Aplicación de la Biología Molecular en el Estudio Antropológico de las poblaciones del Pasado: . Análisis del ADN Mitocondrial Resumido de N . Izagirre &

c. de la Rúa, 1999. Am. J. Hum. Genet., 65: 199-207

Cuando se habla de ADN antiguo (ADNa) parece inevitable hacer una referencia a "Parque Jurásico", película basada en el hecho de que un grupo de científicos logran traer a la vida a diferentes especies de dinosaurios, a partir del ADN fósil recuperado en insectos preservados en ámbar. Aunque, ha sido posible recuperar pequeños fragmentos de ADNa a partir de los restos fosilizados de un dinosaurio de 80 m. a. (Woodward et al., 1994), actualmente la ficción supera aún a la realidad. No disponemos de la tecnología necesaria para llevar a cabo un proyecto tan ambicioso como "Parque Jurásico", puesto que, la degradación existente en la estructura molecular del ADNa limita en gran medida las posibilidades de análisis, además de otras limitaciones aún de mayor importancia. Normalmente el tamaño del fragmento de ADN secuenciado no supera los 300 pares de bases (Pb) de longitud, mientras que el genoma completo de un organismo puede llegar a presentar aproximadamente 3.000 millones de pb . Sin embargo si es posible recuperar y analizar pequeños fragmentos de ADN fósil (o ADN antiguo, ADNa). Uno de los trabajos pioneros en este campo fue la clonación y secuenciación de un fragmento de ADN de 220 pb de longitud a partir del tejido taxidermizado de un animal extinguido hace 150 años (Equus quagga) (Higuchi et al., 1984). Uno de los principales problerilas con los que estos autores se encontraron fue una baja eficiencia de clonación, fundamentalmente debido a la mala preservación del ADNa. Estos primeros trabajos con ADNa pudieron haberse quedado como una mera curiosidad, si no hubiera sido por el desarrollo de una nueva metodología de análisis molecular, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Múllis & Faloona, 1987). Esta técnica implica la síntesis en el laboratorio de millones de copias de un fragmento de ADN a partir de una pequeña cantidad inicial (Saiki et al., 1985; Mullis & Faloona, 1987). Es un proceso cíclico en el que la cantidad de una determinada secuencia de ADN elegida por nosotros, se incrementa exponencialmente hasta niveles que permitan la aplicación de las diferentes técnicas disponibles para su análisis (secuenciación y polimorfismos de restricción). La PCR requiere el diseño de "primers" o "cebadores" específicos, que son secuencias de ADN de 18-25 pb de longitud, complementarias a la molécula de ADN de interes (ADN molde), y que determinan el principio y el:final de la región que se quiere amplificar. A partir de estos "cebadores", un enzima denominado Taq polimerasa irá copiando la molécula de ADN molde. Obviamente una de las aplicaciones más interesantes de esta nueva metodología, es la posibilidad de estudiar de manera directa la composición genética de las poblaciones del pasado, compararla con las del presente, e inferir los procesos evolutivos que han tenido lugar a lo largo de la historia. Si bien la genética de poblaciones ha desarrollado sofisticados métodos estadísticos para inferir las relaciones filogenéticas y la historia evolutiva de las poblaciones, en particular de las poblaciones humanas, el análisis dei ADNa permite construir hipótesis basadas no en inferencias estadísticas sino en datos directos. La perspectiva espacio-temporal que esta metodología proporciona permitirá ofrecer respuestas cada vez más precisas a las viejas cuestiones de ¿quiénes somos? y ¿de dónde venimos? En este contexto, el objetivo principal planteado en este trabajo ha sido obtener datos genéticos directos de un conjunto de poblaciones de procedencia arqueológica, distribuidas por el territorio vasco y realizar la comparación con las poblaciones actuales. Asi, hemos analizado 121 muestras recuperadas en los yacimientos de: SJAPL (Araba): 5070±150, 5020±140 BP (Etxeberria & Vegas, 1988), Longar (Nafarroa): 4445±70, 4580±90 BP (Armendariz & lrigarai, 1995) y Pico Ramos (Bizkaia): 4100±1 10, 4790±11O BP (Zapata, 1995). Problemas Metodológicos y Optimización de la Metodología Cuando se trabaja con ADNa, resulta primordial establecer unas pautas o criterios de esterilidad que garanticen la autenticidad de los resultados obtenidos, debido al alto riesgo de ADN moderno y a la escasez de moléculas de ADN endógeno del tejido contaminación con antiguo (hueso o diente). Asi, es imprescindible la eliminación y posterior esterilización de las superficies externas de los tejidos, la extracción del ADN en un laboratorio exclusivamente dedicado al trabajo con ADNa, la separación fisica de los procesos pre-PCR (extracción y preparación de la reacción de amplificación) y post-PCR (tipaje de las muestras amplificadas), la esterilización de reactivos yaparataje

mediante luz VV, la realización de controles de contaminación en los diferentes pasos del procesamiento de la muestra, la realización de múltiples extracciones del mismo individuo y el análisis en dos laboratorios independientes, a fin de corroborar los resultados obtenidos, y finalmente el tipaje obtenido debe mostrar sentido filogenético (Stoneking, 1995). Las piezas dentarias han resultado el resto biológico de mayor utilidad en cuanto a rendimiento de ADN útil, en comparación con el tejido óseos (hueso). Tras un intenso proceso de de contaminación, basado en la limpieza de las superficies dentarias mediante una mezcla de ácidos, el ADN se extrae de la pulpa dentaria siguiendo el método del fenol-cloroformo (Hagelberg & Clegg, 199 1). El estado fragmentado del ADNa conlleva que normalmente se recuperen fragmentos menores de 200 nucleótidos de longitud. La mayoría de los trabajos con ADNa se han centrado en el análisis del ADN mitocondrial (ADN mt), ya que cada célula (eucariota) presenta entre 3.000-5.000 copias de geno mas mitocondriales (Shuster et al., 1988), lo cual facilita enormemente su supervivencia y recuperación, en comparación con el ADN nuclear. Además, otras ventajas que presenta el estudio del ADNmt son que el genoma mitocondrial humano moderno está secuenciado en su totalidad y sus polimorfismos están estudiados en un gran número de poblaciones; asimismo la rápida tasa de evolución y su herencia materna, hacen de él un marcador genético útil para establecer afinidades poblacionales entre grupos humanos. El análisis del ADNmt se puede abordar desde dos perspectivas: 1) secuenciación y 2) enzimas de restricción. La secuenciación implica la "lectura" de una cadena de nucleótidos. La comparación de las secuencias provenientes de distintos individuos, permite averiguar en cuantas posiciones difieren dos o más muestras de ADN y establecer asi relaciones filogenéticas o de parentesco evolutivo entre ellas. Para analizar secuencias de unos 400 pb, es necesario la amplificación y secuenciación independiente de varios fragmentos solapantes de unos 100 pb de longitud, hasta completar la región deseada. Por otro lado, algunos nucleótidos suelen estar modificados en las moléculas de ADNa debido a reacciones químicas de oxidación e hidrólisis, por lo que durante la amplificación enzimática, la Taq polimerasa puede introducir nucleótidos erróneos en estos lugares modificados. Todo ello conlleva que cada fragmento se deba secuenciar varias veces para validar la información obtenida. El otro tipo de análisis, los polimorfismos detectados mediante enzimas de restricción, no se ve dificultado por estos errores tan marcadamente. Los enzimas de restricción son moléculas capaces de cortar (o digerir) el ADN en posiciones en las que se encuentren presentes determinadas secuencias diana (de 4 a 6 pb de longitud diferentes en general para cada enzima de restricción). Los diferentes patrones de presencia/ausencia de corte para las diferentes secuencias diana analizadas permite establecer de manera alternativa a la secuenciación, las relaciones genéticas entre las distintas muestras. Metodológicamente, esta técnica es más sencilla y rápida, lo que permite, por un lado la realización de un mayor número de análisis en menos tiempo y por otro, mayor probabilidad de obtener resultados positivos. El análisis de 7 polimorfismos mediante la técnica de los enzimas de restricción (Richards et al., 1998; Macaulay et al., 1999; Torroni et al. , 1998), permitió clasificar la variabilidad del ADNmt de caucasoides en 9 haplogrupos. Para ello, mediante la técnica de la PCR se amplifican en cada muestra 7 fragmentos de unos 100 pb de longitud, cada uno comprendiendo su respectiva secuencia diana de interés . Tras la amplificación de estos fragmentos, se verifica, mediante el análisis de los diferentes controles, que no se ha producido contaminación durante el procesamiento de la muestra. Si es así, cada fragmento se someterá a digestión con su correspondiente enzima. Dependiendo del ·modelo de digestión que presenta una muestra en cada uno de los 7 nucleótidos analizados, se clasifica como perteneciente a alguno de los 9 haplogrupos mitocondriales descritos en caucasoides (Torroni et al., 1996). Resultados Obtenidos en el Análisis Genético de los Restos Prehistóricos En nuestro estudio de ADNmt prehistórico mediante la técnica de enzimas de restricción, se han podido tipificar con éxito el 97% de las muestras que presentaban todos los controles de la contaminación negativos. Aunque esta cifra pueda parecer elevada, hay que destacar que tan sólo se han analizado el 25 % de las muestras recuperadas, habiéndose seleccionado exclusivamente las piezas dentarias intactas, para minimizar la posibilidad de que algún tipo de ADN exógeno contaminante (moderno o bacteriano) se infiltrara al interior de la pulpa dental. En la Fig. 1, se presentan los primeros datos genéticos obtenidos en población prehistórica del País Vasco. La comparación de las muestras prehistóricas, indica que la población de Longar presenta

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la mayor diferenciación genética en relación a las demás, debido a la ausencia de individuos pertenecientes al haplogrupo J y presencia de individuos que no se pueden clasificar en ninguno de los 9 haplogrupos descritos actualmente en caucasoides. También desde el punto de vista arqueológico, el hipogeo de Longar presenta unas características diferenciadas de otras estructuras funerarias cercanas, más o menos contemporáneas, como son los dólmenes de la Rioja Alavesa (Armendariz & Irigarai, 1995). Por otro lado, el análisis de caracteres no-métricos del cráneo (lzagirre et al., en prensa), indica semejanzas entre SJAPL (Araba) y Longar (Nafurroa). Con los datos disponibles actualmente resulta dificil reconciliar ambos tipos de evidencia (morfológica y genética) en estas poblaciones prehistóricas.

Otro.

Dlongar (Hf:~a) .Pico Ra íMBizkaio) mSJAPL(.Arof5C1)

J

0.00

0.10

0,20

030

0,4)

O,EO

Figura l. Distribución de la frecuencia de los haplogrupos del ADNmt en las poblaciones prehistóricas de SJAPL (Araba), Pico Ramos (Bizkaia) y Longar (Nafurroa). Un factor importante a tener en cuenta en el análisis de los datos del ADNmt, es que éstos nos indican la historia de los linajes femeninos, la cual se verá afectada por una posible migración diferencial entre ambos sexos (Seielstad et al., 1998). La existencia de datos genéticos y craneales de un mayor número de yacimientos prehistóricos podría ayudar a resolver esta cuestión. Asimismo, la comparación de los resultados obtenidos en las poblaciones prehistóricas, con los datos de otras poblaciones de vascos actuales, nos permiten discutir una reciente hipótesis propuesta en base a datos genéticos de la población actual del País Vasco (Torroni et al. 1998), donde se considera que el haplogrupo V, dada su alta frecuencia en esta región, constituye un marcador de una expansión poblacional ocurrida en el Paleolítico Superior, desde el sudoeste de Europa (País Vasco) hace 10.00015 .000 años BP. Los resultados obt~nidos, ponen de manifiesto la ausencia del haplogrupo VenIas poblaciones prehistóricas analizadas en este trabajo (Fig. 1). Esta discrepancia en la frecuencia del haplogrupo V entre los grupos actuales y prehistóricos del País Vasco, puede tener diversas explicaciones: 1) La existencia de heterogeneidad genética en la población del País Vasco. Si la heterogeneidad que observamos actualmente (Aguirre et al., 1991 ; Calderón et al. 1993; Manzano et al., 1996; Iriondo et al ., 1999), ocurrió también en la prehistoria, la deriva genética debió ser la responsable de que el haplogrupo V alcanzara una frecuencia elevada en una o varias subpoblaciones del País Vasco y estuviera ausente en otras. 2) El tiempo de origen del haplogrupo V puede ser más reciente que el propuesto (-10.000-15.000 B.P .) (Torroni et al. 1998), lo que explicaría su ausencia en las muestras prehistóricas estudiadas en el presente trabajo. Estas dataciones basadas en la variabilidad del ADNmt actual son función de parámetros (tiempo de divergencia), para los cuales diferentes autores ofrecen estimas que difieren substancialmente. Los valores que se utilizan para la región no codificante del ADNmt, oscil~n entre 7% y 22o/o/millón año (Tamura & Nei, 1993; Horai et al., 1995), lo que conduce a dataciones muy variables. 3) Que el haplogrupo V fuera introducido en el País Vasco por un proceso de inmigración. Una reciente hipótesis propone que un pequeño grupo neolítico procedente del Caúcaso, habría reemplazado a los cazadoresrecolectores existentes en el País Vasco hace -5 .000-5.500 B.P. (Calderón et al., 1998). Sin embargo, este movimiento poblacional no explicaría la discrepancia de datos que observamos, ya que la población actual del Caúcaso presenta una frecuencia del 0% para el haplogrupo V (Torroni et al., 1998) .

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4) La interpretación del registro arqueológico. La "expansión poblacional ocurrida a finales del Paleolítico desde el sudoeste al noreste de Europa" (Torroni et al., 1998), se ha fundamentado en interpretaciones arqueológicas tipologistas, que explican el parecido en el arte e industrias magdalenienses (10.000 B.P) en el sudoeste de Francia y otras regiones europeas (Bélgica, el Rhin, Suiza, Moravia y Polonia), en términos de migración/difusión (Otte, 1990). Sin embargo, este tipo de interpretaciones es muy criticada (Clark & Lindly, 1991), y resulta más aceptable, otro tipo de enfoques enmarcados en un ámbito ecológico. La expansión de las áreas de ocupación en Europa después del último periodo glacial (~12.000-1O.000 B.P.), se dió en dirección sur-norte, ya que la mejoría climática produjo cambios en el paísaje y modos de subsistencia, que favorecieron la ocupación de áreas (en norte y medio Europa), que hasta entonces habían estado escasamente habitadas por grupos de cazadores dispersos en amplios territorios (Straus, 1996). Basándonos en todo lo argumentado anteriormente, proponemos que la mutación que define el haplogrupo denominado V, pudo haber alcanzado valores muy elevados en algunas regiopes del País Vasco (Gipúzkoa, 20%), por efecto de la deriva genética, lo que explicaría la heterogeneidad observada para este haplogrupo entre distintas muestras (entre O y 20%) (Izagirre & de la Rúa, 1999). Ésto debió ocurrir en el periodo pre-mesolítico (> 11.000 B.P.) cuando el tamaño éfectivo de los grupos humanos era suficientemente pequeño como para que la deriva genética tuviera un efecto apreciable, ya que a partir de entonces se dió un cambio demográfico sustancial en el País Vasco (de la Rúa, 1995). Aunque esta explicación es compatible con la datación atribuída al origen de la mutación, no es preciso recurrir a modelos migracionistas para explicar la distribución del haplogrupo V en el resto de las poblaciones indoeuropeas. El análisis molecular de restos arqueológicos, a pesar de las limitaciones inherentes al tamaño muestral recuperado y al número y tipo de marcadores genético-poblacionales que se pueden analizar, resulta útil, tanto para valorar hipótesis planteadas en base a los datos genéticos de la población actual, como para el establecimiento de hipótesis basadas en datos genéticos directos de las poblaciones prehistóricas. Sin embargo, es necesario disponer de un mayor número de muestras poblacionales que comprendan la distribución de la variabilidad actual y pasada, para poder reconstruir con mayor solidez las relaciones ftlogenéticas existentes entre los grupos humanos del País Vasco. Este trabajo representa un primer paso en esta dirección. Bibliografia ver en trabajo original

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