Maestría en Micología Médica UNNE MODULO II
Técnicas inmunológicas de diagnóstico y seguimiento Dra. Alicia Arechavala Jefa Unidad Micología Hospital Muñiz – Buenos Aires
Diagnóstico inmunológico Detección de anticuerpos específicos Detección de antígenos, metabolitos, componentes de pared celular de los hongos en distintas muestras mediante técnicas inmunológicas.
Anticuerpos en inmunidad frente a los hongos Funciones • Evitar adherencia • Neutralizar toxinas • Opsonización • Citotoxicidad mediada por Ac
Acción protectora? • No susceptibilidad en déficit de Ac • Títulos altos en formas graves • Presencia de Ac protectores y no protectores (en diversas proporciones)
Eficacia protectora depende
• • • •
Cantidad de Ac Especificidad Idiotipo Isotipo
Anticuerpos en inmunidad frente a los hongos INTERDEPENDENCIA Ac-HSP90: recuperación y no diseminación infección por C.a en sida Ac anti idiotipo específico, actividad fungicida
Ac-adhesina de mananos: transfiere protección pasiva anti Ca
Identificación de Ac protectores
Búsqueda de vacunas que estimulen rta rta.. Inmune protectora
Balance Citoquinas TH1/TH2 e inducción TREG
Función T intacta
Protección mediada por Anticuerpos
Cuándo son útiles las técnicas de detección de anticuerpos Diagnóstico de micosis sistémicas endémicas en pacientes que no tienen comprometida su respuesta inmune humoral. En algunas micosis profundas localizadas En infecciones fúngicas ocasionadas por hongos ambientales o de la biota normal en pacientes que no tienen inmunocompromiso grave y pueden producir anticuerpos.
Valor de las pruebas para detección de anticuerpos Pueden ser el primer elemento de diagnóstico (resultados en plazos cortos) Estadio de enfermedad
Capacidad para formar Ac
Resulta dos
Técnica empleada
Tipo y calidad de Ag usado
Valor de las pruebas para detección de anticuerpos Habitualmente se realizan con muestras fáciles de obtener (suero) pero pueden detectarse Ac en otros fluidos orgánicos como LCR o en lavado broncoalveolar Son útiles como parámetro de gravedad (títulos altos), sirven para el seguimiento (disminución de títulos), permiten reafirmar un diagnóstico microbiológico cuando el hongo es ambiental o de flora normal (aspergilosis intracavitarias)
¿En qué micosis las utilizamos?
Paracoccidioidomicosis Histoplasmosis Coccidioidomicosis Aspergilosis (A.fumigatus (A.fumigatus,, A.flavus A.flavus,, A.niger,, A. terreus A.niger terreus)) Candidiasis (sólo en algunas formas clínicas) Esporotricosis
Técnicas de detección de anticuerpos
Inmunodifusión (Ouchterlony) Contrainmunoelectroforesis Prueba de fijación de complemento ELISA WB (técnica no estandarizada)
Pruebas de aglutinación directa, precipitación en tubo, etc. (formas agudas)
Utilidad de las distintas pruebas Micosis sistémicas endémicas Valor diagnóstico: diagnóstico: puede ser el primer elemento antes del hallazgo del agente causal Seguimiento Seguimiento:: El descenso de los títulos serológicos coincide con la mejoría clínica (curvas serológicas)
Inmunodifusión Huésped inmunocompetente Diagnóstico de histoplasmosis clásica, paracoccidioidomicosis, coccidioidomicosis, aspergilosis broncopulmonares, candidiasis diseminadas Simple, rápida, sensibilidad adecuada como prueba tamiz, buena especificidad con antígenos controlados. (99% E)
Contrainmunoelectroforesis Mejora la sensibilidad de la inmunodifusión Formas localizadas, lesiones mínimas
Brinda resultados más rápidos Combinada con la inmunodifusión secundaria permite la detección de anticuerpos contra distintas parcelas antigénicas con movilidad anódica o catódica. Tiene muy buena especificidad Histoplasmosis laríngea, en HIV, ABPA, Esporotricosis
Métodos empleados Prueba de fijación de complemento Más sensible que ID ≅ 25% reacciones cruzadas. Útil en el seguimiento de MSE Mejor cuantificación Resultados a las 24 h Se usa poco Más engorrosa
ELISA
Tiene mayor sensibilidad Requiere muy buena estandarización No hay muchos equipos comerciales en el país Tiene mayor porcentaje de reacciones cruzadas Puede servir para reemplazar a la FC Brinda resultados cuantitativos o semicuantitativos o cualitativos Brinda resultados en pocas horas Puede utilizarse para detección de anticuerpos o de antígenos.
Diagnóstico de paracoccidioidomicosis Inmunodifusión gran sensibilidad y especificidad. Exoantígeno (Ag7 ) No reemplaza al hallazgo del hongo en los tejidos Otra alternativa es el ELISA Especificidad y sensibilidad dependen del tipo de antígeno y la prueba usada. Algunos antígenos crudos pueden dar reacciones cruzadas .ZP Camargo
Resultados Inmunodifusión: Formas graves: 1:161:16-1:32 Formas intermedias: 1:4 – 1:16 Formas leves: s. puro –1:4
Fijación de complemento Graves: 1:512 Intermedias: : 1:128 Leves: 1:64
Diagnóstico de histoplasmosis Formas clásicas
ID: 1:8 ID: PFC:: 1:64 PFC CIE:: 1CIE 1-4 bandas ELISA no mejora resultados WB WB** en forma pulmonar aguda 90% S y 100% E *Antígeno Antígeno deglicosilado
En inmunocomprometidos
ID: 25 25--30% CIE:: 35CIE 35-40% PFC:: 30PFC 30-40% ELISA para anticuerpos (artesanal): 65%** ELISA para antígeno galactomanano en orina ** En pacientes con SIDA
Relación entre pruebas cutáneas y serológicas según gravedad de micosis Título Ac
> TH2 (γINF IL-4, IL-5, Eo, IgE, IgG4, IgA)
P.cutáneas DTH
Gravedad
< TH1, IL-12
Aspergilosis pulmonares (formas no invasoras) Precipitación en medios gelosados • Formas intracavitarias (pulmonar crónica): > 90% • Forma broncopulmonar alérgica ≅ 70% • Forma pulmonar necrotizante (semi invasora) y endocarditis: suelen ser positivas. Gran especificidad, no hay reacciones cruzadas entre las distintas especies de Aspergillus
Hipersensibilidad Inmediata Aspergilosis broncopulmonar alérgica Alergias inhalatorias a hongos ambientales
Semidemorada Aspergilosis broncopulmonar alérgica Alveolítis alérgicas extrínsecas por hongos atmosféricos
Retardada Micosis sistémicas endémicas, dermatoficias, dermatoficias, candidiasis, esporotricosis, esporotricosis, cromoblastomicosis cromoblastomicosis,, aspergilosis semisemi-invasora
Pruebas de hipersensibilidad retardada
Huéspedes inmunocomprometidos Infecciones fúngicas invasoras (IFI) Infecciones de más difícil diagnóstico son: candidiasis y aspergilosis Tasa de mortalidad ≈ 50% en Ca 80% en Asp Histopatología y cultivos requieren de técnicas invasoras Cultivos demandan más tiempo y son negativos en 50% de casos Diagnóstico por métodos no basados en cultivo
Huéspedes inmunocomprometidos Infecciones fúngicas invasoras (IFI) Dificultades en el diagnóstico inmunológico Pobre capacidad para formar anticuerpos Requieren técnicas sensibles y específicas Pobres resultados con las pruebas serológicas convencionales Detección de antígenos o metabolitos circulantes Detección de componentes pared celular Detección de ADN.
Detección de antígenos o componentes de pared
β-glucano Antígeno galactomanano de Aspergillus. Antígeno galactomanano de Histoplasma Antígeno manano de Candida Antígeno polisacárido capsular de Cryptococcus
Galactomanano de Aspergillus GM Polisacárido específico de la pared celular de Aspergillus Principal exoantígeno liberado en angioinvasión Detectable en suero, orina, LBA, LCR, LP, Líq. Pericárdico Método: ELISA doble sandwich con MAb EBEB-A2 (captor y detector). (Platelia, (Platelia, BioRad) BioRad) Resultado 4 horas. Requiere romper CI, límite de detección 0,50,5-1 ng/ml. Punto de corte recomendado = Índice ≥ 0,5
Detección de GM Utilidad Neutropénicos adultos 90% Varios equipos comerciales ELISA. Muy alta sensibilidad y especificidad Inmunocromatografía Utilidad para pruebas cualitativas Titulación de Ag útil para seguimiento.
Detección de anticuerpos en inmunocomprometidos por ELISA.
Muchas reacciones cruzadas
Niveles de antígeno en suero y LCR Antigenemia Alto (> (> 1:5000) 47,2%
• Intermedio (1:100 – 1:1000) 39,4%
• Bajo (< (< 1:10) 10,7%
Antigenorraquia Alto 19,6%
• Intermedio 55,0%
• Bajo 20,8 %
Seguimiento de la criptococosis 5000 4500 4000 3500
Antigenemia
3000 2500
Antigenorraquia
2000 1500 1000 500
a
96
30 31
a 25
21
a
24
20 a
17
a 13
a 10
16
12
9 a 8
6
a
7
5 a 4
2
a
3
m 1
ci
al
0
In i
Título de antígeno
Curvas de antigenemia y antigenorraquia
Tiempo
Muchas gracias
