TRABAJOS PRÁCTICOS DE INGENIERÍA GENÉTICA 2016 INTRODUCCIÓN Plásmidos Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, bicatenario, circular y covalentemente cerrado. Son capaces de replicarse en forma autónoma en la célula hospedadora, esto significa que pueden replicarse independientemente del cromosoma, ya que tienen su propio origen de replicación. Las moléculas de DNA que, como los plásmidos y el cromosoma, contienen un origen de replicación, se llaman replicones. Los plásmidos se encuentran ampliamente distribuidos en los procariotas. Su tamaño varía desde menos de 1x106 Dalton (1 Mdal, un megadalton) hasta más de 200 Mdal (como comparación, el DNA cromosómico de E. coli tiene una masa molecular entre 2200 y 3000 Mdal), y generalmente son dispensables para la célula hospedadora, aunque pueden conferirle alguna ventaja como, por ejemplo, la resistencia a un antibiótico. En la tabla 1 se indican algunos de los fenotipos que los plásmidos confieren a sus células hospedadoras. (Recordemos que genotipo de una célula es el material genético en su totalidad, mientras que fenotipo son las propiedades de una célula en un medio ambiente determinado). Así, el ambiente influye en la expresión de las potencialidades genéticas de la célula, en tanto que el genotipo establece los límites de tales potencialidades. Tabla 1. Algunos caracteres fenotípicos codificados por genes plasmídicos en bacterias

Producción de antibióticos Producción de hemolisina Producción de bacteriocinas Producción de enterotoxinas Degradación de compuestos aromáticos

Resistencia a antibióticos Fermentación de azúcares Inducción de tumores en plantas Resistencia a metales pesados

Los plásmidos que aún no se han relacionado con caracteres fenotípicos se llaman plásmidos crípticos. Los plásmidos pueden clasificarse teniendo en cuenta las siguientes características a) Propiedades de Transferencia: conjugativos y no conjugativos, según que lleven o no un conjunto de genes, llamados genes tra (de transferencia), que promueven su propia transferencia a otra célula por medio de un proceso llamado conjugación, que requiere el contacto físico entre la célula donante del plásmido y la receptora. b) Efectos en el fenotipo: i- Plásmido de Fertilidad (factor F): capaces de conjugarse. ii- Plásmidos Bacteriocinogénicos: poseen genes que codifican para substancias que matan a otras bacterias (bacteriocinas o colicinas). iii- Plásmidos de Resistencia (factores R) – Estos acarrean genes de resistencia a los antibióticos o venenos. Conocidos como Factores R. iv- Plásmidos degradativos: los cuales habilitan la digestión de sustancias inusuales como tolueno o ácido salicílico. v- Plásmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patógeno. c) Número de copias: i- Plásmido monocopias: plásmidos grandes con una copia por célula 1

(control estricto de la replicación). Poseen mecanismos que permiten que se repliquen una vez en cada ciclo celular. ii- Plásmidos de bajo Nº de copias: entre 2 a 10 copias por célula. Poseen mecanismos que permiten que se repliquen un pequeño número de veces en cada ciclo celular. iii- Plásmido de alto Nº de copias: plásmidos pequeños suelen estar presentes como varias copias (>10), denominándose plásmidos de control relajado. Poseen mecanismos que inhiben el inicio de replicación sólo cuando el número de copias ha llegado a un cierto nivel. d) Compatibilidad: i-Plásmidos incompatibles: no pueden coexistir establemente en la misma bacteria en ausencia de una presión selectiva permanente. La incompatibilidad depende de que los distintos miembros de un mismo grupo poseen el mismo tipo de sistema de control del número de copias y de reparto de dichas copias a las células hijas. En cada célula con dos plásmidos distintos del mismo grupo de incompatibilidad, el número total de copias nA+nB = N no varía, pero por fluctuaciones aleatorias, algunas células heredan más copias de uno que del otro, y otras carecerán de uno o del otro plásmido. ii- Plásmidos compatibles: coexisten establemente en la misma bacteria. Son miembros de distinto grupo de incompatibilidad. En los últimos años, los plásmidos aislados de la naturaleza han sido modificados para producir nuevos plásmidos (vectores) de manera de facilitar su manipulación y para su utilización como vehículos en el clonado de genes usando las técnicas del DNA recombinante. El uso de los plásmidos para las manipulaciones genéticas implica su extracción de la bacteria que lo contiene. Se obtiene DNA plasmídico con un alto grado de pureza por centrifugación de un lisado de bacterias en gradiente de CsCl. Dado que en general no se necesitan preparaciones de plásmidos tan puras, se utilizan técnicas más sencillas y rápidas para la obtención de plásmidos, una de las cuales se describe en esta guía.

Microcina J25 Las MICROCINAS son antibióticos de bajo peso molecular, peptídicos o derivados de aminoácidos, producidos por bacterias no esporulantes, cuya síntesis no es letal ni inducible por agentes inductores del sistema SOS, y está codificada por plásmidos. Las microcinas tiene características especiales, algunas de ellas son: •La síntesis se induce en fase estacionaria. •Son sintetizadas como precursores, con un péptido líder amino terminal, que difiere de las señales típicas de importación. •Muchas de ellas experimentan modificaciones postraduccionales. •Son exportadas por sistemas especializados de exportación. •Los genes involucrados en la maduración y exportación forman un operón con el gen estructural. Las microcinas se clasifican sobre la base del estudio de la actividad cruzada entre las cepas productoras. Actualmente se conocen 8 grupos de microcinas: A, B, C, D, E, H, J, L En el año 1989, se aisló en el Instituto de Química Biológica de la Facultad de Bioquímica de la UNT una cepa microcinogénica de E.coli a partir de heces de un lactante sano. El antibiótico producido por esta cepa fue designado microcina J25 (MccJ25). La MccJ25 es un péptido antibiótico de 21 aminoácidos, activo sobre cepas de E. coli, Salmonella y Shigella. La producción de la MccJ25, así como la inmunidad a la misma, están codificadas por genes localizados en un plásmido de bajo número de copias, denominado pTUC100. El fragmento conteniendo estos genes fue clonado en el sitio único para la enzima de restricción BamHI del vector pBR322, inactivando así la resistencia a tetraciclina, y permaneciendo como marcador seleccionable la resistencia a ampicilina. El plásmido obtenido se denominó pTUC200, que es el que se usará en estos trabajos prácticos: 2

Trabajo Práctico Nº1: Extracción y análisis electroforético del plásmido recombinante pTUC200. Trabajo Práctico Nº2: Transformación de la cepa E.coli W3110 con el pTUC200. Trabajo Práctico Nº4: Verificación de la producción de MccJ25 por la cepa transformada. BamHI 375

BamHI

BamHI

Figura 1. Operon MccJ25. Representación de los genes que compone el operon de genes que codifican para la producción de microcina J25 (MccJ25). Se observa el procesamiento postranduccional hasta la obtención de la MccJ25 madura. En azul se observa la proteína precursora de 58 aminoácidos. Dicha proteína a través de McjB (color amarillo), provoca el clivaje proteolítico del cual se desprenden dos productos, uno el péptido líder de 37 aminoácidos y un péptido maduro de 21 aminoácidos que luego, por medio de McjC (color verde) forma la unión amida para dar la MccJ25 madura. Figura 2. 3

Figura 2. Modelo para la exportación e importación de la MccJ25. La MccJ25 activa sería 4

exportada al medio extracelular por intermedio de McjD, que estaría ubicado en la membrana interna y por la proteína de membrana externa TolC. La MccJ25 puede reingresar a la célula uniéndose a la proteína FhuA, la cual por acción del complejo TonB-ExbB-ExbD libera la MccJ25 al periplasma desde donde es transportada al citoplasma en un proceso que requiere de la proteína SbmA. La inmunidad a la MccJ25 estaría dada por su transporte activo al exterior de la célula, mediado por la proteína McjD. ME, membrana externa, MI, membrana interna IMPORTANTE: Prestar atención en la etapa de exportación de Mccj25, específicamente en la función de la proteína TolC, para una mejor comprensión del Trabajo Practico N°3: Transducción: un método de transferencia genética.

Medios de cultivo y reactivos utilizados en los prácticos LB, por litro: hidrolizado enzimático de caseína (N-Z-Case, Sigma Chemical Co.), 10 g; extracto de Levadura (Sigma Chemical Co.), 5 g; NaCl, 5 g. Ajustar el pH con NaOH 2N. Placas LB: 14 g de agar en un litro de medio LB líquido. Solución stock de antibióticos: Ampicilina 10 mg/ml en H2O destilada estéril. Solución de trabajo: placas LB Antibióticos, placas LB agar suplementadas con 50 µg/ml Ampicilina

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Trabajo Práctico Nº1

Extracción del DNA Plasmídico de una bacteria y análisis electroforético en gel de agarosa.

Extracción de plásmidos Todas las técnicas de aislamiento de plásmidos requieren algún método para lisar suavemente las células bacterianas de manera que el DNA plasmídico sea preservado intacto y pueda ser separado físicamente del DNA cromosómico, de mucho mayor tamaño. Actualmente el método más popular para extraer y purificar DNA de plásmidos es el de lisis alcalina, descripto por Birnboim y Doly. En este método las bacterias que contienen plásmidos son lisadas con hidróxido de sodio y el detergente aniónico dodecilsulfato de sodio (SDS). En este medio alcalino (pH 12,0-12,6) se produce la desnaturalización de las proteínas y del DNA cromosómico, pero las dos hebras del DNA plasmídico al ser pequeñas moléculas circulares y cerradas permanecen inseparables (a pesar de estar desnaturalizadas). Luego se neutraliza el medio con acetato de potasio ácido (pH 4,8), lo que provoca la renaturalización y agregación del DNA cromosómico, formando una red insoluble. Simultáneamente, la alta concentración de acetato de potasio ocasiona la precipitación de complejos SDS-proteína y de RNA de alto peso molecular. Si el pH de la desnaturalización alcalina fue cuidadosamente controlado, las moléculas de DNA plasmídico circular covalentemente cerrado permanecerán en estado nativo y en solución, mientras que las macromoléculas contaminantes co-precipitarán. El precipitado se elimina por centrifugación y al plásmido, soluble en el sobrenadante, se lo concentra precipitándolo con alcohol (etanol o isopropanol). Finalmente, al plásmido precipitado se lo resuspende en buffer y se lo analiza por electroforesis.

Electroforesis en gel de agarosa La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es un método estándar empleado para separar, identificar y purificar DNA. La técnica es simple, rápida y capaz de resolver fragmentos de DNA que no podrían ser separados adecuadamente por otros procedimientos, como por ej. centrifugación en gradiente de densidad. Además, la localización del DNA en el gel puede ser determinada directamente usando el colorante intercalante bromuro de etidio, de manera tal que bandas conteniendo cantidades tan pequeñas como 1-10 µg de DNA, pueden ser visualizadas exponiendo el gel a la luz ultravioleta. La elección de poliacrilamida o agarosa como matriz del gel depende principalmente del rango de longitud de los fragmentos de DNA que deseamos separar. En un gel de poliacrilamida pueden resolverse fragmentos muy pequeños, típicamente de 5-500 pares de bases (pb), llegando en el caso de los geles para secuenciación a separarse fragmentos que difieren tan solo en 1 pb. Los geles de agarosa poseen un poder resolutivo menor que los de poliacrilamida, pero tienen un rango de separación mayor (200-50.000 pb). La agarosa, extraída de algas marinas, es un polímero lineal de galactosa. Disponible comercialmente en distintos grados de pureza, la agarosa se encuentra principalmente impurificada con otros polisacáridos, sales y proteínas. Estos contaminantes pueden actuar como inhibidores de las reacciones enzimáticas donde el sustrato es el DNA recuperado de los geles, por lo que algunos fabricantes comercializan agarosa libre de inhibidores y nucleasas y con mínima fluorescencia basal luego de la tinción con bromuro de etidio. Los geles se preparan calentando una suspensión de agarosa en el buffer apropiado hasta obtener 6

una solución clara y transparente. La solución fundida se vierte en un molde en posición horizontal y se la deja enfriar hasta solidificar. Una vez que la agarosa solidifica, forma una matriz en la cual la densidad de la trama y el tamaño del poro están determinados por la concentración del polímero. Cuando un campo eléctrico es aplicado a través del gel, el DNA (cargado negativamente a pH neutro) migra hacia el ánodo. MIGRACIÓN DEL DNA PLASMÍDICO SEGÚN SU CONFORMACIÓN Las moléculas de DNA circular superenrrollado (forma I), circular abierto (forma II) y lineal (forma III) del mismo peso molecular, migran con diferentes velocidades a través del gel como se muestra en la figura. Las movilidades relativas de las tres formas dependen principalmente de la concentración de agarosa en el gel, pero están influenciadas también por la intensidad de la corriente aplicada, la fuerza iónica del buffer y la magnitud del superenrrollamiento de la forma I.

Circula abierta (Forma II)

Lineal (Forma III)

Circular cerrada superenrollada (Forma I)

PARTE EXPERIMENTAL Obtención de plásmidos por lisis alcalina 1 Inocular 5 ml de medio de cultivo LB conteniendo el antibiótico apropiado, con una colonia de la bacteria que contiene el plásmido. Incubar a 37ºC toda la noche con agitación. 2 Poner 1,5 ml de cultivo en un tubo Eppendorf. Centrifugar l minuto a 12.000 rpm en una microcentrífuga. 3

Remover el sobrenadante con una pipeta automática.

4 Resuspender el sedimento, agitando con un vortex, en 100 µl de buffer GTE frío (Solución 1). El GTE facilita la posterior lisis de la membrana. 5 Añadir 200 µl de una solución de SDS alcalino (Solución 2), preparada en el momento de usar. Tapar el tubo y mezclar por inversión rápida 2 o 3 veces. No agitar en vortex. Incubar en hielo 5 minutos. En este paso se produce la lisis celular y la desnaturalización del DNA y las proteínas. Se debe trabajar en hielo para que el proceso de lisis sea suave y no se produzca fragmentación del DNA. 6

Añadir 150 µl de una solución fría de buffer acetato de potasio, pH 4,8 (Solución 3). Tapar el tubo, 7

invertir suavemente 3 o 4 veces. Incubar en hielo 5 minutos. Al bajar el pH el DNA cromosómico se renaturaliza en forma desordenada y se observa un precipitado de aspecto mucoso. Se trabaja en hielo para favorecer la precipitación. 7 Centrifugar 5 minutos a 12.000 rpm en una microcentrífuga. El precipitado que se observa está formado por DNA cromosómico, RNA de alto peso molecular y complejos potasio/SDS/proteína/ membrana. En el sobrenadante queda el DNA plasmídico, RNA de bajo peso molecular y algunas proteínas. 8 Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf, midiendo simultáneamente el volumen con micropipeta. 9 Añadir igual volumen de isopropanol, mezclar y poner a -70oC, 10 minutos, o a -20oC, 20 minutos. El isopropanol produce la precipitación del DNA por deshidratación, ayudado por la elevada concentración de sales que permanecieron en solución. En frío se acelera este paso. 10 Centrifugar a 12.000 rpm durante 10 minutos. 11 Descartar el sobrenadante; lavar el sedimento de DNA con etanol 70%. Agitar con vortex brevemente y centrifugar. El sedimento se lava para extraer el isopropanol y los restos de sales que pudieran haber quedado. 12 Remover el sobrenadante. Secar el sedimento en un desecador de vacío. Resuspender el DNA en 20 µl de buffer TE pH 8 o agua bidestilada estéril.

Electroforesis en gel de agarosa 1 Preparar agarosa al 0,8 %, añadiendo 20 ml de buffer TBE a 0,16 g de agarosa. Fundir la agarosa en un horno de microondas o en un baño de agua hirviendo. Enfriar hasta unos 60oC, evitando formar burbujas. 2

Verter el gel en el soporte, como se muestra en la figura 1B

3 Colocar el peine cerca de uno de los bordes del gel (figura 1B). Cerciorarse de que los dientes del peine estén a alrededor de 1 mm por encima de la placa inferior del soporte (los dientes no deben tocar el piso del soporte). 4

Dejar solidificar el gel hasta que se vuelva lechoso y opaco (aproximadamente 20 minutos).

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Remover cuidadosamente el peine. Figura 1C.

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Verter buffer TBE en la cuba de electroforesis. Figura 1D.

7 Colocar el soporte con el gel en la cuba de electroforesis. El gel debe quedar totalmente sumergido, cubierto por no más de 1 cm de buffer. Figura 1D. 8

Remover las burbujas de aire de los pocillos, si las hubiera, con una pipeta.

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Mezclar cada muestra con solución de siembra en una relación 5:1. El buffer de siembra tiene el 8

propósito de: a) aumentar la densidad de la muestra debido a la presencia de glicerol, asegurando que el DNA entre en el pocillo de siembra. b) permitir visualizar la entrada de la muestra al pocillo y el seguimiento del frente de la corrida electroforética, mediante la presencia de colorantes (azul de bromofenol, Xilene cianol y Orange G). Los colorantes en un campo eléctrico se mueven hacia el ánodo y en un gel de agarosa el Orange G migra aproximadamente a la misma velocidad que un DNA lineal de doble cadena de 50 pares de bases; el azul de bromofenol a la misma velocidad que un DNA lineal de doble cadena de 300 pares de bases; mientras que el xilene cianol lo hace a la velocidad de un fragmento lineal de ADN de 4000 pb. 10 Sembrar las muestras cuidadosamente en los pocillos individuales, usando una pipeta automática. Figura 1E. 11 Conectar la cuba a la fuente de poder y fijar el voltaje de la corrida en unos 80 V (Figura 1F). Dejar correr hasta que el azul de bromofenol haya llegado a unos 2 cm del borde opuesto del gel. 12 Sacar el gel de la cuba y teñir con bromuro de etidio (10 µl en 100 ml de agua destilada) durante 15 min. Y luego se lava con agua destilada. ESTE PROCEDIMIENTO SE REALIZA USANDO GUANTES DE LATEX DEBIDO A QUE EL Bromuro de Etidio ES UN AGENTE MUTAGÉNICO. Visualizar las bandas de DNA teñidas con bromuro de etidio en un transiluminador UV. ESTE PROCEDIMIENTO SE REALIZA USANDO GUANTES DE LATEX DEBIDO A QUE EL Bromuro de Etidio ES UN AGENTE MUTAGÉNICO.

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A

C

E

B

D

F

Figura 1. Preparación de un gel horizontal de agarosa 10

REACTIVOS Buffer GTE (Solución 1) Glucosa Tris.HCl (pH 8) EDTA

50 mM 25 mM 10 mM

SDS alcalino (Solución 2) NaOH SDS

0,2 N 1%

Buffer acetato de potasio pH 4,8 (Solución 3) Acetato de potasio 5 M 60,0 ml Acido acético glacial 11,5 ml Agua destilada 28,5 ml La solución resultante es 3 M con respecto al potasio y 5 M con respecto al acetato. Buffer TE Tris HCl EDTA

10 mM 1 mM

pH 8 pH 8

Buffer TBE (5x) Tris base 54 g Acido bórico 27,5 g EDTA 0,5 M (pH 8) 20 ml Agua destilada c.s.p. 1.000 ml Al momento de usar, diluir con agua destilada a 1x. Solución de siembra Azul de Bromofenol Xilene cianol Orange G Glicerol

0,25 % 0,25 % 0,25 % 30 %

Solución de bromuro de etidio Bromuro de etidio l0 mg Agua destilada 1 ml Guardar a temperatura ambiente en frascos oscuros o envueltos en papel de aluminio.

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Trabajo Práctico Nº2

Preparación de células competentes y transformación con DNA plasmídico.

En biología molecular, transformación es la alteración genética de una célula que resulta de la introducción y expresión de material genético externo (DNA). Se usan diferentes términos para las alteraciones genéticas resultantes de introducir DNA, por ejemplo, por virus transducción o por contactos intercelulares entre bacterias conjugación. A la transformación de células animales se le llama transfección. COMPETENCIA Una célula que es capaz de tomar una molécula de DNA y ser transformada se dice que es competente. En la naturaleza solo algunas cepas son competentes; esta capacidad parece ser una propiedad heredable del organismo. En la mayor parte de las bacterias que se pueden transformar naturalmente, la competencia está regulada y hay proteínas especiales que juegan un papel en el transporte y procesamiento del DNA. Estas proteínas específicas de competencia incluyen una proteína de unión del DNA que está asociada a la membrana, una autolisina de la pared celular y varias nucleasas. Una gran variedad de métodos han sido desarrollados para inducir la competencia. En este trabajo práctico vamos a desarrollar el más comúnmente usado, que consiste en una incubación con CaCl2 frío (0ºC), que permeabiliza la membrana para permitir la entrada del DNA exógeno al citoplasma cuando se someten las células a un shock térmico (42ºC). TRANSFORMACIÓN La transformación genética es un proceso por el que el DNA libre se incorpora en una célula receptora y lleva a cabo un cambio genético. El descubrimiento de la transformación genética en bacterias fue uno de los hechos más destacables en biología pues condujo a experimentos que probaron que el DNA es el material genético. Se han encontrado varios procariotas que son transformables en condiciones naturales, incluyendo especies de Gram positivas y Gram negativas del dominio Bacterias y algunas especies del dominio Archaea. Sin embargo, dentro de algunos géneros transformables, solo ciertas especies o cepas resultan transformables. Células Competentes Transformación Plásmido

CaCl2 0,1M

Asociación

Figura 2. Preparación de células competentes y transformación de DNA plasmídico en Escherichia coli.

Transformación

Medio rico Estabilización y Expresión de la Resistencia antibiótica

LB 1 hr.

Shock Térmico

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Un parámetro importante que se tiene en cuenta en la transformación bacteriana es la Eficiencia de transformación. La eficiencia de transformación representa el número total de células bacterianas que expresa la proteína, el gen o el plásmido bajo estudio, dividido por la cantidad de DNA utilizado en el experimento. Al calcular la eficiencia de transformación bacteriana se indica cuan efectivo fue el proceso de inserción del DNA en la célula. La eficiencia de la transformación es inversamente proporcional al tamaño del plásmido (plásmidos de mayor tamaño son menos eficientes en transformar una bacteria). Este parámetro puede ser calculado con la siguiente ecuación: Número total de colonias en la placa Eficiencia de transformación = Cantidad de DNA utilizado en el experimento

PARTE EXPERIMENTAL PREPARACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES Para preparar células competentes, inocular 10 ml de LB (1:100) con un cultivo en fase estacionaria de la cepa a transformar. Incubar con agitación vigorosa hasta una DO600 de 0.2–0.3. Transferir asépticamente a un tubo enfriado en hielo. Dejar en hielo durante 10 min. Centrifugar a 4000 x g, 10 min, 4ºC. Luego de descartar el medio invertir el tubo sobre papel absorbente durante 1 min. El precipitado celular se resuspende en 5 ml de CaCl2 0,1 M enfriado en hielo (0 ºC), dejándose luego en baño de hielo durante 20 min. Las células se recuperan por centrifugación a 3000 x g, 10 min, 4ºC. Descartar el fluido, y poner los tubos en posición invertida por un minuto para permitir el drenaje de las últimas trazas de líquido. Finalmente, las células se resuspenden en 0,5 ml de CaCl2 0,1 M enfriado en hielo (0 ºC). IMPORTANTE: Las células competentes se deben mantener en baño de hielo hasta ser utilizadas en la transformación. Se ha demostrado que la eficiencia de transformación aumenta de 4 a 6 veces durante las primeras 12-24 hs de almacenadas, y que luego disminuye hasta los niveles basales. TRANSFORMACIÓN CON DNA PLÁSMIDICO POR SHOCK TÉRMICO O CHOQUE TÉRMICO. Para la transformación, transferir 200 µl de la suspensión de células competentes a un tubo de vidrio de paredes delgadas. Añadir el DNA (en un volumen de 10 µl ó menos) y mezclar por agitación suave. Poner el tubo en hielo (0 ºC) durante 30 min. En este paso el DNA plasmídico se pone en contacto con las células bacterianas en zonas de adhesión (transportadores de macromoléculas). Al cabo de este tiempo transferir rápidamente a un baño precalentado a 42ºC, dejándose exactamente 90 seg. En este paso se produce la apertura de los poros ingresando el DNA plasmídico en el interior celular (Fig. 2). Poner de nuevo el tubo en hielo (0 ºC), por 5 min., esto permite el cierre de los poros (Fig. 2). A este procedimiento de someter a las células bacterianas a 0ºC-42ºC-0ºC se denomina SHOCK TERMICO. Añadir 800 µl de LB e incubar 1 h en un baño a 37ºC para permitir la recuperación de las bacterias y la expresión de la resistencia antibiótica codificada por el plásmido (Fig. 2). Finalmente una alícuota de 0,1-0,2 ml de células transformadas se esparce en LB agar conteniendo el(los) antibiótico(s) adecuado(s). Realizar los controles correspondientes. Incubar las placas a 37ºC, toda la noche. 13

Los controles que deben realizarse para evaluar los resultados de una buena transformación son los siguientes: i- Control de célula: a) Control positivo de viabilidad bacteriana indica que las células competentes están vivas después del shock térmico. Se realiza mediante la siembra de las células competentes, que sufrieron el mismo tratamiento de shock térmico, en placas sin antibiótico (debe haber crecimiento). b) Control negativo indica que las células competentes están puras (sin contaminantes resistentes al antibiótico). Se realiza mediante la siembra de las células competentes, que sufrieron el mismo tratamiento de shock térmico pero sin el agregado del plásmido, en placas conteniendo el antibiótico de selección (no debe haber crecimiento). ii- Control de plásmido: a) Control negativo indica que la muestra de plásmido empleada está libre de células. Consiste en el tratamiento por shock térmico de la muestra de plásmido empleado en la transformación sin el agregado de células competentes (no debe haber crecimiento). b) Control positivo indica que las células empleadas estaban competentes. Consiste en transformar las células con un plásmido conocido, generalmente el empleado como vector en el clonado. Este también se conoce como control de competencia, y sirve para calcular la eficiencia de transformación de nuestras células (debe haber crecimiento).

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Trabajo Práctico Nº 3

Transducción: un método de transferencia genética

La transducción es la transferencia de información genética desde una cepa donante a una receptora mediada por fago que portan ADN genómico de la cepa donante. En otras palabras: La transducción es un proceso mediante el cual el ADN es transferido desde una bacteria a otra mediante la acción de un virus. El fago al ser capaz de infectar una bacteria recibe el nombre de bacteriófago. La cubierta del bacteriófago protege al material genético del medio, así es que la transducción, a diferencia de la transformación, no se ve afectada por las nucleasas del medio ambiente. No todos los fagos pueden mediar la transducción. En la mayoría de los casos la transferencia genética se realiza entre miembros de las mismas especies bacterianas. Sin embargo, si un fago en particular posee un amplio rango de huéspedes que él es capaz de infectar, entonces la transferencia entre las especies puede ocurrir. La capacidad del bacteriófago para mediar la transducción, está relacionada con el ciclo de vida del mismo. Los bacteriófagos son ubicuos y pueden ser encontrados en diversas poblaciones de bacterias, tanto en el suelo como en la flora intestinal de los animales. El ciclo de vida de los bacteriófago puede ser ciclo lítico o ciclo lisogénico, aunque muy pocos son capaces de llevar a cabo ambos. En el ciclo lítico, las células hospedadoras del bacteriófago son lisadas (destruidas) tras la replicación y encapsulación de las partículas virales, de forma que los nuevos bacteriófagos quedan libres para llevar a cabo una nueva infección. Por el contrario, en el ciclo lisogénico no se produce la lisis inmediata de la célula. El genoma del fago puede integrase en el ADN cromosómico de la bacteria hospedadora, replicándose a la vez que lo hace la bacteria o bien puede mantenerse estable en forma de plásmido, replicándose de forma independiente a la replicación bacteriana. En cualquier caso, el genoma del fago se transmitirá a toda la progenie de la bacteria originalmente infectada. El fago queda así en estado de latencia hasta que las condiciones del medio se vean deterioradas: disminución de nutrientes, aumento de agentes mutagénicos, etc. En este momento, los fagos endógenos o profagos se activan y dan lugar al ciclo lítico que termina con la lisis celular. Para entrar en una célula, los fagos se acoplan a receptores específicos en la superficie de la bacteria, que pueden ser lipopolisacáridos, ácido teicoico, proteínas , receptores de calcio o incluso flagelos. Por ello, cada fago solo podrá infectar ciertas bacterias según sus receptores. Puesto que los fagos no son móviles, dependen de encuentros al azar con los receptores adecuados en solución para poder infectar una bacteria. Los bacteriófagos presentan una especie de jeringa mediante la cual introducen su material genético en el interior de la célula. Tras el reconocimiento del receptor adecuado, la cola y cuello del

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fago se contraen, quedando así el fago acoplado a la superficie celular. El material genético puede ser introducido a través de la membrana o bien simplemente depositado sobre la superficie. EN LA TRANSDUCCIÓN PODEMOS DISTINGUIR DOS ETAPAS DIFERENCIADAS: a- Formación de la partícula fágica transductora: un trozo de material genético de la célula donante se introduce en el interior de la cabeza de la cápside de un fago. b- La partícula transductora inyecta de forma habitual el ADN que porta a la célula receptora, donde este ADN puede eventualmente recombinarse y expresar su información. EXISTEN DOS TIPOS DE TRANSDUCCIÓN: 1- Transducción Generalizada: es el mecanismo por el cual potencialmente cualquier gene bacteriano de la cepa donante puede ser transferido a la célula receptora, con aproximadamente la misma frecuencia relativa. Los fagos que median la transducción generalizada, normalmente cortan el ADN de la célula huésped en pequeñas piezas y empacan ambos ADN (bacteriano y fágico) al interior de la partícula fágica mediante un mecanismo llamado “head full” o llenado de las cabezas del fago (Figura 1). Por lo cual, la transducción generalizada se produce sólo como consecuencia de infecciones líticas. Ocasionalmente una de las piezas del ADN de la bacteria infectada resulta empacada al azar dentro de una cubierta de fago. Por lo tanto cualquier gene de la bacteria donante puede ser potencialmente transferido, pero solamente se transferirá tanto ADN como pueda caber en una sola cápside. El ADN del genoma de la bacteria donante que es introducido en la partícula transductora suele ir sin acompañamiento de ADN del propio fago. Por ello, a esta peculiar partícula consistente en cápside del fago que encierra sólo ADN bacteriano se la denomina pseudovirión. Cuando la célula receptora se infecta con un fago que contiene ADN de una célula donante, el ADN de la donante puede entrar a la receptora. Ya dentro de la célula receptora puede ocurrir un evento de recombinación generalizada, en el cual se substituye el ADN de la célula receptora por el de la donante transportado en el fago (Figura 2)

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Figura 1: Transducción generalizada

Fijación del fago a la célula

Inyección del material genético viral

Degradación del DNA bacteriano y replicación del genoma viral Síntesis de las cápsides y empaquetamiento del material genético y viral

Lisis celular y liberación de partículas

Figura 2 Pasos requeridos para la transducción generalizada. La transducción generalizada comienza con el empaquetamiento accidental de una porción del ADN bacteriano en una partícula viral normal. Esta partícula transductora es liberada por la lisis celular, y es capaz de adherirse a una nueva célula e inyectar el ADN. Después de la inyección en la célula receptora, el ADN transductor puede recombinarse con ADN homólogo de la célula. Los fagos de transducción generalizada más estudiados son el P22 de Salmonella Typhimurium y el P1 de Escherichia coli. La cantidad de partículas de transducción generalizada que pueden producir las células infectadas es muy variable. Mientras algunas células no producen ninguna, otras pueden llegar a encapsidar el 20% del

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genoma bacteriano. Si bien en este tipo de transducción todas las regiones del ADN bacteriano pueden ser encapsidadas, algunos loci son transducidos con mayor frecuencia (Figura 2). La transducción generalizada no es un proceso que logra células transductantes con alta eficiencia. Se calcula que aproximadamente el 90% de los ADN bacterianos inyectados por partículas de transducción generalizada a células receptoras son abortivos. Esto significa que la información genética introducida no se replica con el genoma de la célula hospedadora y es heredado por una de las células hijas. Solamente un bajo porcentaje de ADN donante se asocia con el ADN bacteriano. 2- Transducción especializada: La transducción especializada es la transducción en la cual solo ciertos genes del donador pueden ser transferidos al receptor. En este proceso solo se transfieren marcadores cromosómicos cercanos al sitio de integración del ADN del fago (profago) en la bacterias lisogénica (p. ej., en el caso de λ, los marcadores gal o bio Figura 3). Las bacterias lisogénica son las cepas bacterianas portadoras silenciosas de ciertos tipos de fagos, o sea aquellas cepas que no son sensibles a ser destruidas por el fago que portan. Los fagos a su vez, son capaces de adsorberse a las bacterias lisogénicas, pero no de producir la subsecuente lisis de las bacterias, por lo que las bacterias lisogénicas pueden crecer y dividirse sin liberar fagos al medio de cultivo. Una bacteria lisogénica posee la capacidad de heredar el fago a sus descendencia, muy pocos de las cuales se lisarán en forma espontánea. Sin embargo, la mayor parte de la progenie de una bacteria lisogénica puede ser inducida a producir el fago por medio de la irradiación con U.V. o por el tratamiento con otros factores inductores. Esos bacteriófagos capaces de existir en forma de profago en el interior de una bacteria hospedera, sin producir la lisis, son denominados fagos temperados. Después de que el profago ha sido inducido, las proteínas y el ácido nucleico específicos del fago son ensamblados para formar nuevas partículas fágicas maduras poco antes de que ocurra la lisis de la bacteria hospedera (Figura 3 y 4). Así, la transducción especializada se produce únicamente como consecuencia de la inducción de la célula lisogénica por escisión del profago, con la consiguiente entrada a fase lítica productora de nuevas partículas de fago (Figura 4). El ADN bacteriano, transportado por la partícula transductora, va unido a ADN del fago. Durante la escisión (separación) del profago, un error llega a ocurrir ocasionalmente en el cual un poco del ADN del huésped se separa del cromosoma junto con el ADN del fago. Solo puede ser transferido el ADN del huésped que esté flanqueando cada lado del sitio donde el profago se ha insertado (Figura 3). Después de la replicación y la liberación del fago y a través de la infección de la célula receptora, puede ocurrir una lisogenización de la receptora dando como resultado la transferencia estable de los genes de la donadora. La receptora ahora tendrá dos copias de los genes que le fueron transferidos. También es posible que se lleve a cabo una recombinación legítima entre los genes de la donadora y de la receptora. 18

Figura 3 Pasos de encapsidación de marcadores cromosómicos (gal/bio) localizados en próximos al sitio de integración del fago (representados por ).

Célula lisogénica: el DNA del fago se encuentra insertado en el DNA bacteriano

Figura 4 Pasos requeridos para la transducción especializada

Circularización y escisión del DNA del fago Escisión anormal que produce la pérdida de algunos genes del fago, los que se mantienen insertados en el cromosoma bacteriano. En cambio, algunos genes bacterianos han sido tomados junto al DNA del fago Degradación del DNA bacteriano y replicación del genoma viral Síntesis de las cápsides y empaquetamiento del material genético y viral

Lisis celular y liberación de partículas

PARTE EXPERIMENTAL En este trabajo practico se realizara la obtención de un lisado transductor del fago P1vir de E. coli, crecido en la cepa MG1655 tolC::Tn10 (conteniendo una inserción Tn10 en el gen tolC) Figura 6. Dicha inserción produce la inactivación del gen, que conduce a un incremento de la sensibilidad de la cepa mutante a MccJ25. El lisado obtenido será utilizado para infectar la cepa salvaje MG1655, de modo tal de TRANSDUCIR dicha mutación a un nuevo contexto genético. Esta cepa construida en este trabajo práctico será probada en el T.P. N°4 (Aislamiento y caracterización fenotípica de las células transformadas y transductantes) 19

1 Preparación de lisados del bacteriófago P1vir. Se emplea el procedimiento descripto por Miller (1992)., cuyos pasos se detallan a continuación: Se inocula un cultivo de 5 ml en medio LB, suplementado con CaCl2 5 mM (El Ca es fundamental en esta técnica ya que al crecer las célula en este medio con CaCl2, activan los canales de Ca, usado por el fago P1 como receptor para entrar a la célula), y glucosa al 2% con una gota de un cultivo en fase estacionaria de la cepa donante MG1655 tolC::Tn10, el cual se incuba con agitación hasta alcanzar una densidad de 2 x 108 células ml-1 (DO600 0,2). Posteriormente, se agrega 107 UFP (unidades formadoras de placas, Figura 5) del fago P1 a 1 ml de cultivo celular. La mezcla se incub durante 20 min a 37°C. Al cabo de este tiempo se agregan 3 ml de agar blando R (mantenido a 45°C) mezclando vigorosamente, el cual es depositado sobre una placa de medio R sólido al 1,2 % (con 30 a 40 ml de medio, preparada el mismo día). Después de incubar a 37°C durante 8 h se colecta la capa superior de agar blando en un tubo de vidrio de centrífuga. La superficie de la placa se lava con 2 ml de medio LB y el líquido de lavado es adicionado al tubo de centrífuga. Se agrega posteriormente, 10 gotas de cloroformo al tubo y se agita vigorosamente durante 2 min, para eliminar toda célula donante que no fuera lisada. El tubo se deja reposar 20 min a temperatura ambiente para permitir la difusión de los fagos desde el agar al medio líquido. Se centrifuga a 9.000 x g (rotor SS34) por 10 min y se recoge el sobrenadante en un tubo estéril. Después de agregar 3 gotas de cloroformo, se agita vigorosamente y se almacena a 4°C. Figura 5: UFP, Unidades Formadoras de Placas de lisis, producidas por fago. Placas de lisis

2 Transducción con lisados P1vir Un cultivo de 5 ml de la cepa receptora MG1655, crecido en LB durante toda la noche, se centrifuga a 5.000 x g (rotor SS34) durante 10 min. Las células se resuspenden en 5 ml de solución MC (MgSO4, 0,1 M; CaCl2 0,005 M). Alícuotas de 0,1 ml de la suspensión celular se colocan en 4 tubos de vidrio. Al primer tubo se le agrega 0,1 ml del lisado P1, al segundo 0,1 ml de una dilución 10-1 del 20

lisado y al tercero 0,1 ml de una dilución 10-2. Al cuarto tubo no se le agrega nada y sirve como control de células receptora. Se prepara un quinto tubo con 0,1 ml de lisado pero sin células, el cual sirve de control de fago, que indica que en el lisado P1 obtenido en el punto anterior se logro eliminar por completo aquellas cepas donantes que no fueron lisadas por el fago. Las diluciones del fago se preparan en solución MC. Se preadsorbe el fago P1 incubando los tubos en baño de agua a 37°C durante 20 min. Posteriormente, se agrega a cada uno de los tubos 0,2 ml de LB-citrato de sodio 0,1 M (para secuestrar el Ca del medio de cultivo). Dependiendo del antibiótico se deja 1 hr a 1,30 hrs para permitir la expresión de la resistencia al antibiótico. Esta mezcla se deposita en placas de medio LB CON Tetraciclina (en este caso el transposón Tn10, presenta el gen tetA que codifica para una proteína de membrana interna “bomba de extrusión” que bombea Tetraciclina que ingresa a la célula desde el interior, al exterior de la misma), suplementado con citrato de sodio 10 mM. El agregado de citrato de sodio inhibe el ciclo lítico del fago, permitiendo que la región de ADN del donante (encapsidado en el fago) recombine con su región homologa de la célula receptora y de este modo la transferencia del material genético (en el práctico: la transferencia de la mutación tolC::Tn10 a la cepa receptora MG1655.

gen de resistencia a tetraciclina Figura 6: Estructura del transposón Tn10 en donde se puede observar en su secuencia el gen tetR (represor), tetA (que codifica para una bomba de extrusión para tetraciclina) y tnp (transposasa)

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Trabajo Práctico Nº 4

A- Aislamiento y caracterización fenotípica de las células transformadas y transductantes. B- Manejo de software como herramienta en Biología Molecular.

PARTE A En este trabajo práctico se llevará a cabo la caracterización fenotípica de las células transformantes obtenidas en el práctico Nº 2 (1) y de las células transductantes obtenidas en el práctico Nº 3 (2). 1) Para confirmar la obtención de células transformadas con el plásmido pTUC200, se estudiará el fenotipo de producción de MccJ25 otorgado por dicho plásmido. En un primer paso se seleccionarán los clones que hayan adquirido resistencia al antibiótico marcador en la transformación y posteriormente se realizarán diferentes pruebas de producción antibiótica tendientes a determinar la capacidad de las células transformantes de producir MccJ25 al medio extracelular, mediante los siguientes ensayos: a- Ensayo en simultáneo Sobre la superficie de una placa con medio M9 sólido se vierten 4 ml de agar blando conteniendo 7 alrededor de 10 células de la cepa indicadora sensible a MccJ25 (rutinariamente E. coli AB1133). A continuación, se inocularán por picadura los clones a ensayar, usando escarbadientes estériles. Al cabo de 12 hs de incubación en estufa a 37° C se examinarán los halos de inhibición de crecimiento alrededor de las colonias productoras de MccJ25. b- Ensayo en diferido La cepa en ensayo se inoculará por picadura en una placa con medio de cultivo agarizado y se incubará 12 hs a 37°C. , Las colonias de las cepas productoras se matan por exposición a vapores de cloroformo durante 15 min. A continuación se cubrirá la superficie de la placa con 4 ml de agar blando conteniendo alrededor de 107 células de una cepa sensible a MccJ25. Luego de una segunda incubación de 12 hs a 37°C se analizarán los halos de inhibición del crecimiento generados por la cepa productora de MccJ25, sobre el tapiz de células sensibles.

2) Para confirmar el fenotipo de las células transductantes MG1655 tolC:: Tn10 se determinará la sensibilidad a MccJ25 de diferentes clones, obtenidos en las placas de medio LB con antibiótico Tc, usando la técnica de estrías cruzadas que se detalla a continuación. Es importante recordar que se espera observar un incremento en la sensibilidad a MccJ25 en las células transductantes comparadas con la cepa parental MG1655. Esto se debe a que la proteína de membrana externa TolC participa en el transporte de MccJ25 al medio extracelular. Por lo tanto, al estar ausente dicho transportador en las células transductantes, el antibiótico se acumularía en el citoplasma ejerciendo su efecto tóxico. Ensayo de estrías cruzadas En primer lugar debe generarse una estría central de una cepa productora de MccJ25 en una placa de medio M9. Para ello, una gota de un cultivo en fase estacionaria de dicha cepa se depositará en 22

el borde de la placa, inclinando la placa para que la gota corra a lo largo del diámetro de ésta (Fig. 1). A continuación, la placa debe incubarse a 37ºC durante toda la noche para permitir el crecimiento celular y la producción de MccJ25. Luego es recomendable dejar la placa en la heladera por 24 hs para que la microcina producida en la estría central difunda por el medio de cultivo. Perpendicularmente a la estría central y desde el borde de la placa, se sembrará con aguja, una colonia fresca de las cepas cuya sensibilidad se quiere estudiar (Fig. 1). Se incubará nuevamente a 37ºC durante 12 hs y se comprobará la inhibición del crecimiento de las cepas a ensayar (estrías cruzadas) producida por la MccJ25 excretada por la cepa de la estría central.

Figura 1. Ensayo de estrías cruzadas. La estría central se realiza con una cepa productora de MccJ25, luego, mediante estrías cruzadas (perpendiculares) se siembran las cepas cuya sensibilidad a microcina se quiere determinar.

PARTE B EJERCICIO Nº1 Se necesita clonar un fragmento de la secuencia 6.7 que está incluido entre los nucleótidos 665 y 1140. a) Realice un mapa de restricción usando el programa “on line webcutter” 2.0 (http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html) y elija un par de enzimas con las que realizaría la digestión. 1- AsnI-SpeI 2- BamHI-EcoRI 3- BsaI-EcoRI 4- AocI-AcsI b) Una vez elegidas las enzimas, usando el programa “DNAman”, diseñe un par de oligonucleótidos para amplificar este fragmento lo más acotadamente posible desde la secuencia 6.7 y que incluya los sitios de restricción de las enzimas seleccionadas. c) Podría clonar usando estas enzimas en los plásmidos: 1) pBR322 2) pUC19 3) pACyC177 EJERCICIO Nº2 Se necesita clonar un fragmento de la secuencia 6.3 que está incluido entre los nucleótidos 35 y 1050. a) Realice un mapa de restricción usando el programa “on line webcutter” 2.0 (http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html) y elija un par de enzimas con las que realizaría la digestión. 1- HindII-StuI 2- HindIII-KpnI 23

3- SalI-NcoI 4- NaeI-BglII b) Una vez elegidas las enzimas, usando el programa “DNAman”, diseñe un par de oligonucleótidos para amplificar este fragmento lo más acotadamente posible desde la secuencia 6.3 y que incluya los sitios de restricción de las enzimas seleccionadas. c) Podría clonar usando estas enzimas en los plásmidos: 1) pBR322 2) pGEM 5Z 3) pACyC184 Medios de cultivo M9, por litro: KH2PO4 , 13.6 g; NH4SO4, 8 g. Antes de llevar a volumen se ajusta a pH 7 con KOH 4 N. Después de autoclavar se agrega 1 ml de MgSO4 1 M, 1 ml de vitamina B1 (1mg/ml), y 10 ml de una solución al 20 % de la fuente de carbono adecuada (en este caso, glucosa). Cuando es necesario, se suplementa con L-aminoácidos (50 µg/ml). Placas M9: después de autoclavar las sales y el agar (en soluciones doblemente concentradas), la solución de sales se suplementa con MgSO4, vitamina B1 y una fuente de carbono (teniendo en cuenta el volumen final del medio), mezclándose luego con el agar. En algunos experimentos, las placas M 9 se suplementan con 0,1% de N-Z-Case (lo que se indica como M9 -C) para estimular el crecimiento y/o permitir el desarrollo de auxótrofos (como la cepa AB1133, frecuentemente usada como cepa sensible indicadora de actividad antibiótica). Agar blando, por litro: agar, 6 g.

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Trabajo Práctico Nº 5

Problemas de Ingeniería Genética: aplicaciones

Ejercicio N°1: ESTRATEGIAS DE CLONADO Los plásmidos son las plataformas utilizadas en ingeniería genética para realizar construcciones quiméricas con diferentes fines (clonado molecular, producción de proteínas recombinantes, vectores de transferencia para transgénesis, vacunas a ADN, etc). En los plásmidos utilizados como vectores de clonado, se han insertado genes indicadores (que confieren resistencia a un antibiótico o que generan un compuesto coloreado a partir de otro incoloro, por ejemplo). Los vectores contienen un sitio múltiple de clonado para incorporar los fragmentos de ADN que se desean clonar, denominados MCS (de Multiple Cloning Site). Asimismo la mayoría, si no todos los vectores que se usan en la actualidad, se han construido de manera que se detecte con facilidad si ha tenido lugar la incorporación de un fragmento de ADN en el sitio de clonaje. En el primer ejercicio, estudiaremos dos vectores de clonado, utilizados rutinariamente en un laboratorio de biología molecular, y cómo seleccionar los clones recombinantes en E. coli; en los dos sistemas.

OBJETIVO: Se quiere colocar un fragmento de ADN que contiene el gen ahp (aminoglycoside 3'phosphotransferase) que codifica para la resistencia al antibiótico Kanamicina (kanr) en los vectores pACYC184 y en pUC18, en un sitio adecuado de clonado. Dicho gen de resistencia a Kanamicina (kanr) será obtenido desde el plásmido pUC4K, en el cual está flanqueado por varios sitios de restricción. a) Averigüe qué tipo de plásmido es pUC4K. b) Como realizaría dicho clonado en el laboratorio?

PROTOCOLO SUGERIDO La siguiente es una guía básica de cómo podemos realizar el clonado de un gen en el laboratorio de biología molecular. - Obtener cultivos de las cepas que contienen los vectores necesarios, en las condiciones óptimas de cultivo. - Aislar y purificar el ADN plasmídico mediante el método de miniprep alcalina. - Obtener el fragmento BamHI, conteniendo el gen de resistencia a Kmr, por digestión del pUC4K con dicha enzima. - Correr la mezcla de digestión en un gel de agarosa, previa inactivación de la enzima de restricción 25

(realizar un esquema del resultado esperado luego de la corrida electroforética) - Purificar el fragmento conteniendo el gen de interés del gel de agarosa. Podemos utilizar algún kit comercial para este propósito (¿En qué se fundamentan estos kits para purificar ADN?). - Paralelamente debemos digerir con la enzima adecuada los vectores, pUC18 y de pACYC184, lo que produce un único fragmento lineal con extremos cohesivos BamHI (realizar un esquema del resultado esperado luego de la corrida electroforética). - Ligación: mezclar el fragmento que contiene el gen de resistencia al antibiótico, obtenido de pUC4K con los plásmidos linearizados en proporciones adecuadas, añadir ligasa, una enzima que reconecta los fragmentos de ADN, para obtener el plásmido recombinante deseado. - Transformar con la mezcla de ligación, células competentes (obtenidas mediante el protocolo de cloruro de calcio). - Las células transformantes deberían haber recibido un plásmido recombinante con el gen de resistencia al antibiotico kanamicina. Los transformantes tienen que seleccionarse en un medio selectivo, pues es la única forma de distinguirlos de las células no transformadas que no han recibido el plásmido. El procedimiento de selección se basa en las diferentes propiedades que distinguen a las células originales de aquellas que adquirieron el plásmido recombinante por transformación. El método de selección es diferente para cada uno de los vectores, pUC18 y pACYC184. Para el primero, lo ideal es realizar selección de colonias azul/blanca y presión selectiva (utilizando los antibióticos correspondientes), de acuerdo a las propiedades que permiten seleccionar a cada tipo de célula. Éstas se resumen en la siguiente tabla: Tipo de célula

Kanamicina

Ampicilina

Color de colonia

sin plásmido

sensible

Sensible

blanco

con pUC18

sensible

Resistente

azul

con plásmido recombinante

resistente

Resistente

blanco

Para pACYC184 utilizamos selección por inactivación insercional, a continuación una tabla resumiendo los fenotipos posibles Tipo de célula

Kanamicina

Tetraciclina

Cloranfenicol

sin plásmido

sensible

Sensible

sensible

con pACYC184

sensible

resistente

resistente

con plásmido recombinante

resistente

Sensible

resistente

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Proponer posibles usos y ventajas de las nuevas construcciones realizadas.

Ejercicio N°2: Estudio de la expresión diferencial de genes Display diferencial (DD-PCR) Introducción: En la actualidad, la capacidad de secuenciar genomas completos ha impulsado a la investigación científica en la dirección de definir la función de cada uno de los genes identificados (Genómica funcional). Para contribuir con ese objetivo se han diseñado técnicas que permiten estudiar la 27

expresión génica global en un determinado tejido y en un momento particular del desarrollo. Absolutamente todas las células que componen un organismo contienen la misma información genética en su ADN. Sin embargo, no todos los genes se expresan en todas las células, ni lo hacen todo el tiempo, ni durante el mismo período. Decir que un gen se está expresando significa que, a partir de ese gen, se está transcribiendo el ARNm (mensajero) que a su vez dirigirá la síntesis de la proteína correspondiente. Es esa expresión diferencial de genes la que define que en un mismo organismo existan muchos tipos celulares. Por ejemplo, sabemos que un osteocito no se parece a un fibrocito. Sin embargo, ambos derivan de un mismo tejido básico, el tejido conectivo. Esto se debe a que existen mecanismos de regulación de la expresión génica que definen qué genes se expresan y en qué momento en cada tipo celular.

Objetivo: Obtener todos los clones de ADNc (de longitud completa), correspondientes a los ARNm que se transcriben diferencialmente en los osteocitos y fibrocitos. Para ello emplearemos la técnica de Display Diferencial de ARN, también conocida como huellas digitales de ARN (RNA fingerprinting) que está basada en la amplificación por PCR de subgrupos al azar de transcriptos a partir de 2 o más muestras. Sus ventajas incluyen la habilidad de aislar genes de función relacionada sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad y el uso de técnicas comunes de biología molecular que no requieren equipos especializados de detección y análisis.

Protocolo: 1) Purificación de ARN Total: a) Extracción con tiocianato de guanidina, fenol y cloroformo (nombre comercial del reactivo: TRIZOL): el tiocianato de guanidina (inactiva las RNAsas) y fenol ácido forman una única fase con la muestra (previamente molida) y luego se agrega cloroformo para formar las dos fases (ver esquema).

b) Precipitación: etanol 96% y acetato de sodio a -70°C. La purificación de ARNm se debe realizar para ambos tipos celulares, y todos los pasos subsiguientes se realizan en dos tubos, uno para cada muestra en este caso. 2) Purificación de ARNm: se puede realizar mediante cromatografía de afinidad con esferas de oligo28

dT en columna. Existen en el mercado kits comerciales para la purificación de ARN, que permiten obtener preparados de muy buena calidad. 3) Síntesis de ADNc: se utiliza como cebador de la transcripción reversa un oligo dT anclado, con dos bases adicionales al extremo 3´ del ARN mensajero (por ejemplo 5’-(T)12AC-3’). Estos oligonucleótidos se fijan al ARNm a través de la unión de las bases adicionales, impidiendo que el poliT “resbale” sobre distintas zonas del poli A. Esto permite hacer una primera selección de un subgrupo de mensajeros ya que el único grupo de ARNm que es transcripto en forma reversa es el integrado por las moléculas que llevan las bases complementarias adyacentes al poliA, en este ejemplo, GT(A)n.

4) Amplificación de segmentos de los transcriptos: se realiza usando como cebadores el mismo oligodT empelado para la retrotranscripción en combinación con un cebador de 10 pb (decámero) de secuencia arbitraria (al azar).

5) Electroforesis y revelado de los fragmentos: se realiza en geles de poliacrilamida y se puede revelar marcando uno de los cebadores con un nucleótido radiactivo o un fluoróforo o sin marcar, tiñendo posteriormente con nitrato de plata. Los fragmentos que están presentes en una muestra y ausentes en la otra, o aquellos que están presentes con diferentes intensidades relativas en los distintos tratamientos experimentales, representan potenciales transcriptos de ARNm de expresión diferencial.

6) Aislamiento, re-amplificación y secuenciación de bandas de interés: las bandas de amplificación de interés son escindidas de gel, reamplificadas con los mismos cebadores y secuenciadas.

Los fragmentos de transcriptos obtenidos representan secuencias parciales de las regiones que se transcriben de un genoma. Se estima que el uso combinado de 12 oligos dT anclados con 20 decámeros al azar (240 combinaciones) representaría estadísticamente a todos los ARNm originalmente presentes en la muestra. Estas secuencias cortas se denominan etiquetas de secuencia expresadas o ESTs (por Expressed Sequence Tags). Estas secuencias pueden ser almacenadas en bases de datos específicas. El DD-PCR es una técnica cualitativa y/o semicuantitativa que nos permite detectar a los genes que se están expresando diferencialmente pero necesitan de la confirmación mediante técnicas cuantitativas (como PCR en tiempo real) que nos pueden indicar cuanto más o menos se está expresando el gen en diferentes circunstancias.

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transcripción reversa usando el oligo dT anclado 5’-(T)12AC-3’.

PCR mediante el cebador anclado 5’-(T)12AC-3’ y un decamero al azar Muestra 1

Muestra 2

Una vez confirmada la expresión diferencial de los ESTs, podemos seguir dos caminos: a) Síntesis de los extremos 3’ y 5’ del ADNc para conocer la secuencia completa del transcripto correspondiente. Esto se puede realizar mediante la técnica de RACE (ver ejercicio Nº 4). b) Si disponemos de una biblioteca genómica completa de ADN de osteocitos o fibrocitos usaremos los ADNc diferenciales para generar sondas con las que haremos una búsqueda o “screening” en la biblioteca para aislar los clones genómicos que contengan los genes correspondientes.

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Una biblioteca genómica es una colección de clones (vectores de alta capacidad, BACs YACs, etc) realizada a partir de un conjunto de fragmentos de ADN que representan al genoma de un organismo. Una sonda es un fragmento de ADN de secuencia complementaria al gen que se desea aislar, que se marca radioactivamente y al hibridar, etiqueta o marca la colonia donde está clonado nuestro gen de interés.

Ejercicio N°4: PRODUCCIÓN DE UNA PROTEÍNA EUCARIOTA A GRAN ESCALA MEDIANTE EXPRESIÓN EN UN SISTEMA DE EXPRESION HETERÓLOGO Introducción La expresión de proteínas heterólogas se ha convertido en una herramienta biotecnológica muy útil y se logra mediante la inserción y consiguiente expresión del gen que expresa la proteína de interés en un organismo diferente, lo que implica utilizar la maquinaria de síntesis de proteínas del mencionado organismo para producirlas. La elección del organismo para expresar la proteína de interés depende en gran medida del organismo de origen, y de las características fisicoquímicas de la proteína a producir. Los sistemas eucariotas (levaduras, plantas, células de animales) tienen la ventaja de que introducen modificaciones postraduccionales como glicosilaciones, eliminación de la metionina inicial, creación de puentes disulfuro, entre otras, de manera similar a lo que ocurre con las proteínas endógenas de origen eucariota. Los sistemas procariotas expresan proteínas solubles o en forma de agregados intracelulares o cuerpos de inclusión. Son generalmente mucho más fáciles para trabajar y son útiles en la mayoría de las aplicaciones, sin embargo tienen importantes limitaciones para expresar proteínas eucariotas completamente funcionales. Esto es debido a que no realizan sobre las proteínas la mayoría de las modificaciones postraduccionales que realizan las células eucariotas y que permiten a las proteínas plegarse de forma correcta para ser plenamente funcionales. Escherichia coli es uno de los modelos más simples para la producción de proteínas recombinantes. Una de las formas de expresión heteróloga en E. coli es la producción de proteínas de fusión, que se forman mediante la fusión del gen de interés a otras secuencias (colas o “tags”) que codifican para péptidos o proteínas que facilitan la purificación y localización de las proteínas heterólogas. En el siguiente caso de aplicación, estudiaremos una posible estrategia de clonado para la expresión heteróloga de una proteína de un hongo, Colletotrichum lindemuthianum, en E.coli. Se detectó actividad subtilisina en un extracto de micelio proveniente del hongo C. lindemuthianum y se identificó por electroforesis (en gel de poliacrilamida) la proteína que posee dicha actividad, 31

determinándose un peso molecular aproximado de 27 kDa. Luego de purificarla a homogeneidad mediante técnicas cromatográficas, se consiguió secuenciar por métodos espectrométricos (análisis de masas) dos péptidos, obtenidos por digestión tríptica de la misma, de 12 y 18 aminoácidos ubicados hacia los extremos N y C terminal, respectivamente.

NH2

COOH péptidos de secuencia conocida

Objetivo: Clonado y expresión de una subtilisina de Colletotrichum lindemuthianum en E.coli. Protocolo sugerido: 1) Diseño y síntesis de cebadores degenerados para PCR a partir de las secuencias aminoacídicas de los péptidos conocidos (secuenciados anteriormente). Los cebadores degenerados se diseñan teniendo en cuenta todos los codones posibles para cada aminoácido, resultando una mezcla de cebadores con las diferentes combinaciones. Los cebadores degenerados se representan de la siguiente manera: F deg: 5´-MTNTTYGGNGCNGCNGCNACN-3´ R deg: 5´-TTYSWNTTYCCNATRKCNCGN-3´ Donde, por ejemplo, M representa las bases A o C y N corresponde a cualquiera de las cuatro bases. Se sugiere buscar en internet el resto de los códigos de una sola letra para representar las ambigüedades del código genético.

2) Extracción del ARN total de un cultivo de C. lindemuthianum productor de la proteína de interés y síntesis de ADNc mediante retrotranscripción, utilizando un oligo dT como cebador.

3) Amplificación de la región central del ADNc sintetizado, mediante PCR usando los cebadores degenerados. En este paso el producto ya será un fragmento de ADNc correspondiente a nuestro gen de interés. F deg

R deg

5’

3’ Amplificación y secuenciación de este fragmento de ADNc

4) Clonado del fragmento de amplificación en vectores adecuados (del tipo TA) y secuenciación.

32

5) Para poder expresar esta proteína en E. coli necesitamos obtener la secuencia completa del ARNm por lo que debemos ahora usar una técnica que nos permita avanzar hacia los extremos 5’ y 3’. Para este fin se procederá a la construcción de una biblioteca de ADNc del tipo RACE (Rapid Amplification of ADNc Ends) que consiste en sintetizar todos los ADNc correspondientes a los ARNm de la muestra con fragmentos de secuencia conocida (que ya vienen en un kit comercial) adosados en los extremos 5’ y 3’. Lo primero que se realiza es una nueva purificación de ARNm, a los cuales se liga un oligonucleótido de ARN en el extremo 5’ mediante una ligasa de ARN. Posteriormente se sintetiza la primera hebra de ADNc pero esta vez con un cebador oligo dT que tiene un fragmento de ADN de secuencia conocida en el extremo, quedando de esta manera esa secuencia conocida en el extremo 3’ de la primera hebra de ADNc sintetizada. El resultado de estos primeros pasos será una biblioteca que contiene todos los ADNc modificados en sus extremos (ver figura).

6) Diseño de cebadores específicos de cada gen, para realizar la técnica de RACE: los cebadores 5’ y 3’ (los cuales inician la reacción de amplificación hacia los extremos 5’ y 3’ respectivamente) son diseñados por el usuario a partir de la secuencia conocida (fragmento central de nuestro gen problema), clonada y secuenciada previamente (paso 4) y serán usados en combinación con los cebadores provistos por el kit, los cuales son complementarios a las secuencias adosadas en el paso 5. Se realizan dos reacciones por separado, una para obtener el extremo 5’ y otra para el extremo 3’. Al igual que en los pasos anteriores, el producto de cada una de estas reacciones debe ser clonado en un vector adecuado, y secuenciado.

7) Las secuencias obtenidas en el paso anterior serán ensambladas con el fragmento central mediante un programa de edición de secuencias (softwares bioinformáticos).

Esquema de amplificación de los extremos 5’ y 3’: Secuencia conocida Fragmentos adosados por la técnica RACE, de secuencia conocida

5’

3’ Cebadores diseñados por el usuario Cebadores complementarios a las secuencias adosadas (Kit GENRACER de Invitrogen)

5’

Fragmentos 5’ y 3’ amplificados cuya secuencia será ensamblada con la anterior para tener la secuencia completa del ARNm (ADNc)

3’

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Secuencia completa del ADNc del transcripto maduro: atgcacttctcgaccctttttggcgccgcggctactgctgctctcgctggcagcacgaacgcaagg tacgtcgccggcggctccttgggcccttgacacagacaccccagactgacacaactcacagccctc tcgcccgtcgccaggttcccgtgggcacacccatcctccagtgcacccagcctggtctggttgccc tgacctacgacgacggtcccttcaccttcaccccgcagctcctcgacatcttgaagcagaacgacg tcagggcgacctttttcgtcaacggcaacaactgggccaacatcgaggccggatccaaccccgaca ccatccgccgcatgcgcgccgacggccacctcgtcggctctcacacgtacgctcacccggacctca acacgctctcctccgcggaccgcatctcccagatgcggcacgtcgaggaggctacccgccgcatcg acggcttcgcgcccaagtacatgcgcgcgccctacctgtcgtgcgacgcgggctgccagggcgacc tcggcggcctcggataccacatcatcgacaccaacctcgacaccaaggactacgagaacaacaagc ccgagaccacgcacctctcggccgagaagttcaacaacgagctgagcgccgacgtcggcgccaaca gctacattgtcctctcgcacgacgtccacgagcagacggtcgtctccctcacgcagaagctgattg acacgctcaagagcaagggctaccgcgccgtcaccgtcggcgagtgcctcggcgacgccccggaga actggtacaaggcgtaa 8) Una vez obtenida la secuencia completa del ADNc del transcripto maduro se procede al clonado del mismo en un vector de expresión que permita sintetizar una proteína de fusión marcada en el extremo C terminal con una cola de 6 residuos de Histidina (6xHis-tag). Para esto se seguirá el siguiente protocolo: -Diseño de cebadores de PCR que hibriden en los extremos de la secuencia del ADNc de nuestro gen de interés: Se deberá tener en cuenta el vector de expresión a usar, si queremos fusionar un tag de histidinas en un extremo de la proteína, y ese tag (o sea el fragmento de ADN que codifica para los seis residuos de histidina) se encuentra en el vector de expresión, se deberá excluir el codón de terminación del ADNc para que la traducción continúe y se sintetice el tag de histidinas fusionado a la proteína en el extremo C terminal. La traducción terminará en este caso gracias a un codón de terminación ubicado también en el vector luego de la secuencia codificante del tag. Es necesario introducir en los extremos de los cebadores secuencias de sitios de corte de enzimas de restricción (una enzima diferente a cada extremo) que produzcan extremos cohesivos y permitan orientar la ligación del ADNc en el vector (que en su MCS tendrá los mismos sitios de corte). El plásmido recombinante obtenido será introducido por transformación a una cepa de E.coli, que se elegirá dependiendo de la proteína que deseamos expresar.

9) Una vez expresada la proteína recombinante en E. coli, se procederá a su extracción y purificación. Esto último puede realizarse mediante una cromatografía de afinidad usando una columna de Ni2+-NTA (níquel-ácido nitrilotriacético) agarosa la cual une específicamente el His-tag que posee la proteína recombinante.

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Gen sin codón de terminación Codón de terminación en el vector

ligación

Transformación en E. coli

Expresión y purificación

Subtilisina con tag de histidinas

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