DETERMINACIÓN DEL CLUSTER (phaC1, phaZ, phaC2, phaD, phaF, phaI) ASOCIADO CON LA PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHAs) SINTASA TIPO II EN UNA CEPA NATIVA COLOMBIANA

JULIETH YADIRA SERRANO RIAÑO 1.018.403.268 de Bogotá.

Tesis para optar al título de Maestría en Ciencias- Microbiología

Directora Nubia Moreno Sarmiento MSc. cPhD.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS POSGRADO INTERFACULTADES DE MICROBIOLOGÍA BOGOTÁ 2010

1

2

Dedico este trabajo a las personas que amo, Que me aman y que siempre amare Mi familia… A mi abuelita mona que desde el cielo me Ilumina todos los días y que nunca me ha dejado sola desde su partida.

Mantén tus ojos en las estrellas, y tus pies en la tierra. Theodoro Roosevelt

3

AGRADECIMIENTOS

Es difícil expresar con palabras la felicidad que se siente al culminar este proyecto, y sobretodo un proyecto que lleva consigo una carga emocional y de responsabilidad enorme, retos muchos, tiempo a veces no el suficiente, pero siempre la convicción presente de superarme cada día, no solo por mi sino por mi familia ¡mi motor!, y por la esperanza que me brinda hacer de mi país un lugar mejor. El camino ha sido corto para tan inmensa satisfacción y en ese camino cada uno de ustedes estuvo presente en cuerpo y alma para hacer de mí pasó por la maestría toda una experiencia de vida, agradezco infinitamente a todas las personas que directa o indirectamente me ayudaron en todo lo que necesite y a veces sin palabras lograron entender que el mejor peso que se puede llevar a cuestas es el conocimiento adquirido , comprendí que la investigación no es un sacrificio es un regalo que nos da la vida a algunos afortunados como nosotros para descubrir lo que no es evidente para el resto del mundo. Agradezco a mi familia a mis padres Duver Serrano y Luz Marina Riaño que siempre han creído en mi, por su comprensión, amor, entrega, por el apoyo lo largo de mi vida, porque me han enseñado que no hay herencia más valiosa que la posibilidad de estudiar, a mi hermanita Angie Serrano la alegría del hogar y de mi vida, a Sebastian Gaines mi amorcito, a Eliza, Lady, Maye y Luisa mis amigas de siempre, a mis compañeros de la maestría, compañeros de lucha, de risas, de trabajo… de vida. Al grupo de Bioprocesos y Bioprospección por abrirme la puerta no solo a un grupo de investigación excelente sino a una verdadera hermandad a un verdadero equipo de trabajo. A Mauricio Bernal por toda la asesoría, a Luz Angela Sastoque por todo el apoyo recibido en todos los ámbitos, al grupo de microbiología y compañeros de trabajo Alexandra, Jenny, Angélica, Natalia, Carlos, Ximena, Gernot, Andrés, Johathan por hacer de las largas horas de trabajo un goce total, a Herlinda y a Yolanda por facilitar nuestro trabajo y estar siempre presente con la mejor disposición , a mis compañeros del grupo de epimol: Alexis, Olga y Vivian por el apoyo siempre mutuo, a los laboratorios de caucho, microbiología agrícola, fermentaciones, virus vegetales y biopesticidas por ofrecer su ayuda de manera oportuna. A la profesora Dolly Montoya por dirigirme de manera tan acertada, encaminarme, escucharme por enseñarnos todos los días como se debe disfrutar de la investigación. A la profesora Nubia Moreno por creer en el proyecto por confiar en mis capacidades y cumplir a cabalidad con todas mis necesidades, a los profesores Ramón Mantilla, Daniel Uribe, María Teresa Reguero por compartirme sus conocimientos. Por último al postgrado de microbiología en cabeza de la Profe Martha Fontanilla que me animo en los momentos difíciles, que me ayudo y me brindo las herramientas necesarias para el quehacer en la universidad a Socorro por su eficacia y a la Universidad Nacional De Colombia por darme la oportunidad de estudiar en la mejor universidad.

4

Quedando aun muchas palabras por decir y dejando que las mismas se manifiesten por medio de actos en mi vida, agradezco a Dios cada minuto de mi existencia, por mi familia, por los momentos maravillosos y por los momentos difíciles que me están haciendo una mujer más fuerte para hacer frente a un mundo lleno de obstáculos, metas y sueños por cumplir.

Gracias...

5

CONTENIDO RESUMEN……………………………………………………………………………………………… 11 1. INTRODUCCIÓN....................................................................................................................... 13 2. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN ........................................................................................ 15 3. OBJETIVO GENERAL .............................................................................................................. 15 3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 15 4. MARCO TEÓRICO.................................................................................................................... 16 4.1 GENERALIDADES ............................................................................................................. 16 4.2 CLASIFICACIÓN DE PHAs ................................................................................................ 17 4.3 SÍNTESIS DE PHAs .......................................................................................................... 18 4.3.1 Síntesis de polihidroxialcanoatos de cadena corta (PHAscl) ................................................. 19 4.3.2 Síntesis de polihidroxialcanoatos de cadena media (PHAmcl) .............................................. 19 4.4 PHA SINTASAS ................................................................................................................. 20 4.5 CLUSTER DE SINTESIS DE PHA ..................................................................................... 21 4.5.1 Cluster asociado con la producción de PHA sintasa tipo II (PHAmcl). .................................. 21 4.6 DEGRADACIÓN DE PHA ................................................................................................. 24 4.7 APLICACIONES DE PHA................................................................................................... 25 5. METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 26 5.1 ACTIVACIÓN Y EVALUACIÓN DE LAS CEPAS ESCOGIDAS........................................ 27 5.1.1 Criterios de inclusión de cepas .................................................................................................... 27 5.1.2 Activación, crecimiento y determinación de la acumulación de PHAs ................................... 28 5.2 DISEÑO DE INICIADORES ............................................................................................... 29 5.2.1 Búsqueda en las bases de datos de bioinformática. ................................................................ 29 5.3 AMPLIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DE LOS FRAGMENTOS CORRESPONDIENTES AL CLUSTER DE PHAs A PARTIR DE ADN TOTAL. ............................................................. 35 5.3.1 Amplificación por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) utilizando los iniciadores de Revelo, 2005 ............................................................................................................................................ 35 5.3.2 Amplificación por PCR utilizando los iniciadores diseñados en este estudio a partir de ADN total del cluster de PHAs ........................................................................................................................ 36 5.4 CARACTERIZACIÓN DE LA CEPA NATIVA ESCOGIDA POR MEDIO DE LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN RIBOSOMAL 16S ARNr............................................................. 42 5.5 SEPARACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE PCR .............................. 43 5.6 ENSAMBLAJE DE SECUENCIAS Y ANALISIS BIOINFORMATICO ............................... 44 6. RESULTADOS Y DISCUSION ................................................................................................. 46 6.1 ACTIVACIÓN Y ACUMULACIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATO (PHA) ...................... 46 6.2 DISEÑO DE INICIADORES ............................................................................................... 47 6.3 AMPLIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DE LOS FRAGMENTOS CORRESPONDIENTES AL CLUSTER DE PHA A PARTIR DE ADN TOTAL. .............................................................. 48 6.3.1 Amplificación por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) utilizando los iniciadores de Revelo, 2005 ............................................................................................................................................ 48

6

6.3.2 Amplificación por PCR utilizando los iniciadores diseñados en este estudio a partir de ADN total del cluster de PHAs ........................................................................................................................ 50 6.3.3 Caracterización molecular de la cepa S1602 a través de la amplificación del gen 16s ARNr.......................................................................................................................................................... 54 6.4 ENSAMBLAJE DE SECUENCIAS Y ANALISIS BIOINFORMATICO ............................... 55 6.4.1 Genes phaC1y phaC2 .................................................................................................................. 55 6.4.2 Genes phaD, phaF y PhaI ........................................................................................................... 67 7. CONCLUSIONES...................................................................................................................... 75 8. RECOMENDACIONES ............................................................................................................. 76 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 77 ANEXOS ........................................................................................................................................ 84

7

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Criterios de inclusión cepas escogidas .......................................................................... 27 Tabla 2. Secuencias escogidas en ENTREZ-NCBI………………………………………………….29 Tabla 3. Propiedades de los iniciadores sense y antisense. ....................................................... 31 Tabla 4. Propiedades de los iniciadores sense y antisense.. ...................................................... 33 Tabla 5. División de las 13 parejas para realizar los protocolos de amplificación . ................... 38 Tabla 6. Secuencias escogidas para realizar el análisis de gen 16s ARNr ................................ 43 Tabla 7. Secuencias escogidas utilizadas como patrones en los análisis bioinformaticos ......... 44 Tabla 8, Parejas correspondientes a cada gen y su tamaño. ..................................................... 48

8

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Imagen por microscopia electrónica donde se muestra la acumulación de PHAs por Pseudomonas aeruginosa …………….…… ………………………………………………………. 16 Figura 2. Propiedades de los PHAs VS PP (polipropileno) ………………………………………. 17 Figura 3. Rutas de biosíntesis de PHAs. ..................................................................................... 18 FIgura 4.Clasificación de la sintasa. Se especifica la especie modelo de cada clase y el sustrato donde actúa . ................................................................................................................................. 20 FIgura 5. Cluster de PHAs en diferentes microorganismos. ....................................................... 21 Figura 6. Cluster de sintasa tipo II…………………………………………………….……………… Figura 7. Estructura primaria de las sintasas............................................................................... 23 Figura 8. Organización genética del cluster phaC1ZC2DFI involucrado en la síntesis de PHAmcl…………………………………………………………………………………………………. 22 Figura 9. Degradación completa de PHA en menos de 50 días bajo condiciones tropicales…………………………………………………………………………………………………23 Figura 10. Modelo grafico de ubicación de iniciadores en el cluster de Pseudomonas putida (AF150670.2). ……………………………………………………………………………………………32 Figura 11. Localización de parejas dentro del Cluster de PHA………………………… …………34 Figura 12. Ubicación de los iniciadores generales diseñados sobre los genes phaC (Clase I y II).. .................................................................................................................................................. 35 Figura 13. Ubicación de los iniciadores específicos sobre el cluster parcial de biosíntesis de PHA de Clase II. ............................................................................................................................ 36 Figura 14. Producción de fluoresceína en la cepa nativa S1602 en agar King B a las 48 horas de incubación a 30°C. ................................................................................................................... 46 Figura 15. Amplificación de un fragmento del gen phaC (512pb) por PCR de las 6 cepas nativas con los iniciadores generales Gen-In–PHA-Sense y Gen-Ex–PHA-Antisense. .......................... 49 Figura 16. Evaluación de Amplificación con los iniciadores de Revelo, 2005 en la cepa S1602. ....................................................................................................................................................... 50 Figura 17. Amplificación de la pareja 1 en S1602 por PCR utilizando los iniciadores 2 sense 3 antisense.. ..................................................................................................................................... 51 Figura 18. Amplificación por PCR de las parejas 1, 2, 3, 4, 5.1 y 11. ......................................... 52 Figura 19. Amplificación por PCR de las parejas 5, 6, 7, 8, 9 y 10 en las cepas controles ……52 Figura 20. Amplificación del gen 16S ARNr................................................................................. 54 Figura 21. Dendograma de similitud del aislamiento bacteriano nativo S1602 con base en el análisis de la secuencia parcial del gen ribosomal 16S. ……………………………………………55 Figura 22. Alineamiento con CLUSTALW2 de la secuencia de aminoácidos de la proteína sintasa PHAC1 en la cepa S1602 frente a 6 secuencias reportadas en las bases de datos todas del genero Pseudomonas………………………… …………………………………………………..58 Figura 23. Alineamiento con CLUSTALW2 de la secuencia de aminoácidos de la proteína sintasa PHAC2 en la cepa S1602 frente a 6 secuencias reportadas en las bases de datos todas del genero Pseudomonas. . .......................................................................................................... 59 Figura 24. Dendograma del gen phaC1 en la cepa S1602. Obtenido por el programa MEGA 4.0 utilizando el modo de agrupamiento Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap. ........ 61 Figura 25. Dendograma del gen phaC2 en la cepa S1602. Obtenido por el programa MEGA 4.0 utilizando el modo de agrupamiento Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap ......... 61

9

Figura 26. Dominios proteicos encontrados con RPS-BLAST en las secuencias traducidas en los genes potenciales phaC1(A) y phaC2 (B) en la cepa S1602. ................................................ 63 Figura 27. Predicción de estructura secundaria usando PSI-PRED de la proteína PhaC1 de la cepa S1602.................................................................................................................................... 65 Figura 28. Predicción de estructura secundaria usando PSI-PRED de la proteína PhaC2.. ..... 66 Figura 29. Dendograma del gen phaD obtenido por el programa MEGA 4.0 utilizando el Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap. ................................................................... 69 Figura 30. Dominios proteicos encontrados con RPS-BLAST en las secuencias traducidas del gen phaD en la cepa S1602.......................................................................................................... 70 Figura 31. Predicción de estructura secundaria usando PSI-PRED de la proteína PhaD de la cepa S1602.................................................................................................................................... 70 Figura 32. Dendograma del gen phaF obtenido por el programa MEGA 4.0 utilizando el modo de agrupamiento Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap. ...................................... 71 Figura 33. Alineamiento de la parte N-terminal y C-terminal de la proteína PhaFy PhaI. .......... 72 Figura 34. Dominios proteicos encontrados con RPS-BLAST en las secuencias traducidas del gen phaF (A) y el gen phaI en la cepa S1602(B). ....................................................................... 73 Figura 35. Organización del cluster de PHA sintasa tipo II de la cepa nativa Pseudomonas fluorecens S1602.......................................................................................................................... 74

10

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1: Composición de medio de Sales Mínimas Desbalanceado (MSM2). .......................... 84 Anexo 2: Prueba de especificidad de los iniciadores con MEGABLAST .................................... 85 Anexo 3: Secuencias nucleotídicas conservadas utilizadas para el diseño de los iniciadores .. 86 Anexo 4: Ensamblaje de secuencias mediante el programa Cap-3 ........................................... 87 Anexo 5: Búsqueda de los ORFS ................................................................................................ 88 Anexo 6: Secuencia nucleotidicas de los genes del cluster ........................................................ 93 Anexo 7: Resultados del alineamiento de los genes del cluster con BLASTP ........................... 95

11

RESUMEN

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son biopolímeros que algunos microorganismos acumulan como reserva de carbono y energía. El cluster asociado con la producción de PHA de cadena media está conformado por 6 genes (phaC1, Z, C2, D, F, I). Con el fin de identificar y analizar la organización y las secuencias de cada uno de los genes que conforman el cluster productor de sintasa tipo II, en una cepa nativa colombiana Pseudomonas fluorecens S1602, se diseñó una metodología por medio de la amplificación por PCR de todos los genes mediante el 19 iniciadores a lo largo de cada uno de los genes (11 sentido y 8 antisentido), se estandarizaron las condiciones óptimas de cada amplificación y se analizaron las secuencias obtenidas medio de la utilización de diferentes programas bioinformáticos , se realizó

por

a su vez los

análisis de estructuras primarias y secundarias de cada uno de los genes , obteniendo datos importantes y contundentes que afirman que la cepa nativa tiene la misma organización del cluster que la reportada para microorganismos productores de sintasa tipo II en donde el género Pseudomonas es el representativo. Estos resultados son el primer acercamiento del estudio detallado de la secuencia del cluster de la cepa nativa Pseudomonas fluorecens S1602 que servirá como sustento para futuras investigaciones encaminadas a la producción de una cepa recombinante productora de PHAs de cadena media.

PALABRAS CLAVES: Biopolímeros, polihidroxialcanoatos de cadena media (PHAs) mcl, iniciadores, PCR, bioinformática.

11

ABSTRACT

The polyhydroxyalkanoates (PHAs) are biopolymers that some organisms accumulate as carbon and energy reserves. The cluster associated with the production of medium-chain PHA is composed of 6 genes (phaC1, Z, C2, D, F, I). In order to identify and analyze the organization and sequences of each gene of cluster producing type II synthase in a colombian native strain (Pseudomonas fluorecens S1602), a methodology was designed through the amplification by PCR of all genes using 19 primers along each of the genes (11 sense and 8 antisense), were standardized the optimal conditions for each amplification and analyzed the sequences obtained by using different bioinformatics programs, was held in turn analysis of primary and secondary structures of each of the genes, obtaining important data asserting that the native strain has the same cluster organization that reported for microorganisms producing type II synthase where the genus Pseudomonas is the representative. These results are the first detailed study approach sequence cluster of

the native strain Pseudomonas fluorecens S1602 which will serve as

support for future research aimed at producing a recombinant strain producing (PHAs)mcl.

KEY WORDS: Biopolymers, medium chain polyhydroxyalkanoates (PHAs) mcl, primers, PCR, bioinformatic.

12

1. INTRODUCCIÓN La acumulación y el consumo de plástico derivado del petróleo se ve demostrada con las siguientes cifras: LA EPA reveló que en el 2007 solo en USA se generaron 14 millones de toneladas de plástico, a su vez el 50% de este corresponde a materiales plásticos desechables. (EPA, 2008), de otro lado, El consumo per capita de plásticos en países americanos es de 80kg, en Europa 60 Kg. y en países como India es de 2 Kg. (Kato et al., 2000). El PNUMA (Programa de Naciones Unidas para el Medio Ambiente) ha señalado que actualmente hay más de13.000 fragmentos de desechos plásticos flotando sobre cada kilómetro cuadrado del océano (PNUMA, 2005). Su amplia diseminación se atribuye a características propias como a su estabilidad y durabilidad, sin embargo esto a su vez ha ocasionado una gran acumulación en el ambiente, creando impactos negativos al mismo en todo nivel; Aunque se han implementado métodos para disminuir su acumulación estas han resultado ineficientes e incluso perjudiciales para la salud (Ojumu, 2004). Los polímeros sintéticos no biodegradables (plásticos) han cobrado mucha importancia desde la década de los 40s, con un crecimiento aproximado del 4% cada año desde 1980 (EPA, 2007) reemplazando materiales como vidrio, madera, metal entre otros; tienen aplicaciones domesticas, industriales, médicas y en la construcción, convirtiéndose en un material imprescindible en la época actual (Ojumu, 2004). Nuestro país no está ajeno a este problema según un informe de la Armada Nacional se reveló que en las playas se botan en un día 2.875 unidades de plástico, 2.100 bolsas, 667 unidades de papel, 563 unidades cartón, 380 unidades de icopor y 216 botellas de vidrio (http: //www.armada.mil.co, 2005).Debido a esto, se han desarrollado nuevas alternativas como la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) estos son biopolímeros producidos por más de 300 bacterias diferentes a su vez poseen propiedades similares a los plásticos de uso tradicional con la ventaja de ser completamente degradados en pocos meses después de su uso (Ojumu, et al, 2004; Braunegg et al., 1998). Su alto costo de producción los hace menos sostenibles que los plásticos derivados de petroquímicos, por esto las investigaciones apuntan a crear estrategias para superar diferentes retos como la utilización de fuentes de carbono económicas, aumento en la productividad, mejoramiento de la de la calidad, optimización en los procesos de fermentación, recuperación y purificación del polímero (Choi et al., 1998). Una manera alterna de superar las limitaciones tecnológicas es el empleo de organismos recombinantes como Escherichia coli que puede llegar a representar formas más sencillas en el manejo metabólico y en su cinética de crecimiento (Sato et al., 2007; García et al., 2004; Park et al., 2002; Hein, et al., 1997).

13

El diseño y uso de una cepa recombinante necesita de un conocimiento del sistema genético que permita tener mayor control sobre las características que se deseen modificar, esto se logra no solo utilizando herramientas moleculares sino bioinformáticas todo esto con un objetivo final de aislar y desarrollar una cepa microbiana que produzca gran cantidad de PHA a partir de una fuente de carbono económica y con una calidad competitiva (Lee, 1996). Cabe anotar la importancia del conocimiento de las herramientas bioinformáticas ya que estas han cambiado muchos ámbitos del estudio de las ciencias. Actualmente todos los equipos biología molecular y medicina traen software más especializados y el rol del científico, más que hacer el experimento, va en interpretar y manejar correctamente los datos; por lo cual es imprescindible que todo profesional de estas áreas desarrollo conocimientos en su uso y aplicación, además que se formen profesionales específicos en esta área que solucionen las incógnitas que vayan apareciendo, pues cada vez más aumentarán las bases de datos y cada vez más tendremos nuevas alternativas bioinformática a las que podemos recurrir, sin embargo debemos contar con un buen criterio para poder depurarlas y aprovechar al máximo las herramientas que nos pueden brindar (Hormazábal, 2006). En Colombia, el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN) promueve la línea de biopolímeros desde hace 10 años con significativos adelantos en ingeniería bioquímica (Córdoba y Vega 2006; Moreno y Garzón 2006; Barbosa et al., 2005; Ruge y Martínez 2005; Rodríguez y Serrato 2004; Barbosa, 2002), en el proceso de purificación y fermentación donde se han presentado los protocolos metodológicos para varios sustratos y en biología molecular donde se lograron identificar los genes asociados a la síntesis del biopolímero (phaC y phaC2) (Revelo et al., 2007; Moreno et al., 2007, Revelo, 2005), estos trabajos ayudaron a seleccionar 6 cepas nativas consideradas como promisorias (C14, C16, S1602, S1804, S0804, 1G3*); estas cepas , fueron aisladas de cultivos de caña de azúcar y evaluadas en los trabajos antes descritos. A partir de ahí los esfuerzos se encaminaron a conocer las características de dichas cepas. Todo esto con el fin de utilizar resultados de nuestras investigaciones en desarrollo de soluciones a las necesidades actuales. Uno de estos trabajos va encaminado a la obtención de una cepa recombinante, para esto es necesario el uso de herramientas tanto moleculares como bioinformáticas con el fin de conocer su estructura genética, su organización y la función de las proteínas implicadas, con el objetivo de crear un buen microorganismo recombinante que sea capaz de competir con los que ya se encuentran en el mercado. Es por esto que esta investigación está encaminada al desarrollo de una metodología que permita conocer en detalle la organización del cluster (phaC1, phaZ, phaC2, phaD, phaF, phaI) asociado a la síntesis de PHA de cadena media en las cepas nativas , además de correlacionar y encontrar datos relevantes utilizando herramientas bioinformáticas, que ayuden a dilucidar de la mejor manera posible el comportamiento de las cepas, el trabajo conjunto de esta investigación con el trabajo en la parte de fermentación permitirá llegar al objetivo final en el desarrollo de una cepa recombinante con las características deseadas.

14

2. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN ¿Cuál es la organización y secuencia que tiene la cepa nativa Colombiana de cada uno de los genes pertenecientes al cluster de síntesis asociado con la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs), es igual a las reportadas en las bases de datos (phaC1, Z, C2, D, F, I)? ¿Qué información importante y que conclusiones nos puede arrojar el estudio de las secuencias nativas junto con las reportadas al analizarlas utilizando herramientas bioinformáticas?

3. OBJETIVO GENERAL Identificar y analizar la organización y las secuencias de cada uno de los genes que conforman el cluster asociado con la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) sintasa tipo II, en una cepa nativa colombiana, por medio de la utilización de herramientas moleculares y bioinformáticas.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Activación y evaluación de las cepas nativas escogidas por medio de pruebas bioquímicas especificas a su vez diseñar los iniciadores para cada uno de los genes que conforman el cluster partiendo de la información obtenida por las bases de datos bioinformáticas. 2. Amplificar cada uno de los genes que conforma el cluster asociado con síntesis de PHAs sintasa tipo II (phaC1, phaZ, phaC2, phaD, phaF, phaI) y obtener las secuencias correspondientes en la cepa nativa proveniente del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN).

3. Analizar las secuencias resultantes y determinar la organización y composición de los genes que conforman el cluster de PHAs de la cepa nativa frente a las secuencias reportadas en las bases de datos y por determinaciones en silico encontrar datos importantes.

15

4. MARCO TEÓRICO

4.1 GENERALIDADES Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son poliésteres de hidroxialcanoatos (HAs) biodegradables que se acumulan en el citoplasma de muchos géneros de microorganismos incluyendo Eubacterias y Archeas, como compuestos de almacenamiento de carbono y energía incrementando las opciones de sobrevivencia bajo condiciones de estrés (Hezayen et al., 2002; Rehm and Steinbüchel, 1999; Steinbüchel, 2003). Se sintetizan formando gránulos cuando en el medio hay abundancia de carbono y déficit de elementos como nitrógeno, fósforo, magnesio entre otros. (Khanna and Srivastava, 2005; Lee, 1996). Su tamaño oscila entre 0.2 - 0.5 μm con un número aproximado de 8-10 gránulos por célula y con un peso molecular de 2 × 105 - 3×106 daltons (Figura 1), sin embargo esto varía dependiendo de la especie (Ojumu et al., 2004). A su vez pueden acumular biopolímero hasta el 90% de su peso seco (Sudesch et al., 2000; Reddy et al ., 2003).

Figura 1. Imagen por microscopia electrónica donde se muestra la acumulación de PHAs por Pseudomonas aeruginosa (Rehm, 2003)

La función principal atribuida a la producción de estas inclusiones en como reserva de carbono y energía, sin embargo hay múltiples funciones que aunque relacionadas, están bien diferenciadas entre ellas están: sobrevivir bajo condiciones de estrés por déficit de nutrientes (James et al., 1999; Hai et al., 2001), establecimiento en la rizósfera o en otras superficies en las plantas (Kadouri et al., 2002), sobrevivir a condiciones ambientales de estrés como el calor , frio, radiación UV, shock osmótico etc, (Ayub et al., 2004) y uso balanceado de la energía disponible y distribución de los recursos de carbono (Rothermich et al ., 2000).

16

4.2 CLASIFICACIÓN DE PHAs La clasificación de los PHAs se realiza dependiendo del enfoque que se tenga en cuenta, si partimos del hecho de que el gránulo está formado por gran cantidad de unidades monoméricas la diferencias de estas marcan un punto de partida para su clasificación. Si nos referimos a un gránulo de PHA formado por solo un tipo de unidades monoméricas nos referimos a un homopolímero siendo el PHB (poli (R)-3-hidoroxibutirato) el mas estudiado, sin embargo se han descubierto otros como el poli (R)-3-hydroxyvalerato, poli (R)-3- hidroxihexanoato, poly (R)3- hidroxiheptanoato etc, generalmente se componen desde cuatro hasta diez atomos de carbono (Anderson et al. 1990; Chung et al. 1999). Si por el contrario nos referimos a un gránulo conformado por monómeros de diferente longitud de átomos de carbono en la misma inclusión nos referimos a un copolímero se conocen de cadena corta (PHAscl) incluyendo poli (R) -3-hidroxipropionato-co-( R)-3-hidroxibutirato, poli (R)3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato , poli (R) -3 -hidroxibutirato-co-( R)-3-hidroxivalerato y poli (R)-3-hidroxibutirato-co-(R)-3- hidroxivalerate-co-4-hidroxibutirato y de cadena media (PHAmcl) producidos principalmente por géneros de Pseudomonas, copolímeros de monómeros que contienen de C6 a C12 átomos de carbono incluyendo el poli (R)-3-hidroxihexanoato-co-(R)-3hidroxioctanoato-co-(R)-3-hidroxidecanoato (Zhao and Chen 2007). Los PHAs de dividen también por la cantidad de átomos de carbono que contengan cada uno de sus monómeros: PHAs de cadena corta (scl - PHA), de 3-5 átomos de carbono, PHAs de cadena media (mcl - PHA) de 6-14 átomos de carbono (Figura 2). La diferencia se debe principalmente a la especificidad de sustrato de las PHA sintasas que pueden aceptar monómeros con diferente número de átomos de carbono (Anderson and Dawes, 1990). Es de especial interés las especies que producen de forma natural los polímeros de cadena media (sintasa tipo II) por que se amplía el rango de posibilidades en el mercado de los plásticos (Lee et al., 1999a; Full et al., 2006). A este grupo pertenecen las Pseudomonas (Hoffmann et al., 2000; Kim et al., 2006).

Figura 2. Propiedades de los PHAs VS PP (polipropileno) (Rehm, 2003).

17

4.3 SÍNTESIS DE PHAs La composición monomérica del biopolímero, depende de la fuente de carbono externa y de las vías metabólicas operantes en la célula para producir los precursores de tioésteres hidroxiacil-CoA, sustratos de la enzima PHA sintasa. Los monómeros para la biosíntesis de PHAs provienen de importantes vías metabólicas tales como, la degradación de azucares mediante la obtención de Acetil CoA por medio de la descarboxilacion oxidativa del ácido pirúvico, la degradación de ácidos grasos (β-oxidación) y/o biosíntesis de ácidos grasos. Involucran además metabolitos centrales como la acetil-CoA y cofactores como NADPH (Aldor and Keasling, 2003) (Figura 3).

Figura 3. Rutas de biosíntesis de PHAs. Para PHAscl se utiliza la degradación de azucares y para la producción de PHAmcl se usa dos vías, la primera es la degradación de ácidos grasos por β- Oxidación, y la segunda es por la biosíntesis de ácidos grasos (Taguchi et al ., 2001).

18

4.3.1 Síntesis de polihidroxialcanoatos de cadena corta (PHAscl) En la primera reacción se condensan dos moléculas de acetil-CoA provenientes de la descarboxilación oxidativa del ácido pirúvico para producir acetoacetil- CoA por actividad de la enzima β-cetotiolasa (codificada por el gen phaA). La segunda reacción es la reducción del acetoacetil-CoA a (R)-3-hidroxibutiril-CoA catalizada por la enzima acetoacetil- CoA dehidrogenasa dependiente de NADPH (codificada por el gen phaB). Finalmente los monómeros de (R)-3-hidroxibutiril-CoA son polimerizados como P(3HB) por acción de la enzima PHA sintasa que es codificada por el gen phaC (Figura 3), (Lee and Papoutsakis, 1999; Braunegg et al.,1998; Anderson and Dawes, 1990). 4.3.2 Síntesis de polihidroxialcanoatos de cadena media (PHAmcl) Hay dos rutas principales por las cuales se realiza la síntesis de PHAmcl en bacterias (Steinbuchel and Fuchtenbusch 1998; Sudesh et al., 2000). La primera es la síntesis de PHA usando intermediarios de la β-oxidación de los ácidos grasos. Esta ruta es encontrada en muchas bacterias como P. oleovorans y Pseudomonas fragii, las cuales pueden sintetizar PHAmcl de ácidos alcanoicos o ácidos grasos. Los ácidos alcanoicos o los ácidos grasos presentes en el medio son transportados dentro de la célula, donde primero son convertidos a esteres CoA antes de ser llevados a la vía de β-oxidación, donde un número de intermediarios de 3-hidroxiacil-CoA son generados. Dado que la PHA sintasa acepta sólo el isómero R de 3hidroxiacil-CoA y la β-oxidación de ácidos grasos genera sólo el isómero S de 3-hidroxiacil-CoA, las bacterias deban tener enzimas capaces de generar 3- hidroxiacil-CoA. Una enzima potencial es la epimerasa 3-hidroxiacil-CoA, que media la conversión reversible de S y R isómeros de 3hidroxiacil-CoA, aunque no se tiene completamente identificado el gen que codifica para la proteína con esta actividad; finalmente se ha especulado que una 3-cetoacil-CoA reductasa podría generar 3-hidroxiacil-CoA y que esta enzima podría estar presente en bacterias, sin embargo esta enzima y su mecanismos no han sido dilucidados aun (Figura 3). La segunda vía de producción de PHAmcl en las bacterias es a través de la utilización de intermediarios de la biosíntesis de ácidos grasos. Esta vía se encuentra también en numerosas especies del género Pseudomonas. En contraste con P. oleovorans y P. fragii, que sólo pueden sintetizar a partir de PHAmcl de ácidos alcanoicos relacionados presentes en el medio de crecimiento. Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida puede sintetizar un tipo similar de PHAmcl cuando se cultivan en sustratos no relacionados, como la glucosa (Huijberts et al., 1992; Steinbüchel and Lütke-Eversloh 2003). En estas bacterias el PHAmcl se forma a partir de intermediarios de la 3-hidroxiacil-ACP de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos de Novo. PhaG es una enzima clave en esta vía, con una actividad transferasa 3-hidroxiacil-CoA-ACP es la responsable de la convertir el intermediario 3-hidroxiacil-ACP de la vía biosintética de ácidos grasos a 3-hidroxiacil-CoA, el sustrato de la sintasa de PHA (Rehm et al. 1998) (Figura 3).

19

4.4 PHA SINTASAS Las PHA sintasas son las enzimas claves de la biosíntesis de PHA y catalizan la conversión estéreo-selectiva de sustratos (R)-3-hidroxiacil-CoA a PHAs con la concomitante liberación de CoA (Rehm and Steinbüchel, 1999). Comprenden una familia de enzimas con características únicas, particularmente considerando la función en la biogénesis de las estructuras subcelulares insolubles en agua (los gránulos de PHA) y la asociación con la monocapa fosfolipídica (Rehm, 2003). En las células que acumulan PHAs, estas enzimas están unidas a la superficie de los gránulos de PHA (Steinbüchel and Eversloh, 2003). Su clasificación está sujeta a la especificidad del sustrato, de esta manera las sintasas pueden aceptar monómeros con diferente número de carbonos (Figura 4).

Figura 4.Clasificación de la sintasa. Se especifica la especie modelo de cada clase y el sustrato donde actúa (Rehm, 2003).

•

PHA sintasas Clase I (Ralstonia eutropha), están compuestas de un solo tipo de subunidad, son preferencialmente activas hacia tioésteres CoA de varios 3hidroxialcanoatos de cadena corta, que comprendan de 3 a 5 átomos de carbono (Rehm, 2003; Eversloh et al., 2001).

•

PHA sintasas Clase II (Pseudomonas aeruginosa), están compuestas de un solo tipo de subunidad, son preferencialmente activas hacia tioésteres CoA de varios 3hidroxialcanoatos de cadena mediana, que comprendan al menos 5 átomos de carbono, incorporan preferencialmente ácidos grasos 3-hidroxi de cadena media (C6C14) dentro de los PHAs y el producto resultante es un polímero semejante al latex (Rehm, 2003).

•

PHA sintasas Clase III (Allochromatium vinosum), comprenden enzimas conformadas por dos diferentes tipos de subunidades, cada una aproximadamente de 40 kDa. Estas PHA sintasas prefieren tioésteres CoA de 3-hidroxialcanoatos de cadena corta (Rehm, 2003).

20

•

PHA sintasas Clase IV (Bacillus megaterium) se parecen a las PHA sintasas de clase III, pero PhaE es reemplazada por PhaR (McCool and Cannon, 2001).

4.5 CLUSTER DE SINTESIS DE PHA Se han caracterizado diferentes cluster de síntesis de PHA a partir de una gran variedad de bacterias; los resultados revelan que las proteínas requeridas para las vías de biosíntesis de PHA han divergido considerablemente (Madison and Huisman, 1999). Sin embargo, la PHA sintasa es una enzima crucial en todas las rutas de síntesis de PHA (Anderson and Dawes, 1990; Madison and Huisman, 1999; Rehm and Steinbüchel, 1999), por su función de polimerización del gránulo de PHA (Figura 5).

Figura 5. Cluster de PHAs en diferentes microorganismos. Aunque todos presentan una organización diferente y genes diferentes todos presentan phaC que codifica para la enzima sintasa responsable de la polimerización (Suriyamongkol, 2007).

4.5.1 Cluster asociado con la producción de PHA sintasa tipo II (PHAmcl). Los microorganismos que representan el modelo de organización del cluster asociado a la producción de PHAs de cadena media son los del género Pseudomonas, aunque en algunos géneros se observan algunas variantes como el caso de P. aerofaciens en donde el gen phaI típico de cluster de sintasa tipo II por el gen phaJ aunque comparten la misma función (Figura 5); poseen dos genes phaC (phaC1 y phaC2) los cuales codifican PHA sintasas de clase II y están separados por el gen phaZ que codifica para una PHA depolimerasa intracelular (Figura 8). Además, corriente abajo de estos genes, está localizado el gen phaD (codifica para una proteína estructural que estabiliza los gránulos PHA) seguido por los genes phaI y phaF que se transcriben en dirección opuesta al resto de los genes (Figura 6) y codifican proteínas estructurales y reguladoras (Rehm, 2003).

21

Figura 6. Cluster de sintasa tipo II. Representación en Pseudomonas putida del cluster compuesto por phaC1 y phaC2 separados de phaZ, phaD y corriente abajo los genes phaF y phaI (García et al., 2004).

4.5.1.1Sintasas (pha C1 y phaC2) Las dos PHA polimerasas son 50 y 60% idénticas en su estructura primaria y parecen tener una especificidad muy similar por el sustrato (Madison and Huisman, 1999). El uso de una u otra parece ser característico de cada cepa y del sustrato proporcionado (Zhang et al., 2003; Hezayen et al., 2002; Rehm et al., 2002; Liebergesell et al., 2000). Se han realizado diferentes estudios sobre la caracterización de la estructura y la mecánica de esta proteína, uno de ellos realizó un alineamiento múltiple de las estructuras primarias de 59 PHA sintasas, mostró la presencia de seis regiones de secuencias de aminoácidos conservados y ocho residuos idénticos en todas las secuencias (Rehm and Steinbüchel, 1999). Se evidencio también que todas las PHA sintasas parecen contener una caja lipasa [GX(S/C)XG] en la cual la serina, el sitio activo esencial de la lipasa, es reemplazado con una cisteína. La búsqueda de homología de dominios conservados sugiere que las PHA sintasas contienen el dominio α/β hidrolasa en la región C-terminal (Rehm et al., 2002; Jiang et al., 2004; Müh et al., 1999; Gerngross et al., 1994) con una triada catalítica (Cys-Asp-His) en el corazón de la estructura de todos los modelos tridimensionales generados para las PHA sintasas I-III (Rehm et al., 2002; Amara and Rehm,2003; Jia et al., 2000) (Figura 7). El mecanismo catalítico propuesto hasta el momento involucra en la función de la catálisis covalente, dos grupos tiol provistos por los residuos conservados de la cisteína, y se basa en el mecanismo empleado por las enzimas de la superfamilia α/β hidrolasas (Rehm, 2003). Más de 59 diferentes genes de PHA sintasa han sido clonados y caracterizados. El alineamiento múltiple de las estructuras primarias de estas PHA sintasas mostró un porcentaje de identidad general de 8~96% con solo ocho residuos aminoacídicos estrictamente conservados (Rehm, 2003). La amplia variedad de microorganismos productores de PHA podría representar un vasto espectro de las condiciones intracelulares a las cuales estas enzimas se debieron adaptar (Madison and Huisman, 1999).

22

Figura 7. Estructura primaria de las sintasas. Se muestran los 6 bloques de secuencias conservadas, el dominio α/β hidrolasa y a su vez la presencia dentro de este de la caja lipasa [GX (S/C) XG] y los 8 residuos estrictamente conservados.

4.5.1.2. Depolimerasa phaZ El gen de la depolimerasa (phaZ) está relacionado estructuralmente con esterasas, todos ellas poseen una caja lipasa convencional (Ohura et al., 1999; Jendrossek and Handrick 2002; Eugenio et al., 2007). Estas enzimas catalizan la liberación de (R)-3-hidroxi-acil /aril -CoA derivados de polímeros intracelulares. Se encuentra presente en la superficie del gránulo y son capaces de hidrolizar la mayoría de los PHAs acumulados por bacterias incluso los constituidos por monómeros inusuales (Figura 8), revelando que la especificidad de sustrato de las enzimas PhaZ es muy amplia como ocurre con otras esterasas (Sandoval et al., 2005). La mutación de este gen acarrea la incapacidad de movilizar los gránulos lo que ocasiona daño en el catabolismo de los mismos (García et al., 1999; Sandoval et al., 2005, Sandoval et al., 2007; de Eugenio et al., 2007). Del mismo modo, cuando phaZ se sobreexpresa no se observa acumulación de PHAs ya que estos son inmediatamente hidrolizados y secretados (Sandoval et al., 2005).

4.5.1.3 Genes phaD, phaF y PhaI Después del gen phaC2 se encuentra el gen phaD, de la función de este gen no se conoce mucho, sin embargo se estudio la función de este mutándolo en la cepa P. oleovorans, se observó que juega un papel importante en cuanto a la biosíntesis de PHAmcl se observaron varios efectos sobre la acumulación del polímero, se redujo la producción de PHA a menos del 20% (Klinke et al., 2000). En cuanto a phaF conocida como fascina actuaria como: un elemento estructural que se necesita para la elongación del polímero (interacción polímero-proteína, PHA-PhaF), como un

23

activador transcripcional de phaC1 (interacción ADN-proteína, PcI-PhaF), o como potenciador de la actividad de la polimerasa (PhaC1-PhaF) (Figura8). La otra fascina PhaI es la otra proteína asociada al gránulo contrarrestando el efecto causado por PhaF cuando los genes phaI y phaF son coexpresados, esto sugiere que PhaI tiene una función regulatoria (represor de phaF).

Figura 8. Organización genética del cluster phaC1ZC2DFI involucrado en la síntesis de PHAmcl. Las funciones putativas de algunas proteínas son indicadas (Prieto et al. 2007; Sandoval et al. 2007).

4.6 DEGRADACIÓN DE PHA Los PHAs son degradados por microorganismos (biodegradación como su principal atributo) que encuentran en ellos fuentes de carbono y energía; se ubican en la superficie del polímero y secretan enzimas extracelulares que actúan directamente en la molécula convirtiéndola en unidades de monómeros independientes (Ojumu et al.,2004). La velocidad de degradación depende de la estructura del biopolímero y de las condiciones a las que sea expuesto, se ha comprobado la degradación en ambientes aerobios, anaerobios, salinos, marinos y otros (Figura 9). Los productos finales de la degradación en condiciones aerobias son CO2 y H2O, mientras que en condiciones anaerobias el resultante es el metano (Ojumu et al., 2004).

Figura 9. Degradación completa de PHA en menos de 50 días bajo condiciones tropicales (Sudesh, 2008).

24

4.7 APLICACIONES DE PHA En la naturaleza se encuentran microorganismos que en condiciones ambientales extremas producen PHAs, a su vez los PHAs son muy ricos estructuralmente, cerca de 150 monómeros diferentes de PHAs han sido reportadas lo que aumenta el rango de aplicaciones. Por las propiedades de elastómeros y gran similitud a los plásticos sintéticos los biopolímeros tienen muchas aplicaciones, sin embargo se han agrupado en cuatro principalmente. (Lee. 1996).

• • • •

Empaques: Envolturas de elementos de aseo, alimentos, en general envases de plásticos desechables o de larga duración como muebles, enceres etc. Medicina: Se han probado como injertos, reemplazando parte tejidos, a su vez pueden ser utilizados como materia prima en los implementos utilizados en esta área. Productos de Higiene: Se utilizan no solo como empaques en estos productos si no también como materia prima (Detergentes, limpiadores etc.) Biocombustibles.

El instituto de biotecnología (IBUN) empezó con la línea de biopolímeros desde hace 1º años y a través de estos han logrado resultados y adelantos en ingeniería bioquímica, en purificación y fermentación; así como también se han venido desarrollando encaminado a la biología molecular donde se lograron identificar los genes de síntesis de PHAs (phaC1 y phaC2), estos estudios permitieron escoger 6 cepas como promisorias para la producción de PHAmcl , que tienen amplio rango de aplicaciones, las 6 cepas se eligieron gracias a diferentes criterios teniendo en cuenta la producción en sacarosa y la clasificación a nivel molecular de productores de sintasa tipo II, Sin embargo el desarrollo a futuro de una cepa recombinante requiere un conocimiento profundo de la maquinaria genética y de las proteínas implicadas en el proceso de fabricación del granulo, es por esto que esta investigación se enfocó en proveer una metodología que permita conocer mediante el diseño de iniciadores, amplificación y análisis de secuencias la organización del cluster con cada uno de sus genes (phaC1, phaZ, phaC2, phaD, phaF, phaI) y de esta manera encaminar los resultados hacia la posible fabricación de una cepa recombinante(Córdoba y Vega 2006; Moreno y Garzón 2006; Barbosa et al., 2005; Ruge y Martínez 2005; Rodríguez y Serrato 2004; Barbos cima, 2002; Revelo, 2005).

25

5. METODOLOGÍA

DIAGRAMA DE FLUJO DE LA METODOLOGÍA APLICADA

26

5.1 ACTIVACIÓN Y EVALUACIÓN DE LAS CEPAS ESCOGIDAS 5.1.1 Criterios de inclusión de cepas El grupo de bioprospección del IBUN lleva 10 años de investigación continua en biopolímeros; el primer paso de estos estudios fue aislar 404 muestras provenientes de cultivo de caña de azúcar de los departamentos de Cundinamarca, Nariño, Valle del Cauca y Santander. Estas cepas fueron evaluadas y seleccionadas por la acumulación de polihidroxialcanoatos (PHAs) mediante tres pruebas: la tinción con Sudán negro, (Schlegel et al., 1970), con la cual se puede observar al microscopio el contenido lipídico de la célula; la prueba de hipoclorito, con la cual se degradan los componentes celulares a excepción del PHA (Berger et al., 1989); y la prueba gravimétrica de peso seco de polímero que permite cuantificar la cantidad de polímero producido. (Moreno, et al., 2004; Moreno, et al., 2007). Con los resultados obtenidos en los estudios antes mencionados se escogieron 6 de esos aislamientos por identificarse sintasa tipo II (Revelo, 2005); por tener buen rendimiento en sacarosa cuando se utiliza sacarosa como fuente de carbono (Moreno, et al., 2004) o por tener afinidad por sustratos alternativos como el aceite (Moreno, et al., 2007) (Tabla1).

CRITERIOS EVALUADOS ESTUDIOS ANTERIORES CEPA ELEGIDA

C14 C16 S0804 S1804 1G-3 S1602

IDENTIFICACION RNAr 16s (Revelo, 2005) Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. Burkholderia sp.

*Sintasa tipo II (Revelo,2005)

X X X X X X

**Capacidad de producción en sacarosa (Moreno, et al., 2004) X X

***Producción con otra fuente de carbono (Moreno, et al., 2007)

X X X X

Tabla1. Criterios de inclusión cepas escogidas * Principal criterio de inclusión presencia de sintasa tipo II ** Cepas promisorias por producción con fuente de carbono de sacarosa. Teniendo en cuenta una producción mayor de 0.058 g (Polihidroxibutirato) PHB/ l h de Ralstonia eutropha (como cepa de referencia). *** Producción con otra fuente de carbono diferente a sacarosa

C14 Y C16: Estas cepas se seleccionaron como cepas promisorias por su mayor capacidad de acumulación en sacarosa, teniendo en cuenta una producción mayor de 0.058 g PHB/ litro por h de Ralstonia eutropha (como cepa de referencia).se uso este sustrato debido al interés del Grupo por utilizar sustratos no refinados como melaza de caña para sintetizar PHAs. (Moreno, et al., 2004; Moreno, et al., 2007).

27

S0804, S1804, 1G-3 y S1602: Estas cuatro cepas no fueron clasificadas como promisorias por el grupo debido a su baja producción en sacarosa (Moreno, et al., 2004) sin embargo es de especial interés los resultados de un trabajo posterior en donde se evaluó el crecimiento de las cepas en otras fuentes de carbono (glucosa y aceite) con el fin de obtener un tipo de PHA diferente. De esta manera se concluyó que en presencia de una fuente de carbono diferente se observa mejor acumulación, por lo que se debe aprovechar su potencial genético de producir PHA de cadena media ya que poseen sintasa tipo II (Revelo, 2005). A su vez las cepas S0804 y S1602 acumularon mejor el polímero utilizando aceite como fuente de carbono lo que es muy acorde con la literatura que afirma que las PHAs sintasas Clase II son preferencialmente activas hacia ácidos grasos 3-hidroxi de cadena media (C6-C14) (Rehm, 2003).

5.1.2 Activación, crecimiento y determinación de la acumulación de PHAs Las cepas se activaron de viales conservados por crió preservación, en caldo nutritivo de 12 a 24 horas a 30°C en continua agitación y luego se sembraron por agotamiento en agar nutritivo durante 12 a 24 horas a 30°C, a su vez se confirmaron sus características morfológicas por medio de la coloración de Gram. Para comprobar la acumulación de PHA se utilizaron las técnicas de crecimiento cultivo Mínimo de Sales Minerales (MSM) y su posterior evaluación con la tinción de sudan. El Crecimiento en medio de cultivo Mínimo de sales Minerales (MSM) está dispuesto para aquellos microorganismos que una vez han alcanzado su fase estacionaria de crecimiento, requieren el desbalance del medio de cultivo para empezar a acumular el polímero, para llevar a cabo este método se inoculó una colonia proveniente del agar nutritivo al medio de cultivo Mínimo de Sales Minerales (MSM) pH 7.0 (Anexo 1) (Ramsay et al., 1990). Se observó el crecimiento por medio de turbidez al 3 día de incubación a 30°C. Una vez se obtuvo un crecimiento por parte del microorganismo se identificó la acumulación de PHAs por medio de la tinción con sudan negro, el cual se fija al material lipídico dentro de las células ya que es de característica liposoluble (Burdon, 1946) y según protocolo establecido mediante la observación de los gránulos al microscopio a 100X (Schlegel et al., 1970).Luego se aislaron en medios de cultivo selectivos, para el género Pseudomonas utilizamos dos medios diferentes el primer medio (Cetrimide) es un medio selectivo que favorece la producción de piocianina (pigmento amarillo no fluorescente) y pioverdina (pigmento verde fluorescente) a su vez el cetrimide y el acido nalidixico inhibe el crecimiento de la flora acompañante. Se incubo a 30°C de 24 a 48 horas. El segundo medio de cultivo (KingB) utilizado para el aislamiento, la detección de especies de Pseudomonas sp con base en la producción de fluoresceína. En este medio de cultivo, la tripteína y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigmentos, la concentración de fosfatos estimula la producción de fluoresceína e inhibe la producción de piocianina y piorrubina (King EO and Raney, 1954).

28

5.2 DISEÑO DE INICIADORES

Se llevo a cabo una filtración exhaustiva al momento de escoger las secuencias teniendo en cuenta varios aspectos como el microorganismo, grupos de investigación, autores, fecha de publicación, curado o no de la secuencia, no redundancia, longitud de secuencia ,secuencias de patentes comerciales y/o mas estudiadas; todo esto con el fin de que el análisis bioinformático sea lo más exacto posible . A su vez criterios técnicos del objetivo general como secuencias de microorganismos productores de sintasa tipo II, a su vez que estuvieran soportadas en artículos de investigación reconocidos, se tomaron las ultimas actualizaciones y se agruparon dependiendo de los genes dentro del cluster que abarcaban (Tabla 2). Tabla 2. Secuencias escogidas en ENTREZ-NCBI. Productoras de PHA sintasa tipo II, curadas y reportadas en trabajos de investigación conocidos, agrupadas por las secuencias reportadas en cada gen dentro del cluster.

Número de acceso del Genbank AB049413 AF150670.2 NC_011770 NC_002516.2 NC_008027 NC_009656

Pseudomonas chlororaphis subs aurefaciens Pseudomonas putida Pseudomonas aeruginosa LESB58 Pseudomonas aeruginosa PAO1 Pseudomonas entomophila L48 Pseudomonas aeruginosa PA7

AB014758 AY910767 AY910768.1 EU275728 AY043314.1 AY113181 AY286491.1 AF394660 AY278219.1 EF067339.1 AF129396.2 AF336849 AY714618.1 AY790329 FJ472656.1

Pseudomonas sp GI-3 Pseudomonas corrugata CFBP5454 Pseudomonas mediterránea CFBP5447 Pseudomonas sp USM4-55 Pseudomonas pseudoalcaligenes 45L Pseudomonas putida KT2440 Pseudomonas putida KTCC1639 Burkholderia caryophylli Pseudomonas stutzeri 1317 Pseudomonas corrugata Pseudomonas resinovorans Pseudomonas nitroreducens 0802 Pseudomonas putida CA-3 Pseudomonas sp KBOS17 Pseudomonas fluorecens

Microorganismo

Cluster PHA (C1ZC2DFI)

5.2.1 Búsqueda en las bases de datos de bioinformática. El cluster asociado a la producción de PHAs sintasa tipo II en Pseudomonas sp está conformado por 6 genes, en el mismo sentido de trascripción encontramos phaC1, phaC2 que son los directamente implicados con la síntesis del polihidroxialcanoatos de cadena media; estos se encuentran separados por phaZ que codifica para una proteína con función de depolimerasa y phaD que codifica para una proteína estructural que estabiliza los gránulos. Posteriormente a los genes mencionados anteriormente, se encuentran y en sentido opuesto de transcripción los genes phaI y phaF que codifican proteínas estructurales y reguladoras (Madison and Huisman, 1999; Rehm, 2003).

29

Esta investigación estuvo enfocada en la determinación y análisis de los 6 genes (phaC1,phaZ,phaC2,phaD,phaF,phaI) que conforman el cluster de PHA ,para cada uno de los genes que conforman el cluster de síntesis y estructural del gránulo de PHA se realizó una búsqueda de sus secuencias en los portales de ENTREZ-NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y en el portal de búsqueda de EBI por SRS (Sistema de Recuperación de Secuencias) en la página (http://srs.ebi.ac.uk) (Tabla 2).

Teniendo en cuenta la organización del clúster (C1ZC2DFI) y así mismo el tamaño de los genes que lo contienen, se diseño una estrategia con la cual fuera posible abarcar todo el clúster y que los amplímeros fueran del tamaño adecuado para su posterior secuenciación; para esto, se buscaron en las bases de datos de la NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y de la EMBL (http://srs.ebi.ac.uk) Secuencias pertenecientes a la producción de PHA. Como se observa en la tabla anterior los representantes por excelencia productores de PHA sintasa tipo II es el género Pseudomonas datos que son demostrados en estudios reportados anteriormente (Suriyamongkol, 2003). Se realizaron dos estrategias diferentes para el diseño de los iniciadores a partir de las secuencias antes mencionadas, en la primera se llevo a cabo un alineamiento múltiple utilizando el programa de licencia libre CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/CLUSTALW2) teniendo en cuenta las secuencias reportadas y la región a amplificar, la secuencia consenso resultante de este análisis se llevó al programa Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) y de esta manera se obtuvo los iniciadores deseados, la segunda estrategia se encamino a diseñar los iniciadores teniendo en cuenta los bloques de secuencias nucleotídicas conservadas y los parámetros para el diseño adecuado de los mismos. Los resultados arrojados por el programa de alineamiento múltiple mostraron cambios puntuales entre algunas especies en sitios específicos dentro de los bloques conservados, por lo que se decidió realizar iniciadores degenerados, a su vez en algunos iniciadores se tomo la misma secuencia para realizarlo antisense, esto con el fin de tener múltiples opciones en el momento de hacer la amplificación, es importante anotar que se decidió buscar los bloques de las regiones sobre regiones codificantes ya que son los segmentos con las secuencias nucleotidicas mas conservadas. Las secuencias de los iniciadores diseñados fueron sometidas a un análisis de similitud con las secuencias de las bases de datos del GenBank, mediante el programa BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) utilizando la opción de MEGABLAST esto con el fin de observar la especificidad de las secuencias diseñadas y su sitio de unión dentro del clúster (Anexo 2). Las propiedades de cada iniciador fueron obtenidas mediante el programa CLC Main Workbench 5.1 evaluación (http://www.clcbio.com) una vez arrojados los resultados se hicieron ajustes en algunos iniciadores de tal manera que todos pudieran ser utilizados en la misma

30

reacción, el parámetro principal que se tuvo en cuenta para realizar dicho ajuste fue la Tm en donde se recomienda que los dos iniciadores utilizados dentro de una reacción tengan Tm (melting temperatura) similares con una diferencia dentro de +/- 5°C, otros parámetros a apreciar son, longitud de 18-28 nt, 40-60% GC, evitar regiones con potencialidad para formar estructuras secundarias internas, evitar la formación de autoanillamiento,evitar poliX etc (Tabla 3).

Nombre

Secuencia 5´3´

Longitud (Nt.)

%GC

Tm°C

I. D

Posición Cluster

1 Sense 2 Sense 3 Sense 4 Sense 5 Sense 6 Sense 7 Sense 10 Sense 11 Sense 12 Sense 3 Antisense 4 Antisense 6 Antisense 7 Antisense 8 Antisense 9 Antisense 10Antisense 11Antisense

GACTCSTGGTGGYTGCACTGGCAG GGACAAYGGAGCGTYGTAGATGAGT GATCTTCAACGGCATMGGYGCCA TGYTGGAGCTGATCCAGTACAAGCC GACCTGATCTGGAAYTACTGGGTCA ACTGGCTGTTCCTGCACCTKATCGT ATGGCGCTGTTCARRCGCTTGTC AGCCAGCCAGATCTKCCGSGAGTA ATCGACGAYGGCCAYCTGTTCCTG GGCAAYCTSTACTACCACTTCCATGG TGGCRCCKATGCCGTTGAAGATC GGCTTGTACTGGATCAGCTCCARCA ACGATMAGGTGCAGGAACAGCCAGT GACAAGCGYYTGAACAGCGCCAT CCATGGCCAAGATTGCCSTGAAGAA AGCATGGCCAAAGTGATTSTGAAGAA TACTCSCGGMAGATCTGGCTGGCT CAGGAACAGRTGGCCRTCGTCGAC

24 25 23 25 25 25 23 24 24 26 23 25 25 23 25 26 24 24

58.33 48 52.17 52 48 52 52.17 54.17 58.33 46.15 52.17 52 52 52.17 48 38.46 54.17 58.33

65.1 60.4 61.9 61.7 58.8 63.2 62.7 64.9 63 59.8 61.9 61.7 63.2 62.7 61.8 59.2 64.9 63.6

4 4 4 2 2 2 4 4 4 4 4 2 2 4 2 2 4 4

2130-2153 568-592 2447-2469 3818-3842 4338-4362 5148-5172 6145-6167 6372-6395 3055-3079 5024-5049 2447-2425 3818-3794 5148-5124 6145-6123 6860-6836 6860-6835 6372-6349 3055-3032

12Antisense

CCATGGAAGTGGTAGTASAGRTTGCC

26

46.15

59.9

4

5024-4999

Tabla 3. Propiedades de los iniciadores sense y antisense. Se encuentra de izquierda a derecha: el nombre del iniciador, la secuencia 5´3´, la longitud de nucleótidos (Nt), el contenido de guanina y citocina (%), la temperatura de hibridación (Tm), el índice de degeneración (I,D) calculado mediante la multiplicación de todos los valores de degeneración (número de bases por posición) incorporados en la secuencia del iniciador, y la posición dentro del cluster en Pseudomonas putida (AF150670.2). Se utilizó el programa CLC Main Workbench 5.1 evaluación (http://www.clcbio.com) Para obtener dichas propiedades.

Se tomo como modelo grafico la secuencia del clúster de PHA de Pseudomonas putida número de acceso al GenBank (AF150670.2) la cual posee 6296 pb que constituyen el cluster y a su vez 528 pb inmediatamente anteriores de la secuencia correspondiente al gen phaC1 y 138 pb inmediatamente después de la secuencia que corresponde al gen phaI el hecho de que se cuente con bases extras a lado y lado del cluster permite que se diseñen iniciadores que tomen por completo los genes de los extremos (phaC1, phaI), (Figura 10); Una vez se termino el diseño, los iniciadores fueron sintetizados por la compañía IDT (Integrated DNA Technologies).

31

Figura 10 Modelo grafico de ubicación de iniciadores en el cluster de Pseudomonas putida (AF150670.2). Posiciones de los iniciadores sense (1,2,3,4,5,6,7,10,11 y 12) y antisense (3,4,6,7,8,9,10,11 y12) diseñados en este estudio dentro del cluster de 6296 pb, anexo a la secuencia del cluster se encuentran 528 pb a la izquierda y 138 pb a la derecha; la dirección de las flechas indican el sentido de los iniciadores.

Las propiedades de cada iniciador fueron obtenidas mediante el programa CLC Main Workbench 5.1 versión de evaluación, para cada iniciador y de acuerdo a las condiciones y parámetros establecidos en el programa mencionado se consiguieron propiedades relevantes a tener en cuenta para cada secuencia como la Tm, el contenido de GC, la formación de estructura secundaria y puntaje de auto complementariedad (Tabla 3 y 4). Una vez se termino el diseño y la síntesis de los iniciadores, se planteo la manera de formar diversas parejas situadas a lo largo del clúster, teniendo en cuenta básicamente el tamaño del amplímero para su posterior amplificación, en teoría, se permitía el uso de cada iniciador sense con su pareja antisense ya que las Tm no se diferencian de +/- 5°C. Una vez se obtuvo la localización exacta de cada iniciador dentro de la cepa de referencia con y se comprobó la especificidad del iniciador diseñado con la ayuda del programa MEGABLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/megablast.shtml, se formaron 13 parejas diferentes con sus respectivos iniciadores que a su vez cubren todo el cluster y se encuentran distribuidas de la manera que se observa en la siguiente figura (Figura 11).Utilizando esta estrategia las parejas de iniciadores propuestas abarcan todo el cluster desde el gen phaC1 hasta el gen phaI a continuación se describen los genes y las parejas que se utilizaran para obtener sus secuencias.

32

Tabla 4. Propiedades de los iniciadores sense y antisense. Se representa de izquierda a derecha: Nombre del iniciador (No), puntaje de alineamiento de auto complementariedad (PAC), el alineamiento de auto complementariedad, el puntaje de formación de estructura secundaria (PES) y la representación de la estructura secundaria. Se utilizó el programa CLC Main Workbench 5.1 evaluación (http://www.clcbio.com).Para obtener dichas propiedades.

33

Figura 11. Localización de parejas dentro del Cluster de PHA. Diseño de parejas de este estudio para la amplificación del cluster de PHA ubicado en Pseudomonas putida AF150670.2. Se especifica el tamaño aproximado de cada fragmento y la tabla en la parte inferior derecha indica los iniciadores a utilizar para la amplificación de cada pareja.

34

5.3 AMPLIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DE LOS FRAGMENTOS CORRESPONDIENTES AL CLUSTER DE PHAs A PARTIR DE ADN TOTAL.

5.3.1 Amplificación por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) utilizando los iniciadores de Revelo, 2005 En el año 2005 el grupo de bioprocesos y bioprospección, realizó un proyecto (Revelo, 2005), el cual tuvo como propósito establecer una herramienta molecular que permitía la selección de bacterias de diferentes géneros con potencial para acumular PHAs, mediante la detección del gen de la PHA sintasa. Por tal razón se diseñaron iniciadores para amplificar un fragmento del gen phaC (iniciadores generales) utilizando la técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa), sin embargo se diseñaron iniciadores específicos que permitieran además clasificar los microorganismos productores de sintasa tipo II mediante la amplificación del gen phaC2 que es perteneciente a este tipo de organización, por esto razón antes de la evaluación con los iniciadores diseñados en este estudio se amplifico a manera de control los iniciadores generales y específicos utilizados en la investigación de Revelo, 2005; en la primera etapa se probaran las 6 cepas con los iniciadores generales y se escogerá una de estas para trabajar a lo largo del trabajo . Los iniciadores generales amplifican un fragmento del gen phaC1 que es común en todos los microorganismos productores de PHAs, aunque la presencia de este fragmento garantiza la presencia del gen sintasa, no diferencia entre sintasa de tipo I o II. Se realizó la amplificación del fragmento de 551 pb utilizando Gen2-In-PHA-Sense y Gen2-Ex –PHA-Antisense, las condiciones utilizadas son las mismas optimizadas por (Revelo, 2005) (Figura 12).

Figura 12. Ubicación de los iniciadores generales diseñados sobre los genes phaC (Clase I y II). Los números indican las posiciones de los iniciadores sobre las 1770 pares de bases (pb) correspondientes a la secuencia del gen phaC de R. eutropha (ACGenBank, J05003): Gen2-In-PHA-Sense (727-748), Gen2-Ex-PHA-Antisense (1258-1278). Los recuadros muestran el tamaño del fragmento esperado (Revelo, 2005).

35

Los iniciadores específicos se utilizaron para amplificar los genes phaC1 y phaC2 de los microorganismos productores de sintasa tipo II, lo que me garantiza que si amplifican estos fragmentos estoy ante un microorganismo con esta característica (Figura 13).

Figura 13. Ubicación de los iniciadores específicos sobre el cluster parcial de biosíntesis de PHA de Clase II. Los números indican las posiciones de los iniciadores sobre la secuencia del cluster PHA sintasa Tipo II de P. aeruginosa (AC GenBank, AE004919). Para el gen phaC1: Esp-PHAC1-Sense (856-881) y Esp-PHAC1-Antisense (2799-2821) y para el gen phaC2: Esp-PHAC2-Sense (3391-3412) y Esp-PHAC2-Antisense (5707-5726). phaC1 y phaC2 codifican para dos enzimas PHA sintasa y se encuentran separados por phaZ que codifica para la PHA depolimerasa. Los recuadros muestran el tamaño del fragmento esperado (Revelo, 2005).

5.3.2 Amplificación por PCR utilizando los iniciadores diseñados en este estudio a partir de ADN total del cluster de PHAs Las reacciones de amplificación se llevaran a cabo a partir de ADN total de la cepa nativa escogida, de dos cepas controles positivas Pseudomonas aeruginosa ATCC 1040 y Pseudomonas fluorecens y utilizando una cepa de Clostridium sp como control negativo.

5.3.2.1 Extracción de ADN total La metodología realizada para la extracción de ADN fue la descrita por Sambrook et al. (1989); Ausubel et al. (2000) , se inoculó desde agar nutritivo colonias aisladas en un tubo de caldo nutritivo de 18.7ml se incubo a 30°C y 180 rpm por 12 horas y luego se paso a un caldo nutritivo que contenía 231 ml, se incubo en las mismas condiciones anteriores, hasta obtener una densidad óptica de 0.4-0.6 de absorbancia leída a 600 nm, las células fueron recogidas por centrifugación después de realizar 3 lavados con SSE (Solución salina EDTA (Nacl 0.15M y EDTA 100mM pH 8.0)), las células ahora se resuspendieron en 567µl de buffer Tris-EDTA (10mM Tris.Cl pH8.0 y 1mM EDTA pH 8.0) y sometidas a lisis a 37°C por medio de la adición de 3 µl de proteinasa K y 30 µl de SDS al 10% (Sodio Dodecil Sulfato) estas sustancias son utilizadas para degradar proteínas que comúnmente contaminan preparaciones de ácidos nucleícos y a su vez el uso de detergentes que lisan la mayoría de las células inhibiendo la acción de algunas enzimas e inactivando y denaturando algunas proteínas, los restos de pared celular , polisacáridos y proteínas remanentes, fueron removidas por la adición de 100 µl de

36

NaCl 5M y 80 µl con CTAB a 65°C que ocasiona una precipitación selectiva bajo una concentración salina alta, se adiciono un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamilico 25:24:1 y se centrifugo a 14500 rpm /4°C por 10 minutos, se recupero la fase acuosa y separándola del complejo CTAB-proteína-polisacárido, se realizaron dos extracciones con fenol cloroformo 25:24 y luego dos mas con cloroformo con el mismo protocolo de centrifugación siempre recuperado la fase acuosa, después de secar el remanente de fenol/cloroformo por exposición al aire se procedió a eliminar el ARN utilizando RNAsa a 0.5 mg/ml a 37°Cpor una hora , finalmente el ADN es precipitado con un volumen de isopropanol recogiendo por centrifugación y lavando con etanol al 70%. El pellet de ADN fue secado por 10 minutos a 37°C y resuspendido en buffer TE por varias horas a 4°C antes de su utilización.

5.3.2.2 Amplificación de los fragmentos por PCR Una vez obtenido el ADN y cuantificado por fluorometría utilizando el equipo QUBIT de INVITROGEN y observando la calidad el mismo por medio del montaje de un gel de agarosa 0.8 % con TBE 0.5X teñido con bromuro de etídio 1µg/ml se comenzó a ensayar las amplificación de las 13 parejas que se diseñaron (Figura 11) se decidió amplificar con el mismo protocolo los fragmentos con tamaños similares. La amplificación se realizó con la cepa nativa escogida, como controles positivos se utilizó Pseudomonas fluorecens y Pseudomonas aeruginosa y como control negativo se utilizó una cepa de Clostridium sp. En general se realizó el protocolo teniendo en cuenta las estrategias que se han propuesto y que son óptimas al momento de realizar la amplificación. Se recomiendan 30 ciclos, sin embargo de ser requerido se pueden realizar ciclos adicionales, un ciclo de denaturación por cada kb por un minuto a 94°C es suficiente, para fragmentos más largos se aumenta 1 min por cada kb, sin embargo un periodo largo de denaturación es realmente importante al momento de iniciar la reacción ya que se asegura que una completa separación de las hebras se lleve a cabo desde el primer momento, por eso se recomienda un primer ciclo de 5-10 min de denaturación inicial sobre todo en regiones ricas de GC. La temperatura de anillamiento es específica para cada iniciador, esta depende del número de bases que lo compongan y del contenido de GC del mismo, generalmente se recomienda de 55-65°C, sin embargo si no se tienen establecidas las condiciones iniciales se recomienda comenzar con 3-5 °C menos de la temperatura optima teórica y si hay aparición de inespecificidades subirla de manera gradual. El tiempo de anillamiento es generalmente de un minuto sin embargo para volúmenes entre 10-25µl se puede reducir el tiempo hasta la mitad. La taq ADN polimerasa es altamente procesiva y extiende de 2-4 kb por minuto, debido a esto para amplímeros de 1kb o menos, 1min a 72°C es suficiente para la amplificación, se debe utilizar un minuto más por cada kb que contenga el fragmento, se recomienda un ciclo de extensión final de 5 a 10 minutos para completar los fragmentos que por alguna razón hayan quedado incompletos.

37

Con las 13 parejas propuestas se realizaron procesos de optimización del proceso por medio de la modulación de variables claves en la amplificación como la concentración de ADN, de iniciadores y de MgCl2 así como temperatura de hibridación, estos protocolos propuestos se diseñaron usando el fundamento de la técnica, teniendo en cuenta las temperaturas en cada ciclo, la concentración de cada uno de los componentes y el número de ciclos mínimo requerido . Se decidió dividir las parejas en tres grupos al momento de diseñar el protocolo de amplificación la variable que se tuvo en cuenta para dicha división fue el tamaño del fragmento esperado (Tabla 5).

Grupo 1: Tamaño del fragmento mayor a 1300pb Pareja 1 1879 pb Iniciador 2 sense y 3 antisense. Pareja 2 1371 pb Iniciador 3 sense y 4 antisense. Pareja 3 1330 pb Iniciador 4 sense y 6 antisense. Pareja 11 1680 pb Iniciador 1 sense y 4 antisense. Grupo 2: Tamaño del fragmento mayor a 1000 pb y menor a 1300pb Pareja 4 1224 pb Iniciador 6 sense y 10 antisense. Pareja 9 1129 pb Iniciador 12 sense y 7 antisense. Grupo 3 : Tamaño del fragmento menor a 1000pb Pareja 5 512 pb Iniciador 6 sense y 10 antisense. Pareja 5.1 512 pb Iniciador 12 sense y 7 antisense. Pareja 6 925 pb Iniciador 6 sense y 10 antisense. Pareja 7 763 pb Iniciador 12 sense y 7 antisense. Pareja 8 686 pb Iniciador 6 sense y 10 antisense. Pareja 10 739 pb Iniciador 12 sense y 7 antisense. Pareja 10.1 739 pb Iniciador 6 sense y 10 antisense. Tabla 5. División de las 13 parejas para realizar los protocolos de amplificación. Se especifican las parejas que se encuentran dentro de cada grupo, dicha división se realizó teniendo en cuenta el tamaño del fragmento deseado así dentro del grupo 1 se encuentran los amplímeros que tengan más de 1300 pb, los del grupo 2 fragmentos mayores a 1000 pb y menores a 1300 pb, y el grupo 3 fragmentos menores a 1000 pb.

La concentración de cada componente de la mezcla de reacción fue establecida teniendo como punto de partida los resultados con los iniciadores específicos del trabajo de Revelo, 2005; se manejaron los mismos componentes en todas las parejas de los tres grupos. Es importante anotar que aunque se realizaron algunos cambios y pruebas en las concentraciones en algunos componentes (MgCl2, iniciadores y ADN molde), para de esta manera lograr optimizar con cada pareja las concentraciones exactas si se respetaron las concentraciones de la Taq polimerasa, dNTPs y buffer. Componentes de PCR para un volumen total de 25 µl: Taq Polimerasa: Se utilizó 0.05 U/цl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS) o (BIOLINE). *BUFFER 1X (FERMENTAS): Sulfato de Amonio [(NH4)2 SO4] 20 mM, Tris-HCl 75 mM pH 8.8 a 25 °C, 0.01 % Tween 20. *BUFFER 1.25X (BIOLINE): Sulfato de Amonio [(NH4)2 SO4] 20 mM, Tris-HCl 83.7 mM pH 8.8 a 25 °C, 0.012% estabilizador. *En relación a la concentración de buffer, fue definida teniendo en cuenta básicamente la concentración de sulfato de amonio como ayudador de PCR imprescindible; según los datos obtenidos por Revelo, 2005, en dicho documento se comprueba que la concentración optima para la amplificación de los genes de sintasa en cuanto a sulfato de amonio es de 20mM, así

38

pues la concentración de sulfato de amonio en el buffer 10X de la marca FERMENTAS es de 200mM y cuando se utiliza el Buffer 1X como se recomienda en el protocolo la concentración de sulfato queda a 20mM que es la concentración optima, en cambio en el buffer marca BIOLINE 10X la concentración de sulfato de amonio es de 160 mM razón por la cual no se utilizó 1X sino 1.25X para que la concentración de sulfato final en el volumen de reacción quedara a 20mM conservando la concentración optima reportada. DNTPs: Se utilizó en todas las reacciones 0.2 mM.Iniciadores: Se realizaron las pruebas utilizando 0.4 μM, 0.7 μM y 1 μM. MgCl2: Se probo con 1.5 mM, 2.0 mM y 3.0 mM. ADN molde: Se trabajo utilizando 25 ng, 50 ng y 100 ng.Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en diferentes termocicladores: i-Cycler de BIO-RAD, Hybaid onm- E y LABNET- Multigene calibrados según protocolo del fabricante

Las condiciones óptimas de cada pareja se describen a continuación: Grupo 1 parejas 1, 2, 3 y 11 El protocolo general de amplificación para este grupo fue: una primera etapa (1 ciclo a 94°C 10 min, 61.8°C por 2 min, y 72°C por 2 min); una segunda etapa (30 ciclos a 94°C 1 min, 61.8°C por 1 min, y 72°C por 1.5 min); una tercera etapa (1 ciclo a 72°C por 5 min); y una conservación final a 4 °C. • Pareja 1 Iniciador 2 sense y 3 antisense. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 0.7 µM de cada iniciador, MgCl2 1,5 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 25 ng de ADN molde preparado para la reacción. Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 1 (Figura 14), se modifico la Tm de la segunda etapa a 58.8°C. • Pareja 2 Iniciador 3 sense y 4 antisense. Los resultados con esta pareja resultaron ser particulares, ya que al utilizar el protocolo con las cepas controles únicamente se observó la banda deseada, sin embargo después de realizar varias pruebas con la cepa nativa S1602 no se logro deshacer la inespecificidad de tamaño aproximado a 800 pb, debido a esto se decidió realizar la amplificación en la pareja 11. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 0.4 µM de cada iniciador, MgCl2 1,0 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 25 ng de ADN molde preparado para la reacción.Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 1 (Figura 14), se modifico la Tm de la segunda etapa a 68 ° C.

• Pareja 3 Iniciador 4 sense y 6 antisense. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 0.7 µM de cada iniciador, MgCl2 2.0 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 50 ng de ADN molde preparado para la

39

reacción. Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 1 (Figura 14), se modifico el Tm de la segunda etapa a 60 ° C.

• Pareja 11 Iniciador 1 sense y 4 antisense. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 0.7 µM de cada iniciador, MgCl2 1.5 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 50 ng de ADN molde preparado para la reacción.Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 1 (Figura 14), se modifico la Tm de la segunda etapa a 61°C.

Grupo 2 parejas 4 y 9 El protocolo general de amplificación para este grupo fue: una primera etapa (1 ciclo a 94°C 10 min, 62.7°C por 2 min, y 72°C por 2 min); una segunda etapa (30 ciclos a 94°C 1min, 58.7°C por 1 min, y 72°C por 1 min); una tercera etapa (1 ciclo a 72°C por 5 min); y una conservación final a 4 °C. • Pareja 4 Iniciador 1 sense y 4 antisense. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 0.7 µM de cada iniciador, MgCl2 1.5 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 50 ng de ADN molde preparado para la reacción.Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 2 (Figura 15), se modifico la Tm de la segunda etapa a 63°C. • Pareja 9 Iniciador 1 sense y 4 antisense. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 0.4 µM de cada iniciador, MgCl2 1.5 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 50 ng de ADN molde preparado para la reacción.Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 2 (Figura 15), se modifico la Tm de la segunda etapa a 60.1°C. Grupo 3 parejas 5, 5.1, 6, 7, 8, 10, 10.1 El protocolo general de amplificación para este grupo fue: una primera etapa (1 ciclo a 94°C 10 min, 62.1°C por 2 min, y 72°C por 1 min); una segunda etapa (30 ciclos a 94°C 1 min, 58.1°C por 1 min, y 72°C por 1 min); una tercera etapa (1 ciclo a 72°C por 5 min); y una conservación final a 4 °C. • Pareja 5 Iniciador 10 sense y 8 antisense. Debido a la variabilidad de la secuencia sobre la que se diseñaron estos iniciadores (8 y 9 antisense), que hacen parte de las parejas 5 y 5.1 respectivamente se realizaron dos iniciadores diferentes que se pegan en la misma región; es importante anotar que una cepa podía amplificar con uno y no con el otro iniciador dependiendo de la secuencia que presentara

40

en esa región, en el caso de la pareja 5, amplificaron los dos controles, pero no la cepa nativa, que amplifico con la pareja 5.1. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 1.0 µM de cada iniciador, MgCl2 3.0 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 100 ng de ADN molde preparado para la reacción.Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 3 (Figura 16), se modifico la Tm de la segunda etapa a 55.1°C. • Pareja 5.1 Iniciador 10 sense y 9 antisense. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 1.0 µM de cada iniciador, MgCl2 3.0 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 100 ng de ADN molde preparado para la reacción.Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 3 (Figura 16), se modifico el Tm de la segunda etapa a 55.1 ° C. • Pareja 6 Iniciador 1 sense y 11 antisense. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 0.4 µM de cada iniciador, MgCl2 1.5 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 50 ng de ADN molde preparado para la reacción.Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 3 (Figura 16), se modifico el Tm de la segunda etapa a 62.8 ° C. • Pareja 7 Iniciador 11 sense y 4 antisense. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 0.4 µM de cada iniciador, MgCl2 1.5 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 50 ng de ADN molde preparado para la reacción.Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 3 (Figura 16), se modifico el Tm de la segunda etapa a 62.8 ° C • Pareja 8 Iniciador 5 sense y 12 antisense. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 0.4 µM de cada iniciador, MgCl2 1.5 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 50 ng de ADN molde preparado para la reacción.Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 3 (Figura 16), se modifico el Tm de la segunda etapa a 62.8 ° C • Pareja 10 Iniciador 7 sense y 8 antisense. Esta pareja junto con la 10.1 tienen los mismos iniciadores que las parejas 5 y 5.1 por tanto presentan esa misma situación de dos iniciadores distintos que se pegan en la misma secuencia, en este caso la pareja 10 se amplifico con los controles, en contraste con la pareja 10.1 que nunca se pudo amplificar. Buffer 1X –FERMENTAS o Buffer 1.25X –BIOLINE, dNTPs 0.2 mM, 1.0 µM de cada iniciador, MgCl2 3.0 mM, 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS O BIOLINE), y agua HPLC estéril para completar 25 µl de reacción. Se empleó 100 ng de ADN molde preparado para la

41

reacción.Se utilizó el protocolo descrito para las parejas del grupo 3 (Figura 16), se modifico el Tm de la segunda etapa a 55.1 ° C.

5.4 CARACTERIZACIÓN DE LA CEPA NATIVA ESCOGIDA POR MEDIO DE LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN RIBOSOMAL 16S ARNr El gen 16S ARNr contiene información que lo hace un excelente marcador de microorganismos ya que posee regiones altamente conservadas encontradas en todos los organismos vivientes y regiones variables de diagnóstico que son únicas de organismos particulares o grupos de organismos relacionados cercanamente. La utilidad de la secuencia ARNr como un instrumento taxonómico ha sido ampliamente demostrada en bacterias, donde el análisis de la secuencia del 16S ARNr ha redefinido completamente relaciones filogenéticas previamente dependientes del metabolismo celular (Jensen et al., 1993). Es de gran importancia tener completa certeza que el microorganismo escogido este bien caracterizado con un género y una especie establecida, esto no solo nos permitirá tener una base en el estudio de los genes para crear una comparación acertada sino también nos brindara información sobre cuales variables debemos modificar al momento de trabajar en el futuro con modificaciones genéticas y de fermentación. Por esta razón fue indispensable comprobar los datos obtenidos en el trabajo realizado anteriormente por Revelo, 2005 en donde se concluyó que las cepas C14, C16, S1804, S0804, 1G3* presentan una alta similitud con secuencias del genero Pseudomonas sp, en relación a la cepa S1602 concluye que tiene una relación con cepas del género Burkholderia, especialmente con B. cepacia, sin embargo afirmo en dicho estudio que la similitud de S1602 con bacterias del género Pseudomonas plantea la necesidad de confirmar la identificación, debido a la inferencia que tendría su clasificación en relación con los genes de biosíntesis de PHAs. En relación con lo anterior se decidió amplificar el gen 16S ARNr de la cepa escogida y realizar entonces el análisis pertinente y correlacionar a su vez con las características microscópicas y macroscópicas en los medios selectivos. Las condiciones de PCR se basaron en (Uribe, 2005). Iniciador Sense 5´GATCATGGCTCAGATTGAACG3´ Iniciador Antisense 5´GTTCCCCTACGGCTACCTTG 3´ Mezcla de reacción La amplificación se realizó a partir de 20ng de ADN molde extraído por el método de fenol cloroformo. Las condiciones para la amplificación de los fragmentos fueron: un ciclo de 10 min a 94°C, 2min a 59°C y 2 min a 72°C; 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 56°C y 1 min 30 seg a 72°C, y un ciclo de extensión final de 5 min a 72°C. Cada 25 µl de reacción contenían: Buffer 1X FERMENTAS (Sulfato de amonio [(NH4)2 SO4] 20 mM, Tris-HCl 75 mM pH 8.8 a 25 °C, 0.01% Tween 20) o Buffer 1.25X BIOLINE (Sulfato de Amonio [(NH4)2 SO4] 20

42

mM, Tris-HCl 83.7 mM pH 8.8 a 25 °C, 0.012% estabilizador), dNTPs 0.8 mM, 0.4 µM de cada iniciador ,MgCl2 1,5 mM y 0.05 U/µl de Taq ADN Polimerasa (FERMENTAS o BIOLINE). La secuencia parcial del gen 16S ARNr fue ensamblada por el programa Cap3, se llevo a CLUSTALW2 para realizar un alineamiento múltiple con secuencias de referencia obtenidas a partir de la base de datos del Genbank , partir de dicho alineamiento se elaboro un dendograma con el programa MEGA 4.0 utilizando el método de agrupamiento Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap . Especie Bukholderia cepacia Bukholderia sp. Pseudomonas fluorescens Grimontella senegalensis Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aureofaciens Ralstonia sp Pseudomonas chlororaphis Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fulva Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Enterobacter agglomerans Stenotrophomonas maltophilia Bacillus megaterium

AC AY741354 AY839565 FJ652595 AY217653 U33121 AY349466 D84008 AY217653 D84011 AI3091837 AB046997 EF194102 AF063219 AY217653 AJ293472 GU904680.1

Tabla 6. Secuencias escogidas para realizar el análisis de gen 16s ARNr

5.5 SEPARACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE PCR Todos los productos de PCR fueron separados en geles de agarosa 1.5% por electroforesis convencional con TBE 0.5X y la visualización se realizó con SYBR® Safe, los geles fueron digitalizados en un transiluminador Gel Doc® con ayuda del software Quantity One® (BioRad). La purificación y secuenciación de los fragmentos amplificados fue realizada por la empresa Macrogen (Corea). Todos los fragmentos se secuenciaron por duplicado, con el fin de aumentar la confiabilidad al momento de ensamblar las secuencias. Como marcador de tamaño de los fragmentos se utilizó Hyperladder II (50-200pb), Hyperladder III (500-5000pb) y Hyperladder IV (100-1000pb).

43

5.6 ENSAMBLAJE DE SECUENCIAS Y ANALISIS BIOINFORMATICO Una vez recibidas las secuencias que se amplificaron utilizando los iniciadores diseñados en el estudio y las secuencias obtenidas de los fragmentos de 16S RNAr se ordenaron los duplicados de cada pareja, se obtuvo también el complemento reverso de las secuencias antisense con ayuda de la aplicación que se encuentra en el programa de análisis de secuencias BIOEDIT (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), las secuencias fueron ensambladas utilizando el programa CAP3 (http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php) y también de manera manual utilizando alineamientos múltiples sucesivos utilizando el programa CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/CLUSTALW2/index.html), las secuencias fueron editadas manualmente en posiciones no coincidentes solamente teniendo el cuenta el duplicado de dicha secuencia y con ayuda de alineamientos múltiples utilizando las secuencias control presentes en las bases de datos, esto con el fin de eliminar posibles errores en la secuenciación. Las secuencias control utilizadas como patrones se escogieron teniendo en cuenta criterios como: secuencias curadas, completas, de trabajos de investigación reconocidos, que las secuencias tanto de nucleótidos como de proteínas coincidieran con la función y estructura reportada para cada tipo de gen dentro del cluster, las secuencias escogidas se describen a continuación (Tabla 7 ). ACCESO GENBANK AB049413 AF150670.2 NC_011770 NC_008027 NC_002516.2 NC_007492.2

CEPA Pseudomonas chlororaphis subs aurefaciens Pseudomonas putida Pseudomonas aeruginosa LESB58 Pseudomonas entomophila L48 Pseudomonas aeruginosa PAO1 Pseudomonas fluorescens Pf0-1

Tabla 7 Secuencias escogidas utilizadas como patrones en todos los análisis bioinformáticos.

Las secuencias nucleotidicas ensambladas de cada uno de los genes del cluster fueron llevadas en busca de marcos abiertos de lectura con ayuda de la aplicación de la NCBI/ORF FINDER (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/). Una vez allí las secuencias traducidas de cada ORF resultante fueron comparadas con las que se encontraban en las bases de datos con ayuda de BLASTP que realiza un alineamiento local teniendo en cuenta las proteínas reportadas (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), esta herramienta es muy útil para predecir una posible función enzimática. Con las secuencias de aminoácidos establecidas y teniendo en cuenta la información descrita por bibliografía en cuanto a secuencia primaria de los 6 genes que conforman el cluster se busco por medio de alineamientos múltiples (CLUSTALW2) con las secuencias reportadas (Tabla 7) datos como similaridad entre las secuencia de la cepa nativa y las reportadas y se localizaron motivos o perfiles estrictamente conservados en cada uno de los genes que conforman el cluster asociado con la síntesis de PHAs. Para definir distancias de las secuencias con respecto a las familias de proteínas reportadas en las bases de datos y a sí mismo la función de dicha familia se utilizó PSI- BLAST (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psiblast/), se buscaron dominios proteicos con la ayuda de CDD- (Conserved Domains Database) utilizando

44

la aplicación RPS-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi), se realizó la predicción de las estructuras secundarias con el programa PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred). Utilizando estos datos se llegaron a conclusiones relevantes y muy informativas respecto a la cepa nativa escogida. Los programas utilizados se corrieron todos utilizando los parámetros por defecto.

45

6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 ACTIVACIÓN Y ACUMULACIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATO (PHA) Una vez activadas las cepas en caldo nutritivo se realizó una coloración de Gram donde se comprobó la pureza y las características morfológicas ; los resultados arrojaron aislamientos puros y con las características deseadas ( Bacilos Gram Negativos) el tamaño de los bacilos es ligeramente diferente entre cepa y cepa, posterior a esto con el fin de observar la acumulación del polímero se inoculó una colonia de cada cepa en el medio de cultivo Mínimo de Sales Minerales (MSM) pH 7.0 y al cabo de tres días de incubación a 30°C se observó crecimiento en todos los tubos de las 6 cepas evaluadas evidenciándose por la aparición de turbidez en el tubo y posterior a la confirmación por medio de la tinción con sudan negro, en donde se observaron los gránulos claramente teñidos. Se observó crecimiento en las seis cepas nativas en el agar cetrimide a 30 °C a las 72 horas de incubación, las características de las colonias fueron similares, se observaron en general colonias redondas verdosas regulares. Después de el aislamiento en el agar cetrimide se sembraron las cepas nativas en agar King donde se estimula la producción de fluoresceína, aunque se observó crecimiento en todas, solo la cepa S1602 produjo una clara fluorescencia a las 48 horas de incubación a 30°C (Figura 14), este resultado es muy particular, teniendo en cuenta que la S1602 fue clasificada en el estudio de Revelo, 2005 como Burkholderia cepacia y según reportes esta cepa no produce fluorescencia, por esto es de especial interés enfocarnos en esta cepa y comprobar los datos anteriores.

Figura 14. Producción de fluoresceína en la cepa nativa S1602 en agar King B a las 48 horas de incubación a 30°C, a la derecha se observa la cepa nativa C14 que a pesar de tener crecimiento no produjo pigmentos fluorescentes.

46

6.2 DISEÑO DE INICIADORES Se diseñaron 19 iniciadores en total, de los cuales 7 fueron realizados de tal manera que se tomara la misma secuencia para realizar el antisentido, estos iniciadores cubren todo el cluster de PHA dentro del cual encontramos 6 genes (phaC1, phaZ, phaC2, phaD, phaF, phaI). Se utilizaron dos estrategias para realizar el diseño, uno mediante el programa primer 3 y dos de manera manual observando las secuencias nucleotídicas mas conservadas utilizando CLUSTALW2 (Anexo 3) como programa de alineamiento múltiple, la especificidad de las secuencias obtenidas se evaluó mediante el programa BLAST utilizando la opción de MEGABLAST, se observó que las secuencias obtenidas por la primera estrategia tuvo menos especificidad, que la segunda, a su vez con esta ultima estrategia, se tiene control del sitio exacto en donde se desea que haya unión con los iniciadores y la cadena molde de DNA, por eso al comparar los dos métodos se decidió utilizar solamente las secuencias resultantes de la búsqueda y diseño de iniciadores de manera manual, es importante anotar que dependiendo de la localización del gen se alinearon un número de secuencias con base en las secuencias anotadas de los genes que conforman el cluster (Tabla 7). Los iniciadores resultantes tienen un tamaño entre 23-26 bases lo que aumento la especificidad al momento de la evaluación en el programa de alineamiento contra las secuencias de las bases de datos, a su vez se realizaron ajustes teniendo en cuenta los parámetros ideales al momento del diseño de los iniciadores y se tuvo en cuenta que entre un iniciador y otro existiera una diferencia entre +/- 5°C, esto con el objetivo de poder utilizar más de una combinación al momento de la amplificación se los segmentos. Es de importancia aclarar que fue necesario diseñar 2 iniciadores diferentes (8 y 9 antisense) sobre la zona correspondiente al final del cluster, ya que se veían en las secuencias analizadas dos patrones diferentes de bases nucleotidicas, lo que nos indico que la mejor opción era tomar en cuenta estos dos grupos de bloques conservados en la misma posición dentro de la secuencia de referencia (AF150670.2). Aunque los resultados del alineamiento múltiple muestran varias regiones estrictamente conservadas a lo largo del clúster (Anexo 5) si existen entre un fragmento conservado cambios puntuales de una o dos bases, a su vez para no disminuir la especificidad, ya que esta propiedad es directamente proporcional al tamaño del iniciador, se realizaron degeneramientos en una o dos bases de cada secuencia. El grado de degeneración de los iniciadores se calculo multiplicando todos los valores de degeneración (número de bases por posición) incorporados en la secuencia del iniciador. (Koelle, 1996).Este valor indica el número de posibilidades de anillamiento que tiene el oligonucleótido. Los estudios demuestran que hay amplificaciones exitosas con un índice de degeneración de 1000, se recomienda que dicho índice no sea mayor de 100 veces (Tabla 5), en esta investigación los índices van desde 2 a 4 lo que muestra un valor mucho menor que lo máximo recomendado y sugiere que no se vio afectada la amplificación por esta degeneración.

47

Las 13 parejas seleccionadas abarcaron todo el cluster, asociado a la producción de PHAs de y debido al tamaño de algunos de los genes del cluster, fue necesario realizar iniciadores dentro de las secuencias del gen (iniciadores internos) para obtener las secuencias completas de cada uno de los genes. Cada gen tiene una o más parejas que cubren su secuencia y existen sobrelapamientos entre algunas parejas, para cada gen hay más de una posibilidad de amplificar sus secuencias en las parejas diseñadas. A continuación se describen las parejas que amplifican Cada uno de los genes del cluster (Tabla 8).

GEN

PAREJAS

Gen phaC1

1(1879 pb)

Gen phaZ

2 (1371 pb)

11 (1688 pb)

6 (925 pb)

Gen phaC2

2 (1371 pb)

11 (1688 pb)

3 (1330 pb)

7 (763 pb)

Gen phaD

3 (1330 pb)

4 (1224 pb)

8 (686 pb)

9 (1121 pb)

Gen phaF

4 (1224 pb)

9 (1121 pb)

5/5.1(512 pb)

10/10.1 (739)

Gen phaI

5/5.1 (512 pb)

10/10.1 (739 pb)

11 (1688 pb)

6 (925 pb)

.

Tabla 8 Parejas correspondientes a cada gen y su tamaño.

6.3 AMPLIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DE LOS FRAGMENTOS CORRESPONDIENTES AL CLUSTER DE PHA A PARTIR DE ADN TOTAL.

6.3.1 Amplificación por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) utilizando los iniciadores de Revelo, 2005 Iniciadores generales: Para este trabajo se realizó la amplificación del fragmento de 551 pb utilizando Gen2-In-PHA-Sense y Gen2-Ex –PHA-Antisense, las condiciones utilizadas se describieron en la sección (5.4.1.1), se amplificó el fragmento en las 6 cepas nativas a evaluar (C14, C16, S1602, S0804, 1G3* y S0804).

48

Figura 15. Amplificación de un fragmento del gen phaC (512pb) por PCR de las 6 cepas nativas con los iniciadores generales Gen-In–PHA-Sense y Gen-Ex–PHA-Antisense. Carriles: 1, marcador de tamaño molecular (HyperLadder IV); 2, Pseudomonas fluorecens (control positivo); 3, C14; 4, C16; 5, S1602; 6, S1804; 7, 1G3*; 8, S0804; 9, Clostridium sp (control negativo); 10, control de reactivos.

Se logró amplificar el gen phaC en las seis cepas nativas evaluadas (Figura 15), esto comprueba que tienen presente este gen que codifica para la sintasa, sin embargo no clasifica a las cepas en productoras de sintasa tipo I o tipo II ya que las dos lo poseen , en este momento se podía partir de cualquiera de las cepas para seguir el estudio; se escogió la cepa S1602 ya que es una cepa que según Revelo, 2005 debe ser estudiada más a fondo ya que en la clasificación taxonómica por la amplificación del gen 16S ARNr se encontró que estaba relacionada con el género Burkholderia cepacia no con Pseudomonas sp como las otras, sin embargo en este mismo estudio se evaluó una cepa del mismo género (Burkholderia cepacia) y esta no amplificó el fragmento de 2335 pb correspondientes a la secuencia del gen phaC2 que codifica para la sintasa II que es específica para cepas productoras de sintasa del mismo tipo a diferencia de la cepa S1602 que aunque se clasificó dentro del mismo género, si se encontró dicho fragmento además, dentro de este estudio cuando se aisló en agar King esta cepa presento fluorescencia lo cual discrepa del género Burkholderia cepacia, lo que causó gran curiosidad al momento de escoger la cepa nativa para seguir el estudio. Iniciadores específicos: Los iniciadores específicos como su nombre lo indica se utilizaron para amplificar los genes phaC1 y phaC2 de los microorganismos productores de sintasa tipo II de manera puntual, se realizó la amplificación de la cepa nativa escogida S1602 lo que comprobó que esta cepa presenta los genes que identifican a los microorganismos que acumulan PHAs de cadena larga por presentar sintasa tipo II. Se utilizó la estrategia de Touchdown PCR y todas las condiciones estandarizadas por Revelo, 2005 sección 5.4.1.2 (Figura 16).

49

Figura 16. Evaluación de Amplificación con los iniciadores de Revelo, 2005 en la cepa S1602. Carriles : 1 marcador de tamaño molecular (HyperLadder II); Amplificación de un fragmento del gen phaC (512pb) por PCR con los iniciadores generales Gen-In–PHA-Sense y Gen-Ex–PHA-Antisense: 2, Pseudomonas aeruginosa (control positivo); 3, S1602; Amplificación del gen phaC1 (1965 pb) por PCR con los iniciadores Esp-PHAC1-Sense y EspPHAC1-Antisense; 4, Pseudomonas aeruginosa (control positivo); 5, S1602; Amplificación del gen phaC2 (2335 pb) por PCR con los iniciadores Esp-PHAC2-Sense y Esp-PHAC2-Antisense; 6, Pseudomonas aeruginosa (control positivo); 7, S1602; 8 marcador de tamaño molecular (HyperLadder III).

6.3.2 Amplificación por PCR utilizando los iniciadores diseñados en este estudio a partir de ADN total del cluster de PHAs Un vez se amplificaron los fragmentos con los iniciadores generales y específicos en la cepa S1602 se optimizó las condiciones para la amplificación de las 13 parejas en las cepas control (Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas fluorecens), y luego se realizó la amplificación en la cepa S1602 con las parejas 1, 2, 3, 4 y 5.1 inicialmente se utilizó esta estrategia ya que estas parejas cubren todo el cluster, se espero el resultado de la secuenciación y se evaluó la calidad de las secuencias obtenidas, en el caso de la pareja dos no se logro evitar la amplificación de una inespecificidad de menor tamaño al deseado, esto se vio reflejado en la calidad de la secuencia, por lo que se decidió amplificar en la cepa S1602 la pareja 11 que abarcaba dicha zona dentro del cluster. Las trece parejas fueron amplificadas bajo el protocolo descrito anteriormente y se evaluaron por separado para obtener las condiciones optimas de cada una al momento de la amplificación, los componentes de PCR que influyeron al momento de realizar la estandarización fueron: la concentración de iniciadores (0.4 μM, 0.7 μM y 1 μM) de MgCl2 (1.5 mM, 2.0 mM y 3.0 mM), de ADN molde (25 ng, 50 ng y 100 n) y la temperatura de hibridación. Por esta razón se probó cada uno de los parámetros, hasta llegar a un producto de amplificación de excelente calidad teniendo en cuenta: amplímero de tamaño deseado,

50

ausencia de inespecificidades y de dímeros de iniciadores, concentración adecuada del producto y controles con los resultados esperados. Para todas las parejas se utilizaron dos controles positivos (Pseudomonas aeruginosa ATCC 1040 y Pseudomonas fluorecens), de la misma manera se utilizó como control negativo una cepa de Clostridium sp. Se trabajó con un volumen de reacción final de 25 µl c/u, de manera que 4 µl fueron utilizados para la evaluación de cada producto por electroforesis, 1 µl para la cuantificación del producto por fluorometría y los 20 µl restantes fueron enviados a MacrogenKorea para el proceso de purificación y secuenciación correspondiente.

Figura 17. Amplificación de la pareja 1 en S1602 por PCR utilizando los iniciadores 2 sense 3 antisense. Carriles: 1, marcador de tamaño molecular (HyperLadder II); 2, Pseudomonas aeruginosa (control positivo) con MgCl2 de 3.0 mM y 56.8°C; 3, S1602 con MgCl2 de 3.0 mM y 56.8°C; 4, S1602 con MgCl2 de 3.0 mM y 58.8°C; 5, S1602 con MgCl2 de 3.0 mM y 60.8°C; 6, S1602 con MgCl2 de 1.5 mM y 56.8°C; 7, S1602 con MgCl2 de 1.5 mM y 58.8°C; 8, S1602 con MgCl2 de 1.5 mM y 60.8°C.

Claramente se observó el efecto que tiene la concentración de MgCL2 y la Tm en la amplificación en la cepa S1602 como se observa en la figura 20, en donde se probaron diferentes temperaturas de hibridación y dos concentraciones diferentes de MgCl2 para la pareja 1, en los carriles 1, 2, 3 y 4 se trabajo con una concentración de MgCl2 de 3.0 mM y en los carriles 5, 6 y 7 se utilizó 1.5mM lo que redujo en gran manera las inespecificidades, estos resultados confirman que concentración de magnesio afecta el funcionamiento de la enzima Taq ADN polimerasa. Los componentes de la reacción tales como: el ADN molde, agentes quelantes como el EDTA, dNTPs y proteínas pueden afectar la cantidad de magnesio libre (Henegariu, 2000). Su carencia puede inactivar la enzima y su exceso reduce la fidelidad de la misma y puede incrementar las uniones inespecíficas lo que se comprobó en este ensayo (Eckert and Kunkel, 1990) A su vez en este mismo ensayo se utilizaron varias temperaturas de hibridación; carril 1, 2 y 5 (56.8°C), carril 3 y 6 (58.8°C) y carril 4 y 7 (60.8°C). Se observó un gran efecto en los carriles 1, 2, 3 y 4 ya que a medida que se aumento la temperatura se disminuyeron las inespecificidades lo que es acorde con la literatura en los carriles 5, 6 7 no hubo ningún cambio aparente, esto sugiere que la concentración de MgCl2 de 1.5 mM es la ideal (Figura 17). Se realizó la amplificación de la cepa S1602 con las condiciones antes descritas empezando con las parejas 1, 2, 3, 4 y 5.1 que cubren todo el cluster , debido a que no se pudo descartar la inespecificidad de la pareja 2 se decidió amplificar la pareja 11 que cubre esta zona (Figura 18).

51

Figura 18. Amplificación por PCR de las parejas 1, 2, 3, 4, 5.1 y 11. Carriles: 1, marcador de tamaño molecular (HyperLadder II); 2, Pseudomonas aeruginosa (control positivo) pareja 1 (1879pb); 3, Pseudomonas fluorecens (control positivo) pareja 1; 4, S1602 pareja 1: 5, Pseudomonas aeruginosa (control positivo) pareja 2 (1371pb); 6, Pseudomonas fluorecens (control positivo) pareja 2; 7, S1602 pareja 2: 8, Pseudomonas aeruginosa (control positivo) pareja 3 (1330pb); 9, Pseudomonas fluorecens (control positivo) pareja 3; 10, S1602 pareja 3; 11, Pseudomonas aeruginosa (control positivo) pareja 4 (1224pb); 12, Pseudomonas fluorecens (control positivo) pareja 4; 13, S1602 pareja 4; 14, Pseudomonas aeruginosa (control positivo) pareja 5.1 (512pb); 15, Pseudomonas fluorecens (control positivo) pareja 5.1; 16, S1602 pareja 5.1; 17, Pseudomonas aeruginosa (control positivo) pareja 11 (1686pb); 18, Pseudomonas fluorecens (control positivo) pareja 11; 19, S1602 pareja 11; 20, marcador de tamaño molecular (HyperLadder III).

Se realizó la amplificación del resto de parejas con las cepas controles (Figura 19).

Figura 19. Amplificación por PCR de las parejas 5, 6, 7, 8, 9 y 10 en las cepas controles (Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas fluorecens). Carriles: 1, marcador de tamaño molecular (HyperLadder III); 2, Pseudomonas aeruginosa pareja 5 (1512pb); 3, Pseudomonas fluorecens pareja 5; 4, Pseudomonas aeruginosa pareja 6 (925pb); 5, Pseudomonas fluorecens pareja 6; 6, Pseudomonas aeruginosa pareja 7 (737pb); 7, Pseudomonas fluorecens pareja 7; 8, Pseudomonas aeruginosa pareja 8 (686pb); 9, Pseudomonas fluorecens pareja 8; 10, Pseudomonas aeruginosa pareja 9 (1121pb); 11, Pseudomonas fluorecens pareja 9; 12, Pseudomonas aeruginosa pareja 10 (739pb); 13, Pseudomonas fluorecens pareja 10; 14, marcador de tamaño molecular (HyperLadder II).

52

Para este trabajo se diseño una metodología basada en PCR para la obtención de los fragmentos de ADN a secuenciar, esta metodología aunque tiene como ventaja su bajo costo a comparación de otras metodologías empleadas, por medio de la construcción de librerías (Timm and Steinbuchel 1992; Prieto et al. 1999; Klinke et al. 2000; Sandoval et al. 2007) sin embargo necesita de estudios anteriores que permita no solo tener secuencias sino que estas sean de buena calidad y correspondan a la realidad biológica del microorganismos, a su vez es necesario que sean taxonómicamente cercanos con la cepa de trabajo y que sus genes sean similares para que el diseño de iniciadores sea un éxito. Gracias a la observación de la similaridad reportada de las secuencias del cluster en el género Pseudomonas y la conservación de ciertas secuencias a lo largo de los 6 genes que conforman el cluster se logro obtener las secuencias requeridas, sin embargo se debe tener en cuenta que todo diseño de iniciadores requiere de un conocimiento mínimo de la secuencia a trabajar y de las herramientas necesarias para analizarla, en este estudio los 19 iniciadores fueron obtenidos por medio de un alineamiento múltiple utilizando CLUSTALW2 tomando las secuencias conservadas como molde para su diseño , esto permitió tener control de el sitio desde donde se empezó la amplificación. Los resultados obtenidos muestran que la cepa S1602 tiene similaridad a lo largo de toda la secuencia del cluster con las cepas reportadas del genero Pseudomonas, lo que permitió que la amplificación resultara de la manera esperada, en el desarrollo de todas las amplificaciones se evidenciaron algunos problemas que se fueron resolviendo a medida que la metodología así lo permitiera, variables como la calidad del ADN, la concentración de todos los componentes de reacción y el protocolo de amplificación utilizado fueron estudiados de tal manera que todos los resultados aquí mostrados reflejan la optimización de todas esas variables juntas. La concentración de MgCl2 estuvo entre 1.5 mM y 3.0 mM lo que muestra que cada iniciador y cada templete necesitan de condiciones diferentes, la Tm oscilo entre un amplio rango de 55 °C y 68 °C lo que demuestra el hecho de que cada iniciador necesita de unas circunstancias diferentes. En el caso de la pareja dos, conformada por el iniciador 3 sense y el iniciador 4 antisense, se observó claramente la diferencia que puede existir en la metodología entre cepas, se observó claramente que la amplificación de este fragmento en las cepas controles dio de la manera esperada, pero en la cepa S1602 no se logro obtener un producto de buena calidad , a pesar de probar todas las opciones para garantizar la astringencia de la reacción no se logro que la amplificación de una inespecificidad de aproximadamente 800 pb no se evidenciara, esto deja en manifiesto que esta técnica es muy sensible incluso entre cepas que en teoría son similares como las cepas control y la cepa nativa, por esto se puede afirmar que aunque se realizan procesos de optimización en la técnica, cada resultado refleja un panorama diferente de reacción, también se concluye que el trabajar con una cepa nativa impone muchos retos, ya que primero no se conoce la naturaleza de las mismas, las características bioquímicas y genéticas se conocen a medida de las investigaciones realizadas y el hecho de que esta sea aislada se microambientes con tanta variedad como el suelo sugiere que la composición y la naturaleza misma de la cepa sea diferente a las cepas de las que se tienen más conocimiento, sin

53

embargo el hecho de aprovechar los recursos propios como fuente de investigación y desarrollo hacen que las cepas nativas sean una muy buena elección.

6.3.3 Caracterización molecular de la cepa S1602 a través de la amplificación del gen 16s ARNr Se amplifico una secuencia de aproximadamente 1500 pb (Figura 20). El propósito que tiene este análisis de similitud en este estudio es mostrar la relación taxonómica de la cepa S1602.

Figura 20. Amplificación del gen 16S ARNr. Carriles: 1 marcador de tamaño molecular Hyperladder II; 2, Pseudomonas fluorecens (Control positivo); 3, S1602, 4, control de reactivos.

La figura 21 muestra un dendograma de similitud construido por el método de agrupamiento de NeigbourJoining, las secuencias seleccionadas en la base de datos se ubican en tres clusters, un primer cluster corresponde a las bacterias del género Pseudomonas excepción de las especies de fluorecens y putida. Este mismo cluster se agruparon las especies del genero Burkholderia que son estrechamente relacionándose incluso antes eran consideradas como Pseudomonas. El aislado S1602, considerado preliminarmente como perteneciente al género Burkholderia, se agrupo en un segundo cluster dentro del grupo de las Pseudomonas fluorecens lo que indica que el planteamiento de Revelo acerca de la necesidad de confirmar la identificación tenía fundamento y que aquí se comprueba que tiene mas relación con el género Pseudomonas fluorecens que con el de Burkholderia cepacia, las pruebas bioquímicas apoyan esta afirmación ya que cuando se sembró en agar selectivo King B hubo un desarrollo de fluorescencia que no es acorde con el género Burkholderia pero si con Pseudomonas fluorecens; en este mismo cluster se ubico P. putida y Klebsiella pneumoniae microorganismos que también acumulan biopolímeros (Wong et al., 2002), además de Enterobacter y Grimontella que están dentro de la familia de las Enterobacterias; Se utilizo como control externo Bacillus megaterium que aunque produce biopolímero es un bacilo gram positivo. El conocimiento a nivel de género y de especie

54

bacteriana es importante en el contexto de acumulación de polímero, debido a la utilización de sustratos y condiciones de crecimiento acordes con un determinado aislado.

Figura 21. Dendograma de similitud del aislamiento bacteriano nativo S1602 con base en el análisis de la secuencia parcial del gen ribosomal 16S. Obtenido por el programa MEGA 4.0 utilizando el método de agrupación de Neighborg-Joning y probado con 5000 repeticiones- bootstrap.

6.4 ENSAMBLAJE DE SECUENCIAS Y ANALISIS BIOINFORMATICO

6.4.1 Genes phaC1y phaC2 Los genes phaC1 y phaC2 codifican para las proteínas sintasas, las dos polimerasas hacen parte de la subfamilia de las α/β hidrolasas catalizan la condensación de (R) 3-hidroxiacetilCoA cuyas cadenas poseen de C5 a C14 átomos ambas enzimas son similares en secuencia de aminoácidos (alrededor del 50%), poseen los mismos 8 residuos conservados y el motivo de la caja lipasa [GX (C)XG]; también se observa que comparten la misma especificidad del sustrato (Madison and Huisman, 1999). La existencia de dos polimerasas en el mismo microorganismo probablemente por consecuencia de la duplicación de genes representa un evento interesante en la evolución que podría haber contribuido a la transición bioquímica de

55

PHBs que solo necesitan una polimerasa a PHAmcl donde ser necesitan de dos polimerasas, aunque se necesitan más estudios para confirmar esta hipótesis 6.4 .1.1 Análisis de estructura primaria Una vez se obtuvieron las secuencias, se ensamblaron con ayuda del programa Cap3 (Anexo 4) y también se realizó manualmente con ayuda del programa CLUSTALW2 alineando todas los duplicados de las secuencias forward con el complemento reverso de las secuencias reverse, se realizó una edición teniendo en cuenta solamente los duplicados de cada fragmento, para disminuir posibles errores al momento de la secuenciación, la secuencia resultante se llevó al programa ORF- Finder con la aplicación de código genético bacteriano, para encontrar el marco abierto de lectura, como estos genes se encuentra de manera positiva a la transcripción se buscaron los ORFs positivos (Anexo 5).

Secuencias de aminoácidos resultantes >S1602 PhaC1 MSNKSNDECPYQASETTLGLNPVVGLRGKDLLASARMVVTHAITQRIHSVKQITLFGIDLKNVLFGKSKLQPAGDDRRF VDPAWSQNPLYKRYLQTYLAWRKELHAWIDDSSLSPKDIARGHFVINLMTEAMAPTNTAANPAAVKRFFETGGKSLLD GLSHLAKDLVHNGGMPSQVNMGAFEVGKTLGVSEGSVVFRNDVLELIQYKPITEQVHERPLLVVPPQINKFYVFDLSP DKSLARFCLRNNVQTFIVSWRNPTKEQREWGLSTYIEALKEAVDVVTAITGSKDVNMLGACSGGITCTALLGHYAATG ENKVNALTLLVSVLDTTLDSDVALFFDEQTLEMTKRHSYQAGVLEGKDMAKVFTWMRPNDLIWNYWVNTYLLGNEPP VFDILFWNKDTTRAPAMFHGDLIEMFKNKPLTLPDALEECGTPINLKKGSPEIFSLADATDHTSPWKSCYKSAQPFCGK VEFLLSSTGHIQSILNPPGNPKSRDTTSEEKTAKIDDWQKKSTKHADSWRLPWQAWQGERSGELKKAPRKLGSTGYL AGESSPGALVHAR >S1602 PhaC2 MRDKPATGVVPSPAVFINAQSAMTGLRGRDLISTLRSVAAHGLRNPIHSAKHALKLGGALGRVLLGETLHPTNPNDSR FADPAWSLNPFYRRSLQAYLSWQKQVKSWIDESSMSDDDRARAHFAFSLINDAVAPSNTLLNPLAIKELFNSGGHSLV RGLSHLFDDLLHNDGLPRQVTKQAFEVGKTVATTTGSVVFRNELLELIQYKPMSEKQYSKPLLVVPPQINKYYIFDLSP SNSFVQFALKNGLQTFMISWRNPDVRHREWGLSTYVEAVEEAMNICRAITGAREVNLMGACAGGLTIAALQGHLQAK RQLRRVSSATYLVSLLDSQIDSPATLFADEQTLEAAKRRSYQKGVLDGRDMAKVFAWMRPNDLIWSYFVNNYLLGKE PPAFDILYWNNDSTRLPAAFHGDLLDFFKHNPLIHPGGLEVCGTPIDLQKVTVDSFSVAGMNDHITPWDAVYRSTLLLG GERRFVLSNSGHVQSILNPPSNPKATYVENGKLSSDPRAWYYDAKKVDGSWWPQWLEWVQQRSGTLRETQMALG NANYPPMEAAPGTYVRVR

Se obtuvo la secuencia de nucleótidos (ANEXO 6) que dio como resultado una secuencia en el gen phaC1 de 1680 pb con una secuencia de 559 aminoácidos y en el gen phaC2 una secuencia de 1683 pb con una secuencia resultante de 560 aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos fueron llevadas al programa de alineamiento local frente a las bases de datos BLASTP, para comprobar que fueran las secuencias esperadas. Los resultados arrojados en BLASTP comprueban que la secuencia de 559 aminoácidos de la cepa nativa de la proteína PhaC1 corresponde a las secuencias reportadas de proteínas sintasa I (PHAC1) , de los 100 hits arrojados, los primeros 50 corresponden a la proteína sintasa I en su mayoría del genero Pseudomonas (48/50) estos hits muestran un porcentaje de identidad de (88% a 70 %), todos presentan un E-value (0.0), y el porcentaje de área de cubrimiento es del 100% en todos ellos, estos datos indican que la proteína PHAC1 de la cepa S1602 presenta un

56

alto grado de similaridad a las reportadas en las bases de datos y claramente son homologas (Anexo 7). En cuanto a la secuencia de 560 aminoácidos correspondiente a la cepa S1602 se comprobó también por medio de BLASTP que la secuencia corresponde a la proteína de las sintasa PhaC2 de las secuencias reportadas en esta base de datos, de los 100 hits mostrados se observaron los primeros 50 correspondieron todos a secuencias de la proteína PhaC2 en su mayoría del género Pseudomonas (48/50) el porcentaje de identidad va desde 71% hasta 96%, con un E. value de 0.0 y con un porcentaje de cubrimiento de secuencia de 97% (2 hits) y 100% en el resto , lo que comprueba su alta similaridad a las secuencias reportadas (Anexo 7), los otros hits restantes de los 100 correspondieron en su mayoría a la proteína de la sintasa PhaC1 con un porcentaje de identidad del 55% al 58 %, lo que es acorde con las referencias reportadas que afirman que su porcentaje de similaridad varia entre un 50 y 60% (Madison and Huisman, 1999) esto a su vez, se comprobó con un alineamiento de las los secuencias de las sintasas (PhaC1 y PhaC2) de la cepa S1602 y que arrojo un porcentaje de similaridad de 50%. Para la búsqueda de los residuos conservados de las sintasas se realizó un alineamiento múltiple con CLUSTALW2 utilizando los parámetros por defecto en donde se alineó la secuencia de la cepa S1602 y las 6 cepas escogidas en la base de datos del GenBank (Tabla 7). En la secuencia de PhaC1 se observó que la proteína de S1602 presenta los 8 residuos estrictamente conservados, también se evidencio la caja lipasa característica en donde se observó que la serina es cambiada por cisteína como reporta la literatura que afirma que la sintasa presenta este tipo de cambio puntual [GX(C)XG] (Rehm et al., 2002; Amara and Rehm,2003; Jia et al., 2000), la secuencia del motivo resultante de la caja lipasa en la cepa S1602 fue [GA (C)SG], lo que comprueba que el motivo se mantiene en la cepa nativa (Figura 22). En la secuencia PhaC2 se encontraron los mismos resultados que en la sintasa I (PhaC1) a diferencia que en el motivo de la caja lipasa la serina que se encuentra después de la cisteína es reemplazada por una alanina [GA (C) AG] , esto representa un cambio entre un aminoácido polar por uno apolar sin embargo no se ha comprobado experimentalmente el papel que juegan los aminoácidos que se encuentran inmediatamente antes y después de la cisteína en la caja lipasa (Figura 23). Aunque no se ha dilucidado la función exacta de los 8 residuos conservados, si se afirma que la triada catalítica compuesta de (Cys-Asp-His) se encuentra en el corazón de la estructura de todos los modelos tridimensionales generados para la PHA sintasas, aunque la estructura terciaria de las sintasas solo se ha obtenido por simulación con otras proteínas (No se ha realizado cristalografía) si se conoce la función por mutaciones dirigidas de cada aminoácido de la triada, se afirma que el aminoácido que realiza la función catalítica en si es la cisteína, y que el acido aspártico y la histidina le dan estabilidad al complejo, se conoce también el papel del triptófano que actúa directamente en la interacción Proteina-Proteina (Rehm et al., 2002; Amara and Rehm,2003; Jia et al., 2000).

57

Figura 22. Alineamiento con CLUSTALW2 de la secuencia de aminoácidos de la proteína sintasa PhaC1 en la cepa S1602 frente a 6 secuencias reportadas en las bases de datos todas del genero Pseudomonas. Se resaltan los 8 residuos estrictamente conservados (S1602: S 238; C296; G299; D 328; W 397; D 451; G478; H479). Los residuos resaltados en rosado son los pertenecientes a la triada catalítica (C238; D 451; H479) La región subrayada con azul representa el motivo de la caja lipasa [GA(C)SG] residuos 294-298.

58

Figura 23. Alineamiento con CLUSTALW2 de la secuencia de aminoácidos de la proteína sintasa PHAC2 en la cepa S1602 frente a 6 secuencias reportadas en las bases de datos todas del genero Pseudomonas. Se resaltan los 8 residuos estrictamente conservados (S1602: S 230; C296; G299; D 329; W 398; D 452; G479; H480). Los residuos resaltados en rosado son los pertenecientes a la triada catalítica (C296; D 452; H480) La región subrayada con azul representa el motivo de la caja lipasa [GA (C) AG] residuos 294-298.

59

En cuanto a la similaridad de la secuencia respecto a la especie de Pseudomonas se encontró que en las dos proteínas PhaC1 y PhaC2 la similaridad fue siempre más alta con la cepa de referencia perteneciente a Pseudomonas fluorecens esto se comprobó también cuando en el alineamiento con BLASTP el primer hit fue con la cepa Pseudomonas fluorescens Pf0-1 en las dos proteínas y en general los primeros siempre correspondieron a esta especie, cuando se utilizó esta aplicación se definió como parámetro buscar en proteínas no redundantes, sin embargo no se utilizó la opción de poner un grupo de microorganismos en especial para el alineamiento sino que el alineamiento se realizó frente a todos los microorganismos reportados, el hecho de que las secuencias de la cepa nativa muestre hits en su mayoría con el género Pseudomonas y que correspondan a las proteínas esperadas, demuestra que la calidad de las secuencias es la adecuada para este tipo de análisis. Debido a este resultado se decidió realizar un alineamiento múltiple utilizando CLUSTALW2 con las 6 cepas de Pseudomonas antes escogidas (Tabla 7) y una cepa del género Burkholderia ya que según Revelo, 2005 la cepa S1602 pertenece a este ultimo , sin embargo los datos del alineamiento arrojaron que tanto las secuencia PhaC1 y PhaC2 presentan un porcentaje de similaridad mayor con la especie de Pseudomonas fluorecens que con la del genero Burkholderia así, la secuencia S1602 PhaC1 presento un porcentaje de similaridad de 88% con Pseudomonas fluorecens y de 78% con el género Burkholderia, y la secuencia de S1602 PhaC2 presento con Pseudomonas fluorecens un porcentaje de similaridad del 96% y con Burkholderia de 79%. Lo que demuestra en general que en cuanto a las secuencias de las proteínas sintasas se refiere la cepa S1602 se acerca mucho más a las secuencias del género Pseudomonas que al género Burkholderia sp. Para realizar un acercamiento filogenético de los genes phaC1 y phaC2 productores de sintasa I y II respectivamente de PHAmcl se realizó un alineamiento múltiple con CLUSTALW2 que incluyo las 6 cepas escogidas en las bases de datos del Gen Bank (P. fluorecens, P chlororaphis. P. putida, P. entomophila, P. aeruginosa LESB58 y P. aeruginosa PAO1) una cepa del genero Burkholderia, además de la secuencia del mismo gen de una cepa de Alcanivorax borkumensis como control externo. A partir de dicho alineamiento se elaboro un dendograma con el programa MEGA 4.0 utilizando el método de agrupamiento Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap los dendograma obtenidos se muestran en la figura 24 y 25. Como se observa en los dos dendogramas la cepa S1602 se agrupa con Pseudomonas fluorecens teniendo un puntaje en esta cepa en secuencia de PhaC1 de 99% y en la secuencia PhaC2 de 100%.

60

Figura 24. Dendograma del gen phaC1 en la cepa S1602. Obtenido por el programa MEGA 4.0 utilizando el modo de agrupamiento Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap.

Figura 25. Dendograma del gen phaC2 en la cepa S1602. Obtenido por el programa MEGA 4.0 utilizando el modo de agrupamiento Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap

Para aumentar la certeza de los genes predichos se analizaron las secuencias PhaC1 y PhaC2 correspondiente en busca de dominios proteicos que revelara la familia a la que pertenece, para ello se tomo la secuencia de aminoácidos obtenida de la secuencia nucleotídica y se utilizó la base de datos de dominios proteicos CDD (Coserved Domains Database) usando la aplicación RPS-BLAST. Esta herramienta arrojo en las dos secuencias la presencia de dos dominios conservados el primero (phaC_N) correspondiente a la superfamilia (pfam07167), que representa la región Nterminal de los microorganismos que producen polihidroxialcanoatos, la PhaC une monómeros de 3-hidroxibutiril-CoA para formar polímeros por la formación de un enlace ester, aunque la región N terminal de esta enzima no es muy estudiada si se han hecho estudios es donde

61

realizan deleciones de este segmento y los resultados mostraron que la composición del polímero se ve afectada ya que esta región puede estar relacionada con la especificidad del sustrato, esto se puede deber al cambio de configuración de la enzima que afecta directamente la relación con el sustrato, además se observa un cambio de polaridad que contribuye al mismo fenómeno (Ziqiang Ye et al.,2008).El segundo dominio conservado encontrado, corresponde a la superfamilia de las α/β hidrolasas (pfam00561), involucra en la función de la catálisis covalente, dos grupos tiol provistos por los residuos conservados de la cisteína, esta familia conserva la triada catalítica compuesta por (Cys-Asp-His) en donde la cisteína cumple el papel del aminoácido catalítica y el aspartato y la histidina dan estabilidad a la unión de la proteína al sustrato (Figura 26). También se muestran los multidominios pertenecientes a los tres tipos de sintasa lo que es coherente ya que estas son similares entre si y cumplen la misma función, en general se observaron e-Values que oscilaron entre < 8.78e-143 a 8.04e-04, lo que aumenta la confiabilidad en el resultado (Figura 26).

62

Figura 26. Dominios proteicos encontrados con RPS-BLAST en las secuencias traducidas en los genes potenciales phaC1(A) y phaC2 (B) en la cepa S1602.

63

6.4 .1.2 Análisis de estructura secundaria Aunque hay una fuerte relación entre la composición de aminoácidos de una proteína y su clase estructural, usualmente una predicción de clase es demasiado general. La técnica computacional que proporciona el científico con información adicional de topología se llama predicción de estructura secundaria. Esta predicción de estructura secundaria es simplemente una secuencia de estados de estructura secundaria, por ejemplo, H significa hélice, E significa cadena, que corresponden a la secuencia de la proteína (Conklin, 2000). La formación de las estructuras secundarias de las proteínas se debe al plegamiento regular local entre los residuos aminoacídicos cercanos de la cadena polipeptídica. Se adopta gracias a la formación de enlaces de hidrógeno entre las cadenas laterales (radicales) de aminoácidos cercanos en la cadena, los métodos de predicción de estas estructuras se basan en el alineamiento múltiple de las sintasas, se reporta que al menos el 72% de ellas poseen (39,9%) de α- hélice, (10,4%) de β-plegada y (49,7%) de giros variables, sin embargo la evidencia experimental muestra ligeros cambios entre las sintasas en cuanto a este tipo de estructura, por ejemplo Pseudomonas sp USM 4–55. Presenta un 41.3% de α- hélice, un 12,4% de β-plegada y (46.3%) de giros variables, por lo tanto se sugiere que las sintasas tienen una estructura mixta entre ellas respecto a la predicción de la estructura secundaria (Rehm, 2003). La región correspondiente al dominio de las α/β hidrolasas no presenta ningún patrón establecido de αHelice y de β-plegada (Wanab et al., 2006). Se utilizó el programa PSI-PRED (http://bioinf4.cs.ucl.ac.uk) para predecir la estructura secundaria de PhaC1 y PhaC2 (Figura 27 y 28). Los resultados de este análisis, mostraron que la secuencia de PhaC1 presenta un 51.3 % de α- hélice, 12.2 % de β -plegada y 36.5 % de giros variables, y la secuencia PhaC2 presento un 53.2% de α- hélice, 11.3 % deβ -plegada y 35 % de giros variables, a su vez en las dos secuencias la caja lipasa no presento una conformación establecida acorde con lo reportado, se observó que la región del aminoácido 1 aproximadamente hasta el aminoácido 170 no presento ninguna representación deβ -plegada, se busco en la literatura y observamos el mismo fenómeno (Wanab et al., 2006). Aunque se conservó la tendencia en los porcentajes si se observaron ciertas diferencias en la predicción de la estructura, que se pueden atribuir a que las sintasa aunque presentan una especificidad a cierto tipo de sustratos estos sustratos son amplios y se sugiere que esto le da esa flexibilidad requerida.

64

Figura 27. Predicción de estructura secundaria usando PSI-PRED de la proteína PhaC1 de la cepa S1602, la caja lipasa box está encerrada en un recuadro en donde se observa que no tiene un perfil especifico.

65

Figura 28. Predicción de estructura secundaria usando PSI-PRED de la proteína PhaC2, la caja lipasa box está encerrada en un recuadro en donde se observa que no tiene un perfil especifico.

66

6.4.2 Genes phaD, phaF y PhaI Después del gen phaC2 se encuentra el gen phaD, de la función de este gen no se conoce mucho, sin embargo se estudio la función de este mutándolo en la cepa P. oleovorans, se observó que juega un papel importante en cuanto a la biosíntesis de PHAmcl se observaron varios efectos sobre la acumulación del polímero, se redujo la producción de PHA a menos del 20% (Klinke et al., 2000), a su vez el tamaño del gránulo y el número de gránulos por célula también disminuyo. Algunos autores afirman que este gen participa en la codificación de una proteína fascina sin embargo otros autores niegan esta afirmación, sin embargo proponen que la proteína codificada por el gen phaD actúan por medio de un mecanismo no conocido previniendo la expresión o unión de las proteínas del gránulo como PhaI. Se ha propuesto que, si bien PhaF parece ser un represor de los genes phaC1ZC2 y del gen PhaI, PhaD actúa a diferencia de la proteínas TetR, como activador del gen PhaI (Klinke et al., 2000). Sin embargo también se propone que PhaD es una proteína reguladora que activa la síntesis de PhaF y PhaI. En cuanto a phaF conocida como fascina actuaria como: un elemento estructural que se necesita para la elongación del polímero (interacción polímero-proteína, PHA-PhaF), como un activador transcripcional de phaC1 (interacción ADN-proteína, PcI-PhaF), o como potenciador de la actividad de la polimerasa (PhaC1-PhaF). De esta manera se propone que PhaF desempeña una doble función: una función estructural en función de la unión PHA con un motivo en la parte N-terminal, a su vez esta secuencia es similar a la que se encuentra en la proteína PhaI y que facilita su fijación a los gránulos de PHA (Prieto et al., 1999), y una función de regulación mediante la existencia en la región C-terminal que presenta una secuencia similar a proteínas similares a histonas H1 (Figura 8). La otra fascina PhaI es la otra proteína asociada al gránulo contrarrestando el efecto causado por PhaF cuando los genes phaI y phaF son coexpresados, esto sugiere que PhaI tiene una función regulatoria (represor de phaF). Sin embargo este efecto negativo solo se produce en ausencia de PhaD, sugiriendo que PhaD compite con PhaI por el promotor de PhaF (pf), sin embargo PhaD presenta mayor afinidad que PhaI. De esta manera cuando las proteínas (PhaD y PhaI) están presentes , la PhaD podría facilitar la transcripción de phaF y phaI, y por lo tanto las proteínas PhaI y phaF se adjuntarían al polímero naciente(Prieto et al., 1999; Klinke et al., 2000),teniendo en cuenta que en la presencia de PhaI los efectos estimulantes para la síntesis de PHA por PhaF no son observados, se podría especular que cuando las dos proteínas (PhaF y PhaI) son sintetizadas ( en presencia de phaD), PhaI podría interactuar con PhaF en la superficie del gránulo, previniendo los efectos reguladores causados por PHA-PhaF causando un aumento peligroso del volumen celular (Sandoval et al., 2007). El cluster de PHAs es un grupo de genes que se encuentran perfectamente organizados, los genes phaC1 y phaC2 son los responsables de la polimerización, phaZ es la depolimerasa,

67

phaD es un gen que codifica como control de los genes phaF y phaI, estos dos últimos son los responsables de la estabilización del gránulo. Se realizo el mismo protocolo de bioinformática que los genes phaC1 y phaC2, se ensamblaron las secuencias, se encontraron los ORF´, se compararon las secuencias con las disponibles en las bases de datos por medio de BLASTP y CLUSTALW2, se llevaron las secuencias a RPSBLAST para encontrar dominios y se realizo un dendograma con el programa MEGA 4.0. >S1602 PhaD MKTSERILECALQLFNEKGEPNVSTMEVANEMGISPGNLYYHFHGKEPLILGLFERFQSELAPLLDPPAAVDSVNXXH WLFLHLITTEPPPKSLFQDLSNLAGRLPKLAKGIRNFLNVLKRTLASLLARLKASGQLVSDTQALGQLVEQITMTLLFSLD YQRILDREGEVRLVVYQIMMLVAPHLLPPVKVATERMALQYLEDHE >S1602 PhaF MAGKKKSEKESSWIGEIEKYSRQIGWLKNLTLIKFECFXLAPALLPPAGDGEKAEKLTKAAVGKKVDAAKDTASSAKSRI SGVKDRALGTWDQLEGAFDKRLNSAISRLGVPSRNEVKDLHKKVDTLTKQIEKLTGLKTQPVAAKTAAAKPAAKPAAK PLAKAAAKPAAKPAAKTAAAKPAVKAAAKPVAAKAAAKPAAKPAAKPAAKTAAAKPAAKPAAKPAAAKKPAVKKPAAP KAAAPKAAAPKPVTTPQALASTSNSASAPTPAPVSTVVSTPSTPTSQS >S1602 PhaI MAKVILKKKTVSESTSLVSEIRHYARQIWLAGLGAYSRLGTEGSDYFKELVKAGEALEKKGKSLVTSQVDSANDSVKTG LSSVKGKVVDQLDRIEQAFDSRVASTLNRIGIPSRNDVEALSAKLDELSAVLERVARTQ

Se obtuvieron los tres ORF´s (Anexo 5) de los tres genes, que dieron como resultado una secuencia en el gen phaD de 618 pb (Anexo 6) con una secuencia de 205 aminoácidos, en el gen phaF una secuencia de 855 pb con una secuencia resultante de 284 aminoácidos y en el gen phaI de 618 pb con una secuencia de 205 aminoácidos, es importante anotar que en los genes phaF y phaI se escogieron los ORF´s en sentido negativo ya que estos se transcriben en sentido contrario de los genes del cluster. Las secuencias de aminoácidos fueron llevadas al programa de alineamiento local frente a las bases de datos BLASTP, para comprobar que fueran las secuencias esperadas. Los resultados arrojados en BLASTP comprueban que la secuencia de 618 aminoácidos de la cepa nativa de la proteína PhaD corresponde a las secuencias reportadas de proteínas PhaD, los 100 hits mostrados todos corresponden a la proteína correspondiente a un regulador transcripcional de la familia TetR (The tetracycline resistance repress) el mecanismo de proteína no está bien dilucidado sin embargo se afirma que PhaD actúa a diferencia de la proteínas TetR, como activador del gen PhaI (Klinke et al., 2000). Otros proponen que PhaD es una proteína reguladora que activa la síntesis de PhaF y PhaI. De los 100 hits mostrados los 50 primeros en su mayoría pertenecen al género Pseudomonas 43/100 y los restantes al género Acinetobacter, el porcentaje de similaridad fue desde 76.6% hasta 37% con un e-value que se ubico entre 1e-83 y 8e-39, estos resultados afirman que la secuencia pertenece a esta proteina y al género Pseudomonas , ya que aunque se puso a comparar contra las proteínas no redundantes (Nr) no se especifico un grupo de microorganismos en especial y la aparición de otros géneros se explica desde el punto de vista que este gen está presente en muchos microorganismos y esta secuencia pertenece a la familia TetR a la cual están asociados multidominios asociados a control de resistencia a muchos antibióticos. (Anexo 7).

68

En el alineamiento múltiple con CLUSTALW2 se incluyeron las secuencias escogidas del genero Pseusomonas (Tabla 7), además de incluir la secuencia de Burkholderia pseudomallei ya que la cepa S1602 según Revelo, 2005 correspondía a una Burkholderia y la secuencia de la bacteria Alcanivorax borkumensis como grupo externo. Los resultados arrojaron que la cepa S1602 presento un porcentaje de similaridad de 90% con la cepa P, fluorecens y de 84 a 67% con las otras Pseudomonas, con la cepa de B. caryophylly se obtuvo una similaridad tan solo del 29% lo que indica se lejanía en cuanto a este gen del genero. A partir del alineamiento se elaboro un dendograma con el programa MEGA 4.0 utilizando el método de agrupamiento Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap (Figura 29). Los datos obtenidos reflejaron lo observado en el alineamiento múltiple donde se ve claramente que la cepa S1602 se agrupa en el mismo lugar que la cepa P.fluorecens y muy lejos de la cepa B. pseudomallei.

Figura 29. Dendograma del gen phaD obtenido por el programa MEGA 4.0 utilizando el Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap.

La búsqueda de dominios proteicos con RPS-BLAST arrojo la presencia de un dominio TetR_N (PF00440), esta entrada representa un dominio de unión al ADN con una estructura hélice-girohélice (HTH) se encuentra en varios reguladores de la transcripción de bacterias y arqueas, como TetR, el represor resistencia a la tetraciclina, también se encontró la presencia de un multidominio AcrR que cumple la misma función (Figura 30).

69

Figura 30. Dominios proteicos encontrados con RPS-BLAST en las secuencias traducidas del gen phaD en la cepa S1602.

El análisis de la estructura secundaria de esta secuencia arrojo datos muy interesantes, primero presenta un 78% de conformación α -hélice y 22 % de giros variables y no presenta ninguna conformación de β-plegada, segundo la presencia de 10 α-hélices en este dominio, y tercero según lo reportado esta conformación es la típica del dominio TetR, además concuerda con los dominios de unión al ADN con función de regulación de la transcripción y que se denominan HTH (helix-turn-helix) precisamente por esta conformación. La parte del dominio asociada con la unión al ADN corresponde a las 3 primeras hélices de la región N-terminal este se encuentra representado en la figura 31(Sandoval et al 2007).

Figura 31. Predicción de estructura secundaria usando PSI-PRED de la proteína PhaD de la cepa S1602, los números dentro de las α-hélices representan las diez que son reportadas y la parte subrayada con naranja es el sitio de unión al ADN.

70

PhaF y PhaI El análisis de la secuencia de 284 aminoácidos de la cepa S1602 por BLASTP arrojo que corresponde a las secuencias reportadas de proteínas PhaF o fascinas o proteínas asociadas a la estabilización del granulo. De los 41 hits mostrados 35 corresponden a la proteína esperada y de estos 31 corresponden a la proteína PhaF del género Pseudomonas, con un porcentaje de similaridad de 77% a 56% y un e-value de 9e-36 a 1e-53, estos resultados confirman que la secuencia de la cepa S1602 corresponde a la proteína fascina (Prieto et al., 1999; Klinke et al., 2000) (Anexo7). En el alineamiento múltiple con CLUSTALW2 se incluyeron las secuencias escogidas del genero Pseudomonas (Tabla 7), además de incluir la secuencia de Burkholderia pseudomallei y la secuencia de la bacteria Aeromonas salmonicida como grupo externo, los resultados arrojados muestran un porcentaje de similaridad con las Pseudomonas del 59% a 84% siendo el más bajo con P. putida y el más alto con P. fluorecens. A partir del alineamiento se elaboro un dendograma con el programa MEGA 4.0 utilizando el método de agrupamiento Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap (Figura 32). Los datos obtenidos reflejaron lo observado en el alineamiento múltiple donde se ve claramente que la cepa S1602 se agrupa en el mismo cluster que la cepa P. fluorecens y que P. chlororaphis. Sin embargo el porcentaje de similaridad es más alto con P. fluorecens.

Figura 32. Dendograma del gen phaF obtenido por el programa MEGA 4.0 utilizando el modo de agrupamiento Neighborg Joning con 5000 repeticiones- bootstrap.

El análisis de la estructura primaria del gen phaF muestra que codifica una proteína similar a histonas H1 que juega un doble papel en el cluster de PHA, primero actúa como estabilizador del granulo junto a PhaI y segundo como una proteína represora de phaC1 impidiendo su transcripción, la porción N-terminal de la proteína (1aa-142aa) está asociado a la estabilización del granulo, mientras que la región C-terminal está relacionada con la regulación de la transcripción del gen que codifica la sintasa (phaC1/phaC2) y que la unión al ADN está relacionada con la presencia de un motivo AAKP que se puede repetir de 9 a 21 veces y que es típico de las proteínas de unión al ADN tipo histonas (Luengo et al., 2003; Prieto et al., 1999), para comprobar lo dicho anteriormente se alineo con CLUSTALW2 los primeros 142

71

aminoácidos de la proteína phaF de la cepa S1602 que corresponden a la parte N- terminal de la proteína con la secuencia de la proteína PhaI de la cepa S1602 y la misma parte de la secuencia de la proteína PhaF de la cepa de referencia P. fluorecens con la secuencia PhaI de la misma cepa (Figura 33) , se observo que las secuencias de las proteínas PhaF y PhaI de la cepa S1602 tienen un porcentaje de similaridad del 33% (Figura 33),a su vez las de la cepas de referencia P. fluorecens presentaron un porcentaje de similaridad de 38% , lo que significa que los resultados entre las cepas son parecidos, sin embargo estudios anteriores muestra que la similaridad se encuentra aproximadamente en un 50 % , aunque con la cepa nativa dio solo un porcentaje de 33% no se diferencia mucho de la cepa de referencia que obtuvo 38% lo que nos hace pensar que las dos proteínas (la parte N-terminal de la proteína PhaF y la proteína PhaI ) tienen funciones similares, en este caso la estabilización del granulo(Prieto et al., 1999). Además se observo en la parte C-terminal de la proteína PhaF de la cepa de referencia Pseudomonas fluorecens y la cepa nativa S1602 las repeticiones AAKP, la cepa de referencia mostró en total doce repeticiones y la cepa nativa S1602 13 repeticiones del motivo AAKP (Figura 33).

Figura 33. Alineamiento de la parte N-terminal y C-terminal de la proteína PhaF y la proteína PhaI. A) Alineamiento de la región N-terminal de la proteína PhaF y la proteína PhaI en la cepa S1602 y la cepa de referencia P. fluorecens por medio de CLUSTALW2; B) Alineamiento de la región C-terminal de la proteína PhaF de la cepa s1602 con la cepa de referencia P. fluorecens por medio de CLUSTALW2, las secciones en azul representan las repeticiones AAKP que se encuentran en la misma posición en el alineamiento en la cepa de referencia y la cepa nativa , las líneas rojas son repeticiones AAKP pero que se encuentra solo en una de las dos cepas, además cada repetición AAKP se encuentra numerada.

72

La búsqueda de dominios de la proteína PhaF arrojo como resultado el dominio correspondiente a la fascina (pfam05597), donde especifica las dos funciones mencionadas anteriormente, y la proteína PhaI arrojo el mismo dominio (Figura 34) .

Figura 34. Dominios proteicos encontrados con RPS-BLAST en las secuencias traducidas del gen phaF (A) y el gen phaI en la cepa S1602 (B).

Por medio de esta metodología se logro amplificar los fragmentos y ensamblarlos obteniendo las secuencias de los genes y analizándolos logrando datos importantes, es importante anotar que se analizaron los genes de las sintasas (phaC1, phaC2) y los genes reguladores y de las fascinas (phaD, phaF, phaI), sin embargo con el gen phaZ correspondiente a la polimerasa que se encuentra dividiendo las dos sintasas se tuvo problemas al momento de observar la calidad de las secuencias, esta región específicamente se cubrió con dos parejas la 2 y la 11, esta ultima tuvo buena calidad de la secuencia cuando se trabajo con la parte reverse pero la parte correspondiente al forward no se logro tener la calidad de secuencia esperada, a su vez como en la pareja 2 hubo siempre presencia de inespecificidades la calidad tampoco fue la adecuada. Sin embargo usando la secuencia de la pareja 11 la parte reverse se logro obtener una secuencia de 56 aminoácidos. [MRLLAWRIPNAQLHIIDDGHLFLITRAEAVAPIIMKFLQEERLRAVMHPHPTPLG]

73

Este fragmento se comparo con BLASTP y mostró que pertenecía a la proteína depolimerasa (PhaZ), la proteína tiene una longitud aproximada de 283 aminoácidos, aunque el hecho de encontrar por lo menos los últimos 56 aminoácidos nos muestra que la cepa S1602 tiene la proteína PhaZ y que se encuentra en el mismo sitio del cluster. Por lo tanto la cepa nativa S1602 arrojo datos contundentes que afirman que tiene la misma organización del cluster que la reportada para microorganismos productores de sintasa tipo II (phaC1ZC2DFI) (Figura 35). Además gracias a la amplificación del gen ribosomal 16S se logro clasificar la cepa como Pseudomonas fluorecens, estos datos concuerdan con las pruebas bioquímicas y con los datos de similitud de los genes en donde todos mostraron un porcentaje de similaridad mayor con esta especie.

Figura 35. Organización del cluster de PHA sintasa tipo II de la cepa nativa Pseudomonas fluorecens S1602. Se muestra el orden de los genes dentro del cluster (phaC1, phaZ, phaC2, phaD, phaF, phaI). Las flechas indican el sentido de la transcripción.

74

7. CONCLUSIONES •

Se utilizó una estrategia de diseños de iniciadores que permitió realizar la amplificación de todo el cluster (phaC1, phaZ, phaC2, phaD, phaF, phaI) asociado a la producción de PHAmcl, esta estrategia va de la mano con un manejo adecuado de las herramientas bioinformáticas disponibles. Estos datos ayudan a establecer la organización de la maquinaria genética tanto de genes como de proteínas, y nos permite conocer más de la cepa y de cómo se debe manejar genéticamente en el futuro.

•

Los parámetros de diseño de los iniciadores utilizados en este trabajo fueron adecuados para la amplificación de los fragmentos deseados bajo unas condiciones establecidas, se lograron obtener fragmentos de buena calidad, esto implica obtener productos con buena concentración, específicos y del tamaño esperado. La metodología de PCR desarrollada en esta investigación permitió estandarizar el uso de diferentes parejas de iniciadores para amplificar los genes del cluster tanto en las cepas control como en la cepa nativa S1602, sin embargo la estandarización de la técnica es muy sensible y requiere de muchos ensayos.

•

Se logro clasificar la cepa nativa S1602 dentro de un genero y una especie (Pseudomonas fluorecens) utilizando dos frentes diferentes las pruebas bioquímicas, y la caracterización molecular, esto se plasmo en la producción de fluorescencia, en la amplificación del gen 16s ARNr agrupándose en el mismo cluster del grupo de las Pseudomonas fluorecens, y por los hits obtenidos en los alineamiento de las proteínas producidas por cada uno de los genes del cluster que apuntaban siempre a tener puntajes más altos y mayor porcentaje de similaridad con los microorganismos de este género y especie.

•

El análisis de la secuencias resultantes de la amplificación de los 6 genes dio los resultados esperados en cuanto a la función asignada a cada uno de los mismos, así como es análisis de la estructura primaria y secundaria , los datos obtenidos concuerdan con lo reportado en la literatura, a su vez gracias a la amplificación y el estudio de todos los genes del cluster se comprobó que la cepa nativa Pseudomonas fluorecens S1602 tiene la misma organización de los genes del cluster, que reportan los microorganismos productores de sintasa tipo II.

75

8. RECOMENDACIONES •

Profundizar en estudios de regulación mediante el conocimiento de los segmentos de ADN corriente arriba del gen phaC1 y corriente abajo del gen phaI, con el objeto de encontrar posibles promotores y regiones reguladoras. Además de completar la totalidad de la secuencia correspondiente a la depolimerasa phaZ y realizar el análisis correspondiente.

•

Utilizar la misma metodología para el estudio de las otras cepas nativas escogidas (C14, C16, S1804, S0804, 1G-3*), incluyendo la amplificación por medio de los 19 iniciadores diseñados.

•

Establecer las condiciones de fermentación para la cepa Pseudomonas fluorecens S1602, utilizando aceite como fuente de carbono, optimizando las variables que permitan tener una buena productividad.

•

Iniciar la manipulación genética de la cepa, aprovechando el conocimiento del cluster obtenido en este trabajo. Empezar a realizar estudios de mutaciones sitios específicas que permitan aumentar la productividad y empezar a realizar manipulaciones genéticas en el desarrollo de una cepa recombinante.

76

BIBLIOGRAFÍA

Aldor LL. and Keasling J. 2003. Process design for microbial plastic factories: metabolic engineering of polyhydroxyalkanoates. Current Opinion in biotechnology. 14: 475-483. Amara A. and Rehm B. 2003. Replacement of the catalytic nucleophile Cys-296 by serine in class II polyhydroxyalkanoate synthase from Pseudomonas aeruginosa-mediated synthesis of a new polyester: Identification of catalytic residues. Biochem. J. 374: 413-421. Anderson A. and Dawes E. 1990. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiological reviews. 54(4):450-472. Anzai Y., Kim H., Park J., Wakabayashi H. and Oyaizu H. 2000. Phylogenetic affiliation of the Pseudomonasds based on 16S rRNA sequence. International Journal of Systematic Bacteriology. 50: 15631589. Ayub R., Solaiman D. and Foglia T. 2004. The synthesis of short- and medium-chain-length poly(hydroxyalkanoate) mixtures from glucose-or alkanoic acid- grown Pseudomonas oleovorans. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 28: 147-153. Barbosa M. 2000. Producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) empleando Ralstonia eutropha. Trabajo de grado (Ingeniería Química). Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ingeniería. Bogotá. Barbosa M., Espinosa A., Malagón D. y Sarmiento N. 2005. Universitas Scientiarum. 10 (1):45-54. Barbosa M. 2002. Producción de polihidroxialcanoatos (PHAS) empleando Ralstonia eutropha. Tesis para optar al título de Ingeniero Químico. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química. Berger E., Ramsay B., Ramsay J., Chaverie C. and Braunegg G. 1989. PHB recovery by hypochlorite digestion of non-PHB biomass. Biotechnol. Tech. 3: 227-232. Braunegg G., Lefebvre G. and Genser K. 1998. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects. Journal of Biotechnology. 65: 127-161.

77

Chen G., Zhang G., Park S. and Lee S. 2001. Industrial scale production of poly(3hydroxybutyrate-co-β-hydroxyhexanoate). Appl Microbiol Biotechnol . 57:50-55. Choi J., Lee S. and Han K. 1998. Clonning of the Alcaligenes latus Polyhydroxyalkanoate Biosynthesis Genes and Use of These Genes for Enhanced Production of Poly(3.hydroxybutyrate) in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 64: 48974903. Chung D., Choi M., Song J., Yoon S., Kang I. and Huh N. 2001. Intracellular degradation of two structurally different polyhydroxyalkanoic acids accumulated in Pseudomonas putida and Pseudomonas citronellolis from mixtures of octanoic acid and 5-phenylvaleric acid. Int J Biol Macromol 29:243–250. Córdoba A. y Vega G. 2006. Caracterización físico-química, mecánica y determinación de la biodegradabilidad de un polímero de la familia de los polihidroxialcanoatos. Tesis para optar al título de Ingeniero Químico. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química. De Eugenio LI., Garcia P., Luengo J., Sanz J., San Roman J., Garcia J. and Prieto M . 2007. Depolymerase gene from Pseudomonas putida, and characterization of the gene product. depolymerase gene of Pseudomonas stutzeri and analysis of the function of substratebindingdomains. Appl Environ Microbiol 65:189–197. Eversloh T., Bergander K., Luftmann H., and Steinbüchel A. 2001. Identification of a new class of biopolymer: bacteriano synthesis of a sulfur-containing polymer with thioester linkages. Mycrobiology. 147: 11-19. Full T., Jung D. and Madigan M. 2006. Production of poly-β-hydroxyalkanoates from soy molasses oligosaccharides by new, rapidly growing Bacillus species. Letters in Applied Microbiology. 43: 377-384. García B., Olivera E., Sandoval A., Barrau E., Arias S., Naharro G. and Luengo J. 2004. Strategy for cloning large gene assemblages as illustrated using the phenylacetate and polyhydroxyalkanoate gene clusters. Applied and environmental Microbiology. 70(8):5019-5025. Gerngross T., Snell K., Peoples O. and Sinskey A. 1994. Overexpression and Purification of the Soluble Polyhydroxyalkanoate Synthase from Alcaligenes eutrophus: Evidence for a Required Posttranslational Modification for Catalytic Activity. Biochemistry. 33: 9311-9320. Hai S., Chang Y. and Lee S. 2001. Recovery and characterization of poly(3-hydroxybutyric acid) synthesized in Alcaligenis eutrophus and recombinant Escherichia coli. Applied and environmental Microbiology. 61(1):34-39.

78

Hein S., Söhling B., Gottschalk G. and Steinbüchel A. 1997. Biosynthesis of poly(4hydroxybutyric acid) by recombinant strains of Escherichia coli. FEMS Microbiology Letters. 153:411-418. Hezayen F., Steinbüchel A. and Rehm B. 2002. Biochemical and enzymological properties of the polyhydroxybutyrate synthase from the extremely halophilic archaeon strain 56. Archives of Biochemistry and Biophysics. 403: 284–291. Hoffmann N. and Rehm B. 2004. Regulation of polyhydroxyalkanoate biosynthesis in Pseudomonas putida and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Letters. 237:1-7. Hormazabal . 2006. Evidence of medium-chain-length polyhydroxyoctanoate accumulation in transgenic potato lines expressing the Pseudomonas oleovorans Pha-C1 polymerase in the cytoplasm. Biochemical Engineering Journal. 16: 135-143. Huijberts G., Eggink G., de Waard P., Huisman G. and Witholt B .1992. Pseudomonas putida KT2442 cultivated on glucose accumulates poly(3-hydroxyalkanoates) consisting of saturated and unsaturated monomers. Appl Environ Microbiol 58:536–544 James Y., Kappock T., Frick T., Sinskey A. and Stubbe J. 1999. Lipases Provide a New Mechanistic Model for Polyhydroxybutyrate (PHB) Synthases: Characterization of the Functional Residues in Chromatium vinosum PHB Synthase. Biochemistry. 39: 3927-3936. Jendrossek D. and Handrick R. 2002. Microbial degradation of polyhydroxyalkanoates. Annu Rev Jensen, M., Webster, J., Straus, N. 1993. Rapid Identification of Bacteria on the Basis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Ribosomal DNA Spacer Polymorphism. Applied and Enviromental Microbiology. 59: 945-952. Jiang Y., Ye J., Wu H. and Zhang H. 2004 Cloning and expression of the polyhydroxyalkanoate depolymerase gene from Pseudomonas putida, and characterization of the gene product. Biotechnol Lett 26:1585–1588. Kadouri D., Burdman S., Jurkevitch E. and Okon Y. 2002. Identification and Isolation of Genes Involved in Poly(β-Hydroxybuturate) Biosynthesis in Azospirillum brasilense and Characterization of a phbC Mutant. Applied and Enviromental Microbiology. 68: 2943-2949. Kato M., Bao H., Kang C., Fukui T. and Doi Y. 2000. Production of a novel copolyester of 3hydroxybutyric acid and medium-chain-length 3-hydroxyalkanoic acids by Pseudomonas sp. 613 from sugars. Appl. Microbiol. Biotechnol. 45: 363-370. Kim T., Jung Y., Vo M., Shioya S. and Lee Y. 2006. Metabolic engineering and characterization of phaC1 and phaC2 genes from Pseudomonas putida KCTC1639 for overproduction of medium-chain-length polyhiydroxyalkanoate. American Chemical Society and American Institute of Chemical Engineers. Published in web 09/16/2006.

79

Klinke S., Roo G., Witholt B. and Kessler B. 2000. Role of phD in Accumulation of MediumChain-Length Poly(3-Hydroxyalkanoates) in Pseudomonas oleovorans. Applied and Environmental Microbiology. 66: 37053710. Lee S., and Papoutsakis E. 1999. Metabolic engineering. Marcel Dekker, Inc. New York – Basel. P. 113. Lee S., Choi J. and Wong H. 1999. Recent advances in polyhydroxyalkanoate production by bacterial fermentation: mini-review. International Journal of biological macromolecules. 25:3136. Liebergesell M., Hustede E., Timm A., Steinbüchel A., Fuller R., Lenz R. and Schlegel H.1991. Formation of poly(3-hydroxyalkanoates) by phototrophic and chemolithotrophic bacteria. ArchMicrobiol 155:415–421 Luengo J., Garcia B., Sandoval A., Naharro G. and Olivera E .2003. Bioplastics from microorganisms. Curr Opin Biotechnol 6:251–260 Madison L. and Huisman G. 1999. Metabolic engineering of poly(3-hidroxyalkanoates) from DNA to plastic. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63(1):21-53. McCool G. and Cannon M. 2001. PhaC and PhaR are required for polyhydroxyalkanoic acid synthase activity in Bacillus megaterium. J. Bacteriol. 183: 4235-4243. McGuffin LJ., Bryson K. and Jones DT. (2000) The PSIPRED protein structure prediction server. Bioinformatics. 16, 404-405. Moreno L. y Forero M. 2004. Biosíntesis de polímeros biodegradables del tipo poli-βhidroxialcanoatos (PHAs) a partir de cepas nativas. Trabajo de Grado. Facultad de Ingeniería. Departamento de Ingeniería Química. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, D.C. Colombia. Moreno N., Gutiérrez I., Malagón D., Grosso V., Revelo D., Suárez D., González J., Aristizábal F., Espinosa A. and Montoya, D. 2007. Bioprospecting and characterization of poly-bhydroxyalkanoate (PHAs) producing bacteria isolated from Colombian sugarcane producing areas. African Journal of Biotechnology. 6(13):1536 -1543. Müh U., Sinskey A., Kirby D., Lane W. and Stubbe J. 1999. PHA Synthase from Chromatium vinosum: Cysteine 149 Is Involved in Covalent Catalysis. Biochemistry. 38: 826-837 Networks for enhanced blood compatibility. Int J Biol Macromol 32:17–22. Ohura T., Kasuya K. and, Doi Y. 1999. Cloning and characterization of the polyhydroxybutyrate depolymerase gene of Pseudomonas stutzeri and analysis of the function of substrate-binding domains. Appl Environ Microbiol 65:189–197.

80

Ojumo T., Yu J. and Solomon B. 2004. Production of Polyhydroxyalkanoates, a bacterian biodegradable polymer. African Journal of Biotechnology. 3: 18-24. Park S., Park J. and Lee S. 2002. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates rich in specific monomers. FEMS Microbiology Letters. 214:217-222. Prieto M., Buhler B., Jung K., Witholt B. and Kessler B .1999. PhaF, a polyhydroxyalkanoategranule-associated protein of Pseudomonas oleovorans GPo1 involved in the regulatoryexpression system for pha genes. J Bacteriol 181:858–868. Ramsay B., Lomaliza K., Chavarie C., Dubé B., Bataille P. and Ramsay J. 1990. Production of Poly-(β-hydroxybutyric-Co-β-Hydroxyvaleric) Acids. Applied and Environmental Microbiology. 56: 2093-2098. Ramsay B., Langlade V., Carreau P. and Ramsay J. 1993. Biodegradability and mechanical properties of poly-(β-hydroxybutyrate-co-β-hydroxyvalerate)- starch blends. Applied and environmental Microbiology. 59(4):1242-1246. Reddy C. and Rashmi V. 2003. Polyhydroxyalkanoates: an overview Bioresource Technology. 87: 137–146. Rehm B. 2003. Poliéster synthases: natural catalysts for plastics. Biochem. J. 376: 15-33. Rehm B. and Steinbüchel A. 1999. Biochemical and genetic analysis of PHA synthases and other proteins reequires for PHA synthesis. Int J Biol Macromol. 25: 3-19. Rehm B., Krüger N. and Steinbüchel A. 1998. A new metabolic link between fatty acid de novo synthesis and polyhydroxyalkanoic acid synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 273(37): 24044 -24051. Revelo D. M. 2005. Diseño de iniciadores y validación de una metodología molecular para la selección de bacterias de diferentes géneros acumuladoras de polihidroxialcanoatos (PHAs). Tesis para optar al título de Maestría en Ciencias Microbiológicas. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Postgrado Interfacultades de Microbiología. Revelo D., Grosso M., Moreno N. and Montoya, D. 2007. A most effective method for selecting a broad range of short and mediumchain- length polyhidroxyalcanoate producing microorganisms. Electronic Journal of Biotechnology. 10(3):348-357. Rodríguez L. y Serrato M. 2004. Biosíntesis de polímeros biodegradables del tipo poli-βhidroxialcanoatos (PHAs) a partir de cepas nativas. Tesis para optar al título de Ingeniero Químico. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química.

81

Rothermich M., Guerrero R., Lenz R. and Goodwin S. 2000. Characterization, seasonal occurrence,and diel fructuation of poly(hydroxyalkanoate) in photosynthetic microbial mats. ApplEnviron Microbiol 66:4279–4291. Ruge W. y Martínez A. 2005. Generación de una matriz polimérica para aplicación biomédica, utilizando mezclas de poli(3-hidroxibutirato) (PHB) y sustancias biodegradables. Tesis para optar el título de ingeniero químico. Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ingeniería. Sambrook J., Fritsch E. and Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Sandoval A., Arias-Barrau E., Arcos M., Bermejo F., Canedo L., Naharro G., Olivera E. and Luengo J. 2005. Production of 3-hydroxy-n-phenylalkanoic acids by a genetically engineered strain ofPseudomonas putida. Appl Microbiol Biotechnol 67:97–105. Sato S., Nomura C., Abe H., Doi Y. and Tsuge T. 2007. Poly[(R)-3-Hydroxybutyrate] formation in Escherichia coli from Glucose through an Enoyl-CoA hydratase-mediated Pathway. Journal of Bioscience and Bioengineering. 103(1):38–44. Schlegel H., Lafferty R. and Krauss I. 1970. The isolation of mutants not accumulating poly-β- hydroxybutiric acid. Arch. Mikrobiol. 38: 209-222. Steinbüchel A. and Eversloh T. 2003. Metabolic engineering and pathway construction for biotechnological production of relevant polyhydroxyalkanoates in microorganisms. Biochemical Engineering Journal. 16: 81-96. Steinbüchel A. and Lütke-Eversloh T. 2003. Metabolic engineering and pathway construction for biotechnological production of relevant polyhydroxyalkanoates in microorganisms. Biochemical Engineering Journal. 3734:1-16. Sudesh K., Abe H. and Doi Y. 2000. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters.Polymer Chemistry Laboratory. 25: 1503-1555. Suriyamongkol P., Weselake R., Narine S., Moloney M. and Shah S. 2007. Biotechnological approaches for the production of polyhydroxyalkanoates in microorganisms and plants – A review. Biotechnology Advances. 25:148-175. Timm A. and Steinbüchel A. 1992. Cloning and molecular analysis of the poly (3hydroxyalkanoic acid) gene locus of Pseudomonas aeruginosa PAO1. Eur. J. Biochem. 209: 1530. Uribe D.2009. Informe final de proyecto."Evaluación de estrategias de control biológico para el manejo de Rhizoctonia solani y Spongospora subterranea en cultivos de papa". Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural y Asohofrucol.pp 78.

82

Wahab H., Ahmad Khairudin N., Samian M. and Najimudin N. 2006. Sequence analysis and structure prediction of type II Pseudomonas sp. USM 4-55 PHA synthase and an insight into its catalytic mechanism. BioMed Central Structural Biology. 6.(23):2– 14. Wong P., Chua H., Lo W., Lawford, H. and Yu P. 2002. Production of Specific Copolymers of Polyhydroxyalkanoates from Industrial Waste. Applied Biochemistry and Biotechnology. 99 : 641-654. Zhang S., Kolves S., Lenz R. and Goodwin S. 2003. Mechanism of the polymerization reaction initiated and catalyzed by the polyhydroxybutyrate synthase of Ralstonia eutropha. Biomacromolecules. 4: 504-509. Zhao W. and Chen G. 2007. Production and Characterization of terpolyester poly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3-hydroxyhexanoate) by recombinant Aeromonas hydrophila4AK4 harboring genes phaAB. Process Biochem 42:1342–1347.

83

ANEXOS ANEXO 1

Composición de medio de Sales Mínimas Desbalanceado (MSM2) (Ramsay et al., 1990). SUSTANCIA

CANTIDAD

Na2HPO4.7H20

6.7 g

KH2PO4

1.5 g

(NH4)2SO4

1.0 g

MgSO4.7H2O

0.2 g

CaCL2.H2O

10 mg

Citrato de amonio Ferroso

60 mg

Solución de elementos traza*

1 ml

Glucosa

5g

Agua destilada c.s.p.

1000 ml

Caldo nutritivo

15 g

pH ajustado a 7.0 con ácido fosforito al 10 %( p/v)

*Solución de elementos traza H3BO3 CoCL26H2O ZnSO4.7H2O

0.3 g 0.2 g 0.1 g

MnCL2

30 mg

NaMoO4.2H2O

30 mg

NiCl2.6H2O

20 mg

CuSO4.5H2O

10 mg

Agua destilada c.s.p.

1000 ml

84

ANEXO 2 Prueba de especificidad de los iniciadores con MEGABLAST

85

ANEXO 3 Secuencias nucleotídicas conservadas utilizadas para el diseño de los iniciadores

86

ANEXO 4 Ensamblaje de secuencias mediante el programa Cap-3

87

ANEXO 5

Búsqueda de los ORFS Gen phaC1

88

Gen phaC2

Gen phaD

89

Gen phaD

90

Gen phaF

91

Gen phaI

92

ANEXO 6 Secuencia nucleotidicas de los genes del cluster >S1602 phaC1 ATGAGTAACAAGTCGAACGATGAGTGTCCATACCAAGCCTCGGAGACCACCCTGGGGCTGAATCCTGTGGTTGGGCTT CGCGGAAAGGATCTGCTGGCCTCTGCTCGAATGGTGGTGACCCATGCCATCACACAACGGATCCATAGCGTCAAACAG ATCACTCTTTTCGGCATCGACCTGAAGAACGTGCTGTTCGGCAAATCCAAACTGCAACCGGCAGGCGATGACCGTCGC TTTGTCGACCCGGCGTGGAGTCAGAACCCGCTGTACAAACGTTACCTGCAAACCTATCTGGCGTGGCGCAAGGAACTC CATGCCTGGATCGACGACAGCAGCCTCTCGCCCAAGGACATCGCGCGCGGCCACTTCGTGATCAACCTGATGACCGAA GCCATGGCGCCGACCAACACTGCGGCCAACCCGGCGGCGGTCAAACGCTTCTTCGAAACCGGCGGCAAGAGCCTGCTC GACGGCCTCTCGCATCTGGCCAAGGATCTGGTGCACAACGGCGGCATGCCGAGCCAGGTCAACATGGGCGCATTCGAG GTCGGCAAGACCCTGGGCGTGAGCGAAGGCTCGGTGGTGTTTCGCAACGACGTACTGGAGCTGATCCAGTACAAACCG ATCACCGAGCAAGTCCACGAGCGCCCGCTGCTGGTAGTGCCGCCGCAGATCAACAAGTTCTACGTATTCGACCTGAGC CCGGACAAGAGCCTGGCGCGCTTCTGCCTGCGCAACAACGTGCAGACTTTCATCGTCAGCTGGCGCAACCCGACCAAG GAACAGCGCGAGTGGGGCCTCTCGACCTACATCGAAGCCCTGAAGGAAGCGGTCGACGTGGTCACCGCGATCACCGGC AGCAAGGACGTCAACATGCTGGGCGCGTGCTCCGGCGGCATCACCTGCACCGCCCTGCTCGGCCACTACGCCGCCACA GGCGAAAACAAGGTCAATGCCCTGACCCTGCTGGTCAGCGTGCTCGACACCACCCTGGACAGTGACGTCGCCTTGTTT TTCGACGAGCAGACCCTGGAGATGACCAAGCGTCATTCGTATCAGGCCGGCGTGCTGGAAGGCAAAGACATGGCCAAG GTCTTCACGTGGATGCGCCCGAATGACCTGATATGGAACTACTGGGTCAACACCTACCTTTTGGGCAACGAGCCCCCG GTGTTTGACATCCTGTTTTGGAACAAGGATACCACCCGAGCGCCGGCGATGTTCCACGGTGACCTGATCGAAATGTTT AAAAACAAACCACTGACCCTCCCCGATGCACTGGAAGAGTGCGGCACGCCGATAAACCTCAAGAAGGGCTCGCCGGAA ATTTTCTCGCTGGCGGACGCCACAGACCACACCTCACCGTGGAAGTCCTGCTACAAGTCGGCGCAGCCCTTTTGCGGC AAGGTGGAATTCTTGTTGTCCAGCACCGGGCATATCCAGAGCATTTTAAACCCTCCCGGCAACCCGAAATCTCGCGAC ACGACCAGTGAGGAAAAGACCGCCAAAATCGATGACTGGCAGAAAAAATCGACCAAGCACGCGGACTCCTGGCGGCTG CCCTGGCAGGCCTGGCAGGGGGAGCGTTCGGGGGAGTTGAAAAAGGCGCCGCGGAAGCTGGGCAGCACGGGATATCTG GCAGGGGAAAGCTCTCCGGGCGCGTTGGTACACGCGCGGTAA >S1602 phaC2 ATGCGCGACAAACCAGCGACGGGCGTAGTGCCCAGTCCCGCCGTTTTCATCAATGCACAAAGTGCAATGACCGGCCTG CGAGGCCGCGACCTGATTTCGACGTTGCGCAGCGTAGCCGCCCATGGTCTGCGCAACCCCATTCACAGCGCGAAGCAC GCGTTGAAACTCGGTGGTGCGCTCGGACGCGTGCTGCTCGGTGAGACCCTGCATCCGACCAACCCCAATGACAGCCGA TTCGCCGATCCGGCCTGGAGCCTCAATCCGTTCTATCGCCGAAGCCTGCAGGCCTATCTGAGCTGGCAGAAACAGGTG AAGAGCTGGATCGACGAAAGCAGCATGAGCGATGACGATCGCGCCCGTGCGCACTTCGCTTTTTCCCTGATCAACGAC GCCGTGGCGCCCTCCAACACGCTGCTCAATCCACTGGCGATCAAGGAGCTGTTCAACTCCGGCGGCCACAGCCTGGTG CGCGGCTTGAGTCATCTGTTCGATGACCTGCTGCACAACGACGGCCTGCCGCGCCAGGTGACCAAACAGGCTTTCGAA GTCGGCAAGACGGTCGCCACCACGACTGGCTCGGTGGTTTTTCGCAATGAACTGCTGGAGCTGATCCAGTACAAGCCT ATGAGCGAGAAACAGTATTCGAAACCACTGCTGGTGGTGCCACCGCAAATCAACAAGTACTACATTTTCGACCTGAGC CCGAGCAACAGCTTCGTCCAGTTCGCCCTGAAGAACGGCTTGCAGACCTTCATGATCAGTTGGCGCAATCCGGACGTG CGCCATCGCGAATGGGGCCTGTCGACCTACGTCGAGGCCGTGGAAGAAGCGATGAACATCTGCCGGGCGATCACCGGT GCCCGCGAGGTCAACCTGATGGGTGCCTGCGCCGGCGGGCTGACCATCGCTGCGCTGCAGGGGCACTTGCAGGCCAAG CGGCAGTTGCGGCGGGTCTCCAGCGCGACCTATCTGGTGAGCCTGCTCGACAGTCAGATCGACTCCCCGGCCACGCTG TTCGCCGATGAGCAGACCCTCGAAGCGGCCAAGCGCCGTTCCTATCAGAAAGGCGTGCTGGACGGCCGCGACATGGCC AAGGTGTTCGCCTGGATGCGGCCCAACGATCTGATCTGGAGCTACTTCGTCAACAACTACCTGCTGGGCAAGGAGCCG CCGGCGTTCGACATCCTCTACTGGAACAACGACAGCACCCGCCTGCCCGCCGCGTTTCATGGCGACCTGCTGGACTTC TTCAAGCACAACCCGCTGATTCATCCGGGCGGCCTGGAAGTCTGCGGCACGCCGATCGATCTGCAGAAAGTCACGGTC GACAGTTTCAGCGTGGCCGGCATGAACGACCACATCACGCCATGGGACGCGGTGTATCGCTCGACCCTGCTGCTGGGC GGCGAGCGGCGCTTCGTGCTGTCCAACAGCGGCCACGTCCAGAGCATTCTCAACCCGCCGAGTAACCCAAAGGCCACC TACGTCGAAAACGGCAAGCTGAGCAGCGACCCGCGCGCCTGGTACTACGACGCGAAAAAAGTCGACGGCAGCTGGTGG CCGCAGTGGCTGGAATGGGTCCAGCAGCGCTCCGGCACCCTGCGCGAAACCCAGATGGCCCTTGGCAACGCGAACTAT CCACCGATGGAGGCGGCGCCCGGCACTTACGTGCGCGTGCGCTGA

93

>S1602 phaD ATGAAAACAAGCGAACGGATCCTCGAATGTGCCCTGCAGTTGTTCAACGAAAAGGGCGAGCCGAACGTCTCGACCATG GAGGTTGCCAATGAAATGGGGATCAGCCCCGGCAACCTCTACTACCATTTCCACGGCAAGGAGCCGCTGATCCTCGGG CTGTTCGAGCGCTTTCAGAGCGAGCTGGCACCGCTGCTCGACCCGCCTGCGGCTGTAGACTCTGTCAACCNGCANCAC TGGCTGTTCCTGCACCTGATCACAACGGAACCGCCGCCGAAATCACTGTTCCAAGACCTGTCNAACCTGGCCGGGCGC CTGCCGAAACTGGCCAAGGGCATTCGCAACTTTCTCAACGTCCTGAAGCGCACGCTGGCNTCNCTGCTGGCGCGGTTG AAGGCGTCTGGACAGTTGGTCAGTGACACCCAGGCGCTGGGGCAACTGGTGGAACAGATCACCATGACNTTGCTGTTC TCGCTGGACTATCAGCGGATTCTCGATCGCGAGGGGGAAGTGAGGCTGGTGGTGTACCAGATCATGATGCTGGTTGCN CCGCATTTGTTGCCGCCGGTGAAGGTGGCGACGGAGCGGATGGCGCTGCAGTATCTCGAAGATCACGAGTGA >S1602 phaF ATGGCTGGCAAGAAGAAGAGCGAAAAAGAGTCCAGTTGGATCGGCGAGATCGAGAAATACTCSCGGMAGATTGGCTGG CTAAAAAATCTTACTTTGATAAAATTTGAGTGTTTCANGCTTGCGCCTGCCTTGCTCCCTCCCGCAGGAGACGGCGAG AAAGCCGAGAAGCTCACCAAGGCTGCAGTCGGCAAGAAAGTCGATGCTGCCAAGGACACCGCGAGCTCGGCCAAATCG CGCATCAGCGGCGTGAAAGATCGCGCGCTGGGCACCTGGGATCAACTGGAAGGGGCTTTCGACAAGCGCCTGAACAGT GCGATTTCGCGCCTGGGCGTACCGAGCCGCAACGAGGTGAAGGATCTGCACAAGAAGGTCGATACCCTGACCAAGCAG ATCGAGAAACTCACCGGCCTGAAAACCCAACCTGTCGCGGCCAAAACCGCAGCAGCCAAACCGGCGGCAAAACCTGCT GCCAAACCATTGGCTAAAGCTGCCGCCAAACCGGCAGCAAAACCAGCAGCCAAAACCGCTGCGGCCAAGCCAGCAGTA AAAGCCGCAGCCAAACCGGTTGCCGCCAAGGCCGCCGCCAAACCTGCTGCAAAACCAGCGGCCAAGCCAGCAGCGAAA ACCGCTGCAGCCAAACCCGCTGCCAAGCCTGCCGCCAAACCGGCTGCAGCGAAAAAACCTGCAGTGAAAAAACCGGCC GCGCCGAAAGCCGCTGCGCCGAAAGCTGCCGCACCAAAACCGGTGACCACACCGCAAGCACTGGCCAGCACGTCGAAC TCCGCCTCGGCTCCAACCCCGGCGCCAGTATCGACTGTTGTATCGACTCCGTCGACGCCGACCAGTCAGTCCTGA >S1602 PhaI ATGGCCAAAGTGATTCTGAAGAAAAAGACCGTTTCCGAATCCACTTCCCTGGTCTCCGAGATCCGCCACTATGCCCGC CAGATCTGGCTTGCCGGCCTGGGTGCGTATTCCCGCCTGGGCACCGAAGGCAGCGACTACTTCAAGGAATTGGTGAAA GCTGGCGAAGCCCTGGAGAAAAAAGGCAAATCGCTGGTCACAAGTCAGGTCGATTCGGCCAATGACAGTGTCAAGACC GGCCTCTCTTCGGTGAAGGGAAAAGTCGTAGACCAGCTCGACAGGATCGAGCAGGCATTCGACAGCCGTGTCGCTAGC ACGTTGAACCGGATAGGCATCCCTTCCCGGAACGATGTCGAAGCACTCTCTGCTAAGCTGGATGAGCTGAGCGCAGTG CTCGAGCGTGTCGCGAGAACCCAATAA

94

ANEXO 7 Resultados del alineamiento de los genes del cluster con BLASTP Proteína PhaC1

95

Proteína PhaC2

96

Proteína PhaD

97

Proteína PhaF

98

Proteína phaI

99