salicilato hidrolasa. Recientemente se ha encontrado que cuando se producen infecciones por patógeno el ácido salicílico se biosintetiza a partir del corismato vía conversión a isocorismato por una isocorismato sintetasa. Posteriormente se libera el grupo piruvato por una piruvato liasa para dar ácido salicílico. Cuando esto sucede las plantas reducen su tamaño probablemente debido a que a la depleción de isocorismato para la producción de filoquinona. Acido gálico

Actividades biológicas de los ácidos fenólicos Los ácidos fenilpropanoides, tales como los ácidos cumárico, cafeico, ferúlico, siringico, etc., tienen actividad citostática contra células Hep G2 (carcinoma epidermoide de laringe) y contra células McCoy derivadas de fluido sinovial de pacientes con artritis degenerativa. Los ácidos fenólicos inhiben la Calcio ATPasa de la membrana plasmática por lo que pueden ser usados como agentes cardiovasculares regulando los niveles de Ca intracelular. Generalmente estos ácidos están esterificados lo que los hace más lipofílicos facilitando el transporte al interior de las células. Estos agentes interaccionan con el interior hidrofóbico de la interfase Proteina-lípido de las membranas plasmáticas perturbando la actividad de la Calcio ATPasa. Al inhibirse la enzima se incrementa el nivel de Calcio en las células cardiacas, aumentando la fuerza de contracción del corazón.

Generalmente los ácidos fenólicos o fenilpropanoides están en mayor concentración que los flavonoides. Se han demostrado las propiedades antioxidantes de los ácidos fenólicos: depurando radicales libres para evitar la peroxidación de lípidos, inhibiendo la oxidación de la LDL plasmática depurando oxigeno reactivo que juega un papel muy importante en la promoción de tumores y carcinogénesis. Actúan previniendo las enfermedades de las arterias coronarias ya que disminuyen la agregación plaquetaria e inhiben la oxidación de las LDL. Esteres del ácido cafeico: Sesquiterpenos cafeatos o 2 fenetiletilcafeato se transportan al interior de las células y allí se hidroliza liberando ácido cafeico que es citotóxico.

Cumarinas Las cumarinas pertenecen a una gran familia de metabolitos de plantas llamados benzopironas, con más de 1500 representaciones en más de 800 especies. Las cumarinas están presentes en las Angiospermas: Fabaceas, Asteraceas, Apiaceas, Rutaceas. En las plantas, esos compuestos pueden ocurrir en la cubierta de las semillas, frutos, flores, raíces, hojas y tallos, pero en general las mayores concentraciones se encuentran en frutos y flores. Su rol en las plantas parece ser principalmente relacionado a la defensa, dado sus propiedades antimicrobianas, antialimentarias, protectoras de radiaciones UV e inhibidoras de la germinación. La ingestión de las cumarinas por los mamíferos produce hemorragias, dada su actividad inhibitoria de la coagulación. Por otro lado, compuestos fotosensibilizantes como el 8metoxipsoraleno, presente en tejidos de hojas de Heracleum mantegazzianum pueden causar fotofitodermatitis en contacto con la piel y posterior exposición a la radiación UV-A. El psoraleno se usa tratar varios desordenes de piel (eczemas, psoriasis) por medio de una combinación de tratamientos: ingestión oral y tratamiento UVA. Se clasifican en:  Cumarinas simples: tienen un anillo pirano o pirona (heterociclo oxigenado de 6 elementos) unido a uno aromático de 6 carbonos. Los exponentes más difundidos son la cumarina y la umbeliferona. En este grupo también se incluyen las cumarinas preniladas, aunque algunos autores las citan como un grupo diferente.  Furanocumarinas: tienen un anillo furano (heterociclo oxigenado de 5 elementos) unido al anillo aromático. Las lineales lo unen en posiciones 6 y 7, siendo el psoraleno el más representativo de este grupo, mientras que las angulares lo unen en posiciones 7 y 8, siendo la angelicina la más representativa de este grupo.  Piranocumarinas: poseen un anillo pirano unido al anillo aromático. Las lineales lo unen en posiciones 6 y 7, siendo la xantiletina la más representativa de este grupo, mientras que las angulares lo unen en posiciones 7 y 8, siendo la sesilina la más representativa de este grupo.  Metilen dioxicumarinas: posen un anillo tipo 1,3 dioxapentano unido a posiciones 6 y 7 del anillo aromático. La ayapina es el principal exponente de este grupo.

 Cumarinas pirono-sustituidas: son cumarinas simples con un sustituyente en el anillo pirona. Un ejemplo de este grupo es la warfarina.

Piranocumarina angular Cumarinas pirono sustituídas Biosíntesis de cumarinas – detalle del proceso

Biosíntesis: Las cumarinas son lactonas derivadas usualmente de los ácidos o-hidroxicinámicos por cierre del anillo entre el OH en posición orto y el grupo carbonilo de la cadena lateral, luego de una isomerización cis-trans de la cadena lateral, puesto que los ácidos cinámicos naturales son trans. En general la formación de cumarinas en plantas superiores, ocurre en forma radicalaria, por acción de enzimas del tipo peroxidasas. En el caso de las furanocumarinas se admite una biogénesis de estas cumarinas mediada por una ciclización de una cumarina simple previamente prenilada, tal como se muestra en el siguiente esquema: Biogénesis de furanocumarinas – detalle del proceso

Las cumarinas como tales probablemente no existen libres en forma natural. Sin embargo

cuando se produce un daño en las hojas es fácilmente formada a partir del ácido trans-Oglicosil cinámico, un componente relativamente frecuente en las hojas frescas. Al parecer el daño permite el acceso de las enzimas que remueven la glucosa y producen la isomerización cistrans seguida del cierre del anillo. Estas reacciones con la resultante formación de cumarina volátil son la causa del aroma característico del heno recién cortado. Propiedades farmacológicas de las cumarinas Las cumarinas son una clase de metabolitos secundarios de las plantas y productos microbianos que muestran un amplio rango de efectos fisiológicos en animales. El miembro menos complejo es conocido como cumarina simple la cual es toxica para mamiferos y la ultima de la escala es una cumarina altamente substituida, la noboviocina, que es un antibiotico comercial. Otra cumarina microbiana es la aflatoxina elaborada por Aspergillus flavus, esta es una potente hepatotoxina y es carcinogénica. El interés farmacéutico de las cumarinas se debe a que actúan como tónicos venosos y agentes vasculares protectores. Melilotus officinalis (Fabaceae) se usa en medicina tradicional para tratar desordenes circulatorios. En hojas jóvenes de Melilotus officinalis se encuentran melilotosidos, glucósidos del ácido 2-hidroxicinámico que por hidrólisis se lactonizan para formar cumarinas. Cuando se producen contaminaciones fúngicas (Aspergillus spp. y Penicillum spp.), el Melilotus officinalis elabora fitoalexinas (pterocarpanos y 3- fenil cromanos) y ácido ohidroxicinámico que puede ser metabolizado para formar un anticoagulante: dicumarol. Este compuesto inhibe la síntesis de protrombina y tromboplastina, factores involucrados en la formación de coágulos. Los farmacologos y fitoquímicos tienen especial interes en las furanocumarinas o piranocumarinas. Una de ellas las xantoxinas son venenos para los pescados. Las furanocumarinas naturales como el psoraleno y la xantoxina en contacto con la piel y exposición al sol (UV cercano) pueden causar dermatitis aguda por su fotoxicidad, incrementandose esta por la humedad. Pueden provocar vesículas, ampollas e hiperpigmentación de la zona afectada. Los constituyentes fototóxicos son las furanocumarinas psoraleno, bergapteno (5metoxipsoraleno) y 8-metoxipsoraleno (xantotoxina). Las furanocumarinas pueden provocar cicloadiciones en 3,4 o en 4’, 5’ o en ambas en las bases pirimidicas del DNA. En algunos casos pueden provocar entrecruzamiento entre los pares de bases del DNA e inducir lesiones en el genoma. Estas propiedades explican sus propiedades carcinogénicas y mutagénicas. Formación de aductos entre furanocumarinas y timina – detalle del proceso

Se utilizan en cosmetología, productos naturales como el aceite bergamat, están autorizados como sensibilizantes fotodinámicos en lociones solares. Aumentan el numero de melanocitos y aumentan la producción de melanina y por lo tanto la protección UV

Taninos A mediados del siglo XX se los definió como metabolitos de plantas superiores, que se distinguen de los compuestos fenólicos simples por las siguientes características: • • •

Son solubles en agua. Su masa molecular está entre 500-3.000/4.000 unidades de masa atómica (u.m.a.), incluyendo moléculas que contienen 12-16 grupos fenólicos y 5-6 anillos aromáticos. Son capaces de interaccionar con otras moléculas formando complejos. Forman precipitados con alcaloides, gelatina y otras proteínas en solución (ej.: albúmina).

El advenimiento de nuevos métodos y análisis llevaron a conocer con más detalles las estructuras de estos compuestos, y así los estudios se extendieron hacia la comprensión de la relación estructura-actividad biológica, permitiendo en la actualidad una definición más amplia: Son metabolitos secundarios ampliamente distribuidos en varios sectores del reino de las plantas superiores, con las siguientes características: a) Solubilidad en agua: en estado puro pueden ser difícilmente solubles en agua. En estado natural existen interacciones polifenol-polifenol que aseguran la solubilidad necesaria en medio acuoso. b) Masa molecular: desde 500-4000, tales metabolitos conservan la propiedad de actuar como taninos, pueden alcanzar valores de masa de hasta 20.000 (no cumplirían con la condición de solubilidad). c) Estructura y carácter polifenólico: fenólicos y 5-7 anillos aromáticos.

para 1000

u.m.a. poseen entre 12 y 16 grupos

d) Complejación intermolecular: además de dar las reacciones fenólicas típicas, tienen la capacidad de precipitar alcaloides, gelatina y otras proteínas en solución. Estas reacciones de complejación son interés científico intrínseco en estudios de reconocimiento molecular y como base de posibles funciones biológicas. Se clasifican estructuralmente en dos grandes grupos:  Taninos condensados  Taninos hidrolizables

Taninos Condensados: están compuestos por el núcleo catequina (flavan 3-ol). Se denominan Proantocianidinas, los oligómeros de 2-5 unidades catequina son solubles, los polímeros constituídos por mayor número de núcleos son insolubles. Los enlaces interflavano se dan ent re entre C4 y C8 y menos frecuentemente entre C4 y C6. Este grupo de compuestos es de biogénesis mixta (ruta del ácido shiquimico – acetato malonato) por lo que lo veremos en el tema flavonoides.

Unidad o núcleo flavan 3-ol (catequina)

Formato general de un tanino condensado

Taninos Hidrolizables : son ésteres del ácido gálico o de su dímero el ácido elagico. Tienen en su estructura una molécula de azúcar, normalmente glucosa, a la que se unen varias moléculas de uno de los ácidos fenólicos. La estructura más simple de este grupo es el del pentagaloil - glucosa.

Ácido gálico

Ácido elágico

Biosíntesis de galotaninos – detalle del proceso

4-galoiltransferasa

βG: β-glucogalin (donante específico de grupos galoil) Biosíntesis de elagitaninos – detalle del proceso

Los taninos hidrolizables son poco importantes en musgos, hepaticas, helechos, gimnospermas y monocotiledóneas. En ellas se encuentran las proantocianidinas. Los taninos hidrolizables se encuentran en dicotiledoneas donde se acumulan en concentraciones que permiten su uso en la industria del curtido. La misma propiedad que propicia su uso en el curtido: enlazar moléculas de proteinas haciendola mas resistente al ataque microbiano, está relacionada con su aparente función en las plantas como protector contra el ataque de herbívoros e insectos. La lesión en los tejidos libera los taninos de las vacuolas, que se unen a las proteínas impidiendo su degradación. El sabor astringente de algunos frutos es debido al elevado contenido en taninos, que se reduce durante la maduración. Propiedades Biológicas de los taninos: Están ligadas a su capacidad de formar complejos con macromoleculas particularmente con proteínas (proteínas digestivas, enzimas fúngicas o virales). Esto explica los problemas que ellos causan en tecnología alimentaria (nubosidad de la cerveza) o en agricultura (formación del ácido húmico que resta valor nutricional a la soja). Complejamiento reversible: en condiciones no-oxidantes, a un pH fisiológico, el complejamiento (por puentes hidrógeno e interacciones hidrofobicas) es reversible. El mecanismo de este complejamiento parece ser un fenómeno de superficie no- especifico. Los taninos forman sobre la superficie de las proteínas una capa que es menos hidrofílica que la proteína misma y causa precipitación. La afinidad de los taninos por las proteínas aumenta con el número de residuos prolina y con la flexibilidad de la conformación de las proteínas. Esta afinidad es altamente dependiente del peso molecular del tanino y es máxima para el pentagaloilglucosa y su oligomero. La formación de ligamientos bifenilos disminuye la libre conformación de la molécula y disminuye su afinidad por las proteínas. Por ello las proantocianidinas tienen menor afinidad por las proteínas que los esteres poligaloil. Complejamiento irreversible: por oxidación espontánea de los polifenoles dan o-quinonas que reaccionan con grupos nucleofílicos de las proteínas para formar uniones covalentes irreversibles (en el caso de las proantocianidinas en condiciones acidicas). Aplicaciones de los taninos 1- Por su afinidad con las proteínas son usados como antidiarreicos. 2- Externamente sobre la piel y mucosas para protegerlas, tienen efecto vasoconstrictor sobre vasos superficiales pequeñas. 3- Previenen las agresiones externas e incrementan la regeneración en lesiones superficiales. 4- Antisepticos , antibacterianos , antifúngicos 5- Depuradores de radicales libres e inhibidores de la formación de superoxidos. 6- Inhibidores enzimáticos: de la 5-lipooxigenasa, d e l a E C A ( enzima convertidos de la angiotensina), Protein Kinasa C. 7- Disminuye la permeabilidad y fragilidad capilar. 8- Aumentan el tono muscular y estabilizan el colágeno (inhiben a la elastasa).