CROMATOGRAFÍA-2011

INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA

INTRODUCCIÓN La cromatografía es una técnica que permite la separación de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos. a) Retención. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido. b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas. El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elución. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaría, mientras que la móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

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TIPOS DE CROMATOGRAFÍA. Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un líquido. b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido anclado a un soporte sólido. c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas. d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas. Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre. a)

Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar.

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b)

Cromatografía de partición. La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil, que son ambas líquidas.

c)

Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un sólido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase móvil.

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN La adsorción es la propiedad que tienen ciertos sólidos de aumentar la concentración en su superficie de otras sustancias. La separación se debe a las diferencias de adsorción de los componentes de una mezcla sobre la fase estacionaria. La fase estacionaria ha de ser un sólido polar de gran superficie (adsorbente). La fase móvil puede ser un gas o un líquido dando lugar a la cromatografía gas-sólido (CGS) o líquido-sólido (CLS). El grado de adsorción varía según la naturaleza y superficie específica de los adsorbentes y naturaleza de los solutos. Los enlaces entre moléculas adsorbidas y el adsorbente han de ser débiles para que su fijación sea reversible, las uniones son debidas a fuerzas intermoleculares (interacciones dipolo-dipolo o puentes de hidrógeno). Como regla general, las polaridades del adsorbente y de los solutos han de ser opuestas.

Cromatografía líquido-sólido (CLS). La fase estacionaria está constituida por un sólido polar poroso y que esta finamente granulado. La superficie específica contiene centros polares aptos para la adsorción de las moléculas polares presentes en la fase móvil. Al Página 3

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disminuir el tamaño de las partículas, el número de centros activos por unida es mayor, y la capacidad de adsorción se incrementa. El adsorbente más utilizado es gel de sílice aunque también se emplea alúmina activada. En el caso del gel de sílice la interacción se establece entre los grupos Si-OH y Si-O-Si, y los grupos funcionales polares de los compuestos orgánicos. La fase móvil está constituida por un disolvente en el que los componentes de la mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. La velocidad de elución de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil y se puede utilizar un gradiente de polaridad aumentando con el tiempo la proporción del disolvente más polar. Propiedades de los disolventes más comunes. Disolvente

Fórmula química

Punto de ebullición

Constante dieléctrica

Densidad

Disolventes no polares

Hexano

CH3-(CH2)4-CH3

69 °C

2,0

0,655 g/ml

Benceno

C6H6

80 °C

2,3

0,879 g/ml

Tolueno

C6H5-CH3

111 °C

2,4

0,867 g/ml

Éter dietílico

CH3CH2-O-CH2-CH3

35 °C

4,3

0,713 g/ml

Cloroformo

CHCl3

61 °C

4,8

1,498 g/ml

CH3-C(=O)-O-CH2-CH3

77 °C

6,0

0,894 g/ml

2,3

1,033 g/ml

Acetato de etilo

Disolventes polares apróticos

1,4-Dioxano

CH2-CH2-O-CH2-CH2-O

101 °C

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Tetrahidrofurano (THF)

CH2-CH2-O-CH2-CH2

66 °C

7,5

0,886 g/ml

Diclorometano (DCM)

CH2Cl2

40 °C

9,1

1,326 g/ml

CH3-C(=O)-CH3

56 °C

21

0,786 g/ml

CH3-C≡N

82 °C

37

0,786 g/ml

Dimetilformamida (DMF)

H-C(=O)N(CH3)2

153 °C

38

0,944 g/ml

Dimetil sulfóxido (DMSO)

CH3-S(=O)-CH3

189 °C

47

1,092 g/ml

Acetona Acetonitrilo (MeCN)

Disolventes polares próticos CH3-C(=O)OH

118 °C

6,2

1,049 g/ml

CH3-CH2-CH2-CH2-OH

118 °C

18

0,810 g/ml

Isopropanol (IPA)

CH3-CH(-OH)-CH3

82 °C

18

0,785 g/ml

n-Propanol

CH3-CH2-CH2-OH

97 °C

20

0,803 g/ml

CH3-CH2-OH

79 °C

24

0,789 g/ml

CH3-OH

65 °C

33

0,791 g/ml

H-C(=O)OH

100 °C

58

1,21 g/ml

H-O-H

100 °C

82

1,000 g

Ácido acético n-Butanol

Etanol Metanol Ácido fórmico Agua

La retención se realiza en base a la competencia que se establece entre el soluto a separar (S) y las moléculas de la fase móvil (M) por adsorberse a los centros activos polares (X) de la fase estacionaria. Así las moléculas de soluto se adsorben a los centros activos de la fase estacionaria y van siendo desplazados por las moléculas polares presentes en la fase móvil. Página 5

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Los tiempos de retención y la selectividad en la separación dependerán de la polaridad de los compuestos a separar (S), la naturaleza del adsorbente (X) y la naturaleza de los disolventes que componen la fase móvil (M).

Cromatografía en capa fina. La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. La mezcla a analizar se deposita a una pequeña distancia del borde inferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase móvil, que asciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los componentes de la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su separación. Cuando el frente del disolvente se encuentra próximo al extremo superior de la placa esta se saca y se visualiza. La relación entre la distancia recorrida por un compuesto y por el disolvente desde el origen se conoce como Rf (rate factor).

Rf= Distancia recorrida por el compuesto Distancia recorrida por el disolvente

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La búsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de diferente polaridad o con mezclas. Para compuestos poco polares, que se desplazan con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como el hexano y en el caso de compuestos de polaridad media, mezclas de hexano y acetato de etilo. La mayoría de las placas de cromatografía llevan un indicador fluorescente que permite la visualización de los componentes activos a la luz ultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la luz ultravioleta, la visualización requiere utilizar un agente revelador. El revelador reacciona con los productos proporcionando productos coloreados.

Cromatografía preparativa en placa. La cromatografía preparativa se lleva a cabo en placas de gel de sílice de 1-2 mm de espesor sobre un soporte de vidrio. Se utiliza para la separación y aislamiento de los componentes de una mezcla en cantidades comprendidas entre 100-200 mg.

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En la superficie del adsorbente (gel de sílice), mediante una pipeta Pasteur, se traza una línea continua con la muestra disuelta y se introduce la placa en posición vertical en una cubeta. Durante la elución debe permanecer tapada para evitar la evaporación del disolvente. Una vez se han separado los productos que componen la muestra, se marca con una cuchilla el contorno del compuesto a aislar y con ayuda de una espátula se desprende del soporte de vidrio el gel de sílice con el compuesto adsorbido. Una vez transferido a un erlenmeyer se añade un disolvente en el cual sea soluble el producto, se filtra el gel de sílice y una vez eliminado el disolvente tenemos el producto puro. Chromatotron.

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Cromatografía en columna. Es el método más utilizado para la separación de compuestos orgánico a escala preparativa. La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna de vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en un estrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria mientras que la fase móvil atraviesa el sistema. Los compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones, los más polares quedan más retenidos y para que salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente. El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de retención.

El adsorbente más utilizado para cromatografía de columna es gel de sílice, aunque también se puede emplear alúmina y florisil. La elución de la Página 9

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cromatografía puede realizarse por gravedad o mediante presión (Flash chromatography), la diferencia en ambos casos está en el tamaño de las partículas de gel de sílice (0,063-0,200 nm, sílice de columna, 0,040-0,063 nm, sílice flash). Debido a que la disminución del tamaño de las partículas de adsorbente conduce a una separación más eficaz, la cromatografía a media presión (flash) proporciona mejores resultados, además de ser más rápida. Las variables que más influyen en la eficacia de la separación en cromatografía de columna y utilizando gel de sílice como adsorbente son las siguientes; a) Diámetro de la columna y cantidad de gel de sílice. La altura del adsorbente está relacionada con la diferencia de Rf de los componentes de la mezcla. El diámetro de la columna con la cantidad de producto a separar. b) Elección del disolvente. El disolvente tienen que conducir a una buena separación de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizándose en muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elución en gradiente. Una de las mezclas más utilizadas es hexano/acetato de etilo.

Cromatografía en papel. Es la más sencilla de las técnicas, pero sólo nos dará resultados cualitativos. Está casi en desuso. El método se basa en un mecanismo de reparto, y consiste en depositar una pequeña cantidad de muestra en el extremo de una tira de papel de filtro, que se deja evaporar. Luego se introduce la tira en una cubeta que contenga el disolvente, de manera que éste fluya por la tira por capilaridad.

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Cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo, se retira el papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección del disolvente y la del papel de filtro.

CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN. La cromatografía líquido-líquido, también llamada de partición se caracteriza por emplear una fase estacionaria líquida, anclada a un soporte sólido, y una fase móvil también líquida. El soporte sólido por lo general es gel de sílice, sobre cuya superficie se ha anclado una fase líquida con la incorporación de una cadena hidrocarbonada larga, mediante la transformación de los grupos silanol (Si-OH) de la gel de sílice en grupos siloxano (Si-O-Si-R), lo que proporciona una fase líquida estacionaria térmicamente estable y difícil de hidrolizar en condiciones normales.

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Tabla. Cadenas hidrocarbonadas ancladas a la gel de sílice en cromatografía líquido-líquido.

Funcionalidad Diamino Aminopropilo Nitrilo Nitro Diol Dimetilamino Propilo Fenilo Octilo Octadecilo

Estructura -(CH2)3-NH(CH2)2-NH2 -(CH2)3-NH2 -(CH2)n-CN -(CH2)n-NO2 (CH2)3-OCH2-CH(OH)-CH2OH -(CH2)3-N(CH3)2 -(CH2)2-CH3 -(CH2)n-Ph -(CH2)7-CH3 -(CH2)17-CH3

Polaridad

Tipo

Muy alta Alta Media Media Débil Débil Baja Baja Baja Muy baja

Normal Normal Normal Normal Normal Normal Inversa Inversa Inversa Inversa

La polaridad de la fase estacionaria puede modificarse en función de la naturaleza de las cadenas hidrocarbonadas introducidas en la gel de sílice, lo que permite disponer de fases estacionarias con selectividad diferente. La separación en la cromatografía líquido-líquido se basa en la diferencia de solubilidad de los componentes de la mezcla entre las dos fases líquida o en las diferentes interacciones de los componentes de la mezcla con los grupos funcionales presentes en la cadena enlazada al gel de sílice. En función de la polaridad de la fase líquida estacionaria, se distingue entre: a) Cromatografía en fase normal. La fase estacionaria está constituida por un líquido de carácter polar. Como fase móvil se emplean mezclas de disolventes apolares (hexano, pentano), con disolventes polares (cloroformo, diclorometano, T.H.F., etanol, metanol o acetonitrilo). Se utiliza para la separación de compuestos muy polares que quedarían demasiado retenidos en una cromatografía sólido-líquido. En este tipo de cromatografía el orden de elución está gobernado por interacciones de tipo polar: los solutos más polares quedan más retenidos, igual que en la cromatografía de adsorción.

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b) Cromatografía en fase reversa. La fase estacionaria está constituida por un líquido de carácter apolar. Como fase móvil se emplean mezclas de agua con disolventes polares miscibles, como metanol o acetonitrilo siendo la fase móvil más polar que la fase estacionaria. Se emplea para la separación de mezclas de compuestos de polaridad baja, que se retienen muy poco en una cromatografía sólido-líquido, y para la separación de compuestos de una misma serie homóloga. La retención se explica en base a una adsorción preferencial del disolvente menos polar de la fase móvil a la superficie de las cadenas apolares que constituyen la fase estacionaria, de manera que se establece un mecanismo complejo que supone una combinación de equilibrios de solubilidad (partición) de la mezcla que se cromatografía entre la fase líquida adsorbida a la fase estacionaria y la fase móvil. La separación ocurre como consecuencia de las diferencias en la superficie apolar de los componentes de la muestra, los compuestos menos polares serán más solubles en la fase estacionaria que los más polares. Por tanto, al contrario que en la fase normal, los compuestos más polares estarán menos retenidos que los menos polares. Los tiempos de retención disminuyen cuando menor sea la proporción de agua, cuando menos polar sea el disolvente empleado.

Cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico (cromatografía iónica) es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en las propiedades de carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada, incluyendo grandes proteínas, pequeños nucleótidos y aminoácidos. La solución que se inyecta es usualmente llamada muestra y los

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componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificación de proteínas, análisis de agua o control de calidad. La fase estacionaria (resina de intercambio) muestra en la superficie grupos funcionales iónicos que interactúan con iones de carga opuesta. Este tipo de cromatografía se subdivide a su vez en la cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico: La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes cargados positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado negativamente (SO3-, CO2-). Las resinas cuyo grupo funcional activo es un sulfonato (SO3-) se consideran resinas intercambiadoras ácidas fuertes, mientras que aquéllas cuyo grupo funcional activo es un ión carboxilato (CO2-) se consideran resinas ácidas débiles. R-A-H+ + M+ + B- R-A-M+ + H+ + BLa cromatografía de intercambio de aniones retiene aniones usando grupos funcionales cargados positivamente, como un catión de amonio cuaternario (R4N+). R4-N+L- + M+ + B- R4-N+B- + L- + M+

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R-H++ M+ R-M++ H+

Kd= [M+]R[H+] / [M+] [H+]R

Este tipo de cromatografía se basa en el equilibrio de intercambio iónico entre una fase sólida que contiene grupos sulfónicos o carboxílicos (para la separación de cationes) o grupos amino cuaternarios, ternarios o secundarios (para la separación de aniones) y los iones presentes en la fase móvil. Por ejemplo, para la separación de cationes se puede utilizar una resina de ácido débil donde se producirá el siguiente equilibrio: R-CO2H + M+  R-CO2M + H+ En este caso, el catión M+ puede ser eluido de la columna por un ácido fuerte en una concentración capaz de desplazar el equilibrio representado en la ecuación anterior hacia la izquierda. El desarrollo de esta técnica al estado de Página 15

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cromatografía de alta resolución, llamada cromatografía iónica, fue posible a partir de la década del 70 cuando se desarrollaron recubrimientos que contienen los materiales típicos para el intercambio (grupos sulfónicos para cromatografía catiónica y grupos aminos cuaternario para cromatografía aniónica). Estos recubrimientos se depositan sobre pequeñas esferas de sílice, vidrio o de algún polímero que son capaces de soportar las altas presiones comúnmente utilizadas en cromatografía líquida de alta resolución.

PRÁCTICA DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA En todo procedimiento en química orgánica reconocemos las etapas que se muestran en el siguiente esquema para el aislamiento y caracterización de los productos orgánicos. Esquema: Esquema general de las etapas de aislamiento y purificación de los productos preparados en un proceso sintético en química orgánica A + B

C + D

Otros Reactivos

Mezcla de reacción Productos de reacción

Extracción

Purificación

Separación cromatográfica

Caracterización

Cristalización

Pf

Destilación

Peb

RMN

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Una vez ha concluido la reacción, la mezcla resultante se extrae para separar los sustratos que nos interesan. A continuación la mezcla obtenida, que generalmente es el producto de reacción, productos secundarios, reactivos y/o algo del producto de partida, se separa por cromatografía de columna. Finalmente los productos, para caracterizarlos correctamente, y por regla general, requieren de una purificación adicional que se lleva a cabo mediante otra cromatografía más cuidadosa y/o cristalizaciones-destilaciones, según el caso. En ocasiones y por necesidades de tiempo en los laboratorios de prácticas no se lleva a cabo la separación cromatográfica, aunque sea una operación necesaria en el trabajo de síntesis, como hemos indicado en párrafos anteriores. Por esta razón hemos considerado oportuno incluirla como ejemplo en un curso introductoria, de esta manera damos una visión real del trabajo sintético en química orgánica. En esta experiencia se propondrá la separación de los componentes de una mezcla hipotética de reacción por cromatografía de columna. Las mezclas estarán constituidas realmente por dos sustancias. Por ello, y como en casos anteriores, se sugiere tener conocimiento de las características de los sustratos antes de comenzar. Las mezclas estarán constituidas por 0.2 g de cada uno de los productos y antes de proceder a su separación habrá que decidir eluyente más adecuado para poder desarrollar una separación aceptable.

Procedimiento general Para el proceso de separación-purificación por cromatografía de columna se

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siguen los siguientes pasos: A)

Se sujeta la columna a un

soporte y se rellena con la fase estacionaria en forma de papilla o en seco según se nos indique. B)

Opcionalmente se puede añadir

arena hasta obtener una franja de unos 2-5 mm de espesor, para proteger el frente de la fase estacionaria. C)

Se deposita la muestra en

disolución o adherida a una pequeña cantidad de adsorbente sobre la arena, procurando tener una franja horizontal. D)

Opcionalmente se puede poner

otra franja de arena como la primera o un poco de lana de vidrio. E)

Añadir la fase móvil

con

cuidado por la pared de la columna hasta llenarla.

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F)

Los componentes de la mezcla

deben eluirse manteniendo un flujo continuo de disolvente. G)

Las

fracciones

recogidas

deberán analizarse mediante una técnica cromatográfica analítica: cromatografía de capa fina para comprobar su contenido y pureza. Las fracciones que tengan semejante contenido se juntan en el mismo matraz, previamente pesado y el disolvente se elimina en el rotavapor.

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