Laboratorio Nº 2 Lípidos
Universidad Nacional del Nordeste Licenciatura en Ciencias Biológicas
LABORATORIO Nº 2 Lípidos
OBJETIVOS * Conocer las propiedades fisicoquímicas fundamentales de los Lípidos. * Comprobar la acción que poseen las fosfolipasas sobre los fosfolípidos.
INTRODUCCIÓN TEÓRICA Bajo el término Lípidos se agrupan un gran número de compuestos, de estructura química variada, que tienen la propiedad común de ser solubles en solventes orgánicos e insolubles en agua. Los lípidos, ampliamente distribuidos en animales y vegetales, comprenden un grupo heterogéneo de sustancias similares entre sí por sus características de solubilidad: son nada solubles en agua y solubles en solventes orgánicos. Esta propiedad se explica por la escasa polaridad de sus moléculas. Los lípidos no forman estructuras poliméricas macromoleculares como las de los polipéptidos o polisacáridos; su masa no alcanza valores muy elevados. El estudio de los lípidos tiene especial interés desde el punto de vista biológico: a) son componentes esenciales de los seres vivos; constituyen parte fundamental de las membranas celulares; b) en animales forman el principal material de reserva energética (grasas neutras); c) desde el punto de vista nutritivo, los lípidos de alimentos son importantes fuentes de energía por su alto contenido calórico y, además, vehiculizan vitaminas liposolubles; d) numerosas sustancias de notable actividad fisiológica están relacionadas con este grupo de compuestos: hormonas, algunas vitaminas, ácidos biliares. De acuerdo con la complejidad de su molécula, se distinguen dos categorías de lípidos, simples y complejos. Existen además otras sustancias que comparten las propiedades de solubilidad de los lípidos y se asocian a ellos en la naturaleza. Son lípidos simples los acilgliceroles y las ceras. Los lípidos complejos comprenden por un lado a los fosfolípidos y gliceroglicolípidos, y por el otro a los glicoesfinfolípidos y fosfoesfingolípidos. Entre las sustancias asociadas a lípidos se consideran diversos compuestos, como esteroles, terpenos, vitaminas liposolubles, etc. En la molécula de casi todos los lípidos se encuentran ácidos orgánicos monocarboxílicos denominados genéricamente ácidos grasos. La importancia de estos compuestos en la constitución de lípidos y en la determinación de sus propiedades aconseja su estudio en primer término. La hidrólisis de un fosfolípido de membrana, en ciertas ocasiones presenta particular interés dado que algunos ácidos grasos que están esterificados al glicerol pueden actuar como sustratos metabólicos importantes, tal es el caso del Ácido Araquidónico. Otro ejemplo en donde la hidrólisis de fosfolípidos es importante se da en la intoxicación ofídica. La serpiente Crotalus durissus terrificus (cascabel) posee un veneno compuesto por una conjunto de proteínas e iones. Una de las toxinas más importantes posee actividad Fosfolipasa (PLA2).
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ACTIVIDADES 1) Ensayos de solubilidad: Fundamento: los lípidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas gotitas formando una emulsión de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo, por reagrupación de las gotitas de lípido en una capa que, por su menor densidad, se sitúa sobre la de agua. Si a esta mezcla se le agrega algún agente emulsionante ambas fases se combinan para formar una emulsión estable, en la cual es posible observar una sola fase debido a la formación de pequeñas micelas. Por el contrario, los lípidos con solubles en los llamados disolventes orgánicos como el éter, benceno, cloroformo, acetona, etc., debido a que poseen una estructura química similar. a) En un tubo de ensayo colocar 3 gotas de aceite y 3 ml de agua. Agitar fuertemente. Observar. Dejar en reposo. Volver a observar. b) Repetir el ensayo agregando previamente al aceite 1 ml de solución de NaOH al 40 %. Calentar de ser necesario. c) Comparar la estabilidad de las emulsiones en ambos casos. d) Preparar tres tubos de ensayo con 3 gotas de aceite en cada uno. e) Agregar al primer tubo 1 ml de cloroformo, al segundo tubo 1 ml de acetona y al tercero 1 ml de tetracloruro de carbono. f) Agitar, observar y comparar los resultados. 2) Manchas en papel: Fundamento: el papel está constituido por fibras de celulosa, las cuales actúan a modo de esponja adsorbiendo los lípidos que constituyen el aceite, la grasa o la margarina, favoreciendo así la transmisión de la luz (rellenando los espacios vacios). La diferencia entre el grado de insaturación dará distintos grados de translucidez. a) Sobre un trozo de papel verter una gota de aceite. b) Sobre otro trozo de papel untar una pequeña cantidad de manteca. c) Sobre un tercer trozo de papel frotar un poco de grasa animal. d) Observar los tres trozos de papel al trasluz. Comparar los resultados. 3) Oxidación: Fundamento: la cadena carbonada de los lípidos puede reaccionar con el oxígeno del aire para dar peróxidos (R–O–O–R), los cuales sufren un reordenamiento que ocasiona un desplazamiento del doble enlace y la formación de hidroperóxidos (R–OOH) que transmiten a los alimentos el olor y sabor rancio, y en los tejidos pueden causar distintos tipos de daño (envejecimiento, enfermedades inflamatorias, cáncer, etc.) Los efectos nocivos se inician por los radicales libres (ROO', RO' ,OH' ) producidos durante la formación de peróxido. Cuanto más insaturado es un lípido más fácilmente sufre estas oxidaciones. Este fenómeno se acelera por acción de la luz y el calor. a) Engrasar bien un trozo de papel con una espátula. b) Encender el trozo de papel engrasado. c) Observar la llama. d) Soplar hasta apagar la llama y anotar el olor percibido.
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4) Hidrólisis de Fosfolípidos: Fundamento: el mecanismo de acción de la toxina es la hidrólisis de la unión éster del carbono 2 presente en los fosfolípidos y de esto resulta la liberación de un acido graso y un lisofosfolípido con acción detergente sobre la membrana de los glóbulos rojos. Materiales: • Yema de Huevo (fuente de fosfolipido). • 0,3 g de Agar para disolver en 20 ml de buffer PBS. • Glóbulos rojos lavados con solución fisiológica. • CaCl2, la enzima de Cascabel es calcio dependiente. a) Disolver el agar en solución Fisiológica y calentar en baño maría hasta la disolución final de este. b) Dejar enfriar hasta los 50°C que es el momento de añadir los glóbulos rojos lavados, la yema de huevo, el CaCl2 y una pizca de azida sódica. c) Colocar esta mezcla en placas de plástico o vidrio y dejar solidificar. d) Sembrar la placa con las muestras e incubar en estufa a 37°C. e) Leer los halos de hemólisis a las 18 hs.
CUESTIONARIO 1. ¿Qué familias de compuestos químicos se asocian bajo la denominación común de lípidos? 2. Explique por qué los lípidos (Grasas y Aceites) son insolubles en agua. 3. ¿A qué se debe el alto poder combustible de los lípidos? 4. ¿Qué es la saponificación? ¿Cómo actúa un detergente? 5. Esquematice la reacción de hidrólisis de un fosfolípido catalizada por la PLA2 presente en el veneno de Cascabel.
BIBLIOGRAFÍA Morrison, Boyd. Química Orgánica. Fondo Educativo Interamericano. S.A. México. 1996. Fox, Mary. Química Orgánica. Segunda edición. Addison Wesley. México. 2000. Blanco, A. Química biológica. Séptima edición. Editorial El Ateneo.
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