La espectroscopía de fluorescencia en el análisis estructural de proteínas y de agregados amiloides Introducción La luz puede ser absorbida y emitida por ciertos compuestos y a este proceso se lo denomina luminiscencia. Existen dos tipos de luminiscencia: la fluorescencia y la fosforescencia. En la fluorescencia el tiempo entre la absorción y emisión de la luz es del orden de 10-8 segundos, mientras que el proceso de fosforescencia es mucho más lento y toma alrededor de 10-3 a 1 segundo en ocurrir. Así, la fluorescencia dura únicamente mientras dura el estímulo, es un fenómeno virtualmente instantáneo, mientras que la fosforescencia puede durar hasta minutos luego de desaparecido el estímulo.

La Fluorescencia es un fenómeno físico mediante el cual ciertas sustancias absorben energía en forma de radiación electromagnética emitiéndola en una longitud de onda mayor en un período de tiempo muy corto.

La espectroscopía de fluorescencia es un método muy utilizado en mediciones analíticas y en la investigación científica, especialmente en bioquímica y biomedicina. Las dos razones principales por las que se masificó el uso de esta técnica espectroscópica son: 1) su gran sensibilidad y 2) el alto nivel de evolución alcanzado tanto por los instrumentos requeridos, como por los fluoróforos diseñados para aplicaciones específicas. Aún cuando una de las aplicaciones más utilizadas de la fluorescencia es el marcaje de macromoléculas (como una alternativa al marcaje con isótopos radiactivos), puede ser usada por ejemplo para realizar estudios de dinámica molecular, análisis estructural de proteínas, cuantificación de iones en compartimentos celulares, microscopía, análisis de potencial de membrana, interacciones entre macromoléculas, etc. Comparada con los métodos de absorción, la sensibilidad de los métodos basados en fluorescencia es 10 a 10.000 veces mayor, esto significa que se pueden analizar nanogramos a picogramos de diversos analitos con muy buenos resultados. Otra ventaja de la fluorescencia es su especificidad, que permite identificar moléculas específicas en matrices complejas. Como desventaja se puede distinguir que tiene menos aplicaciones que la espectroscopía de absorción, ya que es relativamente limitada la cantidad de sistemas químicos que exhiben fluorescencia. Sin embargo, aún cuando el analito no exhiba fluorescencia natural, se pueden usar sondas fluorescentes que se unen a grupos funcionales específicos en la molécula en estudio.

Fluoróforos La fluorescencia es el resultado de una serie de procesos que ocurren en ciertas moléculas llamadas fluoróforos. Dichas moléculas son generalmente orgánicas poliaromáticas o heterociclos. Los átomos son generalmente no fluorescentes, pero una notable excepción son los 1

lantánidos, por ejemplo europio o terbio, cuya fluorescencia resulta de la transnición electrónica entre orbitales ƒ. Los fluoróforos se pueden dividir en dos clases generales: extrínsecos e intrínsecos. Se denomina fluoróforo intrínseco a aquel que por si mismo presenta fluorescencia. Por ejemplo el grupo indol del triptofano en las proteínas. Fluoróforo extrínseco es aquel que se agrega a una muestra que no presenta fluorescencia. Por ejemplo el 1,6-difenil- 1,3,5 hexatrieno (DPH) que se utiliza para medir fluidez de membranas, las cuales no presentan fluorescencia.

Fundamento Cuando el fluoróforo absorbe luz uno de sus electrones pasa a un estado excitado (de mayor energía) que es inestable y al retornar a su estado basal, el exceso de energía se libera en forma de luz pero de una longitud de onda mayor (menor energía) a la de excitación. Este proceso es representado por el diagrama de Perrin-Jablonski (Figura 1).

Decaimiento vibracional Cruce intersistema Decaimiento vibracional

ce nc ia Fl uo re s

Ex ci ta ci ón

Ac ti tér vaci mi ó n ca

sf Fo

ia nc ce s ore

S0 + hνexc → S1

Excitación

S1 → S0 + hνem

Fluorescencia

S1 → T1 T1→ S0 + hνem´

Cruce intersistema Fosforescencia

Figura 1. Diagrama de Perrin-Jablonski

Un fluoróforo absorbe energía electromagnética pasando de un estado electrónico “basal” (S0) a un estado electrónico “excitado” (S1) luego de absorber un fotón (es decir, luz) de energía: E = h .νex donde E es la energía, h es la constante de Planck y νex es la frecuencia de excitación. Esta energía es suministrada por una fuente de luz externa. La absorción de luz produce una transición electrónica en el fluoróforo: un electrón es promovido desde el orbital molecular ocupado más externo al orbital molecular desocupado más cercano al mismo (Figura 1). Este proceso está dirigido por distintas reglas de selección y la probabilidad de que la transición se produzca está reflejada por el coeficiente de absortibidad molar, ε (M-1. cm-1) que está determinado por la ley de Lambert y Beer para cada longitud de onda:

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A = ε . l. c donde A es la absorbancia, l es el paso óptico y c la concentración del fluoróforo. En fosforescencia el electrón excitado sufre una transición a un estado más estable (T1), y la emisión con energía hνem´ resulta mantenida por un tiempo prolongado. En fluorescencia el estado excitado dura un tiempo finito, normalmente entre 10-9 a 10-8 segundos. En este tiempo el fluoróforo sufre cambios conformacionales y esta sujeto a múltiples interacciones con el medio ambiente molecular. Estos procesos tienen dos consecuencias importantes (Figura 1): 1) debido a la energía que se disipa durante el tiempo de vida del estado excitado, el fotón de energía emitido hνem, es de menor energía que el fotón que el fluoróforo absorbió previamente, por lo tanto la longitud de onda de emisión es mayor que la de excitación; 2) no todas las moléculas que se excitaron inicialmente por absorción retornan al estado basal de energía por emisión de fluorescencia. Otros procesos como por ejemplo: “quenching” colisional, transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (RET), conversión interna o desactivación no radiativa y formación de un fotoproducto pueden disminuir la cantidad de moléculas en el estado excitado y por lo tanto disminuyen el rendimiento cuántico de fluorescencia (Figura 2). El rendimiento cuántico de fluorescencia, ΦF es la razón entre la cantidad de fotones emitidos y la cantidad de fotones absorbidos por una molécula:

ΦF = cantidad de fotones emitidos / cantidad total de fotones absorbidos

10-8 segundos

Estado basal

Estado excitado*

Quenching o transferencia de energía de fluorescencia por resonancia Figura 2: Esquema del paso al estado excitado y de los posibles procesos de disipación de energía

Espectro de fluorescencia En espectroscopía de fluorescencia se registran espectros de excitación y de emisión. El espectro de excitación se corresponde con el espectro de absorbancia. Ambos espectros son una representación de la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias en función de la longitud de onda en nm. Para registrar el espectro de emisión se fija una longitud de onda de excitación y para el de excitación se fija una longitud de onda de emisión. Una característica llamativa de los 3

espectros de excitación y emisión de fluorescencia es que para algunas moléculas estos son imágenes especulares uno del otro, a esto se llama “regla del espejo” (Figura 3). Alteraciones de esta regla se pueden deber a impurezas fluorescentes de la muestra o, en muestras muy diluidas, a una banda “Raman” que es la banda de vibración del agua. Además existen muchas sustancias que no siguen esta regla (Figura 4) y esto se debe a una diferencia de arreglos geométricos del núcleo en el estado excitado si se compara con el estado basal.

Intensidad de fluorescencia

Intensidad de fluorescencia

Figura 3. Imágenes especulares de los espectros de excitación y emisión de fluorescencia del isotiosianato de fluoresceína (FITC)

Figura 4. Espectros de excitación y emisión de fluorescencia del p-terfenilo

Otra característica de los espectros de fluorescencia es que el espectro de emisión es independiente de la longitud de onda de excitación (λ λexc), debido a la disipación parcial de energía de excitación que ocurre durante la duración del estado excitado (Figura 5).

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El espectro de emisión de fluorescencia varía marcadamente con la estructura química

Intensidad de fluorescencia

del fluoróforo y del solvente en el que esta disuelto.

Figura 5. Independencia del pico de máxima emisión y la longitud de onda de excitación. Espectro de excitación de un compuesto y sus diversos espectros de emisión excitando a las longitudes de onda EX1, EX2 y EX3.

Procesos de disipación de energía Quenching El “quenching” o atenuación de fluorescencia puede ser definido como cualquier proceso que disminuye la intensidad de fluorescencia de un determinado fluoróforo sin cambiar el espectro de emisión. Puede ser el resultado de interacciones del estado excitado con otras moléculas, por ejemplo el solvente (quenching colisional) o por la formación de complejos del estado basal no fluorescentes. El auto quenching (self-quenching) es la disminución de la fluorescencia debida a la alta concentración del fluoróforo, el cual al disminuir su concentración aumenta la fluorescencia, por ejemplo: calceina o carboxifluoresceina, los cuales se los emplea para medir perdida de contenido de liposomas o de organelas. Cuando el fluoróforo se ha incorporado en el interior de vesículas en altas concentraciones, no fluoresce, pero si por alguna razón, se altera la permeabilidad de la membrana, sale al medio, se diluye y fluoresce.

Transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (RET) La transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (RET) se basa en la transferencia de energía entre un grupo donante y un aceptor. Deriva de la capacidad del donante fluorescente de excitar al aceptor, si ambos se encuentran a una distancia apropiada (entre 1 y 10 nm). La excitación de moléculas de aceptor puede ocurrir por transferencia directa de energía de las moléculas donor excitadas y ésta se manifiesta como una reducción en la intensidad de emisión de la fluorescencia del donor y un correspondiente incremento en la intensidad de emisión del aceptor de fluorescencia (Figura 6). El fluoróforo donante excitado presenta fluorescencia a una determinada longitud de onda. La aproximación estrecha de un segundo fluoróforo con una banda de absorción que se superpone con la banda de emisión del donante, conduce a la excitación del aceptor por el donante y la fluorescencia resultante es de mayor longitud de onda.

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Fuente luminosa Longitud de onda de exitacion del donante

Fluorescencia del donante Donante excitado

RET Aceptor excitado

Donante excitado

Fluorescencia del aceptor

Figura 6. Transferencia de energía de fluorescencia por resonancia

Análisis estructural de las proteínas Hay sólo tres aminoácidos aromáticos que absorben luz en la región del ultravioleta cercano (λ > 240 nm) y son: fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptófano (Trp). El espectro de emisión de fluorescencia de las proteínas está determinado por la presencia en la cadena proteica de dichos aminoácidos. Además existen cofactores como FMN, FAD, NAD y porfirinas que también presentan fluorescencia cuando están presentes en las proteínas. Los cambios de la fluorescencia intrínseca pueden ser usados para monitorear cambios estructurales en la proteína. Los tres aminoácidos aromáticos tienen distinta absorción y emisión de fluorescencia, como se resume en la tabla 1.

Trp

λex (nm) 295

λem (nm) 353

ΦF 0,20

Tyr

275

304

0,14

Phe

260

282

0,02

Tabla 1. Características de fluorescencia de los aminoácidos aromáticos

La fluorescencia de una proteína es una sumatoria de las fluorescencias de los distintos residuos aromáticos que posee, pero generalmente se estudia entre 280-295 nm siguiendo la fluorescencia del triptófano. Generalmente, se mide la emisión de fluorescencia del triptófano por su mayor rendimiento cuántico y su vida media más prolongada. Además, la proximidad de estos tres aminoácidos en la estructura de una proteína permite que ocurra transferencia de energía por resonancia (RET) entre Phe y Tyr y entre Tyr y Trp, siendo la fluorescencia del Trp la única que no se transfiere. Las proteínas usualmente tienen un número limitado de Trp y éste está generalmente en el sitio activo de las proteínas. La tirosina, como el triptófano, tiene una fuerte banda de absorción a 280 nm. Es un emisor más débil que el triptófano, pero puede contribuir significativamente a la fluorescencia de

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la proteeína, ya que normalmente está en un número mayor. La fluorescencia de la tirosina puede ser fácilmente transferida si se encuentra cerca del triptófano. La fenilalanina, con sólo un anillo bencénico y un grupo de metileno es débilmente fluorescente. La sensibilidad experimental (el producto de rendimiento cuántico y absortividad molar) es especialmente baja para este residuo. La fluorescencia de la fenilalanina se observa sólo en ausencia de tirosina y triptófano. Los espectros de fluorescencia y el rendimiento cuántico son generalmente más dependientes del medio ambiente que los espectros de absorción y los coeficientes de extinción molar. En las proteínas los residuos de Trp se encuentran generalmente formando parte del núcleo hidrofóbico de las mismas y por lo tanto está en regiones donde las moléculas de agua tienen poco acceso, el espectro de emisión del mismo, se corre hacia el ultravioleta (corrimiento hacia el azul) con el máximo de emisión generalmente en 330 nm. Esto se debe a que la energía emitida es mayor que cuando la cadena lateral se encuentra en contacto con el solvente, donde parte de la energía absorbida es transferida a las moléculas de agua y por lo tanto la longitud de onda del máximo de emisión es mayor (340-350). Esto también sucede cuando una proteína se desnaturaliza. Por ejemplo, cuando al péptido MccJ25-Trp se lo resuspende en concentraciones crecientes de dioxano, se ve un corrimiento hacia menores longitudes de onda y un aumento de la fluorescencia (Figura 7).

100 %

80 %

40 % 20 % 0%

333 nm

351 nm

Figura 7. Efecto del solvente en la fluorescencia del triptofano de la MccJ25-Trp.

Los rendimientos quánticos de los tres aminoácidos aromáticos decaen cuando se incorporan a una proteína. En la Tabla 2 se comparan las características de la fluorescencia de los aminoácidos libres e insertos en una proteína. También contiene datos que muestran la sensibilidad de la fluorescencia de estos residuos a la polaridad de su entorno.

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Aminoácido)

Proteína

Solvente

Trp Tyr Phe

λem (nm

ΦF

λem (nm)

ΦF

H2O

340

0,12

333

0,02

DMSO

340

0,81

333

0,67

H2O

303

0,21

---

---

DMSO

306

0,27

309

0,06

DMSO

282

0,02

284

0,006

Tabla 2. Características de la fluorescencia de los aminoácidos libres e insertos en una proteína. DMSO = dimetil sulfóxido, un solvente orgánico.

La fluorescencia de los residuos aromáticos varía en forma un tanto impredecible entre las diversas proteínas. Si se compara el estado plegado con el desplegado, el rendimiento quántico puede aumentar o disminuir. La intensidad de fluorescencia no tiene mucho valor en sí misma, pero la magnitud de la intensidad, sin embargo, puede servir como una sonda de perturbación del estado plegado. La longitud de onda de emisión es un mejor indicador del medio ambiente del fluoróforo. Por otro lado la fluorescencia del triptófano es quencheada por iodo, acrilamida, grupos disulfuros, aminos y carboxilos y residuos de histidina cercanos.

Proceso patológico de formación de Amiloides Se conoce como amiloidosis a una serie de patologías que se caracterizan por la formación irreversible de agregados insolubles, denominados fibras amiloides. Como ejemplos de estas patologías podemos mencionar: la amiloidosis sistémica, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, la Encefalopatía Espongiforme, Amiloidosis familiar, Tumor de células C de la Tiroides, las enfermedades priónicas y en algunas Diabetes tipo II. Los agregados se pueden forman a partir de péptidos no estructurados o de proteínas globulares y se caracterizan por ser irreversibles, presentar estructura tipo “cross β” y estructura fibrilar, cuando se los observa al microscopio electrónico. El modelo vigente sostiene que cada fibra presenta un diámetro entre 75-80 Ǻ y se encuentra formada por protofibras de 25-35 Ǻ (Figura 8). En esta estructura la cadena peptídica forma hojas β cruzadas (paralelas o antiparalelas) que se disponen de forma perpendicular al eje fibrilar.

Figura 8. Modelo de una fibra amiloide.

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La formación de fibras amiloides pueden también ser inducidas “in vitro” bajo condiciones fisicoquímicas adecuadas, permitiendo el estudio de los mecanismos que gobiernan el proceso. Se sabe que ciertas proteínas solubles a pH ácido y en un entorno hidrofóbico pueden formar rápidamente estos agregados. También pueden ser formados en presencia de fosfolípidos ácidos como fosfatidil serina (PS), cardiolipina (CL) o fosfatidil glicerol (PG). Estudios realizados “in vitro” demostraron que proteínas como albúmina, lisozima, insulina, gliceraldehido- 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), mioglobina, transtiretina, citocromo c, histona H1, y R-lactoalbumina forman fibras amiloides. La inhibición o reversión de la formación de fibrillas amiloides se insinúa como un posible mecanismo preventivo de las enfermedades amiloides y a la fecha, distintos compuestos orgánicos pequeños han demostrado capacidad de inhibición del proceso “in vitro”.

Figura 9. Cinética de formación de la fibra amiloide.

Los mecanismos moleculares relacionados con la formación de los agregados amiloides no han sido aún dilucidados, pero se acepta la existencia de un mecanismo general de formación. La fibrilogenesis es dependiente de un proceso de nucleación, ya que por diversos estudios se puso de manifiesto que generalmente presenta una cinética de tipo sigmoidal (Figura 9). La proteína en estado monomérico establece un equilibrio lento con estructuras oligoméricas (tiempo de inducción), las cuáles, una vez formadas, dan lugar rápidamente a fibras amiloides, ya sea mediante asociación de unidades de monómeros o bien por fusión de oligómeros. Además, el agregado de fibras preformadas provoca una disminución del tiempo de inducción. La capacidad de la albúmina de suero bovino (BSA) de formar fibrillas amiloides bajo ciertas condiciones experimentales, ha sido recientemente demostrada. Este proceso de fibrilación ocurre minutos luego de la incubación de la proteína a pH fisiológico y a temperaturas mayores de 60°C. La cinética de formación de agregados por la BSA sigue un patrón de tipo hiperbólico en lugar de sigmoidal.

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Instrumentos utilizados para detectar fluorescencia Los elementos esenciales en los sistemas de detección de fluorescencia son cuatro: 1) una fuente de excitación (luz blanca), 2) un lugar apropiado para poner la muestra, 3) monocromadores o filtros para discriminar entre los fotones de emisión de los fotones de excitación y 4) un detector para registrar la emisión de los fotones, el cual produce una señal generalmente eléctrica. Para mejorar la visualización de los resultados generalmente está acoplado al equipo un amplificador de la señal. Existen distintos tipos de equipos que utilizan los aspectos básicos de la fluorescencia, entre ellos: Espectrofluorómetro y detectores de microplacas: miden el promedio de la fluorescencia de la muestra (el volumen de muestra que mide ronda entre los µL a mL). Microscopio de Fluorescencia: determina la fluorescencia como una función de las coordenadas espaciales en dos o tres dimensiones para objetos microscópicos (por debajo de ~ 0,1 mm de diámetro). Scanner de Fluorescencia: determina la fluorescencia en función de coordenadas en dos dimensiones de objetos macroscópicos como ser geles de electroforesis, blotting y cromatografías. Citometría de Flujo: incorpora un detector de fluorescencia para determinar la fluorescencia de células, en un flujo a través de un capilar. Permite identificar y cuantificar subpoblaciones de células en una muestra compleja. Otros tipos de instrumentos que usan la detección por fluorescencia son los sistemas de electroforesis capilar, de HPLC y los equipos de secuenciación de DNA. Espectrofluorómetro

Un espectrofluorómetro (Figura 10) consta de una lámpara de arco de Xenón la cual emite luz blanca en un amplio rango de longitudes de onda que abarcan desde el UV, ~ 240 nm, hasta el infrarrojo, ~ 900 nm. Este rayo de luz es colectado por el monocromador primario o de excitación (M1) el cual selecciona la longitud de onda (λex) que va a incidir sobre la muestra y es determinada por el espectro de absorción de cada fluoróforo. El rayo de luz con la longitud de onda λex incide sobre la cubeta que contiene a la muestra, la cual puede estar termostatizada. Las cubetas pueden ser de diferentes tipos (cuarzo, vidrio, etc.) dependiendo de la longitud de onda en la cual leamos. La emisión de fluorescencia generalmente es detectada a 90° del rayo de luz de excitación. Es colectada por un sistema de lentes y pasa a través de un Monocromador secundario o de emisión (M2) el cual separa la fluorescencia emitida por la muestra de la luz de

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excitación, con una longitud de onda determinada (λem). La luz incide en un fotodetector que convierte los fotones de fluorescencia en una señal eléctrica. Otro componente muy importante es el canal de referencia que es un sistema que crea una señal electrónica proporcional a la intensidad de luz incidente en la muestra. En el espectrofluorómetro se pueden colocar filtros en los trayectos ópticos que impiden el paso de la luz de ciertas longitudes onda que interfieran con la medición.

Monocromador primario de excitación

Cubeta de muestra

λ ex Lámpara de arco de Xenón Monocromador secundario de de excitación emisión λ em

Detector / amplificador

Fotomultiplicador

Figura 10. Representación esquemática de un espectrofluorómetro.

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Parte experimental Objetivo del Trabajo Práctico: *Determinar la fluorescencia intrínseca de distintas proteínas y como dicha fluorescencia varía según el medio en que se encuentran. *Estudiar in vitro la capacidad de formación de fibras amiloides de la albúmina. Determinación de la fluorescencia intrínseca de proteínas 1)

Determinación del espectro de excitación y de emisión de albúmina,

gammaglobulina, tripsina, lisozima, insulina y mioglobina: a) en buffer Tris-HCl 20 mM pH 7,4, b) en dioxano al 50% y c) en urea 8M y d) en cloruro de guanidina 6M. A partir de soluciones madres de la proteína (2mg/ml) se realizaran diluciones 1/10 en los distintos medios con un volumen final de 1,5 ml. Se incuban durante 30 min a temperatura ambiente.

2)

Determinación de RET entre tirosina y triptófano. A partir de una solución madre

de 2mg/ml de TYR se realiza una dilución 1/10, se mide la intensidad de fluorescencia cuando se la excita a 280 nm y fijando la longitud de onda de emisión en: a) 300 nm y b) 350 nm. Luego se le agregan 50 µl de TRP (2mg/ml) y se repiten las lecturas de intensidad de fluorescencia.

3)

Quenching de la fluorescencia intrínseca del triptófano de la albúmina con el

agregado de KI y hormonas tirodeas (T4). La albúmina es la proteína más abundante del plasma sanguíneo, y es un transportador inespecífico de una gran cantidad de sustancias, por ejemplo: hormonas. La albúmina tiene un solo triptófano, el cual se encuentra en su sitio de unión a la hormona. Cuando ésta se une a la BSA se quenchea la fluorescencia del triptófano. A partir de una solución madre de 2mg/ml de albumina se realiza una dilución 1/10, se mide la intensidad de fluorescencia cuando se excita a 300 nm y emite a 350 nm. Luego se le agregan 50 µl de T4 (4mg/ml) y se repite la lectura de intensidad de fluorescencia.

Estudio in vitro de la capacidad de formación de fibras amiloides de la albúmina. La albúmina forma fibrillas amiloides cuando se la incuba a temperaturas mayores de 60°C y a pH fisiológico. La formación de estos agregados se pondrá en evidencia con la sonda fluorescente Thioflavina T. La Thioflavina T (ThT) (Figura 11), es un fluoróforo que cuando se encuentra libre se caracteriza por presentar una λexc 415 nm y de λem 482 nm. Sin embargo, al unirse a las fibras amiloides, su espectro de excitación se modifica apareciendo un pico a λexc 450 nm, sin modificar la longitud de onda de emisión.

Figura 11. Thioflavina T

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Determinación: Se inducirá la formación de fibras amiloides de la albúmina por calentamiento a 65ºC. Se estudiará la cinética de formación de agregados de la albúmina (2mg/ml) en buffer TrisHCl 20 mM pH 7,4. Se tomarán alícuotas a distintos tiempos: 0, 10, 30, 60 y 90 min. Para detener la agregación se pondrán los tubos en baño de hielo. Para la lectura se diluye las proteínas a una concentración final de 0.1 mg/ml y se les agrega ThT a una concentración final de 25 µM.

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1) Proteína: λ exc

λ em

Dioxano 100%

Urea 8M

Guanidina 6M

200 220 240 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 260

280

300

320

340

360

380

400

2) RET: Tyr – Trp y 3) Quenching λexc 275 λem 300

λem 350

KI -----

Tyr Tyr-Trp

4) Fluorescencia (UA) 0 10 30 60 90

1 0, 8 0, 6 0, 4 0, 2 0 0

20

40

60

80

100

14