HEMOFILIA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND

PREVALENCIA - Hemofilia A 1/5000 - Hemofilia B 1/25000 - VWD 3% población

FVIII-VWF FVIIIa

A1 C2

A2 C1

A3

IIa, FXa

372

A2 A1

C1

FVIII

740

A3 B

VWF

C2

N

N

S-S Vlot et al., 1998

1689

C C S-S

Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura 1

D1

D2

I S

2050

D’ D3

A1A2 A3

D4BC1C2 S I S

D’ D3 S I

A1A2 A3

D4BC1C2

RGD RGD Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos

protómero dominios funcionales ligandos

Proteolisis aumentada (vWD2A) ADAMTS-13

kproteolisis

Inicial

Plasma

vWF Ensamble y Catabolismo

ksecreción

kdepuración

Depuración aumentada (vWD1 Vicenza) Sadler JE, 2005

FACTOR VIII NH 2

A1

A2

B

A3

C1 C2

Secreción 200kD

Preactivación

1648

IIa

90kD

80kD

HRG

80kD

IIa 740

Activación 50kD

IIa

43kD 372

Inactivación

APC IIa Xa

73kD 1689

45kD

67kD 336

Lollar P & Parker CG, 1989

Xa

1721

FVIII/VWF - Propiedades FVIII

VWF

Clínica Producción

Hemofilia S. Hepáticos

Gen Molécula Función

Cromosoma X Heterodímero Coagulación Procofactor

vWD C. Endoteliales Megacariocitos Cromosoma 12 Multímero Adhesión Endotelio/Sub Transporta FVIII

FVIII/VWF - Nomenclatura Factor VIII Antígeno Función

Factor von Proteína Madura Willebrand Antígeno

FVIII:Ag FVIII VWF VWF:Ag

Cofactor Ristocetina VWF:RCo Unión al Colágeno

VWF:CB

Unión al Factor VIII

VWF:FVIIIB ISTH

HEMOFILIA A Recesiva Ligada al sexo (gen FVIIICr X) PORTADORA

HEMOFILICO

HEMOFILIA Modo de Herencia

HEMOFILIA Modo de Herencia

Hemofilia A severa 4%

15%

42%

inversiones grandes deleciones mutaciones sin sentido corrimiento de la lectura

17%

cambio de sentido 14%

desconocida

8%

Hemofila A moderada 2%

2%

10% cambio de sentido splicing corrimiento de la lectura desconocida 86%

HEMOFILIA Diagnóstico “sencillo” - APTT prolongado - FVIII disminuido

HEMOFILIA - Clasificación Severa Moderada Leve

< 1% VIII 1-5% VIII >5% VIII

HEMOFILIA Diagnóstico de Portadoras

PORTADORA OBLIGADA Padre hemofílico Hijo hemofílico y antecedentes (vía materna) 2 o más hijos, sin antecedentes familiares No requiere estudio

PORTADORA POTENCIAL Hijo hemofílico, sin antecedentes familiares Sin hijos y con antecedentes (vía materna) Dificultad diagnóstica

PORTADORAS Lyonización Ovulo Fertilizado

XM XP

Heterocigota

XP

XM

XP

XM

XM

XP

XP

XM

XM

XP

XM

XP

Clones

PORTADORAS HEMOFILIA Factor VIII probabilidad

Portadoras Normales

50

100

FVIII

Bioensayos DESVENTAJAS Probabilidad Error por lyonización extrema

Análisis de ADN VENTAJAS Certeza Independiente de lyonización

Análisis de ADN Complejo

Alteración heterogénea Afecta diferentes regiones del gen  No aplicable a todos los casos

IDENTIFICACION No Certeza INDIRECTA Análisis de segregación de RFLP -/+ -

?

-/-

PORTADORA (-) asociado al defecto

IDENTIFIACION DIRECTA Certeza Inversión del intrón 22

↓ 50% hemofílicos severos

IDENTIFIACION DIRECTA Inversiones Deleciones Inserciones Mutaciones “sin sentido” Mutaciones “sentido falso”

Sintomas clinicos

Sintomas clinicos

Sintomas clinicos

HEMOFILIA B Recesiva Ligada al sexo (gen FIXCr X) PORTADORA

HEMOFILICO

HEMOFILIA - Clasificación Severa Moderada Leve

< 1% IX 1-5% IX >5% IX

HEMOFILIA B Diagnóstico “sencillo” - APTT prolongado - FIX disminuido

Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura 1

D1

D2

I S

2050

D’ D3

A1A2 A3

D4BC1C2 S I S

D’ D3 S I

A1A2 A3

D4BC1C2

RGD RGD Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos

protómero dominios funcionales ligandos

VWD Clasificación Revisada Sadler E, 1994

Tipo 1 Deficiencia cuantitativa parcial Tipo 2 Alteración cualitativa Tipo 3 “Ausencia”de VWF

VWD Genética

VWF Cromosoma 12

(12p1212pter)

VWF Expresión Variable Penetrancia Incompleta

Enfermedad primariamutación

Modificadires Ambientales edad, género, trauma Chance

? Genes modificadores

Ginsburg D, 2001

Niveles Variables VWF Difícil Diagnóstico

VWF-Variabilidad  Individual  Familiar

VWF-Variabilidad Factores  40%

no genéticos

 60%

genéticos

VWF-Variabilidad Factores no-genéticos  Edad

 H. Tiroideas

 Estrés

 Estrógenos

 Ejercicio

 F.Aguda

VWF-Variabilidad Factores genéticos  Grupo ABO  20-30% variabilidad Grupo “O” VWF Hipótesis Alteración Glicosilación procesamiento estabilidad secreción

VWD Distribución según grupo ABO “AB” 0,6%  difícil diagnóstico “O” 70%  más sintomático > frecuencia de consulta Woods AI, 2001

vWD-Tipo 2 Clasificación Revisada Sadler E, 1994

2A 2B 2M 2N

 función plaquetaria  Multímeros APM  afinidad VWF-GPIb-IX  función plaquetaria c/Multímeros APM  afinidad VWF-FVIII*

*símil Hemofilia A, autosómica

VWF Pruebas Específicas Cuantitativa Cualitativa VWF:Ag

SI

NO

VWF:RCo

SI

SI

VWF:CB

SI

SI

SEMI

SI

Multímeros

VWF-ELISA

1 a-vWF

2 vWF

3 a-vWF-HRP

4 Color-Abs

1. Anti-VWF inmovilizado 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación con anti-VWF-conjugado 4. Incubación con sustrato cromogénico

VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente

VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente

Ristocetina

Agregometría

Agregación c/Ristocetina

VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente

Ristocetina

Agregometría

Agregación c/Ristocetina PRP

Plaquetas del paciente Plasma del paciente

VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente

Ristocetina

Agregometría

Agregación c/Ristocetina PRP

Plaquetas del paciente Plasma del paciente

Ristocetina

Agregometría

Normal

Agregación c/Ristocetina

vWD-Tipo 1

vWD-Tipo 2A

Kasper C, 2005

vWD-Tipo 3

VWF:CB Unión Colágeno 1 Colágeno Tipo III

2 BSA 3 a-vWFconejo Muestra 4

Esferas poliestireno

IgG F(ab’)2*

1. Inmovilización 5 2. Bloqueo 3. Colágeno  VWF 4. VWF  a-VWF 5. a-VWF  IgGF(ab’)2fluoresceína 6. Adquisición

6 Citometría de flujo

Actividad VWF-ELISA

1

2

a-vWF

vWF

3 a-vWF-HRP

4 Color-Abs

1. AcMo a-vWFepitope funcional inmovilizado 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación con anti-vWF-conjugado 4. Incubación con sustrato cromogénico

Agregación c/Ristocetina

Kasper C, 2005

VWF:FVIIIB Enlace FVIII  VWF

1 a-vWF

2 vWF

3 FVIII CaCl2 0,4M

4 Color-Abs

1. Anticuerpo a-vWF inmovilizado 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación FVIII purificado/CaCl2 4. Incubación con sustrato cromogénico

2N-Variante Normandy Biología Molecular -

Secuenciación Enz. restricción

VWF- Arg19Trp (C2594T) Exón 18 Enzima BspMI 1

1-244 pb

2-148 pb 3-96 pb

Normal

148 pb 96 pb

Mutado

244 pb

Mutación Normal

2

3

VWD Estrategia Diagnóstica

Screening * T. Sangría APTT (fVIII) Adhesividad Tiempo de obstrucción (PFA) *no permiten excluir VWD

VWD Estrategia Diagnóstica Diagnóstico -VWF plasma/plaquetas VWF:Ag VWF:RCo VWF:CB

-FVIII en plasma

VWD Estrategia Diagnóstica

Clasificación Multímeros RIPA Unión GP plaquetarias VWF:FVIIIB Biología Molecular

vWD- Importancia Dignóstica VWF:RCo

Prueba más sensible

VWF:Ag

CorrelacionaVWF:RCo Ratio=1Tipo1 Ratio