Bolilla IV Elementos móviles
Elementos móviles a ADN y ARN. Transposones en procariotas: secuencias de inserción repetidos directos e invertidos. Mecanismo replicativo: cointegrado transposas y resolvasa. Familia A de transposones : Tn 10. Mecanismo no replicativo conservativo inversión duplicativa escisión precisa e imprecisa. Transposones en eucariotas: elemento P en Drosophila; elementos de control en el maíz. Retrotransposones virales. Retrotransposones no virales secuencias LTR elementos LINE y SINE
1
Elementos Transponibles
Elementos genéticos se mueven hacia sitios cromosómico nuevos por transposición Sec. Rep. de 3-12 pb Recombinación entre las molécula de ADN Rep. Terminales invertidas (9-40pb) Escasa selectividad por el sitio de inserción Enzima necesaria para la transposición
2
En la misma cadena las dos secuencias no son inversiones simples Son invertidas como complementarias La enzima que cataliza la transposición reconoce repeticiones termiales invertidas
3
RECOMBINACIÓN
La información genética se ve redistribuida, tras la transferencia.
La recombinación suministrando una fuente de variación y selección para la evolución
Más rápida que la mutación.
Transposición
Corte escalonado del ADN
Se une a la cadena simple
ADN se replica
4
Mecanismos de transposición
Por ADN
POR ARN intermediario (Retro-transposón)
5
Los transposones pueden sufrir transposiciones Replicativas No
Replicativas
Replicativas
6
7
La transposición no replicativa
El evento de transposición es de corte y pegado (una Transposasa únicamente) Genera sitios nocivos para la célula por lo que actúa el mecanismo de reparación de la célula Eso evita el aumento del número de copia en ella Se replica secuencias cortas (repeticiones directas flanqueantes)
Efecto mutagénico
La célula desarrolla mecanismos de regulación de la transposición Limitando
producción de transposasa
Regulando
la trascripción del gen
8
Los elementos transponibles producen mutaciones y reordenaminetos Muchos regulan su propia transposición Fig.
9
TIPOS DE ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES EN BACTERIAS:
Secuencias de inserción (IS):
Pequeños (1000 pb o -), en sus extremos (IR), de 15 a 25 pb. Gen codifica la transposasa.
En los genomas de muchas bacterias existen varias copias de cada tipo de IS. En Escherichia coli K12 existen unas 6 copias de IS1, 7 de IS2, etc. Los plásmidos conjugativos ricos en IS.
10
La frecuencia de transposición varía según el tipo de IS ( 10-3 y 10-4).
La inserción de IS en un gen concreto ocurre a una frecuencia de 10-5 y 10-7 (similar a mutaciones espontáneas puntuales).
Estructura de los elementos transponibles
IS (800-2000 pb) Rep terminales invertidas Repeticiones directas flanqueantes
11
El elemento transponible codifica una enzima (transposasas) que reconoce secuencias específicas inversamente repetidas en los extremos.
Muchos elementos transponible: poseen un mecanismo replicativo de transposición: dejan una copia de sí mismos en el sitio original, y generan una copia nueva en el sitio a donde se transponen (recombinación específica duplicativa).
12
Transposones (Tn): 3.000 pb hasta más de 20.000 pb La transposasa mas un gen ( fenotipos fácilmente seleccionables o detectables) ( resistencia a antibióticos o a metales pesados).
Dentro de los transposones bacterianos podemos distinguir dos subtipos principales:
Transposones compuestos, extremos secuencias de inserción idénticas o casi idénticas.
Algunos poseen las dos copias de IS en la misma orientación, (u opuestas)
IS poseen cortos terminales inversamente repetidos (IR). La transposición depende de una o de ambas copias de la IS.
13
Transposones compuestos
Dos copias de IS
Resistencia a antibióticos
14
Ejemplos:
Tn10: dos IS10 casi idénticas, que “emparedan” a un gen de resistencia a la tetraciclina (TetR).
Tn5: dos IS50 casi idénticas que “emparedan” un gen de resistencia a kanamicina (KmR) y un gen de resistencia a la estreptomicina (StrR).
Tn9: dos copias idénticas y en la misma orientación de la IS1, enmarcando a un gen de resistencia a cloramfenicol (CmR).
Transposones no compuestos:
carecen de IS
dos secuencias inversamente repetidas (IR).
transposasa, y a veces la resolvasa Suelen dar sólo transposiciones.
15
Los cointegrados se “resuelven” por una resolvasa codificada por el mismo transposón.
Existen “familias” que presentan un origen evolutivo común: familia de TnA, que incluye Tn1 (AmpR), Tn3 (AmpR), Tn1000, etc.
Los miembros de una misma familia comparten el mismo tipo de sistema de transposa/resolvasa, pero cada miembro puede contener genes de resistencia totalmente diferentes (adquiridos independientemente por la evolución).
Una clave de cómo han podido adquirirlos la da una categoría especial de transposones, llamada integrones.
Tn3 transposón no compuesto (no IS)
Rep terminales invertidas de 38 pb
Rep dir flanqueantes de 5 pb Tiene gen de Transposasa y resolvasa Betalactamasa (rest. ampicilinas)
16
Integrones (In):
Elementos transponibles terminales inversamente repetidos (resistencia a antibióticos o a metales pesados) poseen una integrasa.
Se transponen como una IS o Tn, la integrasa (recombinación específica de sitio)
Pueden formar parte de transposones mayores (ej., el Tn21 es un gran transposón que codifica múltiples resistencias a antibióticos, y dentro de él se encuentra el integrón In2, que contiene su propio gen int (integrasa)
17
Tipos principales de recombinación:
1)
2) Recombinación específica (no-homóloga), en la que a su vez distinguimos:
Recombinación general u homóloga
a)
conservativa;
b) Rec. específica “ilegítima”, propiciada por elementos genéticos transponibles.
Recombinación general u homóloga
Ocurre en cualquier lugar del genoma, por emparejamiento entre pares de secuencias con homología suficientemente extensa.
Depende de la intervención de un equipo enzimático característico( proteína RecA) .
18
Recombinació Recombinación especí específica legí legítima (conservativa)
Requiere cortas secuencias de homologí homología entre el exogenote y el endogenote “especí específica de sitio” sitio”(reconocidas por proteí proteínas especí específicas).
Independiente de RecA. RecA.
Ej. integració integración de genomas de fagos en sitios concretos del genoma del hospedador.
Recombinación específica ilegítima: fenómenos de transposición
No depende de homologías.
Independiente de RecA.
19
REGULACION DE LA TRANSPOSICION Y POSIBLE SIGNIFICADO EVOLUTIVO
Muchos transposones, no pueden insertarse de nuevo en ese mismo replicó replicón, sino que han de hacerlo en otra molé molécula de ADN.
Se debe a que poseen mecanismos que impiden que sature de inserciones una misma molé molécula de ADN. Ejemplos:
La proteí proteína codificada por el gen tnpR del Tn3, Tn3, ademá además de actuar como resolvasa, resolvasa, interviene como represor del gen tnpR (codifica la resolvasa), resolvasa), y de su propio gen.
Tn10, só sólo se transponen inmediatamente despué después de que haya pasado por ellos la horquilla de replicació replicación. (ADN hemimetilado), hemimetilado), activa el promotor de su transposasa así así como a sus terminales.
20
Si los transposones podrían llegar a “saturar” de sus copias al genoma del “hospedador”(inactivarlo).
La “solución de compromiso” entre la tendencia del transposón de “moverse” ilimitadamente ( inactivación insercional de numerosos genes), y la necesidad de conservar la integridad de las funciones de la bacteria.
Existen mecanismos que limitan el número de inserciones de un mismo elemento transponible dentro de un determinado replicón.
CONSECUENCIAS GENÉTICAS DE LA TRANSPOSICION
21
Causan alteraciones genéticas que pueden a su vez ser fuente de variabilidad genética sobre la que pueden actuar las fuerzas selectivas del ambiente, “alimentar” los procesos evolutivos.
Algunas de las alteraciones genéticas propiciadas por elementos genéticos móviles:
1) Inactivación insercional de un gen donde se hayan transpuesto: rompen la continuidad del gen, generando mutaciones que inactivan la función de dicho gen. En operón policistrónico, efectos polares sobre la transcripción de los genes distales del operón, ( zonas susceptibles de generar horquillas en el ARNm que actúan como terminadores de transcripción )
22
Nomenclatura si una copia de IS1 se ha insertado en el gen lacZ, esto se representa como IS1::lacZ.
2) Secuencias IS (p. ej., IS2, IS3), o transposones (Tn5 y Tn10) en una de sus orientaciones, pueden activar la expresión de genes adyacentes al sitio de integración. (potentes promotores).
3) Algunos tn e IS sufren escisiones anómalas que “arrastran” consigo material genético adyacente. Provoca grandes delecciones en los replicones donde previamente se habían insertado.
4) Los Tn e IS pueden actuar como regiones portátiles de homología: a)
Dos transposones idénticos, situados en lugares diferentes del cromosoma, pueden recombinarse por medio de la enzima RecA de la recombinación general, dando lugar a inversiones del material intercalado.
23
b)
fusión de replicones. base de la producción de cepas Hfr (mismo acontecimiento de integración) a partir de las cepas F+: (conjugación), tanto el plásmido F como el cromosoma poseen copias de determinadas IS; lo cual lleva a la fusión del plásmido F con el cromosoma bacteriano.
5) Producción evolutiva de transposones complejos a partir de IS o de transposones más sencillos. transposón (resitencia a ATB)
ELEMETOS TRANSPONIBLES EN EUCARIOTAS
24
Elementos TY de levadura
Familia de secuencias dispersas de ADN repetidos (distintas cepas de levaduras) 30 Copias
TY abreviatura “transposon y Yeast”. Longitud de 6.9 KB Las últimas 303 pb son repetidas directas y se llaman delta
Cada suceso de transposición deja huella característica 5pb a cada del elemento del elemento TY en ADN DIANA. (frec. Trans 10-7 o -8)
Se los clasifica en dos clases TY1 y TY 917
Rasgos
Repeticiones delta, Región larga en el extremo izquierdo, Región central, y región corta junto a la delta derecha (los dos tipos de regiones no homologas Tya como también Tyb)
Pueden contener 30 copias de ty tipo 1 y 6 copias del tipo TY 917, además de unos 100 elementos delta independientes (delta solistas)
25
El elemento Ty se transcribe a dos ARN poli A constituye mas del 5% del ARN total de una célula haploide de levadura.
La secuencias del Ty tiene dos pautas abiertas de lecturas en la misma dirección TyA Ty B pero leídas en diferentes fases y solapadas (13 aa)
TYA finaliza en codón de terminación
TYB forma parte de una proteína de fusión
Los elementos TY proporcionas regiones portátiles de homología
La recombinación de elementos TY ocurre en explosiones es decir cuando se detecta uno hay alta probabilidad de encontrar otros (recombinación homologa)
Elementos TY son retro-transposones clásicos, transpones utilizando un ARN intermediario
(sigue los mismo pasos que los retrovirus)
26
Retrotamposones Ty de levaduras Retrotransposones (6300) rep dir flanqueadas rep dir (secuencias delta) de 334 pb Con promotores para la transcripción de los genes
TyA codifica enzimas
TyB relacionados a genes gag (pro. De la capside viral) y pol (prot. Integrasa y trans inversa) presente en retrovirus
27
ELEMETOS TRANSPONIBLES EN EL MAIZ
ELEMENTOS Ac y Ds en Maíz Los granos de maíz presentan pigmentación completa o incolora Otros pueden tener manchas
28
Digenesia del maíz
Causado por gen que puede trasladarse y producir la “ruptura cromosomal” y se denomina Ds (Disociación) pero solamente en presencia del Ac (Activador)
Ac 4500 pb Rep terminales invertidas de 11 pb Rep terminales directas de 8 pb
29
C confiere el color
c no confiere el color
cc incoloro
CC o Cc da color
30
31
El elemento Ds recibe influencia de AC se produce la transposició transposición y se inserta en C (no produce color)
32
Drosophila
Alrededor del 10% del genoma de Drosophila podría estar compuesto de secuencias de ADN repetitivas que se mueven como elementos discretos.
Se han caracterizado tres tipos de transposones:
elementos P
copia-like
FB
Elementos P
En Drosophila, los transposones más intrigantes y útiles para los genetistas son los elementos P, 2000 pb Transposones de ADN Descubiertos como resultado del estudio de la DISGÉNESIS HÍBRIDA, cuando hembras de laboratorio son cruzadas con machos de poblaciones naturales. Las hembras tienen un citotipo M (sin transposasa ni su receptor), y los machos un citotipo P (con transposasa y su respectivo receptor).
33
Machos P+ (con elemento P) x Hembras P-= progenie estériles
Machos P- (con elemento P) x Hembras P+ = progenie normales
El elemento P es un represor citoplasmá citoplasmático que inhibe la transposició transposición
34
Retrotransposones no virales
35
Región terminal repetida larga (LTR) del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana funciona como un sitio de control y regulación de la transcripción viral.
LTR no codifica proteínas estructurales o accesorias
Función esta íntimamente relacionada a la replicación viral en respuestas a
Mitogenos (factores que actúan en el ciclo celular estimulando la división celular )
Citocinas (mecanismo de la inflamación )
O estímulos generados por agentes infecciosos oportunistas
36
Los retroretro-transposones presentan largas repeticiones terminales (LTRs: LTRs: Long Terminal Repeats) Repeats) de hasta 1000 pares de bases cada una.
Suponen el 50% del genoma humano. Existen dos grandes grupos de retrotransposones en humanos: las secuencias LINE (Long Interpersed Nuclear Elements) Elements) Elementos nucleares dispersos largos
SINE (Short Interpersed Nuclear Elements) Elements) Elementos nucleares dispersos cortos .
Las secuencias SINE son otro tipo de retrotransposones de secuencia secuencia más corta (de unas 200 a 400 pares de bases).
Los elementos SINE son transcriptos por la ARN polimerasa III y en el genoma humano representan el 11% del genoma. genoma. Producen mutaciones
37
Elementos de ADN largos dispersos (elementos LINE) codifican proteínas activas en sus propios procesos de transposición y que presentan actividad enzimática RNasa H.
Puede aplicarse en cualquier técnica biotecnológica que requiera una enzima con actividad RNasa (generación de genotecas de cADN, ensayos de protección de ARN, inhibición de la expresión de proteínas específicas, blanco de acción de fármacos).
LINEs
Estos elementos se caracterizan por ser movilizados vía un ARN intermediario, y agrupan a elementos tipo retrotransposones.
Los elementos LINEs son considerados autónomos, transposición.
Implicación en procesos biológicos relevantes, como regulación génica, modelaje y plasticidad genómica, y fenómenos de translocación de ADN.
38
Directa relación entre la retro-transposición de elementos LINE y el origen de ciertas enfermedades, especialmente con la generación y progresión de ciertos tumores.
Los elementos móviles LINE carentes de secuencias LTR, utilizan un mecanismo de retro-transposición donde el inicio de la transcripción inversa tiene lugar in situ en el cromosoma
Para la síntesis de la segunda hebra de ADN, el ARN ha de ser eliminado del híbrido RNA/cDNA, hidrólisis que requiere de una actividad enzimática RNasa H la cual, (no ha sido identificada en los elementos LINE)
Por lo tanto es aportada por la célula hospedadora.
39
MUCHAS GRACIAS
40
