O USO DE BANCO DE PERFIS GENÉTICOS DE VESTÍGIOS DE CRIMES SEXUAIS EM INVESTIGAÇÕES CRIMINAIS: UMA EXPERIÊNCIA BEM SUCEDIDA NO BRASIL Samuel T. G. Ferreira Instituto de Pesquisa de DNA Forense, IPDNA, Polícia Civil do Distrito Federal, Brasília, Brasil Secretaria Nacional de Segurança Pública do Ministério da Justiça, Senasp/MJ, Brasília, Brasil O uso de bancos de perfis genéticos em investigações criminais tem se tornado cada vez mais importante. Em crimes sexuais, bancos de perfis genéticos de vestígios biológicos coletados de vítimas e de suas roupas podem desempenhar um papel fundamental nas investigações criminais e identificações de agressores. Particularmente, em países onde não existe legislação relativa a bancos de perfis genéticos de suspeitos ou de condenados, bancos de perfis genéticos de vestígios de crimes sexuais podem ser decisivos nas investigações. No Brasil, até 2012 e 2013 não havia legislação relativa a bancos de perfis genéticos de suspeitos ou de condenados. Como não havia legislação em relação a este tema e devido à necessidade de solucionar crimes sexuais, principalmente nos casos em que não havia suspeitos dos crimes, o Instituto de Pesquisa de DNA Forense, IPDNA, da Polícia Civil do Distrito Federal em Brasília criou em 1998 o primeiro banco de perfis genéticos de vestígios de crimes sexuais no Brasil com o objetivo de auxiliar este tipo de investigação criminal. A utilização deste banco de perfis genéticos tornou-se uma experiência muito bem sucedida nas investigações de crimes sexuais, solucionando diversos casos e identificando os agressores. Peritos forenses do Instituto de Pesquisa de DNA Forense, IPDNA, utilizando um banco de perfis genéticos de vestígios de crimes sexuais, trabalhando em conjunto com autoridades e investigadores da Polícia Civil do Distrito Federal, descobriram 70 estupradores em série que agrediram 196 mulheres até o mês de agosto de 2014, em Brasília, Brasil. O uso deste banco de perfis genéticos demonstrou ser extremamente útil na identificação de agressores, tornando-se um instrumento fundamental nas investigações de crimes sexuais.

EJERCICIOS INTERLABORATORIALES DE CONTROL DE CALIDAD COMO HERRAMIENTA PARA LA EVALUACION DE LA CONFORMIDAD DE LOS LABORATORIOS Juan José Builes Gómez Laboratorio Genes Ltda Laboratorio Nacional de Referencia e-mail: [email protected]; [email protected] Cada día es más frecuente la utilización de ensayos o pruebas con marcadores de ADN para la resolución de diferentes situaciones que afectan la vida de los individuos, desde casos simples de investigación de la paternidad hasta casos complejos de desastres masivos o identificación de restos óseos en fosas comunes. Para la resolución de estos diferentes retos, los laboratorios deben disponer de las condiciones ideales dependiendo de su énfasis o especialización, dichas condiciones comprenden la normalización de los diferentes procedimientos empleados, los marcadores genéticos apropiados, personal capacitado y entrenado, una apropiada gestión metrológica y el aseguramiento de la calidad de los resultados de los ensayos o pruebas realizadas. La Norma ISO 17025 recomienda que los laboratorios deben tener procedimientos de control de la calidad para realizar el seguimiento a la validez de los ensayos llevados a cabo, registrando los datos resultantes para detectar las tendencias y así poder tomar acciones planificadas cuando estos datos no satisfacen los criterios predefinidos. Existen diversos métodos para llevar a cabo el aseguramiento de la calidad de los ensayos, tales como el uso de materiales de referencia certificados y/o un control de calidad interno con materiales de referencia secundarios, la repetición de ensayos utilizando el mismo método o métodos diferentes, la repetición del ensayo de muestras retenidas, correlación de los resultados para deferentes características de la muestra, la participación en comparaciones interlaboratorios o en programas de ensayos de aptitud, entre otros.

Las Comparaciones Interlaboratorios o los Programas de Ensayos de Aptitud son cada día más utilizadas por los diferentes laboratorios en el mundo, ya sea por decisión voluntaria o como un requisito incluido en las políticas de acreditación de diferentes organismos de acreditación, tales como la Cooperación Internacional de Acreditación de Laboratorios (ILAC), la Cooperación Inter Americana de Acreditación (IAAC), el Organismo Nacional de Acreditación de Colombia (ONAC), entre otros. En Colombia, el Grupo Colombiano de Identificación Humana y Genética Forense desde el año 2001 hasta la fecha ha realizado de forma ininterrumpida Ejercicios de Control de Calidad Interlaboratoriales; a partir del año 2006, con la adopción de las disposiciones contempladas en la Ley 721 de 2001, se ha designado la actividad del diseño y ejecución del Ejercicio Colombiano Control de Calidad Interlaboratorios a un Laboratorio Nacional de Referencia seleccionado entre los laboratorios del país que cumplan los requisitos establecidos. En la actualidad, este ejercicio se realiza anualmente con la participación de un promedio de 25 laboratorios pertenecientes a 8 laboratorios latinoamericanos, permitiendo de esta manera brindar una excelente herramienta para evaluar la calidad de los ensayos de estos laboratorios a la vez que permite a todos los participantes acceder a diferentes programas de capacitación académica en temas de interés en los diferente encuentros realizados para la discusión de los resultados.

Tribunal de Justiça, Ministério Público e Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Brasil: Uma Visão Geral sobre os 18 anos do Programa Estadual para Investigação de Paternidade, Criminal e Identificação por DNA Patrícia M. Domingues, João Marreiro, Cristiane S. Domingues, Sílvia Loiola, Celso C. Tavares, Dayse A. da Silva e Elizeu F. de Carvalho Unidade de Desenvolvimento Tecnológico - Laboratório de Diagnósticos por DNA, Instituto de Biologia, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Brasil. O Programa DNA da Universidade do Estado do Rio de Janeiro foi criado, em 1996, em parceria com o Tribunal de Justiça e o Ministério Público do Estado do Rio de Janeiro, com a finalidade de possibilitar à população do Rio de Janeiro a realização de perícias por DNA com elevadas qualidade e eficiência a um custo inferior ao praticado no mercado brasileiro, uma vez que somente parcela diminuta dos envolvidos em investigações de paternidade, ou de outros vínculos genéticos, podia pagar pelas perícias, o que, face à falta dessa prova técnica de alta relevância, tornava os processos judiciais ainda mais lentos. Tampouco havia no sistema de Segurança Pública do Rio de Janeiro um laboratório que realizasse perícias de DNA, como ocorre nos dias atuais. O Programa DNA não se destina somente à camada da população que faz jus à justiça gratuita e também atende a iniciativa privada. Os esforços conjuntos levaram a realização de cerca de 70 mil perícias de vínculo genético, paternidade em sua maioria, e número superior a 1000 perícias associadas a diversos tipos de crimes, ou à identificação post-mortem, através da aplicação de técnicas de análise do DNA genômico ou do DNA mitocondrial. No simpósio serão apresentados detalhes das rotinas de coleta de amostras biológicas e laboratoriais, bem como casos de investigação criminal e de vínculos genéticos que merecem especial atenção da comunidade científica face às suas peculiaridades.

Estudios de Validación de mezclas de ADN con el Sistema PowerPlex® Fusion 6-dye que incluye 23 STR y 3 Y-STR Pablo Martín(1), Lourdes Fernández de Simón José Farfán (1), and Antonio Alonso (1)

(1)

, Gracia Luque

(1)

, María

(1) Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Servicio de Biología. José Echegaray 4. 28232 Las Rozas. Madrid .Spain La idea de este proyecto (IDNADEX: Improving DNA Data EXchange, presentado en octubre de 2011 en el programa ISEC) fue concebida como una forma efectiva de implementar el nuevo estándar Europeo (ESS) de 12 marcadores STR adoptado por el Consejo de la Unión Europea en 2009, manteniendo una compatibilidad e intercambio de información eficaz con los perfiles históricos de ADN registrados en la base de datos nacional de ADN en España (unos 200.000 perfiles de ADN) basados principalmente en los 13 STRs del sistema CODIS y los marcadores D19S433 y D2S1338. Con este objetivo propusimos probar y validar un sistema de amplificación para el análisis simultáneo de 21 marcadores STR que abarcan tanto los STR del estándar CODIS como los STR del estándar Europeo, así como tres STRs adicionales (D19S433, D2S1338 y SE33) incluidos en diferentes kits y muy usados en las bases de datos nacionales de ADN. En 2013, empezamos las primeras pruebas con el prototipo PowerPlex ® Fusión 6dye, desarrollado por Promega Corporation, que contiene 27 loci en respuesta a la recomendación del Grupo de Trabajo para la ampliación de los Loci del estándar CODIS. Este prototipo incluye nuestra propuesta de 21 marcadores STR autosómicos más dos Pentas (Penta D & Penta E) y tres marcadores del cromosoma Y (DYS391, DYS570 y DYS576). Esta presentación describe los estudios de validación realizados con el sistema PowerPlex® Fusion 6-dye usando un analizador genético 3500 para la detección de fragmentos con especial énfasis en el análisis de mezclas de ADN. El análisis de mezclas de ADN incluyó dos series mezclas de ADN (1 ng o 3 ng de ADN total) con proporciones relativas de 1:1, 2:1, 5:1, 8:1, 10:1, 15:1, y 20:1 de mujer (componente mayoritario) / varón (componente minoritario) y 15 mezclas de fluidos biológicos de 2 o 3 contribuyentes de ejercicios de suficiencia de GEDNAP (http://www.gednap.de ) y GHEP-ISFG (http://www.gep- isfg.org). El estudio demostró que la combinación de los STRs autosómicos e Y-STRs

del sistema PowerPlex® Fusion 6-dye maximiza la información obtenida a partir de mezclas de ADN en relación tanto al número total de contribuyentes, como al número especifico de contribuyentes varones. Por otro lado, el sistema PowerPlex® Fusion 6-dye proporcionó un rendimiento general equivalente a otros kits de análisis de STRs, pero con un mayor poder de discriminación que reduce la posibilidad de coincidencias fortuitas durante el intercambio de datos de ADN entre las bases de datos nacionales de ADN.

Identificación humana mediante uso de ADN mitocondrial recuperado de piel y vello púbico María Eugenia Ambriz Franco Romero1, Mariana Ruiz Hernández1, Raúl Flores León1, Yadira Lizethe López Ramírez1, Mauro López Armenta1 1

Laboratorio de Genética, Instituto de Ciencias Forenses del Tribunal Superior de Justicia del Distrito Federal, México D.F La identificación humana mediante pruebas de ADN es práctica recurrente en casos donde otras disciplinas han sido superadas. El uso de marcadores autosomales de ADN suele hacer diferencia sustancial frente a sistemas que carecen de robustez estadística, sin embargo, es el daño al ADN, la cantidad de muestra y los fenómenos de contaminación objeciones claras para ser empleados por estos sistemas. La investigación que se presenta tiene por intención señalar los aportes que da el uso del ADN mitocondrial en casos de muestras complejas, particularizando en muestras con ADN de mala calidad y/o carentes de núcleo; pero además, señalar la importancia que tiene la cadena de custodia en el resguardo. La perfilación mediante ADN mitocondrial que presentamos fue realizada en muestras de piel y vello púbico recuperadas de ropa interior pertenecientes a una víctima de la que su cuerpo fue conservado en formol, superando con ello las vicisitudes de cantidades mínimas críticas de muestra y contaminación cruzada. El análisis de ADN mitocondrial fue realizado por electroforesis capilar con POP 4 al tiempo de corrimiento electroforético de STRs demostrando que no existe contraposición entre secuenciación y análisis electroforético en un mismo equipo, por lo que el uso de ADN mitocondrial sigue siendo una alternativa importante en materia de identificación aun en laboratorios que cuentan con un sólo analizador genético.

Palabras clave: ADN mitocondrial, marcadores autosomales, piel, vello púbico, identificación, formol.

Análisis de ADN de tejido conservado por la técnica de salado procedente de cuerpos con inicio de putrefacción. Mariana Ruiz Hernández1, María Eugenia Ambriz Franco Romero1, Raúl Flores León1, Yadira Lizethe López Ramírez1, Mauro López Armenta1 1 Laboratorio de Genética, Instituto de Ciencias Forenses del Tribunal Superior de Justicia del Distrito Federal, México D.F La recuperación de cuerpos o restos humanos putrefactos trae consigo dificultades inminentes para su identificación, en tales circunstancias el empleo de técnicas tradicionales como dactiloscopia, antropología, odontología pueden ser superadas y no es sino a través de pruebas de ADN que la identificación de una persona puede ser conseguida. En el análisis de ADN de cuerpos y/o restos putrefactos es práctica común el empleo de muestras óseas y aunque novedosos métodos de extracción se han implementado para este fin, son los costos en equipo e insumos una limitante en laboratorios emergentes que se dedican a la identificación humana. Nuestra investigación se centra en el análisis de ADN procedente de muestras de tejido no óseo conservadas con sal procedentes de cuerpos con inicio de putrefacción y putrefacción avanzada mediante extracción con base en sílica, encontrando que el uso de tejido blando salado no sólo es una alternativa viable sino que permite su conservación para estudios futuros, dejando abierto el espectro de nuevos sistemas de identificación que son necesarios en caso complejos. A fin de evaluar la viabilidad de las muestras fueron empleados los sistemas de identificación genética Identifiler, PowerPlex Fusión System y PowerPlex Y23 System lo que deja en claro el potencial que dicho procedimiento de análisis tiene con sistemas tradicionales de identificación así como con sistemas de última generación.

Palabras clave: Análisis de ADN, cuerpos putrefactos, conservación, almacenamiento, cadena de custodia

IMPORTANCIA DE REALIZAR UNA EXTRACCIÓN DIFERENCIAL Verónica Villegas Laboratorio de la policía del Ecuador En casos de agresiones sexuales en donde se sospecha de dos individuos descendientes de la misma línea paterna, el estudio del Haplotipo de Cromosoma Y resulta ineficaz, por lo que se debe realizar un análisis de perfiles genéticos autosómicos para individualizar a un sospechoso pero debido a la gran cantidad de células epiteliales presentes en la muestra correspondientes a la víctima enmascaran a las células espermáticas necesarias para resolver el caso. Al Laboratorio de Genética Forense de la Policía Judicial de Ecuador, llega un caso de violación con muerte en el cual se presume la culpabilidad de dos sospechosos en el entorno familiar. Las evidencias que se reciben en el Laboratorio fueron: un hisopado vaginal, un hisopado rectal, una placa con frotis vaginal y una placa con frotis rectal. Se utilizó el material genético obtenido de las placas debido a la imposibilidad de contar con las muestras de hisopados por haberse consumido en su totalidad en análisis previos. Para desprender las células de la placa se utilizó un hisopo con la punta del aplicador recubierta con fibras cortas de nylon que están dispuestas de una manera perpendicular, donde el hisopo utilizado no tiene un núcleo absorbente interno para atrapar la muestra y de esta manera permitir la completa elución de todo el material celular. Se extrajo el ADN de los hisopados de las placas mediante la técnica de extracción diferencial que consiste en separar la fracción masculina de la fracción femenina y lograr la amplificación de dos perfiles genéticos autosómicos completos. Se realizó la extracción diferencial con el kit Diferex ™ de Promega y se amplificaron los extraídos en solución con el kit NGM de la Casa Comercial Applied Biosystems, y con el kit Power Plex Y23 de la Casa Comercial Promega. De las fracciones se obtuvo un perfil femenino completo y un perfil masculino completo, así como un Cromosoma Y pudiendo de esta manera realizar una discriminación de los posibles sospechosos que compartían el mismo cromosoma Y heredado por línea paterna.

Efeitos de 17 anos de sepultamento na recuperação de informação genética a partir de amostras ósseas Freitas, JM e Chemale, G. Laboratório de Genética Forense do Instituto Nacional de Criminalística, Diretoria Técnico-Científica, Polícia Federal, Brasil. A análise de DNA a partir de amostras ósseas é uma importante alternativa para a identificação de pessoas desaparecidas, uma vez que estas amostras são frequentemente o único material biológico disponível. Condições ambientais, incluindo características do solo, temperatura e umidade são fundamentais para a qualidade do resultado, mas o período de tempo de exposição a tais condições confere maior impacto na recuperação do DNA utilizável para genotipagem. Neste trabalho, apresentamos um estudo de caso comparando os resultados obtidos a partir de dois esqueletos, doravante denominados AXP e IXP. Os restos mortais foram exumados pela primeira vez em 1996 e amostras retiradas dos fêmures direitos foram enviadas para um laboratório privado para identificação por DNA. Na ocasião, não foi possível a obtenção de informação genética a partir de amostras AXP e foram obtidas apenas sequências parciais do genoma mitocondrial de amostras de IXP, que indicaram que a amostra era proveniente de um indivíduo pertencente à mesma linhagem materna da amostra de referência encaminhada (suposta mãe de dois irmãos ausentes). Apesar dos resultados não conclusivos no exame de DNA, IXP foi considerado identificado e, por associação, AXP, uma vez que ambos os esqueletos foram sepultados lado a lado e investigações realizadas indicaram que os irmãos haviam sido enterrados juntos. O caso foi considerado encerrado e os esqueletos foram enterrados novamente, com exceção de fragmentos dos dois fêmures direitos, que foram mantidos em ambiente controlado para eventuais exames adicionais. Em 2013, a família solicitou a identificação genética de AXP e uma confirmação da identificação do IXP. Os restos mortais foram novamente exumados e novas tentativas de identificação de DNA foram feitas em nosso laboratório. Tivemos acesso a amostras ósseas dos dois fêmures

esquerdo tiradas durante a segunda exumação em 2013 e também às amostras de fêmures direitos já mencionadas antes. As amostras de osso foram pulverizadas e extração de DNA realizada através de desmineralização total, utilizando um protocolo desenvolvido internamente no laboratório. Amostras de DNA foram quantificadas por qPCR (kits Quantifiler Human e Plexor®HY), submetidos a seqüenciamento de mtDNA (regiões HVI e HVII) e tipagem de microssatélites autossômica (PowerPlex®ESX17). Foram observadas diferenças dramáticas na quantidade e qualidade do material genético entre as amostras recuperadas em 1996 e aquelas recuperadas em 2013. Nenhuma informação genética interpretável foi obtida a partir de amostras de AXP recuperadas em 2013, porém foram obtidos perfis de STRs completos e seqüências de mtDNA parciais a partir de amostras do mesmo indivíduo, recuperadas em 1996. Perfis parciais de STRs e seqüências parciais de mtDNA foram obtidas nas amostras IXP recuperadas em 1996 e 2013, mas o número de locos e a qualidade das seqüências de mtDNA foram maiores para as amostras recuperadas em 1996 e mantidas em condições controladas. IXP e AXP foram finalmente geneticamente identificados como os dois irmãos ausentes que desapareceram em 1972.

Financiado por: Fundação de Amparo à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF) e Departamento de Polícia Federal (DPF).

ANALISIS GENETICO EN CASOS DE VICTIMAS DESMENBRADAS EN EL PUERTO DE BUENAVENTURA- COLOMBIA Martha L. Camargo1,* M.S. National Institute of Legal Medicine and Forensic Science, Forensic Genetics Laboratory. Cali-Colombia El puerto de Buenaventura en el pacífico Colombiano está situado tan estratégicamente que ha permitido que confluyan actividades ilícitas relacionadas con narcotráfico, contrabando, disputas entre grupos al margen de la ley como guerrilla, paramilitares y bandas criminales (Bacrim), que en la actualidad sitúan a Buenaventura como una de las ciudades más violentas del País. El grado de violencia e intimidación se ha visto marcado actualmente con la práctica de tortura con desmembramiento de víctimas vivas, lo cual ha creado escenas del crimen denominadas “bajamar y casas de pique”, y aumento en las cifras de personas desparecidas, homicidios, recuperación de cuerpos desmembrados y familias desplazadas. Desde el punto de vista del laboratorio de genética del INMLyCF Regional suroccidente, se ha presentado un aumento en el número de solicitudes para análisis de uniprocedencia entre partes corporales recuperadas de diferentes escenas, para determinar si pertenecen a una o más víctimas desmembradas. La mayoría de las muestras recibidas en el Laboratorio de Genética del INMLyCF correspondieron a restos óseos, fragmentos de tejidos blandos, filamentos pilosos y piezas dentales, aunque en algunos casos fue posible trabajar a partir de muestras de sangre en tarjetas FTA tomadas de partes corporales frescas. Para la extracción y purificación de ADN de muestras óseas y dentales se utilizó el método ICMP modificado (sílice) a partir del kit QIAquick PCR Purification de QIAGEN y para extracción de sangre en FTA el protocolo con chelex 100 al 20%; posteriormente se amplificaron las muestras con los kit´s de PCR Power plex 16 HS , ESX 17 y CS7 de PROMEGA y se tipificaron en el ABI PRISM 3130 utilizando genemapper para asignación alélica de STR´s obteniendo perfiles genéticos reproducibles. Los cálculos se realizaron a través de LR por cotejo directo.

A mayo de 2014 se analizaron un total de 51 muestras de fragmentos corporales relacionadas con 14 casos radicados en el laboratorio, de los cuales se obtuvo un total de 9 perfiles correspondientes a 9 víctimas desmembradas individualizadas, de las cuales 7 víctimas eran hombres, 2 mujeres con edades entre 16 y 30 años de edad. Los últimos análisis genéticos han estado orientados a apoyar las investigaciones criminalísticas por cuanto, las autoridades pretenden relacionar las escenas del crimen (casas de pique) con el proceso de tortura y homicidio de las víctimas y con los sindicados a partir de elementos materiales probatorios recolectados, como prendas, fluidos biológicos y evidencia traza.

Palabras claves: víctimas desmembradas, uniprocedencia, Buenaventura.