FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS CÁTEDRA DE BIOQUÍMICA AÑO 2014

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE

INDICE Organización de la Cátedra…………………………………………………………………….…………. 3 Condiciones para aprobar la materia…………………………………………………………………… 5 Objetivos Generales de la Materia………………………………………………………………….…… 6 Programa ………………..……………………………………………………………………..…………..... 7 Programa analítico…………………………………………………………………………………………. 8 Cronograma de clases de bioquímica…………………………………………………………....…….. 15 Bibliografía recomendada y complementaria………………………………………………………… 16 Instructivo para confección de monografía…………………………………………………………… 17 Normas de Bioseguridad………………………………………………………………………….……… 21 Materiales de Laboratorio………………………………………………………………………………... 27 Laboratorios…………………………………………………………………………………………………. 36 Laboratorio de Proteínas……………………………………………………………………………..…… 37 Reacción del Biuret………………………………………………………………….…………… 38 Procedimiento para la precipitación por calor…………………………………….………... 39 Reacción de Rivalta………………………………………………………………………..…….. 39 Prueba de Heller………………………………………………………………………………….. 39 Laboratorio de Enzimas………………………………………………………………………………….… 40 Reconocimiento de la Catalasa……………………………………………………...………… 40 Desnaturalización de la Catalasa……………………………………………………………… 42 Laboratorio de Ácidos Nucleicos………………………………………………………………………… 44 Electroforesis de ADN……………………………………………………………………….…... 44 Laboratorio de metabolismo de Purinas y Pirimidinas…………………………………….………… 47 Determinación de ácido úrico……………………………………………………………...…… 48 Laboratorio de Glúcidos………………………………………………………………………….………… 49 Molisch……………………………………………………………………………………………… 49 Lugol ………………………………………………………………………………………………... 50 Fehling ……………………………………………………………………………………………… 50 Barfoed……………………………………………………………………………………………… 51 Laboratorio de Lípidos……………………………………………………………………………………… 51 Formación de emulsiones…………………………………………………..………………...… 52 Saponificación………………………………………………………………..………………….… 52 Caracterización de jabones soluble e insolubles………………………..………………….. 52 Caracterización de ácidos grasos insaturados: Reacción de Hübl…..…………………. 52 Laboratorio de Metabolismo de Lípidos…………………………………………………………………..53 Caracterización de Cuerpos Cetónicos……………………………………………….………………… 53 Laboratorio de Vitaminas………………………………………………………………….………….……. 54 Det. del poder reductor deL ácido ascórbico: Reacción de Fehling…………………….. 56 Reconocimiento de la Vitamina E………………………………….…………………………... 57 Det. Del poder reductor de la vitamina C. Lugol………………………………………….…. 57 Laboratorio de Oxidaciones Biológicas………………………………………………………………… 59 Fermentación alcohólica………………………………………………………………………… 62 Laboratorio de digestión de Rumiantes Monogástricos y Aves………………………………..….. 63 Determinación de la amilasa en líquidos biológicos……………………………….………. 63 Determinación de Tripsina en Mat. Fecal de aves………………………………………..… 63 Desestabilización de la leche por el Cuajo…………………………………………………… 64 Análisis del contenido ruminal……………………………………………………..………….. 65 Potencial Redox………………………………………………………………………..…………. 67 Determinación de la actividad ureásica. Técnica de Caskey…………………..………… 67 Ejercicios de Seminario…………………………………………………………………………..……..…. 71

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Organización de la Cátedra de Bioquímica

Nómina de Docentes de la Cátedra --------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------- -Apellido y Nombres Cargo Docente Dedicación Prof. Titular. Exclusiva Dra. GLADIS LILIA SANDOVAL (GLS) Prof. Adjunto. Semiexclusiva M.V. ENRIQUE CELSO ALMIRÓN (ECA) Jefe de trabajos Prácticos Simple MSc Bioq. GRACIELA P. ESQUIVEL (PEL) Aux. Docente de I Exclusiva Dra. MSc SILVANA LICIA MARUÑAK (SLM) Exclusiva MSc Bioq. MARÍA BÁRBARA DE BIASIO (MBDB) Aux. Docente de I Aux. Docente de I Simple M.V. GLADYS ROXANA E. OBREGÓN (GREO) Aux. Docente de I Simple M.V. VALERIA INÉS AMABLE (VIA)* Aux. Docente de I Simple M.V. GABRIELA LAFFONT (GVL) Aux. Docente de I Semiexclusiva M.V. MARIANO PINO (MSP) Ayudante Alumno Simple Sr LEANDRO JARA Ayudante Alumno Simple Srta MARÍA EUGENIA DIAZ BURATOVICH Ayudante Alumno Simple Sr CLAUDIO R. ROMERO *Licencia sin goce de haberes

Horarios, Salones y Docentes a cargo de clases Clase Comisión de Horario TP Clases Teóricas (IT) Todas 10:00-12:00 Clases Prácticas Áulicas

Clases de la modalidad semipresencial

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8:00-10:00

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8:00-10:00 13:00-15:00 13:00-15:00

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12:00-14:00 12:00-14:00

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A convenir

Iniciación y finalización del Ciclo lectivo 2014: Fecha de Iniciación 07/04/14 Fecha de Finalización 10/07/14

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Docente a cargo Sandoval/Almirón/ Doc.Asignado María B. De Biasio Silvana L. Maruñak Gabriela V.Laffont Mariano Pino / Gladys Obregón Silvana L. Maruñak Gladys Obregón/ Mariano Pino Patricia Esquivel

Salón Lunes / Jueves Modular “B” Lunes: Modular “B” Jueves: Salón D Modular “C” Modular “B” Modular “D” Modular “B” Modular “D” Modular “B”/a convenir

Clase Inaugural Evaluación Integral

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Modalidad: Cursado promocional – Primer cuatrimestre. El presente régimen promocional de la materia incluye la opción de regularizarla para ser aprobada en las sucesivas mesas de examen. Días y Horarios de Clases: lunes y jueves entre las 7:30/8:00 y las 17:30 hs Desarrollo de las clases La materia se desarrolla según dictado cuatrimestral y régimen promocional para los alumnos inscriptos. Son dieciséis (16) unidades temáticas (UT) del Programa Analítico vigente, distribuidas en 4 unidades modulares (UM) las que incluyen 14 introducciones teóricas, 14 clases prácticas áulicas y 4 de Laboratorio, 4 evaluaciones parciales, con sus recuperatorios (uno para cada una + uno extraordinario) y una evaluación integral (VER CRONOGRAMA). Introducciones Teóricas (IT) Días LUNES y JUEVES de 10:00 a 12:00 a cargo de la Profesora Titular, el Profesor Adjunto, con la colaboración de los demás docentes diplomados (según asignación de temas). Se desarrollan los conceptos centrales de los temas del programa analítico vigente, remarcando los aspectos más importantes, utilizando diferentes recursos didácticos, a los cuales los alumnos tienen acceso para consultar. Las clases tendrán una duración de 2 horas reloj y son de carácter optativo en general. Clases Prácticas Áulicas (CP) Clases de 2 horas reloj de duración, desarrolladas los días LUNES y JUEVES en aulas Modular “B”, Laboratorio de Ciencias Básicas, o Modulares “C” y “D”, en forma simultánea en tres turnos, según comisiones (Nº 1 a 6). Se requiere asistencia mínima de un 80 % para los alumnos que desean promocionar la materia y 75 % para la regularización. Se evalúan mediante cuestionarios o trabajos prácticos que se resuelven y discuten en el contexto de la clase. Con la participación en los trabajos indicados en cada clase práctica, se califican con escala de 1 a 10. Estas actividades deberán ser aprobadas en cada UM, el 100 % de las clases asistidas para los alumnos que desean promocionar la materia y el 75 % de las clases dadas para los que la vayan a regularizar, siendo éste un requisito previo a cada evaluación parcial. Las notas obtenidas corresponderán con una escala de aprobación de entre 6 a 10; notas inferiores serán insuficientes y de ser necesario, el trabajo práctico deberá ser recuperado con actividades ad hoc. Trabajos Prácticos de Laboratorio (L) Clases de 2 (dos) horas reloj de duración (cuatro L en total), desarrolladas en días LUNES o JUEVES en el Laboratorio de Ciencias Básicas, en forma sucesiva en turnos a partir de las 7:30 horas, según las 6 (seis) comisiones de laboratorio. De asistencia y aprobación obligatoria, se requieren 4/4 para los alumnos promocionales de la materia y 3/4 para los regulares. La calificación se corresponderá con nota del 1 al 10. Los requisitos son vestimenta adecuada (guardapolvo, guantes, etc.), participación en prácticos, presentación de protocolos completos y aprobación de una evaluación oral o escrita sobre los trabajos prácticos de cada L. Esta instancia también debe ser aprobada, siendo parte de cada evaluación parcial (el 100 % para los alumnos que desean promocionar la materia y el 75 % para los que la vayan a regularizar). Evaluación del proceso Como se desprende de lo anteriormente expuesto, cada evaluación parcial tiene varias instancias de aprobación: Actividad intra-aula Cada clase práctica requiere de la lectura previa del tema, se efectuarán diferentes modalidades de evaluación (oral o escrita, individual y/o grupal). Además, de la misma manera los alumnos deben aprobar los Laboratorios implementados. En ambos casos (CP y L), los alumnos que desean promocionar la materia deberán aprobar el 100 % de las clases asistidas y los que la vayan a regularizar el 75 % de las clases dadas; dicha aprobación los habilita para responder el cuestionario escrito.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Actividad extra-aula Paralelamente al desarrollo de las clases en el aula, se utilizarán dos modalidades de trabajo grupal extra-aula: 1) producción escrita (monografía) y defensa oral sobre temas puntuales; actividad denominada “exposiciones grupales”, que son presentadas en 10 a 15 min por cada grupo en diferentes clases prácticas durante el cursado. 2) Además, se requiere a los alumnos una búsqueda de trabajos de investigación sobre temas asignados previamente, con lectura grupal, interpretación y exposición en clases según normas explícitas. Estas actividades también serán evaluadas en la misma forma que las actividades intra-aula y con los mismos efectos. Evaluación escrita (cuestionario) Se implementarán en los horarios que se informan en transparentes, una por cada UM, en número de cuatro en total, cada una con un recuperatorio (para alumnos regulares). Se deberá aprobar con nota 7 (siete) o más para la promoción y nota de 6 (seis) o más para la regularización. Evaluaciones recuperatorias (oral) Los alumnos que no alcancen el puntaje requerido para la promoción y cumplan con los demás requisitos de la materia, podrán recuperar una sola evaluación parcial en una sola oportunidad. De no alcanzar ese objetivo solo podrán acceder a regularizar la materia. Para los alumnos que vayan a regularizar cada parcial desaprobado tiene un recuperatorio; y además, tendrán derecho a una evaluación recuperatoria extraordinaria en caso de que adeudaren un solo parcial para regularizar la materia. Evaluación integral Los alumnos que cuenten con una asistencia del 80% o mayor, que obtengan nota igual o superior a 7 (siete) en todas las evaluaciones parciales y cumplan con las demás condiciones para la promoción de la materia accederán al examen integral. Éste consistirá en una evaluación escrita integradora, debiendo contestar correctamente el 60% como mínimo de los contenidos; este resultado determinará la nota final para la aprobación con calificaciones de 6 a 10.

CONDICIONES PARA APROBAR LA MATERIA Alumnos promocionados La condición de alumno “promocionado” en Bioquímica se alcanza al finalizar cada dictado intensivo de esta materia, cumpliendo las siguientes exigencias. a) Asistencia al 80% de las clases como mínimo (se incluyen las CP y, según disponibilidad de salones, las IT). b) Aprobación del 100 % de los parciales (los trabajos prácticos de laboratorio deben aprobarse en su totalidad ya que son parte de las evaluaciones parciales), habiendo obtenido un puntaje para la evaluación escrita de 7 (siete) o superior en cada UM. c) Para permitir el acceso a los mecanismos descriptos de promoción, los alumnos que hayan obtenido nota inferior a siete en una sola evaluación parcial tendrán derecho a un solo recuperatorio. d) Aprobación de una Evaluación Integral con un puntaje mínimo de seis (6). Alumnos regulares Si no cumplieren con los requisitos de la promoción pero asistieran al 75% de las clases y aprobaran con un mínimo de seis (6) puntos el 75 % de las evaluaciones parciales (3 de 4 parciales aprobados) quedarán en condición de alumnos “regulares”. En esta última condición podrán aprobar la materia en las mesas constituidas al efecto, en la forma establecida según reglamentación vigente. Las evaluaciones parciales con nota inferior a seis tendrán sus respectivos recuperatorios, teniéndose una segunda posibilidad en el caso de que el alumno adeudare solo una para regularizar la asignatura. Alumnos libres Los que no reúnan las condiciones para la promoción o la regularización de la materia se considerarán alumnos “libres” y podrán rendir Examen Libre según la reglamentación vigente.

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OBJETIVOS GENERALES DE LA MATERIA  Los objetivos generales de la Bioquímica son que el alumno conozca las estructuras de los compuestos presentes en los organismos vivos, sus roles y los esquemas metabólicos de valor universal que dan lugar a los procesos vitales; y que pueda identificar aspectos que destaquen las implicancias de esos conocimientos en Veterinaria. Estos objetivos se alcanzarán mediante: 1) El estudio de a) la terminología, el ambiente de las reacciones bioquímicas vitales y los métodos de estudio de la materia; b) las estructuras, propiedades y roles de los componentes orgánicos e inorgánicos de la matriz vital; c) la bioquímica de la digestión, la absorción, el transporte, almacenamiento y los destinos metabólicos principales de las moléculas presentes en los organismos vivos; y d) los mecanismos de regulación e integración metabólicos. 2) La incorporación de destrezas en: a) técnicas que permitan comprobar algunas de las propiedades de los componentes orgánicos e inorgánicos de la matriz vital e incorporar aspectos fundamentales de la metodología de trabajo y del rol del laboratorio en el ámbito de competencia del médico veterinario; y b) ensayos de búsqueda y análisis bibliográfico y exposición oral de temas relacionados con las estructuras y metabolismos de las distintas moléculas biológicas.

CONTENIDOS MÍNIMOS  Definición y alcances de la Bioquímica estructural y la Bioquímica dinámica. Terminología y métodos de estudio.  Formas químicas, propiedades y roles de los compuestos inorgánicos del organismo animal.  Estructuras, propiedades e importancia del material genético, proteínas, glúcidos, lípidos y algunos de sus compuestos derivados o asociados.  Estructuras, propiedades y mecanismos de acción de las enzimas, vitaminas y otras coenzimas.  Bioenergética: estructura y metabolismo de las moléculas responsables del transporte, almacenamiento y cesión de energía.  Principales rutas metabólicas que siguen los ácidos nucleicos, proteínas, glúcidos, lípidos y sus respectivas moléculas constituyentes o asociadas.  Procesos bioquímicos de la digestión en animales monogástricos, aves y rumiantes, que conducen al aprovechamiento de los alimentos.  Naturaleza química, propiedades de los principales grupos, mecanismos de acción e importancia de las hormonas en la regulación e integración metabólica.

PRERREQUISITOS Conocimientos básicos de Química General, Inorgánica y Orgánica y Físico-Química; especialmente en cuanto a lo concerniente a: Átomo, materia, sustancia, elementos, isótopos, valencia, uniones químicas entre átomos y entre moléculas. Iones, ácidos y bases; pH y sistemas buffer. Estados físicos de la materia. Soluciones, molaridad, molalidad, normalidad. Análisis químico cuali y cuantitativo. Conceptos de energía, tipos, reacciones químicas, equilibrio de las reacciones. Sistemas físicos, entalpía, entropía, energía libre. Compuestos orgánicos, hidrocarburos, funciones orgánicas. Isomería plana y estereoisomería. Nociones de la estructura microscópica y molecular de las células eucarióticas y procarióticas. Unidades base del sistema SI y otras de uso común en físico-química.

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PROGRAMA DE BIOQUÍMICA (FCV-UNNE) PLAN DE ESTUDIOS 2008 VIGENTE DESDE EL AÑO 2009 (Resolución Nº 451/2008) OBJETIVOS DE LA ASIGNATURA Unidad Temática Nº 1: BIOQUÍMICA Y BIOMOLÉCULAS  Delimitar el campo que abarca la Bioquímica, conocer sus implicancias, su importancia en Medicina Veterinaria, la terminología que emplea y los métodos de estudio.  Comprender la importancia del ambiente acuoso en los procesos bioquímicos que tienen lugar en la matriz vital y el rol de los compuestos inorgánicos y orgánicos. Unidad Temática Nº 2: PROTEINAS  Reconocer la estructura, las propiedades, los criterios de clasificación y la importancia biológica de los aminoácidos, péptidos y proteínas y de algunos compuestos derivados. Unidad Temática Nº 3: ENZIMOLOGÍA  Reconocer la naturaleza, propiedades, nomenclatura y mecanismos de acción de las enzimas y deducir su importancia en el organismo y sus aplicaciones en ciencias médicas. Unidad Temática Nº 4: METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS  Reconocer las principales rutas metabólicas en las que están implicadas las proteínas, los aminoácidos y las moléculas asociadas o derivadas y reconocer las estructuras, propiedades y productos de aminoácidos y bases nitrogenadas en diferentes especies animales. Unidad Temática Nº 5: ACIDOS NUCLEICOS  Conocer la naturaleza de la estructura del material genético en diferentes tipos celulares y las propiedades e importancia de las moléculas componentes de las nucleoproteínas y nucleótidos libres. Unidad Temática Nº 6: METABOLISMO DE ÁCIDOS NUCLEICOS  Conocer las principales rutas metabólicas en las que están implicados los ácidos nucleicos y sus moléculas constituyentes. Unidad Temática Nº 7: GLUCIDOS  Conocer clasificación, estructura, propiedades, importancia de los glúcidos y de los compuestos derivados y las técnicas para su caracterización. Unidad Temática Nº 8: METABOLISMO GLUCÍDICO  Comprender los roles, orígenes y destinos de los glúcidos en el organismo animal e identificar las principales rutas de su metabolismo y las conexiones con los demás compuestos no glucídicos. Unidad Temática Nº 9: LIPIDOS  Conocer clasificación, estructura, propiedades, importancia de los lípidos y las sustancias asociadas a ellos y las técnicas para su caracterización Unidad Temática Nº 10: METABOLISMO LIPÍDICO  Comprender los roles de los lípidos y sustancias asociadas o derivadas en el organismo animal y conocer las principales rutas del metabolismo de los ácidos grasos y los lípidos y los destinos de dichas moléculas en los diferentes organismos vivos.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Unidad Temática Nº 11: VITAMINAS  Reconocer las estructuras, propiedades y reacciones químicas en las que intervienen las vitaminas y deducir su importancia en el organismo animal, en especial en su rol como coenzimas. Unidad Temática Nº 12: ASPECTOS MOLECULARES DE LA ACCIÓN HORMONAL: BIOQUÍMICA DE LAS HORMONAS  Diferenciar la distinta naturaleza química de las hormonas y las propiedades de los principales grupos, reconocer las estructuras básicas, los mecanismos de acción y su importancia en la regulación e integración metabólicas. Unidad Temática Nº 13: UTILIZACION DE LA ENERGIA POR LOS ORGANISMOS VIVOS  Reconocer las moléculas responsables del transporte, almacenamiento y cesión de energía para el normal funcionamiento orgánico, las rutas aeróbicas y anaeróbicas y la síntesis de compuestos ricos en energía. Unidad Temática Nº 14: BIOQUÍMICA DE LA DIGESTION EN MONOGÁSTRICOS Y AVES  Identificar los procesos bioquímicos de la digestión en animales monogástricos y aves, los mecanismos de acción, sustratos y productos de las enzimas de las diferentes partes del tracto digestivo y sus particularidades. Unidad Temática Nº 15: BIOQUÍMICA DE LA DIGESTION EN EL RUMIANTE  Conocer el rol de los microorganismos ruminales, las condiciones y particularidades de los procesos bioquímicos digestivos de los rumiantes y su importancia en el aprovechamiento de los alimentos, en especial de la celulosa y el nitrógeno no proteico. Unidad Temática Nº 16: INTEGRACIÓN Y CONTROL DE LOS PROCESOS METABÓLICOS  Reconocer los esquemas metabólicos de valor universal que dan lugar a los procesos vitales y su integración en el metabolismo intermedio, profundizando en ejemplos para comprender la interrelación y control de las vías metabólicas.  Adquirir el concepto de “lesión bioquímica” y la noción de la importancia de su identificación para poder predecir las consecuencias de la alteración de los procesos bioquímicos “normales” y para reconocer las armas disponibles en bioquímica clínica y el rol del laboratorio en el ámbito de competencia del médico veterinario. PROGRAMA ANALITICO Unidad Temática Nº 1 BIOQUÍMICA Y BIOMOLÉCULAS a) Definición, alcances como disciplina y como ciencia interdisciplinaria. Bioquímica descriptiva y bioquímica dinámica. Objeto e importancia de la Bioquímica actual. Fuentes bibliográficas. Bioquímica y Medicina Veterinaria. Terminología científica. Métodos de estudio. Bioseguridad. b) Bioelementos. Clasificación y funciones de los principales bioelementos. Biomoléculas: organización jerárquica molecular en las células. Medios extra e intracelular. Agua y electrolitos. Estructuras molecular y macromolecular del agua; rol en los sistemas biológicos, acción como disolvente, ionización de la molécula y participación en el equilibrio iónico. Distribución del agua en el organismo animal; proporciones en los diferentes tejidos. Unidad Temática Nº 2 PROTEINAS a) Concepto. Aminoácidos: definición, clasificación. Estructuras y propiedades de los aminoácidos que constituyen las proteínas y de los aminoácidos no proteicos; importancia del tamaño y polaridad de las cadenas laterales. Aplicación en el estudio de las proteínas. Ión bipolar. Comportamiento ácido base de los

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE aminoácidos, propiedades eléctricas. Punto isoeléctrico. Propiedades ópticas, estereoisomería. Aminoácidos esenciales. El enlace peptídico. b) Polipéptidos y proteínas: importancia y diversidad funcional de las proteínas. Clasificación según su función. Clasificación según su forma: fibrosas y globulares. Estructura de las proteínas; fuerzas covalentes y no covalentes determinantes. Niveles de organización estructural: primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. Propiedades generales. Factores físico-químicos que condicionan la conformación de las proteínas. Desnaturalización: agentes que alteran la estructura nativa. Hidrólisis. Diferencias entre proteínas animales y vegetales. Péptidos, polipéptidos y proteínas de interés en medicina. Proteínas transportadoras de oxígeno: mioglobina y hemoglobina. Inmunoglobulinas: tipos, zona variable, sitio de unión al antígeno, región constante y región variable. Glucoproteínas: estructura molecular de los sistemas de transportadores de membrana, canales iónicos y receptores. Unidad Temática Nº 3 ENZIMOLOGIA a) Definición. Naturaleza química de enzimas, coenzimas, cofactores, zimógenos e isoenzimas. Nomenclatura y clasificación según la Unión Internacional de Bioquímica. Propiedades de las enzimas. Diferencias con catalizadores inorgánicos. Sitio catalítico y otras regiones de la superficie de las enzimas. Especificidad. Asimetría de la unión enzima-sustrato. Compartimentalización celular de las enzimas. Sistemas enzimáticos extracelulares. Asociaciones multienzimáticas. b) Mecanismo de acción enzimatica: unión enzima-sustrato; modelos de “llave y cerradura” o de Fischer y de “ajuste inducido” o de Koshland. Mecanismos catalíticos: catálisis ácido-base, covalente, de iones metálicos, de proximidad y orientación y unión preferencial del complejo de estado de transición. Velocidad de la reacción enzimática. Factores que influyen sobre la reacción enzimática: concentración del sustrato, pH, temperatura, cofactores y coenzimas. Activación. Inducción y represión enzimática. Inhibición competitiva y no competitiva. Regulación metabólica y alostérica. Enzimas en el diagnóstico clínico y como insumos de laboratorio. Cuantificación de la actividad enzimática. Unidades. Unidad Temática Nº 4 METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS a) Relaciones entre el nitrógeno inorgánico y el orgánico. Fijación biológica de nitrógeno. Asimilación de amoníaco por los organismos vivos; biosíntesis de glutamato, glutamina, asparragina y carbamoil fosfato. Fuentes de aminoácidos. Proteólisis, vida media de las proteínas. Pozo común de aminoácidos. Destinos metabólicos de los aminoácidos. Características comunes de las vías de degradación de aminoácidos. Desaminación y descarboxilación. Función precursora de los aminoácidos: formación de aminas biógenas. Metilación. Metionina activa. Transferencia de metilos. Rol del ácido tetrahidrofólico. Transaminación y mecanismo de acción del fosfato de piridoxal. Interconversión de aminoácidos. Metabolismo de triptófano, fenilalanina e histidina. b) Destino del residuo no nitrogenado. Aminoácidos glucogénicos y cetogénicos. Degradación de la cadena carbonada de los aminoácidos. Rutas que conducen a ácido pirúvico, a intermediarios del ciclo de los acidos tricarboxílicos y a acetil-CoA. Destinos del nitrógeno amínico. Animales ureotélicos, uricotélicos y amoniotélicos. Biosíntesis de urea; vías de eliminación y recuperación en diferentes especies animales. Unidad Temática Nº 5 ACIDOS NUCLEICOS a) Definición. Importancia en los procesos vitales y como base de la herencia. Bases puricas y pirimídicas. Unión con ribosa y fosfatos. Nucleósidos y nucleótidos. Estructura del ATP, UTP, GTP. Propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos. Unión entre nucleótidos. b) Ácidos nucleicos. Estructura y rol biológico. RNAm, RNAt y ribosoma. Estructura del DNA procariótico y eucariótico. Modelo de Watson y Crick. Diferencias entre DNA nuclear (cromatina), mitocondrial, bacteriano y viral. Unidad Temática Nº 6 METABOLISMO DE ÁCIDOS NUCLEICOS a) Definiciones de terminología genética, código genético y mutaciones. Flujo de la información genética. Duplicación del ADN, mecanismo en procariotas; diferencias con eucariotas. Naturaleza secuencial,

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE dirección, enzimas. Transcripción del ADN en procariotas. Biosíntesis de ácidos ribonucleicos (ARNm, ARNt y ARNr). b) Biosíntesis de proteínas: esquemas básicos; etapas: iniciación, elongación, terminación. Nucleótidos libres. Importancia biológica. Su relación con los metabolismos. Catabolismo de bases puricas y pirimídicas. Síntesis y eliminación de ácido úrico y beta-alanina. Unidad Temática Nº 7 GLUCIDOS a) Definición. Clasificación y función biológica de los glúcidos. Monosacáridos y oligasacáridos de interés, estructuras, propiedades. Isomería de monosacáridos. Compuestos estructuralmente relacionados y derivados de monosacáridos: ésteres fosfóricos de los monosacáridos; deoxiazúcares; alcoholes; aminoazúcares; Nacetil aminoazúcares; ácidos derivados de los monosacáridos: aldónicos, urónicos y aldáricos; lactonas. b) Disacáridos: maltosa, isomaltosa, celobiosa, sacarosa, lactosa. Polisacáridos de reserva y estructurales. Homopolisacáridos: almidón, celulosa, pectinas, glucógeno. Heteropolisacáridos; Mucopolisacáridos: ácido hialurónico, condroitín sulfato, queratán sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato. Glicoproteínas. Glicolípidos. Pared celular vegetal, estructura y función biológica. Unidad Temática Nº 8 METABOLISMO GLUCÍDICO a) Importancia de los glúcidos de la dieta en el metabolismo. Absorción y destinos metabólicos de la glucosa dentro de las células procariotas y eucariotas. Glucólisis. Fermentación y respiración aeróbica: destinos metabólicos del ácido pirúvico; descarboxilación oxidativa, complejo piruvato deshidrogenasa; formación y destinos del Acetil CoA. Síntesis de ácido acético por las bacterias. Síntesis de ácido láctico por las bacterias y el músculo. Formación de ácido propiónico por las bacterias. Utilización del ácido propiónico por el animal. b) Otras rutas de degradación de la glucosa: Vía de las pentosas fosfato. Gluconeogénesis; necesidad fisiológica de síntesis de glucosa por los animales. Ciclo de Cori. Biosíntesis de glucógeno; glucógeno sintasa. Glucógenolisis. Papel del almacenamiento muscular y hepático de glucógeno. Unidad Temática Nº 9 LIPIDOS a) Definición. Propiedades generales. Clasificación. Estructura química. Glicerol y otros “alcoholes grasos”. Acidos grasos saturados y no saturados; propiedades, fórmulas. Importancia biológica. Formación de sales o jabones. Hidrólisis química. Lípidos simples: acilglicéridos de importancia biológica. Grasas y aceites. Propiedades físico-químicas de los acilglicéridos. Actividad óptica. Ceras. Galactoglicéridos. b) Lípidos complejos. Glicerofosfolípidos no nitrogenados y nitrogenados. Esfingolípidos y glicoesfingolípidos. Estructura y función. Propiedades físicas e importancia. Sustancias asociadas a lípidos: compuestos de estructura terpenoide y esteroidea. Esteroles y esteroides. Clasificación general. Nomenclatura y fórmulas. Colesterol. Importancia biológica. Lípidos en la estructura de membranas. Lipoproteínas. Biomembranas: modelos estructurales. Componentes lipídicos. Fluidez de las membranas, rol de esteroles. Componentes proteicos; ubicación en la membrana; proteínas periféricas e integrales. Unidad Temática Nº 10 METABOLISMO LIPÍDICO a) Productos de la digestión de lípidos y absorción. Síntesis y transporte de triglicéridos en la mucosa intestinal. Transporte de los lípidos a los tejidos; roles de las lipoproteínas. Captación celular de los lípidos circulantes. Tejido adiposo; Grasa blanca y Grasa parda. Movilización de ácidos grasos almacenados. Factores Lipotrópicos. Catabolismo de los glicéridos. Degradación de los ácidos grasos: activación de ácidos grasos, la acil-CoA ligasa. Lanzadera de la carnitina. Beta-oxidación de los ácidos grasos; rendimiento energético. Oxidación de ácidos grasos insaturados y de número impar de átomos de carbono. Formación y metabolismo de los cuerpos cetónicos.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE b) Anabolismo de los lípidos. Biosíntesis de ácidos grasos (sistema mitocondrial); lipogénesis. Biosíntesis de ácidos grasos por el sistema de la malonil S.CoA o protoplasmático. Esquema del metabolismo de lípidos simples y complejos. Metabolismo de esteroides; transporte de colesterol y su utilización en animales. Estructuras y metabolismos de otros compuestos isoprenoides: Eicosanoides (prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos).

Unidad Temática Nº 11 VITAMINAS a) Generalidades. Estructuras químicas, funciones y fuentes de las vitaminas. Vitaminas liposolubles: A (retinol), A2 (3- dehidrorretinol), D2 (ergocalciferol), D3 (colecalciferol), E (tocoferol), K (factor de coagulación). Vitaminas hidrosolubles: B1 (tiamina) B2 (riboflavina), B6 (piridoxina), B12 (cianocobalamina), C (ácido ascórbico), Niacina, ácido pantoténico, ácido fólico, colina, carnitina.

b) Importancia de las vitaminas como coenzimas. Biosíntesis de coenzimas que utilizan nucleótidos de adenina (FAD, NAD, NADP y coenzima A). Síntesis de vitaminas en rumen. Unidad Temática Nº 12 ASPECTOS MOLECULARES DE LA ACCIÓN HORMONAL: BIOQUÍMICA DE LAS HORMONAS a) Comunicación intercelular: endócrina, parácrina y autócrina. Aspectos generales de la bioquímica de las hormonas. Concepto. Clasificaciones según su naturaleza química, su origen, el sitio de acción y duración del efecto, ejemplos. Esquema general de la biosíntesis de hormonas proteicas y no proteica; ejemplos. Secreción, transporte y degradación. b) Mecanismos de acción de las hormonas: receptores y efectores, conceptos y clasificaciones. Mecanismos de transducción de señales por receptores de membrana plasmática: proteinas G. Segundos mensajeros: adenilciclasa, guanilciclasa, ión calcio; metabolismo del fosfatidilinositol 4,5-difosfato: generación de IP3, diacilglicerol y ácido araquidónico. La calmodulina. Características generales de los receptores de hormonas esteroideas y tiroideas. Mecanismos de acción de las prostaglandinas. Otras señales químicas extracelulares: conceptos y ejemplos de feromonas, prostanoides, neurotransmisores y factores de crecimiento. Unidad Temática Nº 13 UTILIZACION DE LA ENERGIA POR LOS ORGANISMOS VIVOS a) Catabolismo y anabolismo. Concepto de energía: reacciones exergónicas y endergónicas. Energía libre y reacciones químicas. Enlaces ricos en energía. Potencial de transferencia de grupos. Acoplamiento energético. Fuentes de energía en los sistemas biológicos. Rol central del ATP como transportador de energía libre. Oxidación biológica, la mitocondria como escena de la acción. Etapas de la respiración. Generación de acetil coenzima A. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos o de Krebs: reacciones, enzimas, balances y rol biosintético de algunos compuestos intermedios. b) Cadena respiratoria y fosforilación oxidativa. Introducción. Componentes principales de la cadena respiratoria. Deshidrogenasas. Flavoproteínas. Ubiquinona. Coenzima Q. Citocromos, transporte de electrones. Fosforilación oxidativa, complejo ATPasa, localización, sistema de enzimas, mecanismo. Control respiratorio, acoplamiento de la fosforilación oxidativa con el transporte de electrones. Sistema mitocondrial de transporte para substratos respiratorios y sus productos. El oxígeno como substrato para otras reacciones metabólicas; oxidasas y oxigenasas; citocromo P-450. Incompleta reducción del oxígeno; antioxidantes naturales. Unidad Temática Nº 14 BIOQUÍMICA DE LA DIGESTION EN MONOGÁSTRICOS Y AVES a) Los alimentos, clasificación. Composición química de la dieta de las especies animales. Procesos químicos de la digestión en monogástricos: carnívoros y omnívoros (proteínas, ácidos nucleicos y nucleoproteínas, hidratos de carbono y lípidos). Actividad de las enzimas y composición de las secreciones

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE digestivas. Absorción de agua, sales minerales, glúcidos, lípidos, aminoácidos y bases púricas y pirimídicas en el tracto digestivo. b) Procesos químicos de la digestión en las aves, generalidades. Composición de la saliva. Bioquímica de la digestión en: buche, proventrículo y molleja. Enzimas de los jugos pancreático e intestinal. Rol digestivo de la bilis. Fenómenos químicos de la digestión en intestino grueso y ciegos. Características y composición de las heces. Unidad Temática Nº 15 BIOQUÍMICA DE LA DIGESTION EN EL RUMIANTE a) Condiciones del rumen como cuba de fermentación. Micropoblación ruminal, clasificación según localización y sustratos. Digestión microbiana de los hidratos de carbono: celulosa, almidón, pectina, disacáridos y monosacáridos; importancia del fósforo. Importancia de los ácidos grasos volátiles producidos por bacterias. Aprovechamiento y metabolismo de los AGV en el rumiante. b) Hidrólisis de las proteínas en el rumen. Proteínas vegetales. Importancia de la solubilidad y estructura. Acción bacteriana en el metabolismo proteico. Utilización de los aminoácidos. Importancia de la proteína

bacteriana y de los infusorios. Absorción del nitrógeno en el rumen. Importancia del amoníaco y la urea en el metabolismo ruminal. Ciclo de recuperación de la urea. Degradación y absorción de los lípidos en el rumen. Fermentación de la galactosa y glicerina e hidrogenación de los ácidos grasos insaturados. Importancia de los ácidos grasos microbianos. Alimentos que escapan a la degradación ruminal. Degradación y aprovechamiento de diversos sustratos en librillo, cuajar e intestino. Unidad Temática Nº 16 INTEGRACIÓN Y CONTROL DE LOS PROCESOS METABÓLICOS a) Metabolismo específico de tejidos. Interdependencia entre los principales órganos en el metabolismo energético de los animales. División de tareas metabólicas entre los órganos más importantes. Metabolismo intermedio. Nociones de la regulación del metabolismo por hormonas. Principal regulación hormonal del metabolismo energético. b) Adaptación metabólica: regulación de los niveles de nutrientes en los tejidos ante diferentes estados nutricionales y hormonales. Control hormonal de la glucemia: acciones hormonales a corto y a largo plazo (efectos en los metabolismos de glúcidos, lípidos y proteínas). Cambios del metabolismo energético: estrés metabólico del ayuno y la diabetes como ejemplos para la comprensión de la integración metabólica. Concepto de Lesión bioquímica. Dra Gladis Lilia Sandoval de Grando Profesora Titular PROGRAMA DE TRABAJOS PRÁCTICOS CLASES PRÁCTICAS ÁULICAS (CP) CP1: Unidad Temática Nº 1 y 2ª Taller sobre el trabajo en laboratorio de química, bioseguridad y prevención de accidentes. Reconocimiento de materiales utilizados y su conservación. Ejercitación de estructuras y nomenclatura de aminoácidos, su clasificación y propiedades, unión peptídica y péptidos de interés en medicina. CP2: Unidad Temática Nº 2b Resolución de ejercicios de opción múltiple referentes a propiedades físico-químicas de aminoácidos y proteínas de interés en medicina. CP3: Unidad Temática Nº 3 Ejercitación en reconocimiento de enzimas, nomenclatura, mecanismos de acción y ubicación en la clasificación de la UIB. Interpretación de gráficos de actividad enzimatica según influencia de factores que

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE afectan su actividad. Trabajo grupal de análisis e interpretación de publicaciones científicas seleccionadas previamente sobre actividad de enzimas e isoenzimas y métodos de estudio, con exposición oral ante la clase. CP4: Unidad Temática Nº 4 Ejercitación sobre reacciones comunes del metabolismo de aminoácidos y proteínas en diferentes especies animales. CP5: Unidad Temática Nº 5 Ejercicios de aplicación para fijación de conceptos acerca de estructuras, nomenclaturas, propiedades e importancia biológica de nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos. CP6: Unidad Temática Nº 6 Trabajo grupal sobre metabolismo de ácidos nucleicos y síntesis de proteínas, basado en lectura y análisis de trabajos científicos. Análisis comparativo del catabolismo de bases púricas y pirimídicas. Síntesis y eliminación de ácido úrico, orígenes y valores normales en el suero de especies ureotélicas y uricotélicas. CP7: Unidad Temática Nº 7 Glúcidos: reconocimiento e interpretación de las formas isoméricas. Ejercitación sobre estructuras de glúcidos y derivados por reducción, oxidación y sustitución. CP8: Unidad Temática Nº 8 Resolución de crucigramas e incógnitas en esquemas metabólicos centrales en el metabolismo de los glúcidos, con discusión sobre respuestas correctas e incorrectas. CP9: Unidad Temática Nº 9 Ejercicios de aplicación para fijación de conceptos acerca de estructuras, nomenclaturas y propiedades de lípidos simples, complejos y sustancias asociadas. CP10: Unidad Temática Nº 10 Análisis e interpretación de esquemas sobre composición y metabolismo de las lipoproteínas plasmáticas. Comparación entre anabolismo y catabolismo de ácidos grasos. CP11: Unidad Temática Nº 11 Lecturas complementarias sobre importancia y rol de las vitaminas liposolubles e hidrosolubles. Elaboración de cuadros comparativos. CP12: Unidad Temática Nº 12 Exposiciones grupales de temas seleccionados por los alumnos a partir de títulos sugeridos previamente en relación con las estructuras y los mecanismos de acción hormonales. CP13: Unidad Temática Nº 13a Ciclo de Krebs: trabajo grupal de estudio y análisis del ciclo, con práctica de fórmulas e identificación de las conexiones de los diferentes intermediarios con otras vías metabólicas. Resolución de crucigramas. CP14: Unidad Temática Nº 13b Exposiciones grupales de temas seleccionados por los alumnos a partir de títulos sugeridos previamente y en relación con los substratos y vías para la obtención de energía; respiración aerobia y anaerobia. Cadena respiratoria y fosforilación oxidativa. CP15: Unidad Temática Nº 13b Resolución de incógnitas en esquemas del metabolismo intermedio. Exposiciones grupales de temas seleccionados por los alumnos a partir de títulos sugeridos previamente y con relación a la regulación hormonal del metabolismo energético. CP16: Unidad Temática Nº 13b Elaboración de cuadros comparativos referentes a sustratos, enzimas y productos en los diferentes niveles del tubo digestivo de monogástricos y aves. CP17: Unidad Temática Nº 13b Elaboración de cuadros comparativos referentes a sustratos, enzimas y productos en los diferentes niveles del tubo digestivo de rumiantes. Condiciones de una cuba de fermentación, analogías con el rumen. Ciclo de recuperación del nitrógeno: esquematización.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE CLASES PRÁCTICAS DE LABORATORIO – Según Unidades Temáticas (UT 1 a UT 16)

Laboratorio de UT 1 a 6: Prácticas de Laboratorio sobre ambiente celular, Aminoácidos, Proteínas, Enzimas y Metabolismo nitrogenado. Laboratorio de UT 7 a 10: Prácticas de Laboratorio sobre Glúcidos, Lípidos y sus Metabolismos. Laboratorio de UT 11 a 13: Prácticas de Laboratorio sobre Vitaminas, Bioquímica de las Hormonas y Oxidaciones biológicas. Laboratorio de UT 14 a 16: Prácticas de Laboratorio sobre Bioquímica de la Digestión en monogástricos, aves y rumiantes. Metabolismo Intermedio.

PROGRAMA DE EXAMEN

UT = Unidad Temática Bolilla 1: UT 1a- 11a-16a

Bolilla 7: UT 4a-7a-15b

Bolilla 2: UT 1b- 11b-13a

Bolilla 8: UT 4b-7b-15a

Bolilla 3: UT 2a- 10b-14a

Bolilla 9: UT 5a-8b -13b

Bolilla 4: UT 2b- 10a-14b

Bolilla 10: UT 5b-8a -14a

Bolilla 5: UT 3a- 9b-16b

Bolilla 11: UT 6a-12b-13a

Bolilla 6: UT 3b- 9a-16a

Bolilla 12: UT 6b-12a-15b

Antoine-Laurent de Lavoiser (1743-1794). Considerado el padre de la química moderna por sus trabajos sobre combustión, composición química del agua y del aire, entre otros.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE CRONOGRAMA DE CLASES-CÁTEDRA DE BIOQUÍMICA – 1º cuatrimestre – AÑO 2014 – Clase Nº

Fecha

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Jueves – 17 de abril Lunes – 21 de abril

Contenidos IT y CP de UT 1: Introducción a la Bioquímica. Matriz Vital. Agua. Bioelementos y biomoléculas. Materiales de laboratorio y bioseguridad. Clase introductoria a alumnos presenciales y semi-presenciales. IT y CP de UT 2 y 3: Proteínas y Enzimas I IT y CP de UT 3 y 4: Enzimas II y Metabolismo de Aminoácidos y Proteínas. Feriado (Jueves Santo) IT y CP de UT 5: Ácidos Nucleicos.

5

Jueves –24 de abril

IT y CP de UT 6: Metabolismo de ácidos nucleicos.

6

Lunes – 28 de abril

7 8 9 10 11

Lunes – 05 de mayo Jueves –08 de mayo Lunes –12 de mayo Jueves –15 de mayo Lunes –19 de mayo

12/13

Jueves –22 de mayo

14

Lunes –26 de mayo

15

Jueves –29 de mayo

16

Lunes –02 de junio

17

Jueves –05 de junio

Lab de UT 1 a 6: Ambiente celular, Aminoácidos, Proteínas, Enzimas y Metabolismo nitrogenado. Evaluación Parcial Nº 1 de UT 1 a 6 IT y CP de UT 7: Glúcidos IT y CP de UT 8: Metabolismo de Glúcidos IT y CP de UT 9: Lípidos IT y CP de UT 10: Metabolismo de Lípidos. Lab de UT 7 a 10: Glúcidos, Recuperatorio Evaluación Parcial Nº 1 (ORAL) Lípidos y sus Metabolismos. Evaluación Parcial Nº 2 de UT 7 a 10 IT y CP de UT 11 y 12: Bioquímica de Vitaminas y Hormonas Exposiciones Grupales (ORAL) IT y CP de UT 13 (1ra parte): Utilización de Energía en los Organismos Vivos - Oxidaciones biológicas – Ciclo de Krebs IT y CP de UT 13 (2da parte): Oxidaciones biológicas, Cadena Respiratoria y Fosforilación Oxidativa. Lab de UT 11 a 13: Vitaminas, Recuperatorio Evaluación Parcial Bioquímica de las Hormonas y Nº 2 (ORAL) Oxidaciones biológicas. IT y CP de UT 14 y 15: Bioquímica de la Digestión en Monogástricos, Aves y Rumiantes Evaluación Parcial Nº 3 de UT 11 a 13 IT y CP de UT 16: Metabolismo Intermedio e Integración. Lab de UT 14 a 16: Bioquímica de la Digestión en monogástricos, aves y rumiantes. Metabolismo Intermedio. Recuperatorio Evaluación Parcial Nº 3 (ORAL) Evaluación Parcial Nº 4 de UT 14 a 16 Recuperatorio Evaluación Parcial Nº 4 (ORAL) Recuperatorio Extraordinario de Evaluaciones Parciales (ORAL/ESCRITO) Evaluación Integral (ESCRITO / ORAL)

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Lunes – 07 de abril

2

Jueves –10 de abril

3

Lunes –14 de abril

18/19

Lunes – 09 de junio

20

Jueves –12 de junio

21 22

Lunes –16 de junio Jueves –19 de junio

23

Lunes –23 de junio

24 25 26

Jueves –26 de junio Lunes –30 de junio Jueves –3 de julio

27

Lunes –7 de julio

28

Jueves – 10 de julio

Fecha de iniciación del ciclo: 7/04/14 Clase Inaugural Fecha de finalización: 10/07/14 Evaluación Integral 15

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA (*) Y COMPLEMENTARIA 1.

(*)BERG JM TYMOCZKO JL & STRYER L. BIOCHEMISTRY. Fifth Edition, 2002. W.H.

2.

(*)BLANCO, A.: Química Biológica, 7ma. ed., El Ateneo, Buenos Aires, 2000.

3.

(*)BOREL, J.P.; RANDOUX, A.; MAQUART, F.X.; LE PEUCH, C. & VALEIRE, J.: Bioquímica Dinámica, 1ra. ed. en español, Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires, 1989.

4.

(*)CAMPBELL, NA & REECE, JB. Biología. 7ª ed., Ed. Médica Panamericana, University of California, Riverside, Berkeley, California, 2007. http://www.medicapanamericana.com/campbell/

5.

(*)CURTIS H y BARNES N S. Autores de la actualización de la 6º ed.: CURTIS, H; BARNES, NS; SCHNEK, A; FLORES, G. Biología. 7º. Ed., Panamericana, Buenos Aires, 2007. http://www.curtisbiologia.com/

6.

(*)HERRERA, E.: Elementos de Bioquímica, 1ra. ed. en español, Interamericana, México, 1993.

7.

(*)LEHNINGER, A., NELSON, D.L. y COX, M.M. "PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA", editorial Omega, 3ª Edición, 2002.

8.

(*)McGILVERY, R.W. & GOLDSTEIN, G.W.: Bioquímica - Aplicaciones Clínicas, 3ra. ed. en inglés y 2da. En español, Nueva Editorial Interamericana, México, 1986.

9.

(*)MURRAY, R; GRANNER, D; MAYES, P & RODWEL, V: Bioquímica de Harper, 15ta. ed., El Manual Moderno, México, 2000.

10. (*)ROSKOSKI, R. Bioquímica. McGrow-Hill. 2000. 11. (*)VOET, D. y VOET, J. G. "BIOQUIMICA", 3º ed., Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires, 2006. www.medicapanamericana.com 12. (*)VOET, D; VOET, JG & PRATT, ChW. Fundamentos de Bioquímica. La vida a nivel molecular. 2º ed., Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires, 2007. www.medicapanamericana.com 13. BRESCIA, F.; ARENTS, J.; MEISLICH, H. & TURK, A.: Fundamentos de Química, 3ra. ed., Compañía Editorial Continental, México, 1980. 14. CHURCH, D.C.: Fisiología digestiva y España, 1983.

nutrición

de los rumiantes, Vol. 1, 2 y 3, Acribia, Zaragoza,

15. CONN, E.E. & STUMPF, P.K.: Bioquímica fundamental, 3ra. ed., Limusa, México 1977. 16. DE ROBERTIS, NOWINSKI, SAEZ. Biología Celular. 12da. Ed. Bs. As., El Ateneo, 1998. 17. DEVLIN T. Bioquímica, libro de texto con aplicaciones clínicas. 2 Tomos. 3ª Edición. Editorial Reverté 1999, 2000. 18. HENRY, J.B.: Todd-Sanford-Davidsohn Diagnóstico y Tratamiento Clínicos por el Laboratorio, Tomos I y II, 8va. ed., Promotora Editorial, México, 1991. 19. KOLB, GURTHER, KETZ, SCHRODER, Y SEIDEL. Fisiología Veterinaria. 2a. ed. española. Zaragoza, Acribia, 1976. 20. LEHNINGER, Albert. Bioquímica. 3a. ed. Barcelona, Omega, 1979. 21. LINDQUIST R. Bioquímica, problemas. Interamericana Mc Graw- Hill (1991). 22. MAIDANA, Sergio. Bioquímica de la digestión ruminal. 1a. ed. Resistencia, Moro, 1982. 23. MATHEWS C., VAN HOLDE K., AHERN K G. Bioquímica. 3º Edición. Addison Wesley, 2002. 24. MAYNARD. Nutrición animal. 7ma. Ed, 1981. 25. MONTGOMERY. Bioquímica, casos y texto, 6ta. Ed, 1998.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 26. MONTGOMERY; DRYER; CONWAY & SPECTOR: Bioquímica Médica, 1ra. ed. en español, Salvat Editores, Barcelona, España, 1984. 27. NIEMEYER, H.: Bioquímica, 2da.ed., Intermédica, Buenos Aires, 1974. 28. RAWN J. D. Tomos I y II.. –Bioquímica-1ra. Edición. Ed. Interamericana - McGraw-Hill. 1989. 29. STRYER L. Bioquímica. Ed. Reverté, 1995. 30. VILLEE S. Biología. 4ta. ed, 1998. 31. W.H. Freeman, New York. EN: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=stryer.TOC&depth=10

INSTRUCTIVO PARA CONFECCIÓN DE MONOGRAFÍA "Una monografía estructura en forma analítica y crítica la información recogida en distintas fuentes acerca de un tema determinado. Exige una selección rigurosa y una organización coherente de los datos recogidos. Dicha selección y organización sirve como indicador del propósito que orientó la escritura" (en Kauffman y Rodríguez; 1994, página 47). La monografía debe estar organizada en: 1. Carátula: la carátula es la primer hoja, donde debe constar a. asignatura b. título del tema c. autores d. año 2.

Introducción: enmarca el tema y destaca su importancia.

3.

Desarrollo: exposición del contenido temático

4. Conclusión: proporciona un resumen del tema expuesto que cierra el planteo de la introducción. Debe ser sintética pero completa. 5. Bibliografía: Las referencias bibliográficas deben escribirse siguiendo las normas contenidas en este documento. Éstas normas pueden consultarse, para su ampliación y mayor comprensión en: http://www.hospitalitaliano.org.ar/docencia/biblioteca/attachs/vancouver%20N%ba%201.pdf Para la entrega de la monografía en Bioquímica se tendrán en cuenta los siguientes aspectos:  Deben consignarse al menos tres fuentes bibliográficas consultadas, las cuales NO deben pertenecer a una sola de las 5 categorías señalas (A, B, C, D, E). La extensión del trabajo no debe superar las 10 páginas en letra 12 y doble espacio.  La monografía será evaluada en función a su pertinencia al tema, presentación, ortografía (más de 10 errores ortográficos implicarán el descuento de un punto en la calificación) y caligrafía en el caso de los manuscritos.  La nota de la monografía es la misma para todos los integrantes del grupo.  Este trabajo debe ser presentado el mismo día en que el grupo haga su exposición oral.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE

*Normas para la escritura de Referencias bibliográficas Las referencias bibliográficas se numerarán correlativamente según el orden en el que aparecen por primera vez en el texto. Se identificarán en el texto, en las tablas y en las leyendas mediante números arábigos entre paréntesis. Las referencias citadas únicamente en las tablas o en las leyendas de las figuras se numerarán de acuerdo con el orden establecido por la primera identificación dentro del texto de cada tabla o figura en particular. Se utilizará el estilo de los siguientes ejemplos, que se basan en los formatos que emplea la National Library of Medicine (NLM) de los Estados Unidos en el Index Medicus. Los títulos de las revistas deberán abreviarse, según el estilo empleado en el Index Medicus. Debe consultarse la List of Journals Indexed in Index Medicus, que publica anualmente la NLM por separado y en el número correspondiente al mes de enero del Index Medicus. El listado también se puede obtener a través de Internet: http://www.nlm.nih.gov. Se evitará la utilización de resúmenes como referencias. Las referencias a originales aceptados pero todavía no publicados se designarán con expresiones como«en prensa» o «de próxima aparición»; los autores deberán obtener autorización por escrito para citar dichos artículos y comprobar que han sido admitidos para su publicación. La información procedente de artículos remitidos pero rechazados, se mencionará en el texto como «observaciones no publicadas», previa autorización por escrito de la fuente. Se evitarán las referencias del tipo «comunicación personal», salvo cuando ofrezcan información esencial no disponible en fuentes públicas, en cuyo caso figurarán entre paréntesis en el texto el nombre de la persona y la fecha de la comunicación. Si se trata de artículos científicos, los autores deberán obtener de la fuente de la comunicación personal la autorización por escrito y la confirmación de su exactitud. Las referencias bibliográficas deberán ser cotejadas por el (los) autor(es) con los documentos originales. El estilo de los requisitos de uniformidad (estilo Vancouver) se basa en gran medida en el estilo normalizado ANSI adoptado por la NLM para sus bases de datos (por ejemplo, MEDLINE). Se han añadido notas en los casos en que el estilo Vancouver difiere del estilo utilizado por la NLM.

A) Artículos de revista • (1) Artículo estándar (Se mencionan los 6 primeros autores y, si su número excede de 6, se añade la expresión «et al.») [Nota: La NLM incluye actualmente hasta 25 autores; si hay más de 25, la NLM cita los 24 primeros, luego el último autor y finalmente añade «et al.»]. Vega KJ, Pina I, Krevsky B. Heart transplantation is associated with an increased risk for pancreatobiliary disease. Ann Intern Med 1996 Jun 1;124(11):980-3. Como opción, si una revista lleva paginación continua a lo largo del volumen (como sucede con muchas revistas médicas) pueden omitirse el mes y el número. [Nota: Por coherencia, esta alternativa se emplea en los ejemplos de este documento. La NLM no aplica esta opción.] Vega KJ, Pina I, Krevsky B. Heart transplantation is associated with an increased risk for pancreatobiliary disease. Ann Intern Med 1996;124:980-3. En el caso de más de 6 autores: Parkin DM, Clayton D, Black RJ, Masuyer E, Friedl HP, Ivanov E, et al. Childhood leukaemia in Europe after Chernobyl: 5 year follow-up. Br J Cancer 1996;73:1006-12. • (2) Autor institucional The Cardiac Society of Australia and New Zealand. Clinical exercise stress testing. Safety and performance guidelines. Med J Aust 1996;164:282-4. • (3) No se menciona autor Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994;84:15. • (4) Artículo en idioma distinto del inglés [Nota: La NLM traduce el título al inglés, cita el título original entre corchetes y añade una indicación del idioma original en abreviatura.] Ryder TE, Haukeland EA, Solhaug JH. Bilateral infrapatellar seneruptur hos tidligere frisk kvinne. Tidsskr Nor Laegeforen 1996;116:41-2. • (5) Suplemento de un volumen

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Shen HM, Zhang QF. Risk assessment of nickel carcinogenicity and occupational lung cancer. Environ Health Perspect 1994;102 Suppl 1:275-82. • (6) Suplemento de un número Payne DK, Sullivan MD, Massie MJ. Women's psychological reactions to breast cancer. Semin Oncol 1996;23(1 Suppl 2):89- 97. • (7) Parte de un volumen Ozben T, Nacitarhan S, Tuncer N. Plasma and urine sialic acid in non-insulin dependent diabetes mellitus. Ann Clin Biochem 1995;32(Pt 3):303-6. • (8) Parte de un número Poole GH, Mills SM. One hundred consecutive cases of flan lacerations of the leg in ageing patients. N Z Med J 1994;107(986 Pt 1):377-8. • (9) Número sin volumen Turan I, Wredmark T, Fellander-Tsai L. Arthroscopic ankle arthrodesis in rheumatoid arthritis. Clin Orthop 1995;(320):110- 4. • (10) Sin número ni volumen Browell DA, Lennard TW. Immunologic status of the cancer patient and the effects of blood transfusion on antitumor responses. Curr Opin Gen Surg 1993:325-33 • (11) Paginación en números romanos Fisher GA, Sikic BI. Drug resistance in clinical oncology and hematology. Introduction. Hematol Oncol Clin North Am 1995 Apr;9(2):xi-xii. • (12) Indicación del tipo de artículo según corresponda Enzensberger W, Fischer PA. Metronome in Parkinson's disease [carta]. Lancet 1996;347:1337. Clement J, De Bock R. Hematological complications of hantavirus nephropathy (HVN) [resumen]. Kidney Int 1992;42:1285. • (13) Artículo que contiene una retractación Garey CE, Schwarzman AL, Rise ML, Seyfried TN. Ceruloplasmin gene defect associated with epilepsy in EL mice [retractación de Garey CE, Schwarzman AL, Rise ML, Seyfried TN. In: Nat Genet 1994;6:426-31]. Nat Genet 1995;11:104. • (14) Artículo retractado Liou GI, Wang M, Matragoon S. Precocious IRBP gene expression during mouse development [retractado en Invest Ophthalmol Vis Sci 1994;35:3127]. Invest Ophthalmol Vis Sci 1994;35:1083-8. • (15) Artículo sobre el que se ha publicado una fe de erratas Hamlin JA, Kahn AM. Herniography in symptomatic patients following inguinal hernia repair [fe de erratas en West J Med 1995;162:278]. West J Med 1995;162:28-31. B) Libros y otras monografías [Nota: En versiones anteriores de las normas de estilo de Vancouver figuraba incorrectamente una coma, en lugar de un punto y coma, entre el editor y la fecha.] • (16) Personas como autores Se coloca en este orden: Autor/es. Título del libro. Edición. Lugar de publicación: Editorial; año. Nota: la primera edición no es necesario consignarla. La edición siempre se pone en números arábigos y abreviatura: 2ª ed. – 2nd ed. Si la obra estuviera compuesta por más de un volumen, debemos citarlo a continuación del título del libro: ……….. . Vol. 3 Ringsven MK, Bond D. Gerontology and leadership skills for nurses. 2nd ed. Albany (NY): Delmar Publishers; 1996. • (17) Directores de edición y compiladores como autores Norman IJ, Redfern SJ, editores. Mental health care for elderly people. New York: Churchill Livingstone; 1996. • (18) Organización como autor y editor Institute of Medicine (US). Looking at the future of the Medicaid program. Washington: The Institute; 1992. • (19) Capítulo de libro [Nota: En versiones anteriores de las normas de estilo de Vancouver figuraba una coma, en lugar de una «p. » delante de las páginas]

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Phillips SJ, Whisnant JP. Hypertension and stroke. In: Laragh JH, Brenner BM, editors. Hypertension: pathophysiology, diagnosis, and management. 2nd ed. New York: Raven Press; 1995. p. 465-78. • (20) Actas de congreso Kimura J, Shibasaki H, editores. Recent advances in clinical neurophysiology. Proceedings of the 10th International Congress of EMG and Clinical Neurophysiology; 1995 Oct 15-19; Kyoto, Japan. Amsterdam: Elsevier; 1996. • (21) Ponencia presentada a congreso Se coloca en este orden: Autor/es de la comunicación/ponencia. Título de la comunicación/ponencia. En: Título oficial del congreso. Lugar de publicación. Editorial; año. Página inicial-final de la comunicación/ponencia. Nota: es frecuente que la fecha y ciudad de celebración formen parte del título del congreso. Esta misma estructura se aplica a Jornadas, Conferencias, Simoposios, Reuniones, etc. Bengtsson S, Solheim BG. Enforcement of data protection, privacy and security in medical informatics. En: Lun KC, Degoulet P, Piemme TE, Rienhoff O, editores. MEDINFO 92. Proceedings of the 7th World Congress on Medical Informatics; 1992 Sep 6-10; Geneva, Switzerland. Amsterdam: North-Holland; 1992. p. 1561-5. • (22) Informe científico o técnico Se coloca en este orden: Autor/es. Título del informe. Lugar de publicación. Organismos/Agencia editora; año. Número o serie identificatoria del informe. Publicado por el organismo financiador o patrocinador: Smith P, Golladay K. Payment for durable medical equipment billed during skilled nursing facility stays. Final report. Dallas (TX): Dept. of Health and Human Services (US), Office of Evaluation and Inspections; 1994 Oct. Report No.: HHSIGOEI69200860. Publicado por el organismo realizador: Field MJ, Tranquada RE, Feasley JC, editors. Health ser-vices research: work force and educational issues. Washington: Nacional Academy Press; 1995. Contract No.: AHCPR282942008. Patrocinado por la Agency for Health Care Policy and Research. • (23) Tesis doctoral (o similar) Se coloca en este orden: Autor. Título de la tesis [tesis doctoral]. Lugar de edición: Editorial (si está editada); año. Kaplan SJ. Post-hospital home health care: the elderly's access and utilization [tesis doctoral]. St. Louis (MO): Washington Univ.; 1995. • (24) Patente Larsen CE, Trip R, Johnson CR, inventores; Novoste Corporation, assignee. Methods for procedures related to the electrophysiology of the heart. US patente 5,529,067. 1995 Jun 25. C) Otros trabajos publicados • (25) Artículo de periódico Se coloca en este orden: Autor del artículo*. Título del artículo. Nombre del periódico** año mes día; Sección***: página (columna). * Autor del artículo, si figura ** Los nombres de periódicos o diarios se colocan completos *** Si existiera identificada como tal Navarra, Gabriela. “Patentar genes plantea un grave riesgo”: entrevista con el coordinador del Programa Latinoamericano del Genoma Humano. La Nación 2001 Junio 21. p. 14 Lee G. Hospitalizations tied to ozone pollution: study estimates 50,000 admissions annually. The Washington Post 1996 Jun 21;Sect.A:3 (col. 5). • (26) Material audiovisual Se coloca en este orden: Autor/es. Título del video [video]. Lugar de edición: Editorial; año. Aplicable a todos los soportes audiovisuales. HIV+/AIDS: the facts and the future [video]. St. Louis (MO): Mosby- Year Book; 1995. • (27) Mapa North Carolina. Tuberculosis rates per 100,000 population, 1990 [mapa demográfico]. Raleigh: North Carolina Dept. of Environment, Health, and Natural Resources, Div. of Epidemiology; 1991.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE • (28) Diccionario y obra de consulta similar Stedman's medical dictionary. 26th ed. Baltimore: Williams & Wilkins; 1995. Apraxia; p. 119-20. D) Trabajos inéditos • En prensa [Nota: La NLM prefiere la expresión «de próxima aparición» ("forthcoming"), puesto que no todos los trabajos serán impresos.] Leshner AI. Molecular mechanisms of cocaine addiction. N Engl J Med. En prensa 1996. E) Material informático • Artículo de revista en formato electrónico Se coloca en este orden: Autor. Título. Nombre de la revista abreviado [tipo de soporte] año, [fecha de acceso]; volumen (número): páginas o indicador de extensión. Disponible en: Morse SS. Factors in the emergence of infectious diseases. Emerg Infect Dis [serie en línea] 1995 Jan-Mar [citado 1996 Jun 5];1(1):[24 pantallas]. Disponible en: URL: http://www.cdc.gov/ncidod/EID/eid.htm • Monografía en formato electrónico Se coloca en este orden: Título [tipo de soporte]. Editores o productores. Edición. Versión. Lugar de publicación: Editorial; año. CDI, clinical dermatology illustrated [monografía en CD-ROM]. Reeves JRT, Maibach H. CMEA Multimedia Group, producers. 2nd ed. Version 2.0. San Diego: CMEA; 1995. • Archivo informático Se coloca en este orden: Autor. Título [tipo de soporte]. Versión. Lugar: Editorial; año. Hemodynamics III: the ups and downs of hemodynamics [programa informático]. Version 2.2. Orlando (FL): Computerized Educational Systems; 1993.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD INTRODUCCIÓN El trabajo en el laboratorio en mayor o menor grado, está sujeto a riesgos de todo tipo, que debemos conocerlos para poder evitarlos. La concientización del personal basada en la discusión e información permanentes es la mejor manera de eliminar accidentes. Definición de BIOSEGURIDAD: es la seguridad y protección de lo viviente. ACCIDENTE: causas y consecuencias. Según la OMS “Accidente” es todo suceso inesperado que en forma veloz y repentina, ocasiona interrupción o interferencia en la tarea, pudiendo ocasionar o no una lesión al trabajador, pérdidas de material, deterioro del ambiente, pérdida de tiempo, etc. Al estudiar un accidente se deben valorar todas las etapas:

CAUSA

ACCIDENTE

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CONSECUENCIAS

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE FACTORES ACCIDENTALES: -Técnicos: infraestructura e insumos necesarios. -Sociales: inestabilidad laboral, sobrecarga de horas de trabajo, bajos salarios, etc. -Personales: pueden ser a su vez: individuales (desequilibrio emocional), colectivos (fallas en las relaciones interpersonales). RIESGOS:  RIESGO DE INCENDIO El laboratorio es un lugar de riesgo potencial alto de incendio debido a la existencia de: -instalaciones y aparatos eléctricos. -almacenamiento de líquidos inflamables. -gases inflamables comprimidos. -material de plástico (fácilmente combustible, productor de grandes cantidades de humo y gases tóxicos) Un programa de lucha contra el fuego debe comprender aspectos de prevención de manera de evitar que el incendio se produzca; protección, para que una vez iniciado el fuego se minimicen las consecuencias; y control. CLASES DE FUEGO: CLASE SIMBOLO Triángulo verde A letra blanca

A

B

Cuadrado rojo Letra blanca

B

C

Círculo azul Letra blanca

C D

Estrella amarilla Letra blanca

D

CARACTERISTICAS Fuegos que se desarrollan sobre combustibles sólidos: madera, papel, tela, goma, plástico, etc.

FORMAS DE EXTINCION Por enfriamiento. Matafuego aconsejado: agua muy eficiente, polvo o anhídrido carbónico relativamente eficiente.

Fuego sobre líquidos y gases: Por sofocación. Matafuego gasolina, solventes, grasas, aconsejado: polvo o pinturas, aceites, ceras, etc. anhídrido carbónico muy eficiente, agua no eficiente.

Fuegos que se desarrollan sobre materiales, equipos o instalaciones sometidas a corriente eléctrica.

Con sustancias no conductoras. Matafuego aconsejado: polvo o anhídrido carbónico. AGUA NO DEBE USARSE. Fuegos que se desarrollan La extinción no se realiza sobre metales combustibles: con los agentes sodio, potasio, magnesio, etc. convencionales sino con polvos especiales para cada uno de ellos.

Pautas básicas para prevenir el riesgo de incendio:  Los líquidos inflamables deben almacenarse en pequeñas cantidades, en recipientes seguros y en armarios especiales.  Cuando se trabaja con líquidos inflamables debe ser en zonas ventiladas y lejos de cualquier llama o fuente de calor.  Los recipientes que han contenido material inflamable deben ser lavados convenientemente antes de eliminarlos.  No se deben arrojar solventes orgánicos ni líquidos inflamables por el desagüe.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE   

Nunca se fumará en el laboratorio. Se deben revisar periódicamente las instalaciones de gases comprimidos, para detectar posibles fugas. Todo el personal debe conocer las salidas de emergencia y debe ser capaz de alcanzarlas aún a oscuras.

Reglas elementales de ataque y modo de utilizar el matafuego:  Ataque el fuego en la dirección del viento.  Al combatir fuegos en superficies líquidas, comience por la base y parte delantera del fuego.  Al combatir en derrames, empiece a extinguir desde arriba hacia abajo.  Es preferible usar siempre varios extinguidores al mismo tiempo, en vez de emplearlos uno tras otro.  Esté atento a una posible reiniciación del fuego, no abandone el lugar hasta éste quede completamente apagado. 

RIESGO ELECTRICO La existencia de este riesgo se debe a la existencia de aparatos eléctricos que pueden ser causa de accidentes, tanto por acción directa de la electricidad sobre las personas, como de la posibilidad de originar fuegos y explosiones. Es necesario recordar algunas definiciones para entender el vocabulario: Electricidad: agente físico que se manifiesta como una diferencia de potencial eléctrico entre dos puntos de una sustancia. Si estos dos puntos se unen se produce una circulación de corriente eléctrica. Corriente eléctrica: puede ser de dos tipos: Continua: tiene intensidad, diferencia de potencial y sentido de circulación constantes. Alterna: su intensidad, diferencia de potencial y sentido de circulación, varían en forma periódica regular. Intensidad de corriente: es el número de cargas que circula por unidad de tiempo, su unidad es el Ampere. Diferencia de potencial: es la diferencia de nivel eléctrico entre dos puntos de un sistema, es la fuerza impulsora del movimiento de cargas. La unidad es el voltio. Resistencia: es la dificultad que opone el circuito a la circulación de corriente, su unidad es el Ohm. De acuerdo a la forma en que afectan el cuerpo humano, las intensidades de corriente se clasifican en: -corrientes peligrosas: hasta 25 mA. -corrientes muy peligrosas: desde 25 mA. La resistencia del cuerpo humano depende de los siguientes factores: Piel: es la superficie de contacto (a menor superficie mayor resistencia), importan también su humedad (a mayor humedad menor resistencia), su grosor (mayor grosor mayor resistencia) su temperatura y lesiones (disminuye la resistencia). Estado general del individuo: el hambre, ser, fatiga, sueño, preocupaciones, etc. disminuyen la resistencia que presenta el cuerpo. Entonces, de acuerdo a lo dicho, la severidad del daño dependerá de la cantidad de corriente recibida, del estado previo del individuo y del tiempo de exposición. Las lesiones pueden variar desde una contracción muscular refleja (“quedarse pegado”) con corrientes menores a 25 mA. Quemaduras y paro respiratorio con corrientes entre 25 y 70 mA. Con corrientes del orden de 100 mA, paro cardíaco, fibrilación cardíaca daños al sistema nervioso y muerte. Los medios de protección lo constituyen las conexiones a tierra, los transformadores de seguridad, etc. siendo el medio más idóneo los disyuntores diferenciales.  RIESGO QUIMICO Es la posibilidad de sufrir daños a través de un accidente con un “reactivo”. Un reactivo es toda sustancia química que se utiliza para investigar o reconocer otra sustancia, según la “reacción” que se produzca. Se pueden clasificar en orgánicos o inorgánicos o en generales y especiales. Existe el riesgo químico en la forma de almacenamiento, transporte, manipulación y descarte de reactivos. Almacenamiento: en términos generales, las drogas deben guardarse en lugares secos, frescos, protegidos del polvo y la luz. Estos lugares deben preservarse del acceso de personas ajenas al trabajo específico para evitar accidentes por imprudencia o desconocimiento.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Transporte: el personal debe estar capacitado acerca de los peligros que poseen los reactivos que manipula y de cuál es la forma de proceder en casos de derrames o fugas. Manipulación: existen una serie de normas básicas: - En el lugar de trabajo se deben disponer solo de las disoluciones a utilizar, o bien los reactivos puros fraccionados en recipientes adecuados. - No se deben regresar fracciones excedentes de reactivos a los frascos originales. - Los tapones nunca deben dejarse sobre la mesada. - Se debe disponer de material absorbente en el lugar de trabajo, para casos de derrames. - Cuando se realizan reacciones que produzcan vapores o gases tóxicos, se debe trabajar bajo campana. - Nunca se deben oler directamente de la boca del frasco, sino con la mano dirigir los vapores hacia la nariz. - Nunca se deben gustar los productos con los que trabaja. - Los líquidos inflamables no se calientan a la llama directamente, y no se descartan en las piletas. - No se deben arrojar a la pileta, ni a papeleros los restos de sodio o potasio. - Nunca se arrojara agua sobre metales alcalinos o fundidos, porque puede producirse una explosión. - Cuando se calienten sustancias en tubos de ensayo, dirigir la boca del tubo hacia un lugar despejado flameando el tubo sobre la llama. - Los restos de cianuro nunca se arrojaran a la pileta, ya que si hay restos de ácidos se produciría ácido cianhídrico, gas toxico mortal. - Al trasvasar reactivos conviene hacerlo con embudos. Descarte: cuando se eliminan los reactivos, primero deben inactivarse de manera tal que no sea peligroso para la comunidad o para el medio ambiente. Efectos de las sustancias químicas sobre el organismo. De acuerdo a su peligrosidad los reactivos químicos se clasifican según el siguiente cuadro: Pictograma

Clasificación y Precaución Evitar choque, percusión, fricción, formación de chispas, fuego y acción del calor. Peróxidos orgánicos, sustancias y mezclas que en contacto con materiales combustibles pueden llevar a estos a la combustión de explosión. Evitar cualquier contacto con sustancias inflamables. Evitar cualquier contacto con el cuerpo humano, ya que pueden provocar graves daños para la salud posiblemente irreversibles y con consecuencias mortales. Se hace referencia especial a la acción cancerígena, teratógena o riesgos de alteraciones genéticas. Evitar contacto con el cuerpo humano, también inhalación de vapores. Posibles daños para la salud en caso de empleo inadecuado. No se descarta acción cancerígena, teratógena o riesgos de alteraciones genéticas. Líquidos con punto de inflamación inferior a 0ºC y punto de ebullición máximo de 35ºC. Mantener lejos de llamas abiertas, chispas y fuentes de calor. Líquidos con punto de inflamación inferior a 21ºC. Gases licuados con punto de inflamación a presión normal. Sustancias y mezclas que en contacto con agua y aire húmedo liberan gases fácilmente inflamables. Mantener lejos de llamas abiertas, chispas y fuentes de calor.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Destrucción de la piel en su total grosor, en piel sana e intacta. Evitar contacto con los ojos, la piel y la ropa mediante medidas protectoras especiales. No inhalar vapores.

Claros daños en los ojos e irritación de la piel, que se mantienen como mínimo 24 hs posteriores a la acción, o irritación de las vías respiratorias. Evitar contacto con los ojos, la piel y la ropa mediante medidas protectoras especiales. No inhalar vapores. Cabe destacar que los pictogramas se encuentran en todos los rótulos de los reactivos químicos, de allí la importancia de conocer su significado y las precauciones a tomar en cada caso.  RIESGO BIOLOGICO Es la posibilidad de contraer enfermedades infecciosas a partir del manipuleo de “material biológico”. El material biológico se puede definir como el conjunto de materia orgánica que es o potencialmente puede ser, reservorio de agentes infecciosos, por ejemplo: sangre, orina, tejidos, fluidos y secreciones corporales, etc. En medicina veterinaria se suma el riesgo de contraer enfermedades infecciosas transmitidas por animales (zoonosis), por lo tanto se debe considerar también dentro de las normas de bioseguridad, el correcto manejo de animales. Existen una serie de normas que varían según la especie y la finalidad, no es lo mismo el manejo de animales con objetivos clínicos que con fines de experimentación para la investigación. En este último caso se siguen Procedimientos Operacionales Estandarizados, son efectivos para realizar una determinada labor y lograr su objetivo y que se realizan de forma estándar. Las normas prácticas en el manejo de las distintas especies animales serán vistas en las materias correspondientes. En el presente curso nos limitaremos a dar las posibles formas de infección accidental y las precauciones generales a tener en cuenta. En el siguiente cuadro se resumen las posibles vías de ingreso al organismo, los accidentes más frecuentes y las precauciones a tomar. Accidentes más frecuentes

Vías de ingreso

Precauciones

Inhalación de aerosoles

RESPIRATORIA

Evitar producción de aerosoles. Utilizar material de protección adecuado (barbijos)

Ingestión accidental de material biológico. Inoculación parenteral de material biológico. Herida cortante y contacto directo con el material biológico. Mordeduras accidentales de animales infectados o peligrosos.

DIGESTIVA

CUTÁNEA

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Evitar pipetear con la boca. Utilizar pro-pipetas o dispensadores. Evitar contacto directo con el material biológico (usar guantes descartables). Correcto manipuleo de animales.

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NORMAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD-LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior. Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común realizadas en forma rutinaria. 1. Durante su estancia en el laboratorio, el alumno deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello recogido (guardapolvo preferentemente de algodón y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes). 2. No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse. 3. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. Al finalizar el laboratorio los alumnos dejarán todo el material ordenado y limpio. 4. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de laboratorio y antes de retirarse del mismo. 5. Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias químicas o material biológico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberá tocar objetos, ni superficies tales como: teléfonos, lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc. 6. No pipetear con la boca. 7. No se permitirá correr en los laboratorios. 8. Dado que muchas prácticas requieren el uso de corriente eléctrica, se deberá tener especial cuidado de evitar la manipulación de elementos húmedos o reactivos inflamables en sus proximidades. 9. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarán anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales y otros dispositivos de protección. Cuando se manipulen productos químicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto. 10. Se requerirá el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de producción de aerosoles (mezcla de partículas en medio líquido) o polvos, durante operaciones de pesada de sustancias tóxicas o biopatógenas, apertura de recipientes con cultivos después de agitación, etc. 11. Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de ignición. Para calentamiento, sólo se utilizaran resistencias eléctricas o planchas calefactoras blindadas. Se prestará especial atención al punto de inflamación y de autoignición del producto. 12. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plásticas. El que sea necesario reparar se entregará limpio al taller. 13. Será necesario que todo recipiente que hubiera contenido material inflamable, y deba ser descartado sea vaciado totalmente, escurrido, enjuagado con un solvente apropiado y luego con agua varias veces. 14. Está prohibido descartar líquidos inflamables, tóxicos, corrosivos o material biológico por los desagües de las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos. 15. Los laboratorios contarán con un botiquín de primeros auxilios con los elementos indispensables para atender casos de emergencia. 16. En el laboratorio sólo podrán estar los alumnos del grupo correspondiente. No se admitirán visitas.

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MATERIALES DE LABORATORIO Definición: Este ítem comprende todos los elementos que se utilizan corrientemente en los laboratorios de química. Describiremos aquí los más comunes y los que serán manipulados por los alumnos en forma mas frecuente a lo largo del curso de Bioquímica y otras materias afines dentro de la carrera. Clasificación: 1) De acuerdo a su constitución  Material de vidrio  Material de goma  Material de metal  Material de madera  Instrumental (el desarrollo de éste apartado escapa al alcance del presente apunte). 2) De acuerdo a su capacidad para medir volúmenes  Volumétricos  No volumétricos Material de vidrio: Este rubro constituye la mayor parte de los elementos de un laboratorio, debiendo reunir ciertas propiedades de resistencia. El vidrio es una mezcla de silicatos y existen variedades con mayor o menor termorresistencia (termorresistencia se refiere a la capacidad que poseen para soportar elevadas temperaturas; existe otra variedad llamada "vidrio blanco" o termofusible, el cual es maleable a temperaturas más bajas), con diferentes proporciones de óxidos en su composición, etc. Como se puede apreciar, los vidrios termorresistentes son mezclas poliméricas de boratos (BO 3') y silicatos (SiO 4"), los cuales se encuentran eslabonados (unidos) tridimensionalmente en forma desordenada (ya que se considera un líquido enfriado hasta solidificar, sin cristalizar) Estos vidrios resistentes a altas temperaturas (500 °C) tienen muy bajo contenido en álcalis, son neutros, de muy baja solubilidad y bajo coeficiente de dilatación (resistentes a roturas por cambios térmicos bruscos) y son incoloros. Sólo son atacados por los ácidos fluorhídrico y fosfórico concentrados y en caliente, y también por algunos álcalis en las mismas condiciones, como el hidróxido de sodio (NaOH). En general se utiliza el vidrio PIREX, y otros como el Duran-Jena y Schott-Jena. Se reconocen por inmersión en una solución con el mismo índice de refracción que ellos poseen (por ejemplo en soluciones de tetracloruro de carbono al 51% y benceno al 49%), en las cuales no es posible visualizar sus bordes. Los vidrios coloreados se obtienen por el agregado de óxidos de distintos metales. Limpieza: El material de vidrio debe estar siempre perfectamente limpio, ya que su contaminación puede conducir a resultados erróneos. En general deben lavarse con detergente y enjuagarse con agua destilada. En caso de efectuarse pruebas en las que interfiera la presencia de iones (Ca3+, Fe2+, PO4H2) el lavado debe efectuarse con detergentes no iónicos y enjuagarse una vez con acido clorhídrico (HCI) y repetidamente con agua bidestilada o desionizada. Para quitar restos de material no removible con el procedimiento anterior y la ayuda de cepillos, se pueden utilizar mezclas químicas más agresivas. Ellas pueden ser soluciones de:  Bicromato de sodio o potasio (50 g) y acido sulfúrico (100 ml) en agua (llevando el volumen final a 1000 ml). Esta mezcla se denomina sulfocrómica

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE  Ácido sulfúrico concentrado y acido nítrico, llamada mezcla sulfonítrica  Jabón y agua en caliente  Soluciones de hidr6xido de sodio o de potasio El material se sumerge en estas soluciones y se deja actuar durante un tiempo variable y se lava nuevamente. Material volumétrico y no volumétrico: Esta clasificación, como su nombre lo indica, se basa en la posibilidad que brindan los diferentes elementos de vidrio para medir distintos volúmenes de líquidos. El material no volumétrico es de medidas estándares, pero no calibrado para cuantificar volúmenes exactos. Materiales volumétricos:  Probeta  Matraz aforado  Micropipeta  Pipetas  Bureta Materiales no volumétricos:  Pipeta Pasteur  Embudo  Balón  Tubo de ensayo  Vaso de precipitación  Caja de Petri  Capsula de porcelana

      

Erlenmeyer Kitasato Mortero Frasco gotero Ampolla de decantación Vidrio de reloj Frasco de reactivos

Los elementos que se usan en volumetría tienen ciertas características que se describen a continuación: Graduación: Divisiones representadas por líneas, que abarcan parte o todo del contorno del elemento volumétrico y responden a las fracciones del volumen total a medir. Así, una pipeta o una probeta se pueden encontrar divididas en diez grandes fracciones; entre cada una de estas fracciones se pueden presentar a su vez diez subdivisiones. Si una probeta contiene un volumen total de 100 ml, cada división será equivalente a 10 ml y cada subdivisión a 1 ml. Si se tratara de una pipeta de 10 ml, cada división sería 1 ml y cada subdivisión 0,1 ml. Para averiguar los volúmenes correspondientes a las divisiones de materiales graduados se puede plantear una regla de tres simple: 10 divisiones 10 ml (o 100 ml) 1 división x = 1 ml (o 10 ml) Esto vale para las divisiones y las subdivisiones Aforo: Es la marca (línea) que poseen ciertos materiales volumétricos, la cual indica el volumen total que pueden contener a una temperatura determinada (generalmente a 20° C). Estos datos deben estar registrados en el recipiente, y se refieren a la "capacidad" del mismo. Menisco: Este término no indica un elemento del material, sino que corresponde a la forma que adopta la superficie del líquido contenido en el recipiente, al "mojar" el vidrio. Esta forma, depende de la mayor o menor tensión superficial y de si se trata de líquidos polares (como el agua) o no polares (como los hidrocarburos). Los líquidos polares poseen mayor tensión superficial, lo que limita su capacidad para "mojar" sólidos o mezclarse con otros

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE líquidos no similares (como el agua y el aceite). El mercurio (Hg) tiene la tensión superficial más alta de todos los líquidos a temperaturas normales; por ello, al estar contenidos en un recipiente su superficie está más elevada en la parte central (no "rnoja" las paredes).

Enrase: Es el procedimiento por el cual se hace coincidir el menisco con el aforo o línea de graduación al medir un líquido. Estos elementos deben estar a la altura del ojo del observador teniendo la precaución de apoyar el recipiente sobre una superficie plana horizontal (para las probetas) o de mantenerlo perpendicular a dicha superficie (para las pipetas).

Descripción de los materiales de vidrio volumétricos: MATERIAL

DESCRIPCIÓN

Probeta: Recipiente cilíndrico graduado, con borde superior terminado en pico de jarra. Posee una base que puede ser de vidrio, madera o plástico. Para utilizarlas se apoyan sobre las mesadas, se carga el líquido hasta un volumen ligeramente inferior al requerido, y luego se completa lentamente hasta enrasar. Matraz aforado:

Bureta:

Recipiente esférico con base plana y cuello generalmente largo, donde se halla el aforo, aunque puede no estar (puede ser también no volumétrico). De capacidad variable, sirven para preparar y guardar soluciones. Se cargan generalmente con embudo y en forma similar a las probetas. Es un tubo terminado en punta afinada y graduado. Por medio de un robinete o llave (debe estar lubricado) permite la salida del líquido contenido en forma gradual, generalmente por goteo. De capacidad variable, son usadas para medir volúmenes exactos, por ejemplo al efectuar titulaciones. Se cargan por arriba (con embudo) o por abajo por succión superior. Se sostienen en soportes adecuados, El robinete tiene dos posiciones extremas (cerrado y abierto) e intermedias. Se usa en operaciones en que se necesita medir volúmenes con gran exactitud.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Pipetas bola o de traslado:

En su parte media poseen una dilatación o bulbo; puede tener uno o dos aforos y están calibradas para un volumen fijo de líquido. No son graduadas.

De capacidad inferior al mililitro. Se clasifican en manuales y automáticas. Las primeras son de vidrio, aforadas, se conectan a una manguera de goma con boquilla para cargar por succión y descargar soplando.Su uso está siendo desplazado por la pipeta automática (dibujo). Son graduadas en fábrica; pueden ser de volumen fijo o variables. Tienen dos posiciones, una para la carga y otra para la descarga. Se usan con "tips" (picos de plástico) descartables, uno para cada muestra. Tienen amplia difusión por la practicidad y la rapidez, sobre todo para trabajos en serie.

Micropipetas:

Descripción del material NO volumétrico: 1) De vidrio 2)

MATERIAL

DESCRIPCIÓN Tubo de vidrio no graduado ni calibrado a un volumen determinado que consta de dos partes de diferentes diámetros (el inferior se denomina capilar, por su delgadez). El extremo superior se conecta a una pera de goma que se aprieta o deja expandir para expulsar el líquido. Se fabrican con facilidad a partir de tubos de vidrio blandos.

Pipeta Pasteur:

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Recipiente cilíndrico con un extremo cerrado (convexo) y el otro con borde redondeado o liso. Tienen aproximadamente 18 mm de diámetro por 15 cm de largo y hasta 20 ml de capacidad. Deben tener relativa resistencia a los golpes y al calor. Esto se puede comprobar dejándolo caer en forma vertical y con el extremo cerrado hacia abajo a unos 5 cm de la superficie dura, debiendo resistir el impacto. Para calentarlo, se lo coloca en ángulo de 45° (sosteniéndolo con una pinza) y se expone a la llama su pared inferior (no el fondo) moviéndolo constantemente para evitar que se rompa y para un calentamiento homogéneo. Si se debe llegar a la ebullición, no puede cargarse más de dos tercios de su capacidad.

Tubo de ensayo:

Embudo: De medidas variables, puede ser liso o estriado. Este últimos se usan para filtración con conos de papel de filtro; las estrías permiten la entrada de aire, lo que facilita el filtrado. Ampolla de decantación: Es un recipiente esférico con un orificio superior para su llenado (con un tapón). Por debajo se continúa con un tubo al que se interpone un robinete o llave; este mecanismo permite separar mezclas de dos o más fases.

Balones:

Recipiente esférico sin base, con cuello cilíndrico largo o corto (que en algunos casos presenta una salida lateral para trabajos de destilación). Se presenta con distintas capacidades; necesita estar sujeto a un soporte y pueden ser utilizados para calentar sustancias o para destilaciones.

Erlenmeyer:

Son recipientes de forma cónica, con vértice superior terminado en un cuello corto y una base plana. Pueden poseer aforo (en este caso son volumétricos) y capacidad variable. Se los utiliza para preparar y guardar soluciones.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Kitasato: Son similares a los anteriores, pero poseen una tubuladura lateral corta en la base del cuello. Tienen paredes gruesas y muy resistentes y capacidad variable. Se pueden emplear para filtrar al vacío. Vidrio reloj:

Vidrios en forma cónica. Pueden servir para depositar sustancias en pequeñas cantidades, mezclarlas o pesarlas y evaporar.

Cajas de Petri: Recipientes esféricos de altura muy inferior a su diámetro. Constan de dos partes: la caja propiamente dicha y la tapa que cubre a la caja (de igual forma pero mayor diámetro). Tiene variada utilidad, pero es especialmente empleada para cultivos en microbiología.

Vaso de precipitación: Recipiente con el borde superior terminado en jarra. Tienen capacidad variable y pueden ser lisos o graduados.

Frascos goteros: Son frascos de vidrio grueso (generalmente oscuros), casi siempre de capacidad inferior a los 100 ml. Tienen tapones de vidrio acanalados y terminados en pico que permiten el goteo.

Frascos de reactivos: Similares a los anteriores pero pueden ser de mayor capacidad. Hay oscuros (para reactivos sensibles a la luz) y claros, generalmente son de boca ancha y tienen tapones de vidrio en forma de hongo (esmerilados).

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Cápsula de porcelana: Recipiente similar al vidrio de reloj pero de mayor capacidad (y no es de vidrio).También se usa para evaporar sustancias.

Consta de dos partes: 1) el recipiente con relativa profundidad y grosor de sus paredes (resistentes), según los diferentes tamaños. 2) el pilón o mazo, que se utiliza para triturar sustancias sólidas por medio de presión o pequeños golpes, pueden ser de vidrio o porcelana

Mortero:

Desecadores:

Los desecadores de vidrio tienen paredes gruesas y forma cilíndrica, presentan una tapa esmerilada que se ajusta herméticamente para evitar que penetre la humedad del medio ambiente. En su parte interior tienen una placa o plato con orificios que varía en número y tamaño. Estos platos pueden ser de diferentes materiales como: porcelana, o nucerite (combinación de cerámica y metal).

3) Materiales de goma

MATERIAL

DESCRIPCIÓN

Tapones: Existen de varios colores y tamaños, clasificados por números cuyos diámetros coinciden con los de tubos, balones, erlenmeyers, etc. Tubuladuras:

También existen de variadas clases (de plástico, goma negra o roja opacas, látex transparente, mas o menos resistentes al calor, etc.), Se emplean como medio de conexión al armar ciertos aparatos (como el de destilación y filtrado al vacío), o también como tubuladura de gas o agua. Su longitud y diámetro varían según la necesidad; el diámetro se toma midiendo la luz y se expresa en cm. o subunidad de pulgada.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Propipetas y pipeteadores:

Dispositivo que consta de una pera de goma con 2 orificios de salida. El de la parte superior se utiliza para hacer ingresar o salir aire de la pera. El inferior se contacta con una pipeta. Posee una válvula que regula la entrada de líquido a la pipeta y otra para descargarlo. Es un sistema muy ingenioso y simple que evita los accidentes del operador por aspiración del contenido de las pipetas y permite enrasar y descargar fácilmente. Los pipeteadores son dispositivos o instrumentos para el trasvase o medición de fluidos.

4) Materiales metálicos v de madera

MATERIAL

DESCRIPCIÓN

Trípode y mantilla con amianto:

El trípode consta de un sostén circular de hierro con tres patas, utilizados para apoyar recipientes que serán calentados con un mechero. La mantilla es una rejilla metálica cuadrada con un centro impregnado con amianto (silicato de calcio y magnesio) que se interpone entre el recipiente a calentar y el mechero (sobre el trípode), así el calor se distribuye en forma pareja.

Cepillos de cerda:

Están constituidos por dos trozos de alambre enroscados uno sobre el otro entre los cuales se sostienen trocitos de cerda (en la porción inferior) que se disponen en forma espiral y perpendicular al alambre. Existen de diversos tamaños para poder ser introducidos en los diferentes elementos de vidrio y efectuar una cómoda y adecuada limpieza.

Mechero de Bunsen:

Tubo metálico por el cual circula gas que entra por una conexión lateral. El gas se mezcla con aire que entra por dos orificios de la base, cuyo tamaño puede ser regulado. El uso más frecuente que se dará al mechero es el calentamiento de tubos de ensayo; para ello se usará una llama no mayor de 10 cm, en lo posible de color azulado para evitar el depósito de carbón en las paredes del tubo.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Soportes universales: Estos elementos de hierro constan de una base rectangular plana y, perpendicularmente inserto en ella, el soporte propiamente dicho. Este es un vástago de metal al que se adosan pinzas que sujetan diversos materiales (buretas, balones, tubos refrigerantes, etc.) Pinzas de Bunsen: También llamadas de "doble nuez". Sus dos extremos actúan como pinzas. De un lado se sujetan al soporte y por el otro se adecuan al recipiente a sostener. El ajuste se efectúa con tornillos mariposa o similares. Pinzas de Mohr:

Son llaves hechas de una varilla de metal doblada a la mitad de manera que sus brazos se superponen y queda formado un ojal. Este se puede abrir presionando los extremos de los brazos de la varilla para enhebrar un tubo de goma. La pinza sirve para cerrar o abrir a voluntad la luz del tubo de goma.

Pinzas de madera: Son broches parecidos a los usados para sostener ropa, pero con un brazo de mayor longitud para comodidad del operador. También los hay de metal y para diferentes diámetros de tubos. Se usan para sostenerlos durante el calentamiento. Gradillas portatubos:

Son de metal, madera, acrílico o alambre forrado en plástico. Consisten en soportes con múltiples perforaciones de diferentes diámetros donde van insertos los tubos. Manteniéndolos en forma vertical. Algunas son para tubos de ensayo y otras para tubos de hemólisis o Kahn.

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LABORATORIO DE PROTEINAS Introducción: Los aminoácidos son compuestos orgánicos con un grupo ácido, carboxilo (-COOH) y un grupo básico, amina (-NH2), unido al carbono  (carbono inmediato al carboxilo), es decir son  - aminoácidos. Además presentan actividad óptica, siendo los de configuración “L” los de mayor interés bioquímico. Los aminoácidos pueden establecer enlaces covalentes entre el grupo carboxilo de uno y el nitrógeno del grupo  - amina de otro. Esta unión se denomina “unión peptídica”, es de tipo amida y se produce con pérdida de agua. Los polímeros formados por más de diez aminoácidos unidos por uniones peptídicas se llaman polipéptidos o proteínas. Las proteínas son macromoléculas formadas por un gran número de aminoácidos. Poseen una estructura muy compleja, por lo que conviene describirla en distintos niveles de organización: Estructura Primaria: es la secuencia de aminoácidos, se refiere al número e identidad de los aminoácidos que componen la molécula y al ordenamiento de estas unidades en la cadena polipeptídica. Las cadenas son lineales, no poseen ramificaciones por la naturaleza de la unión peptídica. Estructura Secundaria: es la disposición espacial regular, repetitiva que adopta la cadena polipeptídica. Pueden formar a su vez una  - hélice o una  - lámina plegada, o bien disponer la cadena polipeptídica en una estructura irregular, en tal caso se habla de una disposición al azar. Estas estructuras se mantienen unidas por puentes de hidrógeno. Estructura Terciaria: se refiere a la arquitectura tridimensional completa de la proteína. De acuerdo con la forma final se clasifica a las proteínas en globulares y fibrosas. Estas conformaciones se mantienen unidas por fuerzas de atracción o repulsión electrostática, enlaces de hidrógeno, presencia de cadenas hidrofóbicas e hidrofílicas, y puentes disulfuro. Estructura Cuaternaria: es la disposición espacial de las subunidades polipeptídicas constituyentes de las proteínas formadas por más de una cadena polipeptídica (proteínas oligoméricas). Las fuerzas responsables de mantener en posición a las diferentes subunidades son las mismas que en caso anterior. La secuencia de aminoácidos de una proteína es el principal determinante de su conformación, propiedades y características funcionales. Los requerimientos estructurales para que una proteína cumpla su papel fisiológico son muy rigurosos, no solo es necesario mantener el número y tipo de aminoácidos constituyentes, además cada uno de ellos debe ocupar una posición definida en la cadena. Alteraciones en ese ordenamiento o sustituciones de aminoácidos pueden afectar la capacidad funcional de la molécula hasta tornarla inútil. Cuando las proteínas son sometidas a la acción de agentes físicos como calor, radiaciones, etc., o agentes químicos como ácidos o álcalis fuertes, pueden sufrir alteraciones en su conformación al modificarse las fuerzas que mantienen unidas las estructuras. Esta desorganización de la estructura resulta en la pérdida de las propiedades naturales y funcionalidad de la proteína. El proceso se denomina desnaturalización, se pierden las estructuras cuaternaria, terciaria y secundaria de la proteína. La estructura primaria no se ve afectada ya que los agentes desnaturalizantes no atacan la unión peptídica. Desnaturalización y coagulación: Es la ruptura de las estructuras 2ª, 3ª y 4ª, conservándose las estructuras primarias, cambiando las propiedades de la proteína nativa. Experimentalmente se comprobó que ciertas proteínas frente a un desnaturalizante mantenía solo su estructura 1ª, perdiendo sus propiedades, y al retirarle el agente desnaturalizante recuperaba sus estructuras 2ª,3ª y 4ª. Se deduce que el control genético de la síntesis de proteínas se reduce a la estructura 1ª y las restantes son consecuencia de la primera. Las proteínas desnaturalizadas (ej. la clara de huevo calentada) son menos solubles y precipitan, pierden su capacidad de cristalizar, tienen mayor reactividad química y son más fácilmente atacadas por enzimas.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Son agentes desnaturalizantes; el calor, la agitación mecánica, los ácidos y bases minerales fuertes, detergentes iónicos, agentes caotropicos (urea, guanidina), solventes orgánicos, sales, metales pesados, etc. Trabajo Práctico: PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS 1) Reacción del Biuret Los péptidos forman complejos de coordinación con el ión cúprico (Cu++). Cada Cu++ se liga a la cadena polipeptídica por 4 valencias de coordinación aportadas por pares electrónicos libres de átomos de nitrógeno (figura 1). Los iones Cu++ reaccionan con N de las uniones peptídicas (color rojo) y N de grupos amino libres (color azul) lo que da por resultado un color violáceo. Esta reacción es muy utilizada para cuantificar proteínas en fluidos biológicos (orina, sangre, líquido cefalorraquídeo, etc.), ya que el complejo color formado posee un máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra. O C

C O

HN

NH

R CH

HC R Cu2+

O C

C O

HN

NH

R CH

HC R

Figura 1: Complejo de coordinación Materiales: - Tubos de ensayos

- Pipetas

Reactivos: - Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril polieter (AAP) - Muestra: suero

Procedimiento: Tubo 1: colocar 50 l de agua destilada + 3,5 ml del reactivo EDTA/Cu. Tubo 2: colocar 50 l de suero + 3,5 ml del reactivo EDTA/Cu. Tubo 3: colocar 50 l de suero diluido al medio con solución fisiológica + 3,5 ml del reactivo EDTA/Cu. Mezclar por agitación e incubar durante 15 minutos a 37 °C en baño María. Observar los colores producidos en cada tubo y las intensidades.

Resultado: Tubo 1: coloración azul del reactivo EDTA/Cu. Tubo 2: coloración violeta intenso del complejo proteína – Cu. Tubo 3: coloración violeta pálido del complejo proteína – Cu.

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2) Procedimiento para la precipitación por calor: En un tubo de ensayo se coloca 3 ml de solución proteica y en otro tubo la misma cantidad de orina previamente centrifugada, calentar los tubos flameándolos en mechero o en baño maría entre 56º a 78º C. Resultado: Se observa la precipitación de grumos blancos en el tubo con la solución proteica, pero no en el que contiene orina (en la que no debe haber proteínas).

3) Reacción de Rivalta: Es una técnica para la diferenciación grosera entre líquidos patológicos colectados en cavidades del organismo (peritoneal, pleural, etc.). Cuando ellos contienen una concentración de proteínas inferior al 3% se denominan TRASUDADO. Si la cantidad de proteínas es mayor, se denomina EXUDADO. El trasudado se considera que es consecuencia de un desequilibrio físico entre los líquidos del organismo (por ej. Ascitis o colecta liquida entre las hojas del peritoneo) a consecuencia de trastornos circulatorios o hipoproteinemias. El exudado se origina por un proceso infeccioso con participación de microorganismos patógenos en la cavidad (por ej. Peritonitis infecciosa o inflamación de peritoneo). Procedimiento: Colocar en una probeta 200 ml de agua destilada más 3 gotas de ácido acético puro. Dejar caer gota a gota con pipeta Pasteur el líquido problema. Resultado: Será positivo (exudado) si la gota al caer forma un enturbiamiento lechoso (como humo de cigarrillo) al producirse la coagulación de las proteínas. 4) Prueba de Heller: Se trata de otra prueba para la detección de proteínas en orina por acción del ácido nítrico. Es una prueba específica e importante por su facilidad de realización. Procedimiento: Colocar 4 ml de orina en un tubo, darle una inclinación de 45º y agregar lentamente por las paredes 1 ml de ácido nítrico concentrado. Resultado: Es positivo cuando existen proteínas (en condiciones patológicas) dando un anillo en la zona de separación de los líquidos.

LABORATORIO DE ENZIMAS Introducción: La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales. La función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molécula tóxica que es el peróxido de hidrógeno, H2O2 (agua oxigenada). Esta enzima, la catalasa, lo descompone en agua y oxígeno, por lo que se soluciona el problema. La reacción de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente:

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La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias patógenas son anaerobias (no pueden vivir con oxígeno), mueren con el desprendimiento de oxígeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada. En esta primera experiencia vamos a demostrar su existencia. 1) Reconocimiento de la catalasa: Figura 2

Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado. Añadir 5 ml de agua oxigenada. Se observará un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxígeno.

Foto 1: En esta fotografía puede verse el resultado de la reacción. Se debe repetir esta experiencia con muestras de distintos tejidos animales y vegetales. Puede ser interesante ir observando la mayor o menor actividad, según el tejido con el que se realice la experiencia.

2) Desnaturalización de la catalasa: Mediante esta experiencia, vamos a ver una propiedad fundamental de proteínas, que es la desnaturalización. Ya que la catalasa químicamente es una proteína, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perderá también la función y como consecuencia su función catalítica, por lo que no podrá descomponer el agua oxigenada y no se observará ningún tipo de reacción cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos.

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Colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hígado. Añadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos. Después de este tiempo, retirar el agua sobrante. Añadir el agua oxigenada. Observar el resultado. Figura 3

Figura 3

BIOSEGURIDAD DEL LABORATORIO DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS. METABOLISMO DE PROTEÍNAS Y ENZIMAS: Riesgos químicos: ÁCIDO ACÉTICO: En estado puro puede producir irritación de nariz y garganta. Dificultad para respirar. Irritación en la piel. Lesiones oculares. Su ingestión produce irritación, quemaduras y perforación del tracto gastrointestinal. Otros síntomas pueden ser náuseas y vómitos. Considerado moderadamente tóxico ACIDO NITRICO: Ingestión: Corrosivo. Dolor abdominal, sensación de quemazón, shock Inhalación: Sensación de quemazón, tos, dificultad respiratoria, pérdida del conocimiento Piel: Puede causar severas quemaduras Ojos: Quemaduras graves e irritación ocular. PERÓXIDO DE HIDROGENO: El peróxido de hidrógeno es muy irritante en concentraciones altas, ya que causa quemaduras temporales al desprenderse en la reacción el oxígeno. La ingestión de soluciones diluidas de peróxido de hidrógeno puede inducir vómitos, leve irritación gastrointestinal, distensión gástrica, y en raras ocasiones, erosiones o embolismo (bloqueo de los vasos sanguíneos por burbujas de aire) gastrointestinal. Ingerir soluciones de 10-20% de concentración produce síntomas similares, sin embargo, los tejidos expuestos pueden también sufrir quemaduras. Ingerir soluciones aún más concentradas, además de lo mencionado anteriormente, puede también producir rápida pérdida del conocimiento seguido de parálisis respiratoria. ACIDO PICRICO: El trinitrofenol (T.N.P.), también denominado ácido pícrico, es un explosivo que se utiliza como carga aumentadora para hacer explotar algún otro explosivo menos sensible como el T.N.T. Riesgo fuego: En estos laboratorios trabajaremos con mecheros de Bunsen por lo que tendremos que tomar las medidas necesarias para evitar quemaduras e incendios.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Riesgo eléctrico: Verificar las instalaciones eléctricas así como el mantenimiento de los equipos empleados. En estos laboratorios utilizaremos el baño maría. Riesgos Biológicos: SALIVA, TEJIDOS (hígado), SUERO Y ORINA: Siempre que manipulemos material biológico debemos tomar ciertas precauciones como el uso de guantes, barbijos, antiparras, guardapolvos o delantales y evitar ingestión y contacto con mucosas.

LABORATORIO DE ACIDOS NUCLEICOS

James Crick

Watson y Francis descubrieron

la

famosa estructura de doble hélice o escalera en espiral, modelo

del

ADN

que

conocemos y manejamos en la actualidad.

Introducción:

Localización: ADN y ARN están presentes en el núcleo y en las mitocondrias. En los ribosomas inactivos hay ARNr; y dispersos en el citoplasma existen ARNm y ARNt en cantidades variables según el tipo celular y su actividad. Bases Heterocíclicas: Las purinas y pirimidinas sustituidas son las bases constituyentes de los nucleótidos. Son moléculas planares que tienen importancia en la estructura de los ácidos nucleicos. Las principales purinas de los ácidos nucleicos de procariontes y eucariontes son adenina y guanina y las pirimidinas son citosina, timina y uracilo. Otras bases adicionales están presentes en ADN y ARNt de procariontes y eucariontes o en ácidos nucleicos de virus y bacterias; por ejemplo la 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina y otras bases metiladas

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE (con sustituyentes metilo, -CH3). Los vegetales contienen purinas farmacológicas como cafeína, teofilina y teobromina de café, te y cacao.

metiladas

con

propiedades

Guanina y Xantina son las menos solubles a pH neutro; en cambio, son relativamente solubles las sales de ácido úrico (uratos), pero a pH ácido este último es muy insoluble (por ejemplo si se encuentra en la orina de carnívoros) pudiendo constituir cálculos en las vías urinarias.

Roles de los nucleósidos fosfato: Los nucleótidos trifosfato tienen un elevado potencial de transferencia de grupo por lo que participan en numerosas reacciones en las que se forman enlaces covalentes; por ejemplo al polimerizarse estos trifosfatos para formar ADN y ARN. Otros di y trifosfatos libres cumplen roles fisiológicos muy importantes; por ejemplo ADP y ATP son substratos y productos en la fosforilación oxidativa o en las transducciones intracelulares de energía. En forma similar existen GTP y GDP participando para conservar las condiciones del medio donde viven las células. Pueden actuar como señales reguladoras como AMPc (adenosina monofosfato cíclico o adenosina 3',5' monofosfato) y GMPc = guanosina monofosfato cíclico), como parte de las coenzimas FAD (flavin adenin dinucleótido), NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) y NADP+ (NAD fosfato) y del donador de grupos metilo S-adenosilmetionina. Además UDP, CTP y sus derivados participan en los metabolismos de glúcidos y lípidos respectivamente. Electroforesis de ADN La electroforesis en gel es una técnica empleada para separar moléculas basándose en propiedades como tamaño, conformación o carga, se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar otra técnica (espectroscopía de masas, amplificación por PCR, clonación o secuenciación de ADN). La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo, si están cargadas positivamente y hacia el ánodo, si están cargadas negativamente. La segunda parte del nombre, gel se refiere a la matriz usada para separar las moléculas y que consiste en un polímero entrelazado de porosidad controlable. Cuando la separación es de proteínas, ADN o ácidos nucleicos pequeños (ADN, ARN o ribonucleótidos), el gel está compuesto por diferentes concentraciones de acrilamida/bis-acrilamida y un iniciador de la polimerización, para producir redes de poliacrilamida de diferentes tamaños. Para separar ácidos nucleicos grandes (más de unos centenares de bases), la matriz empleada es agarosa. En ambos casos, el gel forma una matriz sólida porosa. En los ácidos nucleicos la dirección de migración es desde el electrodo negativo al positivo y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar-fosfato. En los fragmentos de ADN dobles cadena la velocidad de migración es proporcional a su tamaño, mientras que en fragmentos de ADN monohebra y ARN, dichas moléculas tienden a plegarse y migrar de forma más compleja, según la estructura formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces de puente de hidrógeno, como el hidróxido de sodio o la formamida, son empleados para “desplegar” las moléculas plegadas y permitir que la velocidad de migración dependa únicamente del tamaño y no de la estructura formada tras el plegamiento. Revelado y visualización Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo. Entonces se pueden “revelar” mediante la adición de un colorante específico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los ácidos nucleicos, o la plata para ácidos nucleicos y proteínas. Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo dicha luz y si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografía.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Si se siembran varias muestras una junto a otra en el gel, se producirán separaciones paralelas, mostrando cada una bandas de distintos tamaños correspondientes a cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dará un solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o más componentes. Las bandas en calles paralelas que están a la misma distancia del principio indican que contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de tamaño conocido, llamados marcadores de peso molecular. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamaño. La distancia a la que se encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula.

1) Electroforesis de Ácido Desoxirribonucleico Preparación de Agarosa 1,5% Pesar 1,5g de agarosa y agregar buffer TBE (EDTA, ácido bórico, tris) 0.5X hasta alcanzar un volumen final de 100ml. Disolver la agarosa por calentamiento. Agregar 3ml de solución stock de Bromuro de etidio y volcar sobre plataforma de acrílico con peine. Dejar solidificar. Retirar el peine y disponer en cuba de electroforesis con buffer TBE 0.5X. Siembra, Corrida y Revelado Mezclar 2l de buffer de siembra (azul de bromofenol, glicerol y agua) y 10l de solución de productos de PCR o ADN genómico. Homogeneizar con pipeta automática y sembrar en cada pocillo del gel de agarosa preparado con anterioridad. Correr a 100voltios durante 25minutos. Retirar el gel y observar el ADN por transiluminación con luz UV.

BIOSEGURIDAD DEL LABORATORIO DE ÁCIDOS NUCLEICOS: Riesgos químicos: BROMURO DE ETIDIO: Es una sustancia fuertemente mutagénica y es irritante a los ojos, piel, mucosas y el tracto respiratorio. Los efectos sanitarios de la exposición a este compuesto no han sido todavía investigados profundamente. Se sospecha que puede ser cancerígeno y teratogénico por su cualidad de mutagenicidad, aunque no hay ninguna prueba concluyente de ninguno de estos efectos. Si se ingiere, se inhala o se absorbe por la piel, esta sustancia puede tener efectos nocivos.

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LABORATORIO DE METABOLISMO DE PURINAS Y PIRIMIDINAS

Introducción: Estos compuestos no son esenciales en la alimentación pues se sintetizan con facilidad "de novo" (a partir de otros intermediarios metabólicos). Las enzimas intestinales (ribonucleasas, desoxirribonucleasas y polinucleotidasas) degradan a mononucleótidos a los ácidos nucleicos. Aquellos se absorben o desfosforilan (por una fosforilasa). El nitrógeno en exceso es excretado por los mamíferos ureotélicos (hombre, otros primates, etc) como urea; los animales uricotélicos (aves, anfibios y reptiles) lo eliminan como ácido úrico, razón por la que estos últimos tienen un mayor metabolismo de nucleótidos de purina. Los animales amoniotélicos (peces) lo eliminan como amoníaco. Un importante derivado metabólico del ciclo de los nucleótidos de purina es el ácido inosínico (IMP), que puede originarse por desaminación del AMP y que es el ribonucleótido de hipoxantina. Otros análogos, en los que se altera la estructura del núcleo heterocíclico o la fracción de azúcar, se utilizan en medicina para inhibir la síntesis de ácidos nucleicos, alterar la transmisión de la información, modificar la síntesis de purinas (allopurinol), actuar en la quimioterapia del cáncer, infecciones virales, inhibición del rechazo inmunitario en transplantes, etc. La descripción de los procesos de biosíntesis escapan a los objetivos de esta guía, valga mencionar solamente que el nucleótido purínico precursor es el monofosfato de inosina (IMP). Este se forma a partir de αD-ribosa 5-P y ATP, por una serie de pasos en los que intervienen intermediarios anfibólicos. Los átomos provienen de diferentes orígenes, como: CO2 respiratorio, Aspartato, Glicina, N5, N10-metenil tetrahidrofolato, N10-formil tetrahidrofolato y amida de la glutamina. En este camino metabólico se forma el IMP que da por oxidación y aminación AMP y GMP. Purinas y nucleótidos también se pueden convertir de manera directa a mononucleótidos por fosforribosilación. Los nucleósidos pirimidínicos y los purínicos tienen precursores comunes pero la unión de la fracción de fosfato de ribosa al N de la base pirimidínica ocurre al final de la vía biosintética.

Catabolismo de las purinas a ácido úrico: El ácido úrico es el principal producto del catabolismo de las purinas en el hombre y monos antropoides; se forma a partir de la xantina por acción de la xantinooxidasa. Guanina e hipoxantina (producto formado por la oxidación de la adenina) forman ácido úrico por vía de la xantina, en reacciones catalizadas por la guanasa y la xantina oxidasa.

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Adenosina desaminasa

Fosforilasa

Fosforilasa

Guanasa

Xantina Oxidasa

Xantina Oxidasa

Los primates inferiores y otros mamíferos catabolizan el ácido úrico a alantoína (producto muy soluble en agua) por acción de la uricasa. Esta enzima esta ausente o en concentraciones escasas en los anfibios, aves y reptiles, los que excretan ácido úrico y guanina como productos finales del catabolismo de purinas y proteínas. Las aves pueden excretar el ácido úrico poco soluble en forma de cristales y conservar agua. En el hombre el contenido de ácido úrico corporal proviene de: 1) catabolismo de purinas exógenas (nucleoproteínas ingeridas), 2) catabolismo de nucleoproteínas endógenas, y 3) transformación directa de los nucleótidos endógenos de la purina. Diariamente un 60% de esa reserva se recambia por formación y excreción concomitantes. La gota es un trastorno metabólico del catabolismo de las purinas. Como cualquier ácido débil, las proporciones de ácido no disociado (ácido úrico) y su base conjugada (urato de sodio) varían con el pH. La disociación del primer protón (pK 5.75) es de interés fisiológico, pues el otro (pK 10.3) se disocia a pH muy elevado. Así, en el organismo se encuentran solo ácido úrico y la sal monosódica. Al ser poco soluble, el aumento de la concentración de ácido úrico en la sangre excede su saturación y pueden acumularse cristales de urato sódico en tejidos blandos y articulaciones (depósitos o "tofos"). La orina a pH 5.0 se satura con 15 mg/100 ml (150 mg/l) de uratos, y a pH 7.0 disuelve hasta 150-200 mg/100 ml; a pH 5.75 predomina el ácido úrico. Si se forman cristales en el sistema urinario serán de urato sódico en sitios previos a la acidificación urinaria (tubos distales y colectores del riñón), y de ácido úrico en distal (los más frecuentes). Por lo antes dicho es conveniente alcalinizar la orina previniendo la formación de cálculos de ácido úrico.

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Catabolismo de las pirimidinas: Los productos de la degradación de pirimidinas (que ocurre en el hígado) son sumamente solubles en el agua, a diferencia del ácido úrico y el urato sódico de las purinas. Beta-alanina y beta-aminoisobutirato sódico son productos finales del catabolismo de uracilo, citosina y timina. La pseudouridina se excreta sin cambios pues no hay enzimas que catalicen su hidrólisis o fosforólisis. 1) Determinación de Acido Úrico En Suero (Uricemia) y Orina (Uricosuria) de Mamíferos y Aves. Las especies ureotélicas (mamíferos en general) tienen bajas concentraciones de ácido úrico circulante en sangre a diferencia de aquellas uricotélicas (reptiles, aves, batracios). Este metabolito se elimina principalmente por vía urinaria, por lo que en este fluido existe en mayor concentración que en el plasma. En las excretas de las aves de hace evidente su presencia en forma de "pasta" o "polvo" blanco mezclado con las materias fecales (ya que estos animales excretan orina y materias fecales conjuntamente a través de la cloaca). La determinación del ácido úrico se puede efectuar por diferentes técnicas. La mayoría se basan en la transformación del ácido úrico a alantoína por métodos químicos o enzimáticos. A pesar de numerosas modificaciones que se han introducido al método colorimétrico clásico, el más específico continúa siendo el que se basa en la oxidación del ácido úrico con la enzima uricasa. El ácido úrico pero no la alantoína absorbe a 293 nm. Existen diversas modificaciones que se basan en el acoplamiento de la reacción anterior por el H2O2 que se formó. Ellas incluyen su reacción con la enzima catalasa para la formación de un cromógeno. Muestras: El ácido úrico es estable en el suero y orina unos 3 días a temperatura ambiente, y puede aumentarse la estabilidad por el agregado de fluoruro o timol. Procedimiento: Con los reactivos provistos por el equipo comercial: a) Preparar el "Reactivo de Trabajo" (que es estable 30 días en frasco color caramelo a 2-10 ºC) como sigue: Agua destilada............................4 ml Reactivo de Fenol......................0,50 ml Reactivo 4-AF/POD..................0,50 ml Uricasa........................................0,04 ml

b) colocar en siete tubos de hemólisis marcados: "B" = blanco; "St" = Standard; "Smm" = suero de mamífero monogástrico; "Smr" = suero de mamífero rumiante; "Sa" = suero de ave; "Om" = orina de mamífero y "Oa" = orina de ave (preparar una solución con los cristales):

tubos Standard Muestra Reactivo de trabajo

"B"

"St" 20 ul

1 ml

1 ml

"Smm"

"Smr"

"Sa"

"Om"

"Oa"

20 ul 1 ml

20 ul 1 ml

20 ul 1 ml

20 ul 1 ml

20 ul 1 ml

c) Incubar todos los tubos en Baño María de 37ºC durante 15' o a temperatura ambiente (18-25ºC) por 30'. d) Leer en el fotocolorímetro a 490-530 nm (505 nm); llevando a 100% de tramitancia con el tubo "B". e) Efectuar los cálculos teniendo en cuenta que la concentración de ácido úrico en el Standard = 100 mg/l, de la siguiente forma:

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Concentración de Ac. Urico en mg/l

100 mg/l x Absorbancia de cada desconocido ("Smm", "Smr", "Sa", "Om" y "Oa") =-------------------------------------------------------Absorbancia del Standard

Resultados: Los valores en suero varían con la especie animal. En el ser humano oscilan entre 20 y 60 mg/l; en los mamíferos que eliminan una gran proporción como alantoína son menores; y en las aves pueden dar valores mayores. En la orina su concentración es más elevada. El hombre elimina unos 250 a 750 mg/24 hs. La muestra correspondiente a los cristales eliminados por las aves contendrá una cantidad variable según la proporción en que se efectúe su disolución.

LABORATORIO DE GLÚCIDOS

Introducción: Los grupos aldehídos y cetonas libres, o potencialmente libres de los glúcidos, le confieren la capacidad de poder reducir a diversas sustancias, oxidándose a la vez ellos mismos. Esta propiedad es utilizada para su caracterización mediante diferentes reacciones como las que tienen acción sobre colorantes y óxidos metálicos (Fehling, formación del espejo de plata, Nylander , Trommer- Feling – Benedict, Brown I y II).

Luis Federico Leloir fue un bioquímico y

médico

argentino

que

recibió

el Premio Nobel de Química en 1970 por sus descubrimientos acerca de la unión de los azúcares en polisacáridos. Reacciones de caracterización:

Los distintos grupos de glúcidos poseen características y comportamientos especiales frente a determinados reactivos que nos permite, mediante una secuencia analítica de reacciones, conocer la composición de una muestra problema. Por ejemplo, si nos entregan una fracción de solución que se presume es un glúcido, siguiendo estas reacciones podemos descifrar frente a qué glúcido estamos trabajando.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 1) Molisch: Sirve para diferenciar glúcidos libres o combinados de otros grupos moleculares como proteínas y lípidos. Se fundamenta en la acción del ácido sulfúrico concentrado sobre los glúcidos, que provoca la formación de un compuesto furfurico (furfural, omega oximetilfurfural) por deshidratación. Al condensarse los compuestos furfuricos con alfa-naftol, dan productos coloreados (color violeta).

HO

H C CH

HOCH 2

OH

OH CH HC

H 2SO4 O

OH

Calor

H

CH 2OH

O

H

Hidroximetil-Furfural

Glucosa HO H C

3 H 2o

O

OH CH

CH O CH 2 HO HO H

H 2SO4 O Calor

HO

O

+

3 H 2o

H

Procedimiento: Colocar en un tubo de ensayo, 2 ml de solución de glúcidos. Añadir “X” gotas de solución alcohólica de alfanaftol al 0,15%. Inclinando el tubo, verter por las paredes 1 ml de ácido sulfúrico concentrado evitando que se mezclen los líquidos. Resultado: Luego de algunos instantes, aparece un disco color violeta en el límite de separación entre ambos líquidos. 2) Lugol: Sirve para identificar y diferenciar glucosanos tipo almidón, de mono y disacáridos. Por su estructura molecular, el almidón puede incluir dentro de su molécula, debido a su disposición espacial, a otras moléculas más pequeñas como el yodo, formando complejos de canal. Procedimiento: En un tubo de ensayo colocar 3 ml de engrudo de almidón y agregar unas gotas de lugol. Resultado: Aparece un color azul intenso o violeta (la amilosa da color rosado). En el caso de aparecer un color rojo-violeta, indica la existencia de dextrinas, y en el caso de no colorearse, y haber dado la reacción de Molisch positivo, estaremos en presencia de mono o disacáridos (por ejemplo galactosa, glucosa, lactosa, sacarosa, levulosa, maltosa, etc).

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 3) Reacción de Fehling: Esto nos permite separar los glúcidos reductores (galactosa, glucosa, lactosa, levulosa, maltosa, pentosas) de los no reductores como la sacarosa. Esta es una reacción cualitativa y cuantitativa. Reactivo de Fehling “A” Sulfato de cobre cristalino Ácido sulfúrico puro Agua destilada c.s.p.

35 g 5 ml 1000 ml

Reactivo de Fehling “B” Sal de Seignette Solución de NaOH 40% Agua destilada c.s.p.

150 g 5 ml 1000 ml

AL MOMENTO DE USAR, SE MEZCLAN VOLUMENES IGUALES DE REACTIVOS “A” Y “B” Procedimiento: En un tubo de ensayo, colocar 1 ml del reactivo de Fehling; agregar al mismo, 2 ml de solución de glúcidos y calentar suavemente.

Inicio de la reacción

Líquido azul

si da positivo:

ejemplos (dos positivos y uno negativo)

Líquido rojo

Resultado: Ante la presencia de glúcidos reductores, se forma un precipitado rojo ladrillo. 4) Barfoed: Esta reacción es para identificar monosacáridos o disacáridos. Estas sustancias se diferencian teniendo en cuenta la velocidad para reducir el óxido cúprico a oxido cuproso (los monosacáridos lo reducen mas rápidamente). 2 CuO (celeste)+ Monosacarido ------------------Acido derivado + Cu2O (rojo) Procedimiento: Colocar en un tubo de ensayo 3 ml de solución problema. Agregar 2 ml de reactivo y calentar.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Reactivo de Barfoed: Acetato de Cobre (cristalizado) Ácido acético glacial Agua destilada

66 g 10 ml 1000 ml

Resultado: Si existen glúcidos monosacáridos reductores, como galactosa, glucosa, levulosa, pentosas, aparece un anillo rojo sobrenadante rápidamente. Los disacáridos, como lactosa y maltosa, lo hacen más lentamente y estos se los puede diferenciar por los cristales de ozasonas. BIOSEGURIDAD DEL LABORATORIO DE GLÚCIDOS Riesgos químicos: ACIDO SULFURICO: La preparación de una disolución de ácido puede resultar peligrosa por el calor generado en el proceso. Es vital que el ácido concentrado sea añadido al agua (y no al revés) para aprovechar la alta capacidad calorífica del agua. En caso de añadir agua al ácido concentrado, pueden producirse salpicaduras de ácido.

Riesgos Biológicos, Riesgo fuego y Riesgo Eléctricos: ídem laboratorio anterior

LABORATORIO DE LÍPIDOS Introducción: Debido a las largas cadenas carbonadas que poseen, a la presencia de grupos hidrófobos y la ausencia de polaridad de la molécula, no se disuelvan en agua y forman emulsiones (donde hay dos fases y partículas menores a 1 micra). Son solubles en solventes orgánicos como éter, cloroformo, benceno, acetona alcohol. La temperatura influye en la solubilidad, siendo directamente proporcional. 1) Formación de emulsiones: Los lípidos en agua no se disuelven y forman emulsiones, estas son un sistema de dos fases donde existe una fase dispersa (con partículas menores a una micra) de menor volumen y una fase dispersante, de mayor volumen; por ej.: aceite en agua (leche) o agua en aceite (mayonesa). Procedimiento: En un tubo de ensayo colocar 3 ml de agua más unas gotas de aceite y en otro 3 ml de aceite con algunas gotas de agua. Tapar y agitar ambos tubos y observar el tipo de emulsión. Luego se deja reposar para que se produzca la separación de ambas fases (emulsión inestable). Resultado: En el tubo con agua en aceite se verá que con la agitación el agua toma un aspecto lechoso. Aquí el aceite se ha dividido en pequeñísimas gotitas que están dispersas en el seno del líquido. Al dejar el tubo en reposo las gotitas se van agregando y la opalescencia disminuye: las gotas de mayor volumen ascienden por su menor densidad, se fusionan en la superficie y forman una capa sobrenadante. En el segundo tubo el fenómeno es similar, pero la fase dispersa en este caso es el agua que luego del reposo forma la fase inferior.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 2) Saponificación Es la hidrólisis termo alcalina de una grasa o aceite, obteniéndose como resultado la formación de jabones. Los jabones poseen un extremo hidrófobo (cadena carbonada) y un extremo hidrófilo (dado por el extremo polar), esto le permite interactuar entre sistemas que no son solubles y poder así estabilizar una emulsión. C-O-C-(CH2)n –CH3 C-O-C-(CH2)n—CH3 C-O-C-(CH2)n--CH3

CH3-OH + 3 Na (OH) ------------------ CH-OH CH3-OH

+ 3 CH3(CH2)-C=O Na

Procedimiento: En un recipiente colocar un trozo de grasa, agregarle 5 ml de alcohol para solubilizarla. Luego agregar 5 ml de NaOH o KOH al 40 %, calentar a baño maría a ebullición durante 15 minutos y agitar de vez en cuanto. Dejar enfriar y comprobar las propiedades jabonosas, acción detergente y formación de espuma del producto obtenido. 3) Caracterización de jabones insolubles y solubles: Jabones solubles: Son los jabones obtenidos a partir de cationes de Na+ y K+, son solubles en agua y tienen capacidad de formar espuma. Jabones insolubles: Son los jabones que poseen Ca++ y Mg++ en sus moléculas, son insolubles en agua. La presencia de estos cationes en el agua es la causa de su dureza. Procedimiento: Colocar en 3 tubos de ensayo 1 ml de la solución jabonosa obtenida, luego agregar 5 ml de agua a cada uno. En el primer tubo agitar y observar;: en el segundo tubo agregar gotas de solución de cloruro de calcio (Ca2Cl), agitar y observar; en el tercer tubo agregar solución de sulfato de magnesio (MgSO 4), agitar y observar si en los dos últimos tubos hay formación de espuma. 4) Caracterización de ácidos grasos insaturados: Reacción de Hübl Los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados. Éstos últimos, se caracterizan por tener en su molécula uno o más dobles enlaces. Como consecuencia de ello pueden adicionar oxígeno, hidrógeno, cloro, bromo, yodo;

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE utilizándose la cantidad de sustancia fijada para determinar su grado de insaturación. El ácido graso insaturado

que se halla con mayor frecuencia es el ácido oleico, cuya fórmula es C18H34O2 con doble enlace en C9. Fundamento: El reactivo de Hübl está formado por yodo en alcohol (con bicloruro de mercurio como catalizador). El yodo se fija sobre la cadena carbonada de los ácidos grasos etilénicos a razón de dos átomos por cada doble ligadura. Reactivo de Hübl: Disolver 26 g de yodo en 500 ml de alcohol del 95%. Disolver 30 g de cloruro de mercurio II en 500 ml de alcohol del 95%. Mezcle las dos soluciones y filtre si es necesario. Resultado: el reactivo se decolora al perder yodo (mientras el ácido graso lo gana).

LABORATORIO DE METABOLISMO DE LIPIDOS 1) Caracterización de cuerpos cetónicos en orina. Detección mediante tiras reactivas para orina El Multistix contiene reactivos el nitroprusiato de sodio y un amortiguador alcalino. La reacción con el ácido diacético de la orina forma un color castaño. Esta tira no reacciona con acetona ni con el b -hidroxibutírico. El Multistix se lee a los 15 segundos y permite detectar niveles de ácido diacético hasta de 5-10 mg/dL. El cambio de color es de rosado ante a castaño, y la reacción se informa como: negativa, trazas, cantidad moderada, gran cantidad, o como 5, 15, 40, 80 o 160 mg/dL. Con el Multistix pueden ocurrir resultados positivos falsos (trazas o menos) en los casos en que la muestra de orina sea muy pigmentada o cuando posee grandes cantidades de metabolitos de la levodopa. Algunas muestras con elevada densidad y pH pueden dar reacciones positivas falsas (trazas, 5 mg/dL). Debido a la especificidad del nuevo Multistix para determinación del ácido diacético, el reactivo para cetonas no da resultados positivos con controles que tienen acetona.

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El Combur-10 contiene los siguientes reactivos: nitroferrocianuro sódico, glicina y un amortiguador alcalino. El nitroferrocianuro de sodio y glicina reaccionan con el ácido diacético y con la acetona en medio alcalino formando un complejo color violeta. Esta tira reactiva es más sensible al ácido acético que la acetona; no permite detectar ácido b -hidroxibutírico. El Combur-10 se lee a los 60 segundos y permite detectar niveles de ácido diacético de 5-10 mg/dL y de acetona de 40-70 mg/dL. El color cambia desde el beige al violeta, y la reacción se gradúa de la siguiente forma: negativa, 1+ (5-40 mg/dL), 2+ (40-100 mg/dL), o 3+ (>100 mg/dL).

CN

2Na+

NC

ON

Fe

CN

CN

-2

. H2O

CN

Na2 [Fe (CN)5 NO]. 2H2O

BIOSEGURIDAD DEL LABORATORIO DE LÍPIDOS Y METABOLISMO DE LÍPIDOS: Riesgos químicos: CLOROFORMO: Respirar gases de cloroformo durante cortos periodos de tiempo puede causar insomnio, delirios, mareo, cansancio, dolor de cabeza, cefalea, migraña y alucinaciones. El contacto de la piel con grandes cantidades de cloroformo puede producir ulceración. ALCOHOL ETÍLICO: La ingestión del etanol puede afectar al sistema nervioso central, provocando estados de euforia, desinhibición, mareos, somnolencia, confusión (alguno habrá sentido sus efectos el fin de semana). Al mismo tiempo, baja los reflejos.

Riesgos biológicos, Riesgos eléctricos y Riesgos de incendios: idem laboratorios anteriores.

LABORATORIO DE VITAMINAS Introducción: Las vitaminas son compuestos orgánicos de estructura química relativamente simple, y que no son glúcidos, lípidos ni proteínas. Se hallan en los alimentos naturales en concentraciones muy pequeñas. Son esenciales para mantener la salud y el crecimiento normal. Su carencia produce un cuadro patológico característico, denominado “avitaminosis”. En general, no pueden ser sintetizados por el organismo, por lo que deben ser provistos con la dieta. No desempeñan funciones plásticas, ni energéticas. Algunas son coenzimas o forman parte de estas moléculas, otras tienen acción similar a la de las hormonas. De acuerdo a su solubilidad, las vitaminas se clasifican en: liposolubles e hidrosolubles. * Vitaminas liposolubles: a este grupo pertenecen: el Retinol o Vitamina A (antixerolftálmica), los Colecalciferoles o Vitamina D (antirraquítica), los Tocoferoles o vitamina E (antioxidante), y la Vitamina K (antihemorrágica). Generalidades:

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Son moléculas hidrófobas apolares.

-

Solo pueden absorberse con eficiencia si la absorción de lípidos es normal Su transporte en sangre se realiza por unión a lipoproteínas o proteínas fijadoras específicas.

Químicamente se trata de lípidos insaponificables, caracterizados por su incapacidad para formar jabones; ya que carecen en sus moléculas de ácidos grasos unidos mediante enlaces éster. Las mismas son poco alterables y el organismo puede almacenarlas como reserva, su carencia estaría basada en malos hábitos alimentarios.

Vitamina E (anti-esterilidad, tocoferol) Es un diterpeno (C20 H32 ) que puede presentar tres formas moleculares α, β o γ, -tocoferol. Considerado un potente antioxidante ya que favorece la eliminación de los radicales libres generados por el propio organismo, así como los que proceden del exterior, como humos, emisiones, emanaciones de productos contaminantes, etc. Se ha comprobado la capacidad de este elemento para eliminar estas sustancias contaminantes que penetran en el organismo. La capacidad de esta vitamina para proteger las membranas celulares e impedir su oxidación es la responsable de sus poderes preventivos en muchas enfermedades degenerativas que van apareciendo poco a poco a medida que los animales se hacen mayores. Por último, se sabe que la vitamina E tiene propiedades cicatrizantes ya que mezclada con aceite y aplicada externamente sobre las heridas, ayuda a que cicatricen mejor.

Vitamina E (α-tocoferol)

* Vitaminas hidrosolubles: a este grupo pertenecen: el Complejo B, y la Vitamina C o Ácido Ascórbico. Generalidades: - Debido a su solubilidad en agua, sus excesos se excretan por orina. - Rara vez se acumulan en concentraciones tóxicas. - Su almacenamiento es limitado (excepto cobalamina), por lo que deben recibirse con regularidad. La vitamina C se encuentra en cítricos, hortalizas y leche de vaca. Actúa en la síntesis del colágeno y formación de la matriz intercelular. Además ejerce una acción reguladora de las hormonas antiestrés. Químicamente, el ácido ascórbico recuerda a las hexosas, solo que a diferencia de la mayoría de los glúcidos metabolizables de nuestro organismo, el isómero L es el biológicamente activo. El ácido L – ascórbico es un ácido débil (pK 4.17) y un energético reductor, cede dos de sus hidrógenos con gran facilidad dando como producto el ácido deshidroascórbico (ver la siguiente representación); éste es

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE inestable en medio alcalino y se oxida irreversiblemente en forma espontánea incorporando agua a 2,3-diceto-Lgulonato.

La propiedad del ácido L – ascórbico de poder reducir (oxidándose) a otras sustancias (como en el caso de la determinación siguiente al óxido cúprico, que pasa a cuproso) se utilizará en el laboratorio para su determinación. 1) Determinación del poder reductor del Ácido ascórbico mediante la Reacción de Fehling En la reacción se Fehling se observa el poder reductor mediante la reducción del catión cúprico a cuproso, precipitando óxido cuproso de color rojo ladrillo.

SO4Cu + 2 NaOH Sulfato cúprico

Hidróxido de sodio

SO4Na2 + Cu(OH)2 Sulfato de

O C HOC O HOC HC HOC CH2OH

H2O + CuO

Hidróxido cúprico (Azul)

Oxido (Negro)

O C O=C O=C O HC HOC CH2OH

+ CuO Oxido

Ácido L – ascórbico Materiales: - Tubos de ensayos - Micropipetas o goteros

+ Cu2O Oxido cuproso (Rojo Ladrillo)

Ácido L – deshidroascórbico

- Pipetas - Mechero

Reactivos: - Solución A: SO4Cu (35 g) + H2SO4 cc (5 ml) + H2O d (1000 ml) - Solución B: Tartrato de Na y K (150 g) + NaOH 40% (300 ml) + H2O d (1000 ml) Estas soluciones se mezclan en el momento de su uso, en volúmenes iguales. El fundamento es que cuando se mezcla una solución de SO4Cu con otra de NaOH se produce un precipitado de Hidróxido cúprico

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE (Cu(OH)2), sin embargo al mezclar las soluciones de Fehling se obtiene un líquido límpido de color azul intenso, ya que el Cu(OH)2 que precipita es disuelto inmediatamente por acción del tartrato presente.(*) (*) Antes de utilizar el reactivo de Fehling, se debe controlar que esté en buenas condiciones, porque los reactivos viejos se reducen solos. Entonces colocar en un tubo de ensayos una parte del reactivo y cuatro de agua destilada, llevar a ebullición durante medio minuto. Si el líquido permanece azul, el reactivo esta en buenas condiciones. Procedimiento: Colocar en un tubo de ensayos 1 ml de solución A y 1 ml de solución B. Agregar 2 ml de jugo de naranja en solución acuosa. Calentar a fuego directo, flameando el tubo evitando que entre en ebullición. Resultado: se observa un precipitado color rojo ladrillo de oxido cuproso cuando existen en el medio sustancias reductoras, como el ácido L – ascórbico. 2) Reacción de reconocimiento de la vitamina E con ácido nítrico La vitamina E, al combinarse con ácido nítrico concentrado, se oxida con la de una o-quinona, un compuesto de color rojo anaranjado, el tocorojo. Reactivos: - Ácido nítrico concentrado - Vitamina E, solución en aceite (preparado comercial). Procedimiento: En dos tubos de ensayos se colocan 2 o 3 gotas de solución de vitamina E en aceite. En el primer tubo de ensayo colocar 1 ml de agua; en el segundo tubo de ensayo, colocar igual volumen de ácido nítrico concentrado. Ambos tubos de ensayo se calientan a baño maría de 60º C durante 10 minutos. En el tubo de ensayo con ácido nítrico la capa de aceite que contiene vitamina adquiere una coloración rojo anaranjado. 3) Determinación del poder reductor de la vitamina C. Acción sobre el reactivo de Lugol. La Vitamina C o acido L ascórbico, es un nutriente esencial para los mamíferos. Su presencia en el organismo es fundamental para un cierto número de reacciones metabólicas, es un potente antioxidante, actúa como un cofactor enzimático para la biosíntesis de importantes compuestos químicos y actúa como agente donador de electrones para diferentes enzimas. Su incorporación a través de la dieta es necesaria sólo en determinadas especies animales como ser los primates y cobayos. En las demás especies, su incorporación a través la dieta no es muy necesaria, debido a que tienen la capacidad de formarla endógenamente por medio de estructuras precursoras. A continuación, se procederá a determinar la presencia de dicha vitamina en forma cualitativa. Materiales y reactivos a utilizar:      



Pipetas. Pro-pipetas. Tubos de ensayo. Gradillas porta tubos. Vasos de precipitado. Goteros.

   

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Jugo de cítricos (como fuente de vitamina C). Reactivo de lugol (solución indicadora). Agua destilada. Almidón. Baño termostático.

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Procedimiento: Solución indicadora del contenido de vitamina C: 1. Mezclar una cucharada de almidón con suficiente agua hasta formar una pasta. 2. Añadir 250 ml de agua destilada a la pasta y llevarla a ebullición durante 5 minutos. 3. Colocar 10 gotas de la solución hecha con almidón a 75 ml de agua. 4. Agregar suficiente solución de yodo hasta observar un color púrpura/azul oscuro. 5. En un tubo de ensayo, se coloca 5 ml de la solución indicadora. En caso de utilizar varios cítricos como fuentes naturales de vitamina C, utilizar la cantidad de tubos necesarios. 6. Agregar 10 gotas de jugo de cítrico y agitar suavemente. 7. Comparar la coloración de la mezcla frente a un fondo blanco. 8. Organizar los tubos en orden de color (del más claro al más oscuro).

Solución indicadora

Resultados: La coloración menos intensa o más clara, hace referencia a un mayor contenido de vitamina C en la muestra. La razón es porque la vitamina hace que la solución indicadora pierda el color.

.

Tubos de ensayo conteniendo la solución indicadora.

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Resultados obtenidos en diferentes muestras de cítricos

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Fundamentación: Esta práctica se basa en la reacción clásica del yodo con almidón. El almidón como se estudió en el capítulo correspondiente a glúcidos es un homopolisacárido de origen vegetal que está compuesto por dos polímeros distintos de glucosa; la amilosa y la amilopectina. El componente macromolecular amilosa tiene forma helicoidal y es capaz de formar un complejo con el yodo, en este caso con la solución indicadora. Este complejo adquiere una coloración azul violácea característica. Al reaccionar el complejo yodo-amilosa con el ácido L ascórbico presente en los jugos de los cítricos, la disolución indicadora pierde el color. Esto se debe a que la vitamina C es oxidada por un oxidante suave como la solución de yodo para dar lugar al ácido deshidroascórbico y a iones yoduro. De esta forma el almidón, que se tornaba púrpura en presencia de yodo, se vuelve incoloro en contacto con yoduro.

+ I3

+

Ácido L ascórbico

2 H+ + 3 I-

Ácido deshidroascorbico

LABORATORIO DE OXIDACIONES BIOLÓGICAS Y ENERGÍA Introducción: Las células acostumbran a guardar la energía necesaria para sus reacciones en ciertas moléculas, la principal es el: ATP (adenosin trifosfato)

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Estructura del ATP: Note que las cargas altamente ionizables de los grupos fosfatos hacen que se repelan unos de otros; por lo tanto resulta fácil separar uno o dos Pi (fosfatos inorgánicos) del resto de la molécula. 1. ATP + H2O ---> ADP + Pi G o' = -7,3 Kcal/mol -- muy exergónica 2. ADP + H2O ---> AMP + Pi  G o' cercano -7,2 Kcal/mol -- muy exergónica

Para sintetizar ATP (adenosín-trifosfato) a partir de ADP (adenosín-difosfato) se debe suministrar por lo menos una energía superior a 7,3 Kcal. Las reacciones que, típicamente suministran dicha energía son las reacciones de oxidación. El ATP es usado como donante de energía en muchas reacciones anabólicas (de síntesis) acoplándose a las mismas en manera tal que el G sea negativo y la reacción se produzca espontáneamente. Síntesis del ATP Es la mayor función del metabolismo degradativo (catabolismo): producir energía suficiente para fosforilar el ADP (adenosín difosfato). Existen por lo menos tres maneras de obtener ATP: fosforilación oxidativa, fosforilación a nivel del sustrato y ciclo del ATP-PC (fosfocreatina). OXIDACIONES BIOLÓGICAS Las reacciones de oxido-reducción (Redox) están asociadas con la transferencia de energía en la célula. El oxígeno raramente interviene directamente. Las reacciones de oxidación siempre están acopladas con reacciones de reducción. Definiciones: Pérdida de electrón = Oxidación (PEO) Ganancia de electrón =Reducción (GER) Ejemplo: 1. Fe++ ---> Fe+++ + e- (ocurre en los citocromos de la cadena respiratoria) La pérdida de hidrógeno también es una oxidación, ejemplo: 2. ácido succínico ----> ácido fumárico + [2H] (reacción de deshidrogenación que ocurre en el Ciclos de los Ácidos Tricarboxílicos) 1. Etapas de la oxidación-reducción 2H = 2 H+ + 2 eNAD+ (oxi) + 2H+ + 2e- ----> NADH (red) + H+ Cofactores Redox ¿Que es el NAD+? Es una, de un pequeño número de biomoléculas, que funcionan como cofactores Redox, alternativamente se reducen y luego se oxidan. Nota: la concentración de NAD+ en la célula es pequeña; por lo tanto debe continuamente reciclarse de la forma oxidada a la reducida y viceversa.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Fermentación: El término fermentación, en su acepción estricta, se refiere a la obtención de energía en ausencia de oxígeno y generalmente lleva agregado el nombre del producto final de la reacción El piruvato (o moléculas derivadas del piruvato) se encuentra disponible luego del proceso de glicólisis. Muchas células usan piruvato o sus derivados como aceptores terminales, creando productos de desecho que se excretan de la célula. Estos residuos se excretan en enormes cantidades dado que, en razón del bajo rendimiento, son necesarias muchas moléculas de glucosa para producir la energía que necesita la célula. Estos residuos todavía contienen energía aprovechable. Si bien este sistema no es tan eficiente como la respiración, permite que el catabolismo continúe, y esto es mejor que nada. Fermentación Láctica

Se produce en muchas bacterias (bacterias lácticas), también en algunos protozoos y en el músculo esquelético humano. Es responsable de la producción de productos lácteos acidificados ---> yoghurt, quesos, cuajada, crema ácida, etc. El ácido láctico tiene excelentes propiedades conservantes de los alimentos. Fermentación alcohólica Dos reacciones sucesivas que se producen en levaduras, otros hongos y algunas bacterias.

La fermentación alcohólica es la base de las siguientes aplicaciones en la alimentación humana: pan, cerveza, vino y otras.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE La segunda solución es usar un aceptor de electrones externo. El Oxígeno es el ejemplo clásico. El "problema" con la fermentación es que, al usar moléculas orgánicas como aceptores terminales de electrones y tener que eliminar como residuo al producto resultante, se pierde la energía potencial de esos compuestos. La solución alternativa es usar alguna molécula no orgánica que pueda aceptar electrones y convertirse así en una molécula reducida. El oxígeno es perfecto para esto, porque luego de recibir los electrones se combina con dos protones convirtiéndose así en el residuo perfecto para un ambiente líquido: H2O La respiración depende de la disponibilidad de receptor externo de los electrones. Tan pronto como el mismo desaparece, la respiración cesa. A diferencia, la fermentación, donde el aceptor es interno (por ej. piruvato) y es un producto del desdoblamiento de la glucosa, el aceptor estará disponible en tanto exista alimento para oxidar. Formación de acetil-CoA

La Acetil-CoA puede también producirse a partir de lípidos (por beta oxidación) o del metabolismo de ciertos aminoácido. Su formación es un nodo importante del metabolismo central.

1) Fermentación alcohólica Material necesario: Levadura (Saccharomyces cerevisiae) Solución de glucosa al 10% Sacarímetros de Eihorn Papel milimetrado

Procedimiento: 1. Diluir en forma homogénea en una solución de glucosa al 10% una pequeña cantidad de levadura de panificación, en un volumen suficiente para llenar, al menos, un sacarímetro. 2. Llenar con dicha solución un sacarímetro, cuidando de que la columna vertical graduada del mismo esté totalmente llena. Resultado: Observar la producción de burbujas de CO2 que se acumulan en el extremo superior del sacarímetro. Anotar el volumen de gas producido cada 5 minutos durante 30 minutos, a partir del momento del llenado. Previamente a cada lectura , golpear suavemente el sacarímetro con el fin de desprender las posibles burbujas de CO2 adheridas a las paredes del tubo. En un papel milimetrado efectuar una gráfica que relacione el volumen de CO2 producido (ordenadas) en función del tiempo transcurrido (abscisas)

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Fundamento: Las levaduras al consumir la solución de glucosa en anaerobiosis, realizan una fermentación alcohólica liberando como productos CO2 y acetaldehído (que se reduce a etanol). LABORATORIO DE LA DIGESTION DE MONOGASTRICOS, AVES Y RUMIANTES

1)

Determinación de Amilasa salival: Método Amiloclástico Iodimétrico La amilasa es una enzima del grupo de las hidrolasas, se produce principalmente en la fracción exocrina del páncreas y en las glándulas salivales de algunos animales monogástricos, como el cerdo. Actúa escindiendo los enlaces -1,4 glucosídicos de los polisacáridos del almidón y glucógeno. En este método el sustrato, almidón tamponado, se incuba con la muestra que contiene la enzima (suero, saliva, etc.) produciéndose la hidrólisis enzimática. Esta se detiene por el agregado de reactivo de yodo, que al mismo tiempo produce color con el remanente de almidón no hidrolizado. La disminución de color respecto de un sustrato color sin muestra, es la medida de la actividad enzimática, que puede expresarse en unidades amilolíticas por decilitro. Reactivos: - Sustrato de almidón: solución de almidón 500 mg/l, tamponada a pH 7 con buffer fosfatos 0,1 mol/l en ClNa 0,15 mol/l - Reactivo de Yodo: solución de yodo 0,01 eq/l en HCl 0,02 mol/l. - Muestra: saliva Procedimiento: Tubo 1 Muestra

Tubo 2 10 l

Tubo 3 Tubo 4 10 l + gotas de 10 l (calentar a HCl 50% llama directa) 0,5 ml 0,5 ml

Sustrato 0,5 ml 0,5 ml Incubar a 37ºC. A los 7 ½ minutos exactos, agregar: Reactivo de Iodo 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Mezclar por agitación suave. Retirar los tubos del baño y agregar: Agua destilada 4 ml 4 ml 4 ml

0,5 ml 4 ml

Resultado: Tubo 1: coloración pardo - oscuro. No hay enzima, por lo tanto se observa el color del complejo almidón – yodo. Tubo 2: coloración amarillo pálido. La enzima hidrolizó el almidón dejando como productos glucosa y maltosa, que no forman complejos con el yodo. Tubo 3: coloración pardo amarronado. Se produce la desnaturalización ácida de la enzima. Tubo 4: coloración pardo amarronado. Se produce la desnaturalización por calor de la enzima.

2) Determinación de Tripsina en materia fecal de aves: Test de la gelatina La evaluación de la actividad proteolítica de la tripsina en las heces es una de las pruebas que pueden reflejar enfermedades pancreáticas. La tripsina es una endopeptidasa que tiene selectividad por enlaces que contienen el grupo carboxilo de aminoácidos diaminados (arginina y lisina). Sus productos son polipéptidos con aminoácidos básicos en el extremo C – terminal. La tripsina activa todos los zimógenos producidos por el páncreas. Este test se fundamenta en la habilidad de la tripsina para atacar a la gelatina (proteína) de tal manera que, luego de la incubación de la enzima con la gelatina, la solución no podrá solidificar. Materiales:

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Tubos de ensayos

- Pipetas

Reactivos: - Gelatina sin sabor al 7,5% - Bicarbonato de sodio al 5% - Muestra: materia fecal de aves (dilución 1 en 9 con agua destilada). Procedimiento: - Tubo 1: colocar 2 ml de gelatina al 7,5% + 1ml de bicarbonato de sodio 5% + 1ml de dilución fecal. - Tubo 2: colocar 2 ml de gelatina al 7,5% + 1ml de bicarbonato de sodio 5% + 1ml de agua destilada. Incubar ambos tubos a 37ºC por 1 hora ó a temperatura ambiente por 2 horas y media. Refrigerar los tubos 20 minutos y observar los resultados. Resultados: - Tubo 1: se observa falta de solidificación en caso de presencia de tripsina (prueba positiva). - Tubo 2: se observa la gelatina solidificada.

3) Desestabilización de la Leche por el Cuajo: Coagulación Enzimática. La composición química media de un litro de leche de vaca es:

Agua Grasa Lactosa Sustancias nitrogenadas Sales

90% 3,5-4,5% 4,7-5,2% 3,3-3,6% 0,9-1%

Dentro de las sustancias nitrogenadas, encontramos a las proteínas, con un total de 33,5 g/lt aproximadamente. De ellas las más abundantes son las caseínas, ya que representan 27 g/lt. Las caseínas están formadas por tres fracciones diferentes, -caseína, -caseína, y -caseína, separables en base a su movilidad electroforética, y que además presentan distintas propiedades. A su vez la -caseína es heterogénea ya que se halla constituida por dos fracciones, una sensible y una no sensible al calcio. Las caseínas son electronegativas. Como todos los anfolitos-electrólitos que contienen en su molécula a la vez grupos ácidos cargados negativamente y grupos básicos cargados positivamente, las caseínas se disocian según el valor de pH del medio como un ácido, para formar caseinatos, o como una base para formar sales de caseína. Al pH de la leche, las caseínas tienden a formar polímeros (asociaciones de moléculas idénticas). Puede decirse entonces que la caseína bruta es un grupo de proteínas fosforadas precipitables en la leche a un pH 4,6 y a T de 20 ºC. Una de las subunidades de la -caseína, es la responsable de mantener la solubilidad de las demás. El color blanco de la leche es el signo visible de la presencia de las partículas de caseína nativa dispersas en el líquido. Partículas groseramente esféricas, forman micelas, unidas a minerales. Las micelas contienes PO4Ca inorgánico, bajo la forma de fosfocaseinato de calcio.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE El cuajo o quimosina es una enzima proteolítica segregado por la mucosa del cuajar, o cuarto estómago de los rumiantes jóvenes alimentados exclusivamente con leche (terneros, corderos y cabritos). Con el destete, la secreción cesa, siendo reemplazada por la pepsina. El cuajo, como otras enzimas digestivas es secretado en forma inactiva o pro-quimosina. El mecanismo de conversión de la forma inactiva a la activa va acompañado de una fragmentación de la molécula de proquimosina y de la liberación de péptidos básicos procedentes probablemente de la parte N-terminal de la molécula inicial. La activación tiene lugar espontáneamente a pH inferior a 5. El fenómeno es autocatalítico puesto que la adición de cuajo a la solución de pro-quimosina incremente claramente la velocidad de activación de la misma. La estabilidad de la enzima está ligada al pH, siendo máxima a 5,5-6 y pH 2. A pH superior a 7 se observa cierta desnaturalización y a pH 8 inactivación irreversible de la enzima. Las propiedades enzimáticas permiten clasificarla dentro de las endopeptidasas EC 3.4.23.4 (3: Clase de las hidrolasas, 4:Subclase de las proteasas, 23: Subsubclase de las proteasas ácidas, 4: Número específico). El cuajo solo hidroliza una de las caseínas, la responsable de mantener en solubilidad a las demás. Las otras caseínas no son atacadas. Esta proteólisis es limitada, no se afecta más que un enlace fenilalanina-metionina de la cadena peptídica de la caseína. Por ello es rápida y exige poca cantidad de enzima.

Ahora bien, la ruptura de la cadena por el cuajo se traduce en la pérdida de la fracción más hidrofílica de la molécula, disminuyendo su hidratación y solubilidad así como también su carga eléctrica, formando paracaseinato de calcio que precipita (cuajada). Procedimiento - Tubo 1: colocar 5ml de leche. - Tubo 2: colocar 5ml de leche y 4 gotas de ácido acético. - Tubo 3: colocar 5ml de leche, 4 gotas de ácido acético, y 2ml de cuajo - Tubo 4: colocar 5ml de leche, y 2ml de cuajo - Tubo 5: colocar 5ml de leche, 4 gotas de ácido acético, 2ml de cuajo, 4 gotas de Cl2Ca 4) Análisis del contenido ruminal: coloración con yodo de bacterias y protozoarios yodófilos Los protozoos del rumen son anaeróbicos estrictos, aprovechan diversos hidratos de carbono para obtener energía y los degradan con formación de ácidos grasos volátiles (ácido acético, propiónico, butírico, láctico, CO2 y H2). Todos los microorganismos ciliados (Holotricos) sintetizan un hidrato de carbono de reserva semejante al almidón (hasta 70% de su peso seco) que es metabolizado con formación de los mismos productos finales. Al almacenar grandes cantidades de este carbohidrato en su citoplasma, se hacen más pesadas, de mayor peso específico que el licor ruminal y precipitan. Así, adicionando glucosa a nuestra muestra de líquido ruminal e incubando un tiempo determinado, sedimentan los protozoos holótricos por su mayor peso específico. Los holótricos proliferan en rumiantes bien alimentados y desaparecen en el ayuno. Poseen un metabolismo hidrocarbonado propio, independiente de la presencia de las bacterias. Realizan hidrólisis ácida completa de la amilopectina muy ramificada (pura) hasta glucosa, que es degradada en ácido láctico, AGV, CO 2 y H2. Algunas cepas de bacterias ruminales también tienen la capacidad de formar hidratos de carbono de reservas intracelulares (almidón o glucógeno bacteriano) por lo que darán positivas a esta coloración algunas bacterias de gran tamaño. La flora sacarolítica del intestino o del fermento que se eliminan con las materias fecales (aún en monogástricos), también dan positiva la reacción, por lo que esta prueba se puede efectuar con muestras de materias fecales en suspensión.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Materiales: Licor ruminal (obtenidos por zonda o fístulas) Solución de yodo – yodurada: Yodo 1g Yoduro de K 2g H2O destilada 50 ml Metodología: Tubo 1 2 ml

Tubo2 2 ml

Tubo3 2ml

Licor ruminal 2 ml 2 ml 2ml Dextrosa 5% C/n hasta alcalinidad Álcali 1 gota Formol Incubar 30 minutos a 40ªC Centrifugar a 1500 rpm – Descartar sobrenadante 1 ml 1ml 1ml Lugol Incubar 10 minutos a 37ªC Observar al MO (40X) (entre portaobjeto y cubreojbeto) 1 gota de cada tubo Resultados: Se observan los gránulos de microorganismos.

almidón de

color pardo amarillento contenidos en los

ESTUDIO DEL JUGO RUMINAL Extracción: 

Cantidades importantes: sonda de calibre bastante grueso, de unos 2 m de longitud; inclinando la cabeza del animal o mediante una bomba de vacío.



Cantidad pequeña: punción por debajo del pliegue de la babilla, puncionando en dirección craneal, hacia delante. Recoger líquido y filtrar.

Se puede dejar a T ª ambiente cierto tiempo o al baño maría durante varias horas. 1.- COLOR: verde-grisáceo, en función del tipo de alimentos.  Verde oliva-pardo alimentación con pasto.  Gris remolacha.  Amarillo-pardo ensilados.  Gris lechoso acidosis ruminal.  Negruzco indigestión con podredumbre de panza.  Grisáceo y grumoso indigestión láctea en terneros/corderos. 2.- OLOR: aromático, al menos no repelente.  Repugante-mohoso-pútrido putrefacción proteica (ingiere demasiada proteína y se produce una fermentación anormal de esa proteína).  Ácido-picante ácido láctico (hidratos de carbono de fácil digestión).  Inodoro-mohoso inactividad del jugo ruminal.  Olor a “cuajar” (ácido) alteración del tránsito pilórico. 3.- CONSISTENCIA: ligeramente viscosa (aspecto de sopa).  Acuosa inactividad ruminal.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE  

Viscosa contaminación con saliva. Burbujas pequeñas fermentación espumosa. 4.- pH: 5,5 - 7,4  Más altos alimentación con fibra y/o proteína en exceso.  Más bajos alimentación rica en hidratos de carbono (ácido láctico).  Alcalinidad ayuno, inactividad de la flora ruminal.  Muy bajos acidosis ruminal (exceso de HC o reflujo del cuajar). 5.- SEDIMENTACIÓN/FLOTACIÓN: agitar y ver si las partículas finas caen al fondo; las partículas groseras flotan. Normalmente se separan en 4-8 minutos. 

Jugo inactivo sedimentación rápida, flotación retardada o ausente.



Putrefacción/fermentación espumosa flotación muy rápida, mezcla de sólidos y líquidos.

6.- PROTOZOOS:  Funciones discutidas (¿degradación de HC, degradación de celulosa...?)  Realizar el examen con material recién extraído.  Gran variabilidad: 105-107/ml.  Nº total / tamaño / vivos-muertos: da una idea de la funcionalidad de ese líquido ruminal.  Trastornos: van muriendo; primero desaparecen los grandes, luego los medianos y finalmente los pequeños. En trastornos graves la muerte es uniforme. En procesos recientes y moderados aparecen vivos y muertos. 7.- BACTERIAS:  Funciones / nº variable  107-1012 gérmenes / ml / g según alimentación, animal, etc.  Menor número: alimentación con hidratos de carbono.  Acidosis láctica: predominio de Gram positivos.  Alcalosis: aumentan el número de Gran negativos.  Indigestión y ayuno: disminución del número de bacterias. 8.- HONGOS:  Funciones poco claras.  Mantienen la anaerobiosis a nivel ruminal.  Su número aumenta en caso de acidosis ruminal. 5) Potencial redox Mezclar la mezcla de líquido ruminal con azul de metileno y medir el tiempo que tarda en eliminar ese color. Lo normal es que tarde 3-6 minutos. Si desaparece rápidamente, se deberá a una gran actividad microbiana; si desaparece lentamente, se deberá a una insuficiencia ruminal. 6) Determinación de la actividad ureásica del licor ruminal. Técnica de Caskey. Los rumiantes realizan una verdadera simbiosis con los microorganismos ruminales (bacterias, protozoarios y hongos). Estos últimos aportan al animal proteínas de alto valor biológico, debido a que la proteína de origen vegetal que ingieren estos animales es de bajo valor biológico, salvo algunas especies forrajeras, leguminosas y granos. Dichas proteínas, una vez ingeridas por el animal, entran en contacto con el licor ruminal. Allí son hidrolizadas por proteasas, provenientes de las cepas bacterianas proteolíticas. Como resultado se obtienen polipéptidos de diversos pesos moleculares. A continuación, otro grupo de enzimas denominadas polipeptidasas y peptidasas, hidrolizan dichos sustratos obteniéndose péptidos de bajo peso molecular, dipéptidos y

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE aminoácidos libres (pool externo). Estos últimos pasan a través de la pared bacteriana por transporte activo y son introducidos al protoplasma bacteriano. Siendo utilizados posteriormente para la síntesis de proteína bacteriana (de alto valor biológico) y algunos como fuente de energía. Uno de los destinos dentro del metabolismo bacteriano, por parte de los aminoácidos (pool interno) es la desaminación, con la consiguiente obtención de amoníaco. Es importante remarcar el concepto que en forma simultánea en el rumen se degradan proteínas vegetales de bajo valor biológico y se sintetizan las microbianas de alto valor biológico a partir de la incorporación directa de aminoácidos libres y por síntesis de “novo” por aminación de NH3 libre. Las bacterias, como están rodeadas de agua, secretan el amoníaco al rumen y, a la inversa, también pueden captarlo cuando la necesitan. Una vez que el NH3 se encuentra en la luz del rumen, es absorbido a través de las paredes ruminales y llega a la sangre venosa. En ese punto es fijado por el ácido aspártico y por vena porta llega al hígado, en donde es transformado en urea. Una parte de esa urea retorna al rumen por medio de la sangre arterial y saliva. Siendo otra parte, eliminada del organismo por medio de la orina. Una vez en el rumen, la urea es atacada por las ureasas bacterianas y es transformada nuevamente en amoníaco que será captado por las bacterias para la síntesis de nuevos aminoácidos. De esta manera, las cepas bacterianas tienen una fuente de nitrógeno para su subsistencia durante el ayuno y los períodos interdigestivos.

Materiales y métodos:         

       

Pipetas. Propipetas. Tubos de ensayo. Frascos reactivos color caramelo. Probetas. Vasos de precipitado. Matraz aforado. Balanza digital. Rojo fenol (como indicador de pH.).

Hidróxido de sodio. Agua destilada. Urea. Ácido sulfúrico. Licor ruminal. Amoníaco. Ácido acético. Agua destilada.

Reactivos utilizados: 

Solución de reactivo de rojo fenol:

Pesar 0,2 gramos de rojo fenol y agregar 10 mililitros de hidróxido de sodio al 0,1 normal y por último 90 mililitros de agua destilada. Por otro lado pesar 30 gramos de urea y disolverla en 200 mililitros de agua destilada. Juntar ambas soluciones en un matraz aforado de 1 litro y se enrasa con agua destilada. 

Solución de ácido sulfúrico al 0,1 normal:

Agregar 0.4 mililitros de ácido sulfúrico a 1 litro de agua. Técnica: 1. Neutralizar la solución de rojo fenol con la de ácido sulfúrico al 0.1 normal, gota a gota hasta que la solución adquirió una coloración ámbar. 2. En cuatro tubos de ensayo se procederá a lo siguiente:

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Tubo 1: Colocar 2 mililitros de amoníaco y gotas del reactivo de rojo fenol neutralizado. Tubo 2: Colocar 2 mililitros de ácido acético y gotas del reactivo de rojo fenol neutralizado. Tubo 3: Colocar 2 mililitros de licor ruminal, 1 mililitro de solución de urea y gotas del reactivo de rojo fenol neutralizado. Tubo 4: Colocar 2 mililitros de licor ruminal, 1 mililitro de agua destilada y gotas del reactivo de rojo fenol neutralizado. 3. Dejar actuar durante 5 minutos tratando de mantener la muestra a una temperatura de 39 a 40 ºC. Esta temperatura es la ideal para la acción de la ureasa ruminal. 4. Transcurrido ese tiempo se procederá a observar los resultados obtenidos. Fundamento de la reacción: La urea es una diamida del ácido carbónico. Todas las amidas son rápidamente hidrolizadas, dicha hidrólisis es catalizada por la enzima ureasa, dando dióxido de carbono y amoníaco como producto final. La ureasa es una enzima constitutiva, sintetizada por las bacterias ruminales aún sin la presencia del sustrato. Es una amidasa porque rompe los enlaces carbono nitrógeno. El amoniaco alcaliniza el medio, dando un cambio estructural al rojo fenol en la cual rompe la unión covalente del oxígeno, quedando un anión sulfito y los oxidrilos de los ciclos hexano se transforman en cetonas.

Importancia del rojo fenol: Este compuesto es soluble en soluciones hidroxilícas y en esta prueba se lo utiliza como indicador de pH. Los indicadores ácido-base tienen carácter ácido o básico débil, que tienen la propiedad de que su molécula y el ion correspondiente presentan coloraciones diferentes, esto quiere decir que el color del compuesto disociado es diferente del no disociado. Esto permite distinguir variaciones de pH en un medio. En el caso del rojo fenol el rango de pH es de 6.4 a 8.4.

Forma ácida del rojo fenol.

Forma alcalina del rojo fenol.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE BIOSEGURIDAD DEL LABORATORIO DE VITAMINAS Y DIGESTIÓN DE MONOGÁSTRICOS, AVES Y RUMIANTES: Riesgos químicos: ACIDO CLORHÍDRICO: El cloruro de hidrógeno es irritante y corrosivo para cualquier tejido con el que tenga contacto. La exposición breve a bajos niveles produce irritación de la garganta. La exposición a niveles más altos puede producir respiración jadeante, estrechamiento de los bronquiolos, coloración azul de la piel, acumulación de líquido en los pulmones e incluso la muerte. La exposición a niveles aún más altos puede producir hinchazón y espasmos de la garganta y asfixia. La mezcla del ácido con agentes oxidantes de uso común, como la lejía, también llamada lavandina en algunas partes, (hipoclorito de sodio, NaClO) o permanganato de potasio (KMnO4), produce el tóxico gas cloro. A pesar de estas características los jugos gástricos en el estómago humano contienen aproximadamente el 3 % de ácido clorhídrico. Allí ayuda a coagular las proteínas y desempeña un papel importante como coenzima de la pepsina en su digestión. También ayuda en la hidrólisis de los polisacáridos presentes en la comida. Es secretado por las células parietales. Éstas contienen una extensiva red de secreción desde donde se secreta el HCl hacia el lumen del estómago. Riesgos: Ingestión: Puede producir gastritis, quemaduras, gastritis hemorrágica, edema, necrosis. Se recomienda beber agua o leche y NO inducir el vómito Inhalación: Puede producir irritación, edema y corrosión del tracto respiratorio, bronquitis crónica. Se recomienda llevar a la persona a un lugar con aire fresco, mantenerla caliente y quieta. Si se detiene la respiración practicar reanimación cardio- pulmonar Piel: Puede producir quemaduras, úlceras, irritación. Retirar de la zona afectada toda la vestimenta y calzados y lavar con agua abundante durante al menos 20 minutos Ojos: Puede producir necrosis en la córnea, inflamación en el ojo, irritación ocular y nasal, úlcera nasal. Lavar el o los ojos expuestos con abundante agua durante al menos 15 minutos BICARBONATO DE SODIO: La inhalación del polvo o niebla puede causar daños al sistema respiratorio y al tejido pulmonar lo cual puede producir desde una irritación a las vías respiratorias superiores hasta la neumonía química. El contacto prolongado causa irritación a la piel con enrojecimiento y formación de ampollas, lo cual puede agravarse en personas con lesiones previas a la piel. La severidad del ataque a la piel va en relación directa y proporcional a la concentración y tiempo del contacto. SULFATO DE Cu: Causa irritación del tracto respiratorio. La ingestión de este producto causa severas quemaduras a las membranas mucosas de la boca, esófago y el estómago. AMONIACO: Es un gas de olor nauseabundo característico. Es irritante tanto por inhalación como por piel. Está presente en muchos productos de limpieza en forma líquida. Durante su utilización debe evitarse la mezcla con lavandina porque contiene hipoclorito de sodio que al contacto con amoníaco produce cloramina, un gas irritante y muy tóxico ACIDO SULFÚRICO, ÁCIDO NÍTRICO E HIDRÓXIDO DE SODIO: YA VISTO. Riesgo fuego: Para la reacción de Felhing. Riesgo eléctrico: Por el uso del baño maría. Riesgo biológico: En estos laboratorios trabajamos con material biológico (materia fecal de ave y líquido ruminal).

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EJERCICIOS DE SEMINARIO: Seminario unidad temática 1: Bioelementos y moléculas de interés biológico

1. Explique el rol del agua como solvente en el organismo animal 2. Explique la importancia del conocimiento de la bioquímica como parte de la curricula de la Carrera de Veterinaria. 3. Complete las oraciones Las propiedades del material a estudiar que permiten efectuar los siguientes estudios biológicos son: La ______________ separa células, moléculas o líquidos no miscibles, esto es posible por las diferencias en cual propiedad de los mismos: La colorimetría permite identificar y cuantificar sustancias según dichas sustancias puedan_____________ o ___________________la luz. La electroforesis posibilita la separación de moléculas según éstas tengan: diferentes ________________ ________________________________________. 4. Bioelementos primarios, en conjunto 95% de la materia viva, principales constituyentes de las biomoléculas, son: C= 20 %, H= 9.5 %, O= 62 %, N= 2,5 % /// P, S

5. Bioelementos secundarios: 4,5% de la materia viva, son: Na, K, Ca, Mg, Cl

6. Oligoelementos, son inferiores al 0,1%, no son los mismos en todos los seres vivos y son indispensables para el desarrollo armónico del organismo. Se han aislado unos 60 oligoelementos en los seres vivos, pero solamente 14 de ellos pueden considerarse comunes para casi todos; son:, F, Co, Si, Cr, Zn, Li, Mo 7. ¿Cuál de las siguientes características NO es común a los llamados bioelementos primarios?: a) entre tales elementos pueden establecerse enlaces covalentes sencillos y múltiples. b) la combinación de tales elementos produce compuestos, generalmente, con cierta o bastante reactividad química. c) sus combinaciones originan una rica variedad de funciones químicas. d) al ser pocos, el número de compuestos a que su combinación da lugar es bastante limitado. e) son imprescindibles para formar las principales biomoléculas orgánicas. 8. Complete los siguientes enunciados referentes a las propiedades del agua: -Los líquidos orgánicos (citoplasma, líquido tisular, plasma, linfa, savia, etc) son disoluciones acuosas que sirven para el transporte de sustancias y como medio en el que se producen las reacciones metabólicas. El agua interviene en muchas de reacciones como la fotosíntesis, en las hidrólisis y en las condensaciones.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE - A diferencia de otras sustancias de peso molecular semejante, el agua es_____________ a temperatura ambiente. Debido a su polaridad el agua es buen disolvente de los compuestos ___________________ y __________________. - El _______________________(calor necesario para elevar 1ºC la temperatura de 1 g) es Relativamente ____________________, así como el _________________________. Gracias a estas dos propiedades el agua interviene en la t_________________________. - Máxima densidad a 4°°C. Como consecuencia el hielo ___________________el agua líquida, lo que impide los océanos y otras masas menores de agua se congelen de abajo a arriba. - En el agua son elevadas las fuerzas de cohesión (atracción entre las moléculas de agua) y de adhesión (atracción entre el agua y una superficie) lo cual origina los fenómenos de __________________ por los que el agua asciende en contra de la gravedad por conductos de diámetro muy fino (capilares). Estos fenómenos contribuyen al transporte de sustancias en los vegetales.

9. El agua al ionizarse produce... a) iones H3O+ y OH-; b) iones H3O- y OH+; c) iones H3O+ y OH+; d) iones H3O- y OH-. e) Ninguna de las opciones anteriores BIOMOLÉCULAS ORGÁNICAS 1.

Escriba la estructura de los grupos funcionales enumerados:

Grupos Funcionales Hidrófilos Carboxilo Hidroxilo o Alcohol

Grupos Funcionales Hidrófobos - COOH

Radical Alquílico

- CH2 - R

- OH

Radical etilénico

- CH = R

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Carbonilo

>C=O

Amino

Radical fenilo

- C6 H5

- NH2

3. Complete los espacios en blanco: Los grupos funcionales polares son s________________ en agua o _________________. Los no polares son ____________________ o ___________________.

4. Complete los espacios en blanco del siguiente cuadro observando las moléculas debajo del mismo. Identifique los diferentes átomos que componen estas estructuras y clasifíquelos en primarios, secundario u oligoelemento.

Figura Primario

Elementos Secundario Oligoelemento

Grupos funcionales presentes

Ribosa 5 P Cisteína 6-mercaptopurina Fluoroacetato Colesterol Acetil CoA

Ribosa 5 P

6-mercaptopurina

Cisteína

Colesterol

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Fluoroacetato

Acetil CoA

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 5. Observe la estructura de las siguientes moléculas y deduzca su solubilidad frente al agua (hidrofílica, hidrofóbica, anfipática). Señale con una X en la grilla.

hidrofílico hidrofóbico anfipático Lípido complejo Molécula de jabón Glucosa Triacilglicérido Fosfato de Dexametasona Vitamina A Vitamina B1- (Tiamina)

Lípido complejo

Triacilglicérido

Molécula de jabón

Vitamina B1- (Tiamina)

Glucosa

Vitamina A

Seminario unidad temática 2: aminoácidos, péptidos y proteínas 1. Observe las fórmulas y diga; ¿de que compuesto se trata? ¿Qué tipo de isomería puede observar? ¿Cómo se indica en el nombre del compuesto?

2. ¿Qué diferencias hay entre proteínas Simples y Conjugadas? ¿Cómo se las subclasifica?

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 3. 4. a. b. c. d.

¿Existe alguna diferencia entre las proteínas de origen animal y las de origen vegetal? Justifique su respuesta. Aplicación de conocimientos a Proteínas de interés. Explique para el colágeno y la hemoglobina: Función Localización Particularidades acerca de la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria (si la tuviera) de cada una. Clasificación (simples o complejas)

5 - Cuáles de las siguientes afirmaciones describen a la cadena lateral del aminoácido serina: a) Contiene un grupo hidroxilo b) Puede formar uniones disulfuro c) Puede participar de uniones puente de hidrógeno d) Esta cargada a pH fisiológico 6 - Cuáles de los siguientes aa posee una cadena lateral cargada a pH fisiológico. a) Ácido aspártico b) Lisina c) Acido glutámico d) Asparragina 7 - La glutamina: a) Contiene 3 grupos titulables b) Contiene un grupo amida c) Es un aa ácido d) Contiene una cadena lateral que puede formar puentes de hidrógeno en proteínas 8 - Cuáles de las siguientes afirmaciones acerca de los aminoácidos son correctas: a) La glicina contiene 2 hidrógenos disociables b) La tirosina es un sitio de unión de grupos fosfatos en proteínas c) La cisteína es un aminoácidos que contiene azufre d) La glutamina es clasificada como un aminoácido básico. 9 - La unión peptídica a) Es un tipo especial de unión amida b) Posee un carácter parcial de doble ligadura c) No está ionizada a pH fisiológico d) Se rompe por agentes que desnaturalizan proteínas , tales como solventes orgánicos o altas concentraciones de urea. 10 - El péptido alanil-glicil- serina a) Contiene alanina con un grupo alfa –amino libre b) Contiene tres enlaces peptídicos c) Es ópticamente activo. d) Es un dipéptido 11 – Escribir la estructura iónica predominante de la Gly a pH 3; 7 y 13 12 – Las proteínas son macromoléculas biológicas constituidas básicamente por: a) C, H, O, P b) C, H, O, N c) C, H, O, Fe

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 13 – Los alfa – L aminoácidos se caracterizan por: a) la disposición del grupo carboxilo a la izquierda del carbono b) la disposición del grupo amino a la derecha del carbono c) la disposición del grupo amino a la izquierda del carbono 14 – El comportamiento anfótero de los aminoácidos se refiere a . a) el pH que exista en una disolución acuosa determina su ionización b) el pH que exista en una disolución acuosa determina su actividad óptica c) el pH impide que se solubilicen en una disolución acuosa 15 – Un ejemplo de polipéptido es : a) Ala – Glu- Tyr – Met- Pro b) Cys – Pro – His- Ala – Ile – Phe – Gly c) Ninguna es correcta 16 – En cuanto al enlace peptídico, es cierto que: a) se estable entre los grupos amino de dos aminoácidos contiguos b) se establece entre los grupos carboxilos de dos aminoácidos contiguos c) se estable entre los grupos amino y carboxilo de dos aminoácidos. 17 – Escriba la fórmula desarrollada del siguiente dipéptido: Lis – Asn 18 - El punto isoeléctrico de un aminoácido es: a) b) c) d) e)

El pH en el cual las cargas positivas son iguales a las cargas negativas. La temperatura a la cual la disociación del aminoácido es la máxima El pH en el cual la disociación del aminoácido es la máxima Las opciones a, b y c son correctas. Las opciones a, b y c son incorrectas

19 - En cuanto a la estructura de los aminoácidos: a) Alanina y tirosina poseen un anillo bencénico b) Lisina y arginina poseen más de un átomo de nitrógeno en su estructura c) La metionina posee un átomo de azufre en su estructura d) Las opciones a, b y c son correctas. e) Las opciones a, b y c son incorrectas

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Seminario unidad temática 3: Enzimas

Interpretación de gráficos 1. El gráfico 1 ilustra las energías de activación de una determinada reacción en presencia y ausencia de una enzima. ¿Cuál es la curva que grafica el curso de la reacción en presencia de la enzima?

GRÁFICO 1

2. ¿Qué propiedades de las enzimas permiten considerarlas como catalizadores? ¿Qué es un centro activo? 3. Representa gráficamente la cinética de los enzimas señalando el valor de Vmax y Km. Explica brevemente la inhibición competitiva. Seleccione la opción correcta: 4. Los enzimas alostéricos suelen tener estructura cuaternaria, formados por varios protómeros a) Verdadero b) Falso 5. Si un producto final provoca el cambio de conformación del enzima inicial a la forma inactiva, el proceso se llama... a) inducción enzimática b) inhibición no competitiva c) retroinhibición d) regulación conformacional 6. Las moléculas reguladoras de las enzimas alostéricas se unen al centro activo del enzima, modificando su actividad a) Falso b) Verdadero 7. Las enzimas alostéricas se sitúan preferentemente al final de las rutas metabólicas como sistema de control final. a) Verdadero b) Falso

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 8. El producto final de una ruta metabólica es normalmente un regulador positivo de las enzimas alostéricas del inicio de la ruta. a) Verdadero b) Falso 9. Las enzimas alostéricas tienen dos conformaciones, y sólo una de ellas es activa. a) Falso b) Verdadero 10. De la lectura del abstract trascripto a continuación extraiga las respuestas a las siguientes preguntas: a) b) c) d)

¿Cuál es la estructura química de la proteína identificada? ¿Cuál es la actividad enzimática asignada a dicha proteína? Escriba la estructura del sustrato. ¿Cuál de las dos enzimas descriptas mostró mayor afinidad por el sustrato? Fundamente su respuesta. ¿Qué conclusión puede sacar de la comparación de las dos Vmax?

Abstract: Manzanares, P., Van den Broeck, H.C., De Graaff, L.H. and Visser, J. Purification and characterization of two different -L-rhamnosidases, RhaA and RhaB, from Aspergillus aculeatus. Applied and Environmental Microbiology. 67(5), 2230-2234 (2001).

Abstract: Two proteins exhibiting -L-rhamnosidase activity, RhaA and RhaB, were identified upon fractionation and purification of a culture filtrate form Aspergillus aculeatus grown on hespiridin. Both proteins were shown to be N glycosylated and had molecular masses of 92 and 85 kDa, of which approximately 24 and 15%, respectively, were contributed by carbohydrated. RhaA and RhaB, optimally active at pH 4.5 to 5, showed Km and Vmax values of 2.8 mM and 24 U/mg (RhaA) and 0.30 mM and 14 U/mg (RhaB) when tested for pnitrophenyl- -L-rhamnopyranoside. Both enzymes were able to hydrolyze -1,2 and -1,6 linkages to -Dglucosides. Using polyclonal antibodies, the corresponding cDNA of both -L-rhamnosidases, rhaA and rhaB, was cloned. On the basis of the amino acid sequences derived from the cDNA clones, both proteins are highly homologous (60% identity).

Seminario unidad temática 4: metabolismo de aminoácidos y proteínas. 1. Indique en las celdas correspondientes de la grilla siguiente Verdadero (V) o Falso (F) según corresponda, para cada afirmación, en relación al metabolismo de aminoácidos y proteínas.

Los aminoácidos pueden ser utilizados como combustible, pero como función secundaria, reemplazados por carbohidratos y grasas Los niveles de aminoácidos dependen del equilibrio entre biosíntesis y degradación de proteínas corporales Cuando el exceso de aminoácidos se utiliza en síntesis de nuevos constituyentes, se dice que el balance nitrogenado es negativo La pérdida del grupo carboxilo de aa da lugar a formación de aminas biógenas, de intensa acción fisiológica 79

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El principal donante de metilo es la metionina activa o S-adenosil metionina A través de transaminaciones, el organismo puede generar aminoácidos si dispone de los  cetácidos correspondientes 2. ¿Cuál es la función de la S - adenosil metionina? Esquematice su estructura. 3. Mecanismo de las reacciones de transaminación ( formación de Bases de Schiff). 4. Escriba las fórmulas correspondientes a las reacciones catalizadas por las enzimas ALAT (GPT) y ASAT (GOT). 5. Escriba las reacciones de formación de cadaverina y putrescina. ¿Qué tipo de reacciones son? 6. ¿Cuáles son los aminoácidos precursores de las siguientes aminas biógenas?: histamina, tiramina y triptamina? 7. Qué es una reacción de transpeptidación? Escriba la ecuación correspondiente a la formación de glutatión. 8. Esquematice el metabolismo de triptófano, fenilalanina e histidina. 9. El esquema siguiente ejemplifica una reacción básica de la degradación de los aminoácidos. Complete los espacios en blanco del mismo (sustrato/s, producto/s, enzima, coenzima).

Seminario unidad temática 5: ácidos nucleicos 1. ¿Qué otra función poseen los nucleótidos libres, aparte de actuar como eslabones de cadenas poliméricas? Dibuje la estructura del ATP y explique su composición. 2. ¿Cuantos tipos de ARN conoce? ¿Qué diferencia estructural con el ADN poseen? ¿Cuáles son sus funciones y en que parte de la célula se encuentran? ¿Cuáles son sus estructuras? Graficar. 3. Mencione diferencias entre el ADN de procariotas y eucariotas. 4. Explique quienes poseen ADN circular y cómo es el genoma de los virus. 5. Escribir la fórmula de los siguientes compuestos: (Identifique las uniones entre las diferentes partes de la molécula)  CMP (5’ monofosfato de citidina)  dGMP (5’ monofosfato de desoxiguanosina)

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 6. Dibuje la estructura de los anillos de purina y pirimidina y coloque la numeración correcta de sus átomos.

Seminario unidad temática 6: metabolismo de ácidos nucleicos 1- Explique como ocurre el catabolismo de bases púricas y pirimídicas, cuáles son sus productos y como se eliminan del organismo. 2- Mencione las enzimas que participan en el proceso de duplicación del Ácido Desoxiribonucleico y mencione sus funciones. 3. a) b) c) d) e) f) g)

Metabolismo de bases púricas Nombrar los compuestos precursores de la síntesis del anillo de purina Dibujar la estructura de la ribosa 5 fosfato Esquematizar la biosíntesis de los nucleótidos de purina a partir de la ribosa 5 fosfato Dé ejemplos de otras vías para la síntesis de nucleótidos de purina en el organismo ¿Cuáles son los productos del catabolismo de las purinas? Explique el comportamiento del ácido úrico en pH sanguíneo normal Explique la importancia de los uratos y sus orígenes en las especies animales.

4. a) b) c)

Metabolismo de pirimidinas Nombrar los precursores de la síntesis del núcleo de pirimidina Esquematice la biosíntesis del núcleo de pirimidina Esquematice el catabolismo del núcleo de pirimidina

5. Biosíntesis de nucleósidos di y trifosfatos Complete las siguientes ecuaciones a) GMP + _________ b) GDP + _________

 GDP + ADP  GTP + ADP

Indique las enzimas implicadas en las reacciones y los cofactores necesarios 6. Biosíntesis de ácidos nucleicos a) Esquematice la replicación del ADN b) Esquematice la síntesis de los 3 tipos de ARN 7. Cómo eliminan el Nitrógeno en exceso los mamíferos, las aves, los reptiles y los peces?

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Seminario unidad temática 7: Glúcidos Dado el siguiente compuesto:

1. Identifique el grupo de moléculas de interés biológico al que pertenece. 2. Describa las isomerías que advierte en dicha estructura 3. Forme el hemiacetal (furanósido y piranósido) correspondiente, con los dos isómeros que se generan en cada caso. 4. ¿Qué producto obtendría si hace reaccionar dicho compuesto con una molécula de metanol? Escriba la ecuación correspondiente. Ubique al producto de la reacción dentro de la clasificación de glúcidos. 5. ¿Qué tipos de isomería puede presentar la fructosa? 6. Describa con fórmulas la unión éster entre un glúcido y un ácido fosfórico. 7. ¿Cuáles son las características generales de los heteropolisacáridos? 8. Describa ubicación en el organismo y función de cada uno de ellos. 9. ¿Por qué se comportan como polianiones y qué característica le otorga a la molécula? 10. Describa la función y estructura de los proteoglicanos. 11. Forme una glicoproteína de 8 residuos de glúcidos. ¿Cuál podría ser su función? 12. ¿cuáles son los glicolípidos más abundantes y en qué se diferencian bioquímicamente? 13. Describa la estructura de la pared vegetal y explique la disposición y función de los glúcidos que la forman. 14. Compare estructuralmente a las moléculas de almidón y celulosa.

Seminario unidad temática 8: Metabolismo de glúcidos 1.- Ingreso de la Glucosa a las células: naturaleza química y ubicación celular de los Transportadores de

Glucosa. Diferencias entre SGLT y GLUT. Clases de GLUT según su distribución tisular. Propiedades cinéticas. 2.- La Glucosa – 6 fosfato constituye lo que se denomina un punto de “encrucijada metabólica”, ¿cuáles son los posibles destinos de este metabolito? ¿En qué condiciones se ve favorecido cada uno de ellos? Esquematice. 3.- Glucógeno: ¿Para qué sirve? ¿Por qué el organismo deposita glucosa como glucógeno y no como glucosa – 6 fosfato, siendo que la formación de este último demanda menor gasto energético. ¿Existe alguna analogía estructural con el almidón? Esquematice formación y degradación. 4.- ¿A qué se denomina gluconeogénesis? ¿En qué situaciones se produce? ¿A partir de qué sustratos? ¿Por qué no es el camino inverso de la glucólisis? Esquematice los tres desvíos que posibilitan esta vía, señalando las enzimas involucradas y su ubicación celular. Balance energético. ¿Es una vía catabólica o anabólica?

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 5.- Explique el proceso observado en el esquema de la figura, en qué condiciones y dónde se produce.

6.- Nombre los siguientes compuestos y explique qué relación tienen con el metabolismo de carbohidratos:

7.-Marque en el siguiente esquema los dos posibles caminos para la producción del propionato por las bacterias ruminales.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 8.- Mencione tres procesos que aportan glucosa a la sangre y tres procesos que la extraen. El banco de respuestas lo ayudará en la selección. SUSTRAEN APORTAN a) a) b)

b)

c)

c)

Banco de respuestas vía de las Pentosas-Fosfato - absorción intestinal – glucólisis – glucogenólisis gluconeogénesis hepática – glucogenogénesis

Seminario unidad temática 9: Lípidos Escribir las fórmulas de los siguientes compuestos: a) ácido esteárico b) ácido oleico c) 1,2 dilauril 3 esteaoril L glicerol. d) 1,2,3 trilinoleil D glicerol e) Ácido 9,10 dicloro linoleico f) Araquidato de sodio g) Ácido fosfatídico h) Ceramida Escribir las ecuaciones correspondientes a las siguientes reacciones: a) •Saponificación de triesteaoril D glicerol b) •Hidrogenación del ácido palmitoleico Deduzca la variación relativa de las propiedades físicas entre el ácido esteárico y el oleico Seminario unidad temática 10: Metabolismo de lípidos 1- Cetogénesis: Realice un esquema con los tejidos involucrados en la formación, utilización y excreción de cuerpos cetónicos. ¿En qué situaciones se produce? Esquematice las etapas de formación y utilización de cuerpos cetónicos (con fórmulas). ¿Qué es la cetosis? 2- Biosíntesis de ácidos grasos: situaciones en las que se produce. Describa el funcionamiento del complejo Ácido graso sintetasa. Esquematice las etapas. Balance energético. ¿Se pueden sintetizar ácidos grasos insaturados?

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3- Eicosanoides: grupo de compuestos que comprende, funciones biológicas que realizan. 4- ¿Cuál es el intermediario común en la biosíntesis de triglicéridos y fosfolípidos; enumere los pasos de la biosíntesis de fosfolípidos? 5- ¿Cuáles son los factores Lipotrópicos? 6- Utilización y transporte del colesterol en los animales. 7- Describa en orden de mayor a menor los componentes de las siguientes lipoproteínas y las funciones de la mismas.

Seminario unidad temática 11: Vitaminas 1. El ácido nicotínico, la vitamina D, y la vitamina K. tienen cierta independencia de la dieta, pudiendo ser sintetizadas por el organismo. ¿De qué manera ocurre esto? 2. Describa la participación del pirofosfato de tiamina (PPT) en la descarboxilación oxidativa del piruvato.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE Seminario unidad temática 12: Bioquímica de las hormonas De estas seis actividades, deben resolverse en clases por lo menos cuatro. Las demás podrán completarse luego para ser consideradas en la siguiente clase práctica. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Esquematice el Sistema del AMPcíclico y el Sistema Calmodulina-Calcio. Esquematice el Sistema de la proopiomelanocortina (POMC). A que se denomina vida media de las hormonas, ¿de qué factores depende? Esquematice la biosíntesis de hormonas tiroideas. ¿De qué aminoácidos derivan estas hormonas? Hormonas derivadas del colesterol: realice las estructuras químicas señalando las diferencias en cada caso. Esquematice el mecanismo de acción de hormonas esteroideas.

Seminario unidad temática 13: Utilización de la energía. CICLO DE KREBS: Catabolismo del Acetil – CoA. CADENA RESPIRATORIA. FOSFORILACION OXIDATIVA 1. ¿Que son las especies reactivas del oxígeno y como se generan? 2. ¿Qué efectos tienen las especies reactivas del oxígeno en el organismo? 3. ¿Qué mecanismos de defensa posee el organismo contra dichas espacies reactivas? Sistemas endógenos y exógenos. 4. El Acetil – CoA constituye un punto de encrucijada metabólica, ¿cuáles son los posibles orígenes y destinos de este metabolito? Esquematice. 5. Ciclo del Acido Cítrico, de Acidos Tricarboxilicos o de Krebs: Ubicación celular. Papel funcional. Reacciones: describa cada una de ellas (con fórmulas), indicando las enzimas que intervienen y los principales puntos de regulación. Balance energético. ¿Es una vía catabólica o anabólica? 6. Cadena respiratoria y fosforilación Oxidativa: ¿de qué manera se acoplan? Para que sirven? Esquematice indicando los complejos, las bombas de protones, las coenzimas que interaccionan y la ATP sintetasa. Rédito de ATP: rinde lo mismo un NADH + H+ y un FADH2? ¿Por qué? 7.- Identifique la reacción de la figura siguiente, a qué vía metabólica pertenece y si es una reacción endergónica o exergónica.

8.- Defina y ejemplifique acoplamiento energético en las vías metabólicas.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 9.- Complete el cuadro, donde para cada una de las reacciones del ciclo de Krebs presentadas se detallan el sustrato, el producto y la enzima actuante.

N° de Orden de la Reacción (R)

Sustrato

Enzima

Producto

Oxalacetato (o ácido oxálico) Isocitrato deshidrogenasa Oxalacetato 10.- Mencione y ejemplifique el rol biosintético de algunos compuestos intermedios del ciclo de Krebs. 11.- Identifique los Sistemas de provisión de energía muscular (Sistema Creatínfosfato - Sistema de ácido láctico - Sistema Oxidativo) y complete el cuadro Sistema de provisión Período Energía Sistema Creatínfosfato0-30 s La energía en forma de 'combustible' empleada en los músculos (procedente del ATP muscular) Sistema de ácido lácti30 s - 5 min Energía en forma de 'combustible' empleada en los músculos procedente del glucógeno Sistema Oxidativo 1 min - 4-5 h Energía procedente de la oxidación de los lípidos y del glucógeno.

SEMINARIO unidad temática 14 y 15: Bioquímica de la digestión en monogástricos, aves y rumiantes 1. Construya un cuadro comparativo de las enzimas presentes en cada órgano del sistema digestivo de monogástrico y de aves. 2. Clasifique las enzimas anteriores en endo o exo enzimas, y explique brevemente el modo de acción de cada una de ellas y las condiciones necesarias para las catálisis en las que intervienen. 3. Elija un sustrato (glúcido, lípido, proteína) y esquematice la digestión en los diferentes niveles del tubo digestivo de monogástricos y de aves. 4. Clasificar a las distintas aves según el tipo de dieta que ingieren. 5. Describir brevemente las principales diferencias del aparato digestivo de las aves con respecto a las otras especies domésticas. 6. Resuma en un esquema las condiciones necesarias para la fermentación en el rumen y en una cámara de fermentación. 7. Esquematice la degradación de celulosa y almidón en el rumen. 8. Nombre los productos de la fermentación de azúcares, que son absorbidos por las paredes del rumen y algunos de sus destinos en el rumiante. 9. Esquematice el ciclo de recuperación de la urea por el rumiante.

Seminario unidad temática 16: Integración y control del metabolismo 1. Sobre la organización del metabolismo es cierto que:

a) Todas las rutas metabólicas están formadas por secuencias de reacciones irreversibles catalizadas por enzimas.

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE b) Las rutas anabólicas generan intermediarios metabólicos, productos de desecho, ATP y poder reductor que pueden ser utilizados en las rutas catabólicas. c) Las rutas anfibólicas ocurren preferencialmente en anfibios, pero no en microorganismos. d) Las rutas catabólicas generan intermediarios metabólicos, productos de desecho, ATP y poder reductor que pueden ser utilizados en las rutas anabólicas. e) Las rutas anabólicas permiten la biosíntesis de productos de excreción para el organismo, generando energía y poder reductor útil para las rutas anfibólicas. 2. Las vías metabólicas que requieren energía y conducen a moléculas complejas a partir de precursores, se

conocen colectivamente como: a) Anabolismo. b) Autotrofismo. c) Catabolismo. d) Heterotrofismo. e) Metabolismo. 3. En los procesos catabólicos, el conjunto de las reacciones son:

a. Endergónicas. b. De síntesis. c. Exergónicas. d. El proceso requiere energía. 4. Señale sobre la figura siguiente las rutas metabólicas que se encuentran aceleradas o estimuladas en la

diabetes mellitus (poniendo signos + junto a las flechas).

.....

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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS - BIOQUIMICA - AÑO 2014 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE 5-

Complete el siguiente esquema con las enzimas que correspondan.

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