Resolución de Problemas en HPLC:Troubleshooting HPLC ... - Agilent
Fugas, conexiones. 4.8%. %. Rango de pH. 2.0%. Bajo numero de platos. 2.0%. Saturación de la columna. 2 0%. Saturación de la columna. 2.0%. Cost. 1.7%.
Consejos para el mantenimiento de su equipo de HPLC
Resolución de Problemas en HPLC:Troubleshooting Técnicas, Consejos , y Trucos
Agilent Technologies
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Pasos en la Resolución de Problemas Una vez que has detectado que hay un problema! ¿Cómo lo solucionas? •1st ¿Falló el sistema o la calibración de la muestra? Hacer Blancos •2 2ndd Revisar R i ell cumplimiento li i del d l método é d – ¿ Se ha seguido el procedimiento adecuadamente? – ¿ Son correctos los parámetros en el instrumento?
•3rd Hágase más preguntas! – ¿Cuándo funcionó correctamente el sistema por última vez? – ¿ Se ha cambiado alguna cosa?
•4th Revise TODOS los parámetros! – Lo obvio no es siempre la causa –¿ ¿Hubo más de un cambio? Page 2
Componentes del Sistema HPLC Bomba Inyector yecto /Automuestreador / uto uest eado Columna Detector Sistema de datos/Integrador
Los p problemas p pueden estar relacionados con todos los componentes del sistema
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Encuesta a usuarios en LC-GC sobre Problemas de Columnas Column Problem
Percentage of Respondents
Alta presión, fritas obstruidas
24%
Pobre reproducibilidad (formas de pico, retención)
16%
Recuperación de muestra
14%
Perdida de resolución
13%
Inestabilidad
11%
Volumenes muertos
8.1%
Fugas, conexiones
4.8%
Rango de pH
2.0% %
Bajo numero de platos
2.0%
Saturación de la columna
2 0% 2.0%
Cost
1.7%
Miscellaneous
15% Page 4
Tipos de problemas del Sistema y la Columna
A. Presión B. Forma del Pico C. Retención
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Problemas de Presión Sintomas de la columna
Posibles causas
Alta
- Frita obstruida - Contaminación de la
columna - Obstrucción en el empaquetamiento Baja presión
- Fuga - Flujo incorrecto
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Corrección de la sobrepresión Determinación de la causa y corrección de una presión alta Muchos problemas de presión están relacionados con obstrucciones en el sistema sistema. Comprobar la presión del sistema con y sin columna. Si la presión con columna es alta: • Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro) • Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte)
•
Lavar la columna Eliminar la contaminación en la column y limpiar el empaquetado bloqueado Retirar compuestos adsorbidos de alto peso molecular Limpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampón
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Obstrucción del empaquetado Tamaño de partícula
Area (um2)
5.0
2.7
0.9
2.0
3.5
1.3
0.6
2.0
30 3.0
10 1.0
06 0.6
20 2.0
2.7
0.7
0.5
2.0
1.8
04 0.4
0.4
05 0.5
1.7
0.3
0.3
0.5
Diam intersticial Porosidad de medio (um) la frita(um)
Cuidado C id d con las l fases f móviles ó il tamponadas t d Los tampones contienen material insoluble– filtrar La solubilidad del tampón decrece con el aumento del % de orgánico* - evitar 100%B con tampones salinos *Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004) Page 8
Solubilidad del tampón
La a Tabla ab a I p presenta ese ta u una a est estimación ac ó de la a co concentration ce t at o soluble del tampón menos soluble (fosfato potásico a pH 7.0) en tres solventes orgánicos Page 9
Solubilidad de 5 tampones en mezclas con (a) metanol metanol, (b) acetonitrilo acetonitrilo, y (c) tetrahidrofurano
metanol acetonitrilo
THF
El trazo — representa acetato amónico a pH 5.0, •••• representa fosfato amónico a pH 3 3.0, 0 --- representa fosfato potásico a pH 3 3.0, 0 –••– representa fosfato amónico a pH 7.0, y – – representa fosfato potásico a pH 7.0.
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Cambiar la frita puede no ser buena idea Puede que no sea posible con columnas de nueva generación Puede dañar columnas de alto rendimiento Column Inlet Frit
Compression Ferrule Wear gloves Do not allow bed to dry y Do not touch the column body heat will extrude packing
Column Body
Do not overtighten
Female End Fitting Male End Fitting g
Consejo: Prevenir es mucho mejor! Page 11
El Truco: Tecnicas de Prevención- La mejor elección! • Usar protección de la columna - Filtros en linea - Salva columnas
Fácil
• Filtrar las muestras • Filtrar fases móviles tamponadas • Extracción de la muestra(i.e. SPE) • Lavado apropiado de la columna
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No tan fácil
Limpieza de la columna Limpiar con solventes más fuertes que la fase móvil Opciones de Solventes de Fase Reversa en orden de fuerza creciente
Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analíticas
Esto lleva tiempo, amenudo se realiza Offline
• Fase Móvil sin sales de tampón p • 100% Metanol • 100% Acetonitrilo • 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol • 100% Isopropanol • 100% Cloruro de Metileno* • 100% Hexano* Hexano
Debe revertirse para Re-Equilibrar
*Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna con Isopropanol antes de volver a la fase móvil de fase reversa. reversa Page 13
Li i Limpieza de d lla columna– l f fase normall Use al menos 50mL o 20−30 20 30 volumenes de columna para las columnas analíticas • Opciones típicas de solventes en Fase Normal en orden de fuerza creciente:
Solvent
Composition
Methanol:Chloroform
50:50%
Ethyl Acetate
100%
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¿Cuáles son los problemas más comunes de la forma de pico?
1) Si la dieta consta de G gramos de alimento por día, está restringida a ... A ingerida debe ser doble en peso que la de C, hallar en función de G las cantidades.
ptas./kg. Desea hacer una mezcla con los tres tipos de café para suministrar un pedido de 1050 kg. a un precio de 940 ptas./kg. ¿Cuántos kilogramos de cada tipo de café debe mezclar sabiendo que debe poner del tercer tipo el doble de lo que ponga del
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