Evaluación de la resistencia en genotipos de papa a Phytophthora infestans bajo condiciones de campo Guía para colaboradores internacionales G.A. Forbes • W. Pérez • J. Andrade-Piedra

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Evaluación de la resistencia en genotipos de papa a Phytophthora infestans bajo condiciones de campo Guía para colaboradores internacionales © Centro Internacional de la Papa (CIP), 2014 ISBN: 978-92-9060-450-1 DOI:10.4160/9789290604501 Versión digital Las publicaciones del CIP contribuyen con el desarrollo de importante información disponible para el público. Los lectores pueden citar o reproducir el material de nuestras publicaciones en sus propias publicaciones. El CIP tiene derechos de autor y solicita que se reconozca el uso de este material citándolo adecuadamente y enviando una copia de la publicación o el material donde aparezca la información. Por favor envíe esta información al Departamento de Comunicaciones y Divulgación en la dirección indicada lineas abajo Centro Internacional de la Papa. Apartado 1558, Lima 12, Perú [email protected] • www.cipotato.org Cita: Forbes, G.; Pérez, W.; Andrade Piedra, J. 2014. Procedimiento para Evaluación Estándar y Manejo de Datos de Clones Avanzados de Papa. Modulo 3: Evaluación de la resistencia en genotipos de papa a Phytophthora infestans bajo condiciones de campo. Guía para Colaboradores Internacionales. Lima (Perú). Centro Internacional de la Papa (CIP). 50 p. Créditos: Editores: G.A. Forbes • W. Pérez • J. Andrade-Piedra Fotografías: Willmer Pérez DIagramación: Sofía Tejada Traducción al español: Cyntia Zorrilla Marcas registradas Microsoft® es una marca registrada de la corporación Microsoft Nota: De acuerdo a nuestro conocimiento la información brindada en esta publicación es precisa. Sin embargo, los autores no asumen ninguna responsabilidad moral o legal por la exactitud o lo exhaustivo de la información, o consecuencias que surjan de su uso.Esta publicación ha sido realizada solo con el propósito de brindar información. La mención de nombres o productos comerciales no constituye una recomendación de uso por los autores.

Setiembre 2014

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TABLA DE CONTENIDOS INTRODUCCIÓN ................................................................... 5 Phytophthora infest ans, AGENTE CAUSAL DEL TIZÓN TARDÍO .............................................................................. 7 T I Z Ó N T A R D Í O ....................................................................... 8 S Í N T O M A S D E L T I Z Ó N T A R D Í O E N L A S H O J A S ................................... 8 S Í N T O M A S D E L T I Z Ó N T A R D Í O E N L O S T A L L O S ................................. 8 S Í N T O M A S D E L T I Z Ó N T A R D Í O E N L O S T U B É R C U L O S .......................... 8 R E S I S T E N C I A A L T I Z Ó N T A R D Í O ................................................... 9 ENSAYOS DE EVALUACIÓN DEL TIZÓN TARDÍO ....................... 11 LOCALIDADES: SELECCIÓN DE LUGARES PARA ENSAYOS DE BÚSQUEDA DE R E S I S T E N C I A ........................................................................ 11 M A T E R I A L E S : C L O N E S , T E S T I G O S Y C A L I D A D D E L M A T E R I A L S E M B R A D O 11 D I S E Ñ O E X P E R I M E N T A L .......................................................... 12 V A R I A B I L I D A D D E L A E N F E R M E D A D E N E L C A M P O ........................... 12 M A N E J O D E L C A M P O : P R O T E C C I Ó N D E L A S P L A N T A S C O N F U N G I C I D A S . 14 E V A L U A C I Ó N D E L A S E V E R I D A D D E L A E N F E R M E D A D ........................ 14 F U E N T E S D E E R R O R C U A N D O S E E S T I M A E L P O R C E N T A J E D E I N F E C C I Ó N 15 REGISTRO Y ANÁL ISIS DE DATOS .......................................... 17 T O M A D E D A T O S Y C Á L C U L O S ................................................... 17 Á R E A B A J O L A C U R V A D E P R O G R E S O D E L A E N F E R M E D A D (AUDPC) .... 17 A N Á L I S I S D E D A T O S ............................................................... 18 I N T E R P R E T A C I Ó N D E D A T O S ..................................................... 19 MANEJO DE PROBLEMAS COMUNES ASOCIAD OS AL AUDPC .... 21 R E G I S T R O D E L E C T U R A S .......................................................... 21 MANEJO DE LA FALTA DE UNIFORMIDAD DE L A ENFERMEDAD 23 E N E L C A M P O ...................................................................... 23 M A N E J O D E L A F A L T A D E C O M P A R A B I L I D A D E N T R E E X P E R I M E N T O S ..... 23 CÁLCULO DEL AUDPC USANDO M ICROSOFT EX CEL ................. 25 CÁLCULO DEL rAUDPC USANDO MICROSOFT EXCEL ................ 27 CÁLCULO DE LA ESCAL A DE SUSCEPTIBIL IDAD A Phyt ophthor a infest ans PARA GENOTIPOS DE PAPA ................................... 29 CÁLCULO DE LA ESCAL A DE SUSCEPTIBIL IDAD USANDO MICROSOFT EXCEL ................................................ 31 E J E M P L O D E L U S O D E L A E S C A L A D E S U S C E P T I B I L I D A D ..................... 33 BASE DE DATOS GLOBAL DE ENSAYOS DE PAPA Y CAMOTE DEL CIP .................................................................................. 37 LLENANDO L AS PLANTILLAS DEL MÓDULO DE TIZÓN TARDÍO DEL DataCollector ................................................................... 39 LITERATURA CIT ADA .......................................................... 47

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INTRODUCCIÓN El tizón tardío, causado por el oomiceto Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, es el principal problema biótico para la producción de papa a nivel mundial. La presente guía tiene por finalidad asistir a los profesionales y técnicos a cargo de los ensayos diseñados para seleccionar genotipos de papa con resistencia a esta enfermedad. Se puede usar la misma metodología para la evaluación de familias de cruzamientos genéticos que son conducidas bajo condiciones de campo o invernadero. Esta guía puede ayudar a organizar ensayos, mejorar la recolección de datos y análisis e introduce nuevos criterios para la evaluación de resistencia basados en principios epidemiológicos. El personal del Centro Internacional de la Papa (CIP) puede compartir sus datos de ensayos de tizón tardío a través del Sistema Global de Manejo de Datos.

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Phytophthora infestans, AGENTE CAUSAL DEL TIZÓN TARDÍO El tizón tardío de la papa (y el tomate) es causado por Phytophthora infestans. Un reciente esquema de clasificación basado en el análisis molecular del gen de ARN ribosómico y en datos ultra estructurales de la pared celular incluyen al género Phytophthora dentro del reino Cromista, junto con las algas pardas y las diatomeas. El género Phytophthora pertenece al phylum Oomycota, el cual se caracteriza por tener zoosporas propulsadas por flagelos heterocontas (de diferente longitud, uno tipo látigo y el otro tipo plumilla), pared celular compuesta por celulosa, micelio de hifas cenocíticas (sin septas) y reproducción por contacto gametangial. Actualmente, está claro que los oomicetos no están relacionados a los hongos verdaderos, ascomicetos y basidiomicetos (10). La forma asexual de P.infestans es esencialmente la de un parásito natural obligado. El micelio podría sobrevivir por periodos cortos en los desechos de los cultivos, pero en general el patógeno requiere un hospedero vivo (cultivado o silvestre) para su sobrevivencia por largos periodos de tiempo y no puede sobrevivir al invierno o a otra campaña si no hay un hospedero disponible. Sin embargo, en algunos lugares donde ocurre la reproducción sexual, las oosporas resultantes pueden sobrevivir por meses o años en la ausencia de hospederos vivos (4, 11). P.infestans puede ser cultivado sobre un medio artificial y puede sobrevivir en el laboratorio por periodos de tiempo indefinidos en su estado vegetativo. Después de un largo periodo durante el cual las poblaciones de P.infestans fueron consideradas solo como asexuales, un reporte del tipo de apareamiento A2 en el oeste de Europa el año 1984 fue el primer indicio del desarrollo de nuevas y muy agresivas poblaciones de este patógeno (19, 27). El análisis de un amplio número de poblaciones locales dispersas indicó sorprendentemente que los rápidos cambios evolutivos no estaban restringidos al oeste de Europa, sino que ocurrían a nivel mundial (20, 22).

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Estas nuevas migraciones involucraban ambos tipos de apareamiento (A1 y A2), generando una potencial reproducción sexual. La diversidad genética generada por la reproducción sexual puede generar genotipos más agresivos.

Tizón tardío El tizón tardío es una enfermedad policíclica, con varios ciclos de infección y de producción de inóculo durante la misma estación de cultivo. Así, se espera que la infección se incremente proporcionalmente tanto en el inóculo inicial como en el nuevo inóculo producido durante la estación del cultivo. La cantidad de inóculo producido depende del hospedante, el patógeno, el medio ambiente y las condiciones de manejo (5, 21). Más información acerca del ciclo de la enfermedad, condiciones climáticas, control, etc. están bien documentadas en la literatura (5, 20, 25, 32, 39).

Síntomas del tizón tardío en las hojas Al inicio, la enfermedad se manifiesta con manchas húmedas irregulares de color verde claro, mayormente cerca del ápice y los márgenes de las hojas. Estas lesiones crecen rápidamente hasta formar manchas grandes de color marrón oscuro (Foto 1). Durante las primeras horas de la mañana, se puede observar en la cara inferior de las hojas infectadas, especialmente en los márgenes de las lesiones necróticas, una eflorescencia blanquecina formada por esporangios del patógeno. Las lesiones jóvenes son pequeñas (entre dos y 10 mm) y de forma irregular, y pueden estar rodeadas por un pequeño halo (tejido verde claro alrededor de la lesión necrótica oscura). A medida que crecen, las lesiones se vuelven más circulares hasta que son delimitadas por los márgenes del foliolo. Por lo general, no están delimitadas por nervaduras, y las lesiones viejas están rodeadas por un halo clorótico.

Síntomas del tizón tardío en los tallos Cuando el tizón tardío ataca al tallo puede causar su estrechamiento y las hojas que están por encima del punto de infección se marchitan. Las lesiones de color pardo claro o pardo oscuro en los tallos o los peciolos se alargan y circundan el tallo (Foto 2). Las lesiones se vuelven quebradizas y el tallo a menudo se quiebra en ese punto (Foto 3).

Síntomas del tizón tardío en los tubérculos Los tubérculos infectados muestran áreas irregulares, de coloración marrón rojiza a negruzca ligeramente hundidas que se extienden profundamente en el tejido interno de los tubérculos (Foto 4). Los tubérculos infectados son inicialmente duros, secos y compactos, pero

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pueden ser invadidos por otros patógenos, principalmente bacterias que ocasionan pudrición blanda. A menudo va asociado a un olor penetrante y pútrido en los campos muy infectados; sin embargo, dicho olor se debe a la pudrición de tejido muerto y no es consecuencia directa del tizón tardío.

Resistencia al tizón tardío El consenso general es que la mayor resistencia a P. infestans puede clasificarse en dos fenotipos en el campo. El primero es gobernado por un solo gen dominante con efectos mayores y una clara segregación discontinua de la progenie generada por un genotipo resistente y otro susceptible. El segundo tipo de resistencia es gobernado por varios o muchos genes, llamados genes menores, con pequeño efecto acumulativo y una continua distribución de genotipos resistentes en la progenie que resulta del cruce de un genotipo resistente con otro susceptible. La resistencia de genes mayores también ha sido descrita como resistencia vertical, resistencia de genes R, resistencia específica, resistencia específica de raza, resistencia inestable y resistencia completa. La resistencia conferida por genes menores ha sido descrita con nombres contrastantes como resistencia horizontal, resistencia poligénica, resistencia cuantitativa, resistencia general, resistencia no específica de raza, resistencia estable, resistencia parcial, resistencia de campo y resistencia reductora de la tasa de infección (7, 12, 37, 38). Muchas variedades liberadas como resistentes al tizón tardío rápidamente llegaron a ser susceptibles cuando las poblaciones del patógeno estaban involucradas. Ejemplos de esta situación son el cultivar Victoria en Uganda (conocido como Asante en Kenia) (12) y el cultivar Canchán en Perú (Ver Tabla 1, pag.35). La efímera resistencia mediada por un gen mayor y la dificultad de transferir cuantitativamente la resistencia heredada han hecho que la identificación y difusión de la resistencia duradera al tizón tardío sea una tarea difícil (8,25).

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Foto 1: Síntomas de tizón tardío en el envés de la hoja de la papa.

Foto 2: Síntomas de tizón tardío en el tallo de la papa.

Foto 3: Síntomas de tizón tardío en el tallo de la papa.

Foto 4: Síntomas de tizón tardío en el tubérculo de la papa.

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ENSAYOS DE EVALUACIÓN DEL TIZÓN TARDÍO El ambiente físico influye en el desarrollo de una epidemia a través de sus efectos sobre varias fases del ciclo de vida del patógeno a medida que este interactúa con las diferentes fases del desarrollo de la planta (6, 24, 33). El clima frío, húmedo, con lluvia y humedad relativa ambiental de más de 90%, y temperaturas de 7 a 21°C favorecen el desarrollo del tizón tardío (1, 5, 34). Las epidemias naturales de P. infestans en el campo pueden ser usadas ventajosamente para seleccionar grandes poblaciones de genotipos de papa por su resistencia a esta enfermedad (23).

Localidades: selección de lugares para pruebas de búsqueda de resistencia El conocimiento de las poblaciones del patógeno presentes en los lugares seleccionados para este tipo de ensayos podría ser útil en la interpretación de los resultados. Por ejemplo en Perú, el programa de mejoramiento para tizón tardío usa dos sitios en los Andes centrales (Comas y Oxapampa); las poblaciones del patógeno en aquellas zonas pertenecieron al linaje US-1 (23, 35, 39), sin embargo las poblaciones actuales están dominadas por el linaje EC-1, que también ha sido identificado como predominante en Ecuador (13), Colombia y Venezuela (14). Finalmente, el número de lugares elegidos, así como el número de años de evaluación, dependen de la logística y de los recursos humanos y financieros. Una manera de estudiar la estabilidad fenotípica es a través de los análisis de interacción genotipo por ambiente (GxE). La interacción GxE puede ser estudiada temporalmente (dos o más campañas en la misma localidad) o espacialmente (varias localidades durante la misma campaña) o con una combinación de estas (9) a través de efectos principales aditivos y análisis de interacción multiplicativa (AMMI) (3).

Materiales: clones, testigos y calidad del material sembrado  Clones: Pueden evaluarse líneas de mejoramiento o variedades de papa pertenecientes a los programas de mejoramiento local o del CIP.

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 Testigos: En el ensayo deben incluirse un número reducido (1 a 5) de genotipos de papa con niveles de resistencia conocidos que varíen entre susceptible (escala del 6 al 9) a altamente resistente (escala del 0 al 2), particularmente si la evaluación se hace en diferentes localidades o tiempos. Para la escala de susceptibilidad descrita abajo, es deseable tener un genotipo altamente susceptible (valor de la escala cercano a 9) entre los testigos. De preferencia, este mismo genotipo debería usarse en todas las evaluaciones.  Calidad del material de siembra: Se deben usar tubérculos uniformes del mismo origen tanto para los clones avanzados como para los testigos. Se recomienda usar tubérculos de igual tamaño para todos los genotipos evaluados en el ensayo.  Tamaño de la parcela: La resistencia al tizón tardío puede ser evaluada en pequeñas parcelas (5 plantas). Sin embargo, mientras más grande la parcela (por ejemplo. 4x4 m2), más grande será la resolución entre los materiales evaluados.  Manejo agronómico: Fertilización, control de plagas y malezas, así como otras actividades agrícolas deben ser uniformes para todas las parcelas del ensayo y estar en concordancia con las prácticas agrícolas locales.

Diseño experimental La evaluación de clones debe hacerse en un ensayo replicado usando 3 a 4 repeticiones. La resistencia al tizón tardío puede evaluarse en todos los diseños experimentales clásicos, como el diseño de boques completos al azar.

Variabilidad de la enfermedad en campo Se pueden tomar diferentes acciones para reducir o controlar la variabilidad en la severidad de la enfermedad en el ensayo de campo. Una medida es la inoculación, la cual es especialmente útil en áreas donde el inóculo natural podría no ser suficiente. Para que la inoculación sea eficiente, el inóculo no puede secarse. Por lo tanto, la inoculación debe hacerse después de que se forma rocío o después de una lluvia, temprano en la tarde. Otra alternativa es regar el campo mediante aspersión antes de la inoculación por un periodo suficientemente largo para asegurar que el follaje esté húmedo. Es mejor inocular plantas al anochecer para que el inóculo no se seque y para

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proteger a las zoosporas y esporangios de la luz solar directa. El inóculo debe aplicarse en cada parcela con una aspersora manual tan homogéneamente como sea posible (aproximadamente 20 ml por planta) (12, 17, 18). La inoculación debe hacerse en plantas que aún no han alcanzado la floración para permitir el adecuado desarrollo de la enfermedad. Otra medida frecuentemente usada para mejorar la uniformidad de la enfermedad en un campo es la siembra de una variedad susceptible (valor de la escala entre 6 a 9), o de un genotipo de papa susceptible y otro moderadamente resistente (valor de la escala entre 4 a 5) alrededor de las parcelas con el objeto de producir continuas fuentes de inóculo. Estos genotipos adicionales a menudo se consideran “surcos diseminadores” (Foto 5). Los surcos diseminadores pueden introducir sesgos: si el genotipo usado como diseminador es muy susceptible, hará que sus vecinos inmediatos se vean más susceptibles debido a la gran cantidad de inóculo difundido por el diseminador. Para evitar esto, se pueden sembrar los genotipos diseminadores entre cada clon, de tal manera que todos los clones reciban igual cantidad de inóculo; pero esto duplicará el tamaño del experimento.

Foto 5. Surcos diseminadores sembrados alrededor de las parcelas

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Manejo del campo: protección de las plantas con fungicidas En muchos lugares tropicales y subtropicales, el tizón tardío se presenta desde los primeros estadíos del cultivo. Si la infección aparece cuando la planta es aún muy pequeña, puede ser difícil apreciar la diferencia entre genotipos resistentes y susceptibles. Bajo estas condiciones es aconsejable proteger las plantas con fungicidas hasta que sean suficientemente grandes para la evaluación; esto es, cuando alcancen un 30% de crecimiento del área foliar. Las aplicaciones de fungicida deben detenerse al menos tres semanas antes de que se haga la inoculación.

Evaluación de la severidad de la enfermedad La severidad de la enfermedad se evalúa como el porcentaje de área foliar infectada. Esta variable se registra a lo largo de la campaña junto con la fecha de cada lectura. Los datos son recolectados en cada parcela o unidad experimental (cada clon o variedad dentro de cada repetición). Los datos se pueden registrar manualmente o con dispositivos electrónicos (por ej. tabletas) con la finalidad de reducir el tiempo y el costo de la recolección de datos y su análisis posterior. Cuando el número de plantas por parcela es bajo, algunos investigadores toman datos sobre severidad en cada planta. Sin embargo, hay poca evidencia de que este proceso otorgue alguna ventaja, con el agravante de que requiere una cantidad significativa de tiempo adicional. Por esta razón, el CIP recomienda tomar datos simplemente a nivel de parcela. La primera lectura debe hacerse antes del inicio de la enfermedad. Los investigadores deben conocer el tiempo normal de aparición del tizón tardío en su localidad, y/o sondear los campos cercanos en búsqueda de síntomas. La toma de datos debe comenzar tan pronto como las condiciones del clima se vuelvan propensas para el desarrollo del tizón tardío; las siguientes lecturas deben hacerse apenas se observen los primeros síntomas de la enfermedad. Los porcentajes del área foliar enferma se usan para calcular el área bajo la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC), por lo tanto, los intervalos de tiempo constante entre lecturas no son realmente cruciales. Si la enfermedad avanza rápidamente en los genotipos susceptibles, las lecturas deben hacerse frecuentemente (cada 7 días en áreas frías, o cada 3 a 4 días en áreas húmedas y templadas). Si la enfermedad avanza lentamente, el intervalo entre las lecturas puede ser más largo (cada 10 a 14 días). El objetivo es tener lecturas de la enfermedad a niveles bajos, intermedios y altos de todos los genotipos, incluyendo los susceptibles.

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Las lecturas son luego integradas en una medida como el área bajo la curva del progreso de la enfermedad (AUDPC) (16) (ver más abajo). Cuando se evalúa el tizón tardío, la mayoría de investigadores estima visualmente el porcentaje total del área foliar afectada por la enfermedad. Esto se hace comparando la porción verde de la no verde (asumiendo que el tizón tardío es la única enfermedad o la predominante en el follaje). Por ende, el porcentaje de follaje infectado en la parcela se estima mentalmente. Este es un procedimiento estándar y generalmente funciona bien, especialmente cuando las lecturas son integradas en una medida como el AUDPC. Sin embargo, la estimación del porcentaje de infección está sujeta a varias fuentes de error (15).

Fuentes de error cuando se estima el porcentaje de infección 1) Podría subestimarse el porcentaje del área foliar enferma cuando solo se evalúa la porción de la planta con síntomas visibles y que todavía continúa adherida a la planta. Los foliolos enfermos finalmente caen pero el momento de la caída probablemente dependa del cultivar. El tejido enfermo puede estar verde y no presentar síntomas, y por lo tanto pasar inadvertido durante la evaluación. El tejido verde infectado incluso puede estar esporulando, pero no siempre es visible, a menos que el evaluador esté muy cerca del foliolo. Por lo general, este nivel de examen no es empleado rutinariamente en la evaluación de cultivares. 2) Cuando se evalúan las diferencias proporcionales o los porcentajes, se puede incurrir en error humano. La investigación demuestra que la enfermedad se estima con mayor precisión en los niveles alto y bajo de severidad que en niveles intermedios (29). El uso de escalas logarítmicas no corrige necesariamente esta tendencia por lo que se recomienda el uso de porcentajes simples del área infectada (16). 3) En general, es mejor si todas las lecturas de un ensayo son realizadas por una persona con experiencia en la evaluación de la enfermedad, para mantener así el mismo grado de precisión y eficacia en las evaluaciones de la enfermedad (6). Es recomendable tomar los datos de manera independiente (esto significa, sin tener conocimiento del valor dado en la lectura previa), haciendo que otra persona los registre en la hoja de datos o usando una forma de registro digital que oculte las lecturas previas. Si se usa papel para tomar las evaluaciones de la enfermedad, se debe elegir un color que no refleje la luz del sol. El mejor momento del día para evaluar la severidad de la enfermedad es en la mañana o en condiciones nubladas.

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REGISTRO Y ANÁLISIS DE DATOS Toma de datos y cálculos Área bajo la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC). Debido a que el tizón tardío es una enfermedad policíclica, el CIP recomienda el uso del AUDPC para sintetizar las lecturas de la enfermedad en una medida sinóptica (18). El AUDPC es calculado a partir de los porcentajes estimados del área foliar enferma registrados en diferentes momentos durante la epidemia. El AUDPC es fácil de calcular, usa evaluaciones múltiples y no depende de transformaciones. El AUDPC presenta también algunas desventajas, las cuales serán discutidas al final de este capítulo. El AUDPC es frecuentemente calculado usando la fórmula del punto medio (6):

Donde “t” es el tiempo de cada lectura, “y” el porcentaje de follaje afectado en cada lectura y “n” el número de lecturas. La variable “t” puede representar los días julianos, los días después de la siembra o los días después de la emergencia. El diagrama mostrado en la Figura 1 es una representación gráfica de la ecuación. Asimismo, muestra al AUDPC como una suma de las áreas trapezoidales. Al final del capítulo se brinda un ejemplo de cálculo del AUDPC con Microsoft Excel. El paquete informático ‘DataCollector’ también calcula el AUDPC. (https://research.cip.cgiar.org/confluence/display/GDET4RT/Downloads)

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Figura 1. Representación gráfica del AUDPC

Análisis de datos Los valores de AUDPC, así como los porcentajes de infección, se pueden analizar usando el análisis de variancia (ANOVA) previo a un análisis de datos a través de estadística simple como hallar la media, el error estándar, realizar distribución de frecuencias y diagrama de cajas. También se pueden usar comparaciones múltiples de medias (por ej. Dunnet) (36). Para estimar la validez de los modelos y evaluar la homogeneidad de las variancias se recomiendan los análisis de residuales (36).

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El AUDPC y el porcentaje de infección se consideran variables pseudo cuantitativas con jerarquía y pueden analizarse sin transformación (30). Si se ha evaluado el rendimiento además del AUDPC se puede calcular la correlación entre el rendimiento y la resistencia del genotipo con el método Spearman (28). Este método cataloga cada observación en rangos dentro de cada repetición y calcula la correlación de los valores por rangos. Un valor del coeficiente cercano a 1, indica una buena correlación entre rendimiento y AUDPC (por ej. severidad total de la enfermedad).

Interpretación de datos El AUDPC es una variable que estima la cantidad de enfermedad a lo largo de la campaña. El AUDPC se expresa en porcentajes por días (es decir, la acumulación diaria del porcentaje de los valores de infección) y se interpreta directamente sin transformación. Cuanto más alto es el AUDPC, más susceptible es el clon o variedad. Para tener una mejor idea de cómo se comportan los clones o variedades del experimento, generalmente es útil hacer un gráfico del porcentaje de área de hoja infectada frente a la fecha de evaluación (Figura 2).

Figura 2. Curvas de severidad de la enfermedad de tres clones de papa

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MANEJO DE PROBLEMAS COMUNES ASOCIADOS AL AUDPC Registro de las lecturas Problema: La selección de genotipos de papa resistentes se basa frecuentemente en el AUDPC (26). Sin embargo, el mismo valor de AUDPC se puede obtener de una infección que empieza temprano, que progresa lentamente o que empieza tarde; por lo tanto, el AUDPC no provee información del tipo de resistencia presente en los genotipos, o su potencial durabilidad. Por esta razón es recomendable examinar las curvas de progreso de la enfermedad (2). Solución: Es importante iniciar las lecturas cuando comienza la enfermedad, idealmente incluso antes de que aparezcan los síntomas. Generalmente no es relevante continuar las lecturas después que los materiales susceptibles han alcanzado el 100% de severidad de la enfermedad. El AUDPC puede ser calculado a partir de dos datos, pero se alcanza una mayor precisión con cada observación adicional. Sin embargo, se han observado algunos casos en los que se han obtenido valores de AUDPC muy precisos usando sólo dos datos (30).

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MANEJO DE LA FALTA DE UNIFORMIDAD DE LA ENFERMEDAD En el campo Problema: El AUDPC es sensible a la falta de uniformidad de la enfermedad en el campo. Solución: Los diseños experimentales para controlar este tipo de error ya se han descrito arriba. La inoculación debería ayudar si la enfermedad es típicamente heterogénea en una localidad.

Manejo de la falta de comparabilidad entre experimentos Problema: El AUDPC per se no debería ser usado para comparar genotipos de papa entre experimentos. Además, las unidades del AUDPC como indicadores de resistencia o susceptibilidad no son fácilmente interpretadas. Por ejemplo, un valor de AUDPC de 2043 podría darse a un genotipo moderadamente resistente que se desarrolló en condiciones propicias para una infección severa, o podría darse a un genotipo susceptible que se desarrolló bajo condiciones no propicias para una infección severa. Solución: En un esfuerzo por estandarizar el AUDPC, los investigadores usualmente usan el AUDPC relativo (rAUDPC) (18). El rAUDPC se calcula dividiendo el AUDPC entre el “máximo AUDPC potencial”. El máximo AUDPC potencial simplemente es el AUDPC que tendría una variedad o clon si tuviera 100% de infección en todas las lecturas. El máximo AUDPC potencial está representado por la línea punteada en la Figura 1 y se calcula multiplicando el número total de días entre la primera y última lectura por 100. El rAUDPC tampoco es la mejor medida para comparar resultados entre diferentes experimentos por las mismas razones explicadas para el AUDPC. Para esta tarea, el CIP recomienda la escala de susceptibilidad descrita a continuación.

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CÁLCULO DEL AUDPC USANDO MICROSOFT EXCEL El AUDPC puede ser calculado usando programas estadísticos o programas con hojas de cálculo. He aquí un ejemplo usando una plantilla de evaluación de Microsoft Excel. Paso 1: Colocar las fechas de evaluación de los cinco clones para cada uno de los días registrados

Paso 2: Localizar el cursor en la celda N7, que corresponde al AUDPC del clon 1, e ingresar la siguiente fórmula: Area=((G7+F7)/2)*($G$6-$F$6)+((H7+G7)/2)*($H$6-$G$6)+((I7+H7)/2)*($I$6$H$6)+((J7+I7)/2)*($J$6-$I$6)+ ((K7+J7)/2)*($K$6-$J$6)+((L7+K7)/ 2)*($L$6-$K$6)

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Paso 3: Presionar la tecla “Enter” y aparecerá el área “581” en la celda N7

Paso 4: Copiar la fórmula de la celda N7 a las otras celdas desde N8 a N11.

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CÁLCULO DEL rAUDPC USANDO MICROSOFT EXCEL El rAUDPC también se puede calcular usando un programa estadístico o programas con hojas de cálculo. Se usa la misma hoja de cálculo preparada para encontrar el AUDPC. Paso 1: Localizar el cursor en la celda O7, la cual corresponde al rAUDPC del clon 1, e ingresar la siguiente fórmula: rAUDPC =N7/((L6-F6)*100) Luego presione la tecla “Enter”, y aparecerá el valor 0.14 del rAUDPC en la celda O7.

Paso 2: Copiar la fórmula de la celda O7 a las otras celdas, de la O8 a la O11, pero sea cuidadoso para mantener los valores de la última (celda L6) y la primera (celda F6) lectura copiadas en cada fórmula.

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Una alternativa para calcular el rAUDPC es colocar los datos de la última y primera lectura en la fórmula. En el ejemplo, la última lectura es a los 85 días (celda L6) y la primera lectura a los 42 días (celda F6). rAUDPC = N7/((85-42)*100)

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CÁLCULO DE LA ESCALA DE SUSCEPTIBILIDAD A Phytophthora infestans PARA GENOTIPOS DE PAPA En la mayor parte del mundo no existe un sistema estándar para medir el grado de resistencia a Phytophthora infestans en los genotipos de papa. Generalmente son clasificados en: resistentes, moderadamente resistentes o susceptibles. Esta clasificación puede ser útil, pero para la comparación de genotipos en diferentes ambientes es muy limitada y es demasiado simple para proveer información útil para el manejo con fungicidas. Esta situación es particularmente problemática en los países en desarrollo, porque hasta hace poco no existía una escala para condiciones de días cortos, propia de las zonas altas de los trópicos (39). Para enfrentar este problema, Yuen y Forbes (39) propusieron una escala simple (0 a 9) que puede calcularse a partir de los valores de AUDPC o un rAUDPC; sin embargo, para usar esta escala se requiere tener un cultivar susceptible como referencia en todos los experimentos que van a ser comparados. La escala de valores de susceptibilidad se calcula usando la siguiente ecuación:

Donde Sy y Dy representan, respectivamente, el valor de la escala de susceptibilidad asignada y la medida de la enfermedad observada (AUDPC o rAUDPC) para el genotipo estándar, y Sx y Dx representan, respectivamente, el valor de la escala de susceptibilidad calculada y la medida de la enfermedad observada para el genotipo en cuestión. En esencia, se divide el valor de la susceptibilidad asignada al testigo por la medida de resistencia del testigo (p.e. AUDPC o rAUDPC) para generar una constante. Esta puede ser multiplicada luego por la medida de resistencia de cada cultivar de interés para obtener el valor de la susceptibilidad de ese genotipo.

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CÁLCULO DE LA ESCALA DE SUSCEPTIBILIDAD USANDO MICROSOFT EXCEL Paso 1: Se usará la misma hoja de cálculo utilizada para calcular el AUDPC y rAUDPC. Seleccione un cultivar susceptible en todos los experimentos. Posicione el cursor en la celda P12 y asigne el valor apropiado de la escala de susceptibilidad (generalmente 8 o 9) a este cultivar susceptible (ejemplo: Desiree, Bintje, Tomasa Condemayta, Diacol Capiro, etc.). En el ejemplo, Desiree es el cultivar seleccionado como susceptible (celda C12) y se le asignó el valor 9 (celda P12).

Paso 2: El valor asignado se divide por el rAUDPC calculado para el mismo cultivar y el valor obtenido se usará como una constante para los siguientes procedimientos. En los ejemplos, el valor asignado para Desiree es 9 (celda P12) y el rAUDPC calculado en el ensayo es 0.65 para esta variedad (celda O12). En la hoja de cálculo, localizar el cursor en la celda Q12 e ingrese la siguiente fórmula: C=P12/O12 Presione la tecla “Enter” y la constante 13.91 aparece en la celda Q12.

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Paso 3: La constante obtenida debe ser multiplicada para cada uno de los valores de rAUDPC de los otros genotipos para obtener los respectivos valores de la escala de susceptibilidad. En la hoja de cálculo, posicione el cursor en la celda R7 e ingrese la siguiente fórmula: El valor de la escala de susceptibilidad para el clon 1 = O7*Q12 Presione la tecla “Enter” y aparece el valor 1.88 en la celda R7.

Paso 4: Copie la fórmula de la celda R7 a las otras celdas de R8 a R12, pero sea cuidadoso de mantener el valor de la constante (celda Q12) en cada formula copiada.

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Una alternativa para calcular el valor de la escala para cada cultivar es colocar el valor de la constante en la fórmula. En la hoja de cálculo, posicione el cursor en la celda R7 e ingrese la siguiente fórmula: El valor de la escala de susceptibilidad para el clon 1 = O7*13.91 Presione la tecla “Enter” y aparece el valor 1.88 en la celda R7.

Copie la fórmula de la celda R7 a otras celdas de R8 a R12. Note que el valor de la escala asignado a Desiree es 9 después del cálculo, el cual es similar al mismo valor previamente asignado.

Ejemplo del uso de la escala de susceptibilidad El cultivar de papa Canchán-INIA, desarrollado en el CIP a finales de los años 1970, fue liberado en el Perú en 1990 como resistente al tizón tardío, pero las cepas compatibles de Phytophthora infestans fueron rápidamente seleccionadas a medida que Canchán se hizo popular y ahora es considerada como muy susceptible en todo el Perú (Tabla 1). A pesar de su susceptibilidad al tizón tardío, Canchán ha mantenido su popularidad como un importante cultivo comercial debido a su rendimiento estable, precocidad y demanda en el mercado. La escala de susceptibilidad es útil para visualizar el incremento en susceptibilidad de la variedad Canchán causada por los cambios en la población del patógeno.

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Tabla 1. Comportamiento histórico del cultivar Canchán (CIP380389.1) en los Andes peruanos.

Zona agroecológica (Rango de altitud, msnm) Huánuco Cajamarcaa, b, c Junína, b, c ,e Pascoa, b, c ,e (2500-2700) (2500-2800) (2600-2800) (1700-1900) 1983-1984 (1) 1990-1991 (1) 1998-1999 (9) 1998-1999 (9) 1984-1985 (1) 1991-1992 (0) 1999-2000 (9) 1985-1986 (1) 1991-1992 (0) 1999-2000 (9) 1986-1987 (1) 1992-1993 (1) 1987-1988 (1) 1993-1994 (2) 1988-1989 (1) 1994-1995 (2) 1996-1997 (1) 1990-1991 (1) b,c,d,e

a

Zonas usadas por el CIP como lugares de selección para resistencia debido a las condiciones propicias para el desarrollo del tizón tardío. b El valor entre los paréntesis indica el valor de la escala de susceptibilidad para el cultivar Canchán en un ensayo llevado a cabo en la zona agroecológica indicada durante la respectiva campaña. c El cultivar Tomasa Condemayta se usó como susceptible y se le asignó el valor más alto de la escala = 9. d Valor de la escala analizado a partir de datos publicados por Egúsquiza, R (ed.) 1984-1990. Sistema Nacional de Evaluación de Recursos Genéticos 1984 -1990. Instituto Nacional de Investigación y Promoción Agropecuaria (INIPA) – Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM). Lima, Perú. e Valor de la escala analizado a partir de datos colectados por el Programa de Mejoramiento para Tizón Tardío del CIP.

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El cultivar Yungay se seleccionó como cultivar susceptible para el programa de mejoramiento del CIP en Perú. Otras variedades, como Tomasa Condemayta y Chata Blanca, tienen altos valores de la escala de susceptibilidad (Tabla 2) pero son tan susceptibles que usualmente alcanzan niveles altos de susceptibilidad muy temprano en la campaña agrícola de manera que no se puede estimar con precisión el rAUDPC y AUDPC para los genotipos experimentales. Tabla 2. Determinación del valor de la escala de susceptibilidad del cultivar de papa Yungay usado como variedad susceptible en el Programa de Mejoramiento para Tizón Tardío del CIP

Zona agroecológica

Comas, Junín

Oxapampa, Pasco

Campaña

2007-2008 1998-1999 2005-2006

Valor de la escala de susceptibilidad estimado para el cultivar Yungayb Canchan (9) 8 Canchan (9) 7 Canchan (9) 6 Chata Blanca (9) 6 Chata Blanca (9) 7 Tomasa 8 Condemayta (9) Chata Blanca (9) 6 Canchán (9) 7 Chata Blanca (9) 5

2008-2009 2009-2010

Chata Blanca (9) Desiree (9)

1998-1999 1999-2000 2000-2001 2004-2005 2005-2006 2006-2007

Variedad susceptible usada como controla

8 7

a

El valor de la escala más alto asignado a la variedad susceptible usada en el experimento. b Valor de la escala analizado a partir de datos colectados por el Programa de Mejoramiento de Tizón Tardío.

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Las mismas variedades evaluadas en diferentes localidades pueden obtener diferentes valores en la escala por muchas razones (Tabla 3). Por ejemplo, pequeñas diferencias de una o dos unidades en la escala pueden ser resultado de efectos ambientales o artificios experimentales. También se pueden observar pequeñas o grandes diferencias debido a la presencia de genes R en algunos clones de papa en los cuales aparecen cepas compatibles en diferentes periodos de la campaña agrícola en diferentes localidades.

Tabla 3. Escala de valores obtenida para variedades peruanas en dos lugares de selección para resistencia durante la misma campaña (2010-2011); la variedad Tomasa Condemayta fue usada como control y se le asignó un valor de 9.

Escala de valores de susceptibilidad Variedades Oxapampa (1813 Paucartambo (2480 msnm) msnm) Chucmarina 0 0 Venturana 0 0 Serranita 1 0 UNICA 2 5 Amarilis 3 6 Capiro 4 7 Liberteña 4 7 Perricholi 5 6 Yungay 5 7 Chaska 7 8 Tomasa 9 9 Canchan 9 8

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BASE DE DATOS GLOBAL DE ENSAYOS DE PAPA Y CAMOTE DEL CIP El CIP, junto a sus colaboradores, promueve el uso de “DataCollector”, un programa que ayuda a estandarizar y asegurar la calidad de los datos (12). Esta herramienta forma parte del Sistema Global de Manejo de Datos del CIP (34) y ayuda a los investigadores en el análisis de datos calculando automáticamente el AUDPC, rAUDPC y la escala de valores de susceptibilidad (Figura 3).

Figura 3. Hoja de EXCEL generada por "DataCollector" mostrando el AUDPC, rAUDPC y la escala de valores de susceptibilidad SAUDPC.

El “DataCollector” también realiza análisis estadísticos basados en la escala de susceptibilidad al tizón tardío y una serie de parámetros adicionales (Figuras 4 y 5). El paquete informático está en desarrollo, pero cuando se culmine dará acceso a los pedigríes de los genotipos, metadatos de los ensayos y datos experimentales de ensayos de papa y camote. El manual del usuario puede descargarse gratuitamente en: https://research.cip.cgiar.org/confluence/display/GDET4RT/Manuals

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Figura 4. Análisis estadísticos realizados con “DataCollector” usando la escala de valores de susceptibilidad.

Figura 5. Comparación de medias realizada con “Data Collector” usando la escala de valores de susceptibilidad.

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LLENANDO LAS PLANTILLAS DEL MÓDULO DE TIZÓN TARDÍO USANDO “DataCollector” La información de tizón tardío se registra en las hojas Excel del DataCollector.

Tabla: Registro de datos Fase

Componentes Datos Mínimos Diseño experimental Instalación Manejo del del cultivo y experimento fechas de y evaluación caracterizació Lista de n de los materiales ambientes de selección Datos de clima Análisis de suelos Resultados del Ensayo

Variables Observadas y calculadas

Métodos

Formato para registro

Lista

Minimal

Lista

Installation

Lista

Crop_Management

Lista

Material_list

Estación meteorol Weather_data ógica Análisis Soil_Analysis de suelos Fieldbook

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Hoja: Mínima El software DataCollector completará esta información de acuerdo con su localidad. Asegúrese de completar la "Fecha de inicio" y la "Fecha de finalización". El formato de fecha correcta es: ‘aaaa-mm-dd. Por favor, incluir un apóstrofe antes de la fecha, por ejemplo: '2014-0916, con el fin de mantener el formato de la fecha.

[Volver a la tabla “Registro de datos”]

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Hoja: Instalación Completar la información requerida de acuerdo a su diseño experimental. NOTA: El tamaño de parcela se refiere a la parcela neta a la cosecha.

[Volver a la tabla “Registro de datos”]

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Hoja: Lista de materiales Completar la columna “Institutional number” y la información de pedigrí. Elegir el clon o genotipo control. En el ejemplo usamos Yungay, cuyo valor en la escala es 6 para evaluaciones en Perú.

[Volver a la tabla “Registro de datos”]

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Hoja: Manejo del cultivo Colocar la fecha de siembra, fecha de cosecha y las fechas de evaluación del follaje afectado por la enfermedad. Es importante colocar un apóstrofe antes de la fecha para evitar que cambie de formato (año-mes-día): ‘aaaamm-dd, por ejemplo: ‘2014-04-07.

[Volver a la tabla “Registro de datos”]

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Hojas: Análisis de suelo y Datos de clima Por favor completar esta información con los datos de su experimento

[Volver a la tabla “Registro de datos”]

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Hoja: Lista de variables Colocar en Selection direction (-) o (+) dependiendo de la variable. Ejm: AUDPC, rAUDPC y SAUDPC (-) y Selection weight (1).

[Volver a la tabla “Registro de datos”]

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Hoja: Libro de campo Permite el ingreso de los datos observados y calculados de las variables de estudio de acuerdo al diseño experimental.

[Volver a la tabla “Registro de datos”]

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LITERATURA CITADA 1. Agrios, G. N. 1989. Fitopatología. Mexico: Editorial Limusa. 2. Andrivon, D., Pelle, R., and Ellisseche, D. 2006. Assessing resistance types and levels to epidemic diseases from the analysis of disease progress curves : Principles and application to potato late blight. American Journal of Potato Research 83:455–461. 3. Annicchiarico, P. 1997. Additive main effects and multiplicative interaction (AMMI) analysis of genotype-location interaction in variety trials repeated over years. Theoretical and Applied Genetics 94:1072– 1077. 4. Bashi, E., Ben-Joseph, Y., and Rotem, J. 1982. Inoculum potential of Phytophthora infestans and the development of potato late blight epidemics. Phytopathol. 72:1043–1047. 5. Beaumont, A. 1947. The dependence on the weather of the dates of outbreak of potato blight epidemics. Trans. Br. Mycol. Soc. 31:45–53. 6. Campbell, C. L., and Madden, L. V. 1990. Introduction to Plant Disease Epidemiology. New York: John Wiley & Sons. 7. Collinge, D. B., and Slusarenko, A. J. 1987. Plant gene expresion in response to pathogens. Plant Molecular Biology 9:389 – 410. 8. Cooke, L., Schepers, H., Hermansen, A., Bain, R., Bradshaw, N., Ritchie, F., Shaw, D., Evenhuis, A., Kessel, G., Wander, J., Andersson, B., Hansen, J., Hannukkala, A., Nærstad, R., and Nielsen, B. 2011. Epidemiology and integrated control of potato late blight in Europe. Potato Research 54:183–222. 9. Cotes, J. M., Nuñez, C. E., Martinez, R., and Estrada, N. 2002. Analyzing genotype by environment interaction in potato using yield-stability index. American Journal of Potato Research 79:211–218. 10. Dick, M. W. 1995. Sexual reproduction in the Peronosporomycetes (chromistan fungi). Canadian Journal of Botany 73(Suppl. 1):5712–5724. 11. Drenth, A., Janssen, E. M., and Govers, F. 1995. Formation and survival of oospores of Phytophthora infestans under natural conditions. Plant Pathology (Oxford) 44:86–94. 12. Forbes, G. A. 2012. Using Host Resistance to Manage Potato Late Blight with Particular Reference to Developing Countries. Potato Research 55:205–216. 13. Forbes, G. A., Escobar, X. C., Ayala, C. C., Revelo, J., Ordoñez, M. E., Fry, B. A., Doucett, K., and Fry, W. E. 1997. Population genetic structure of Phytophthora infestans in Ecuador. Phytopathology 87:375–380.

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El Centro Internacional de la Papa (CIP) es una organización que realiza investigación para el desarrollo con un enfoque en papa, camote, y raíces y tuberosas andinas. El CIP se dedica a entregar soluciones sostenibles basadas en descubrimientos científicos acerca de temas que apremian al mundo tales como el hambre, la pobreza, la equidad de género, el cambio climático, y la preservación de la frágil biodiversidad de nuestro planeta y los recursos naturales. El CIP es un miembro del CGIAR. El CGIAR es una asociación de investigación de la agricultura global para la seguridad alimentaria futura. Sus investigaciones se llevan acabo en 15 centros de investigación que son miembros del Consorcio del CGIAR en colaboración con cientos de organizaciones asociadas. www.cgiar.org Centro Internacional de la Papa• Av. La Molina 1895, La Molina • Apartado 1558 Lima 12, Perú

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