UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMAS MEDICINA Y ENFERMERIA IV SEMESTRE ASIGNATURAS: MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA BASICO CLINICA Y CUIDADO DE LAS PERSONAS CON PROCESOS INFECCIOSOS

GUIA ELABORADA POR LILIANA CALDAS ARIAS DOCENTE DEPARTAMENTO MEDICINA INTERNA

TINCION DE GRAM METODOLOGIA DE ENSEÑANZA. Revise y estudie la presente guía para su discusión y aplicación en el desarrollo del laboratorio número 1 en la unidad de Bacteriología. PROPOSITOS EDUCATIVOS 1. Conocer la utilidad de la tinción de Gram como herramienta para el diagnóstico microbiológico de algunos procesos bacterianos. 2. Conocer el fundamento de la coloración de Gram. 3. Adquirir conocimientos teórico-prácticos sobre la realización de esta técnica de coloración. 4. Realizar lecturas microscópicas para identificación bacteriana preliminar.

UTILIDAD. Ya que por el método de coloración de Gram, tanto las bacterias patógenas, oportunistas y las que hacen parte de la flora normal pueden teñirse y observadarse, es importante tener en cuenta el sitio anatómico de donde provienen las muestras clínicas y su adecuada recolección para que la tinción de Gram, constituya una herramienta de utilidad diagnóstica en las infecciones bacterianas. La tinción de Gram tiene valor diagnóstico y puede ser aplicada a diversos y múltiples tipos de especimenes clínicos como líquidos corporales estériles (LCR), exudados, excreciones (orina), secreciones (esputo), abscesos y tejidos. También puede aplicarse a diferentes tipos de materiales de uso hospitalario como catéteres y soluciones para el diagnóstico y control de las enfermedades intrahospitalarias. El uso de la tinción de Gram es LIMITADO en muestras de materia fecal y NO tiene valor en muestras faríngeas como en el caso de faringitis estreptocócica y en muestras nasofaríngeas. La observación de esta tinción permite encontrar características como forma (cocos, bacilos, cocobacilos y espirilos), agrupación (parejas, racimos, cadenas y empalizadas), y tamaño de las células bacterianas a partir tanto de muestras clínicas como de cultivos bacterianos. En la interpretación de este método es relevante considerar la presencia de respuesta leucocitaria o respuesta inflamatoria y otro tipo de células del huésped como células epiteliales, con el fin de orientar la presencia de infección aguda o crónica y en algunos casos permitir la evaluación de la calidad de la muestra clínica como sucede con las muestras de esputo. REACTIVOS. La tinción de Gram utiliza en orden estricto de primero a cuarto los siguientes reactivos: 1. CRISTAL VIOLETA o violeta de genciana:COLORANTE BASICO 2. LUGOL DE GRAM: MORDIENTE 3. ALCOHOL - ACETONA: DECOLORANTE 4. FUSCINA (SAFRANINA): COLORANTE DE CONTRASTE

FUNDAMENTO. El cristal violeta sirve como colorante básico uniéndose a la pared celular bacteriana, con al ayuda del mordiente que refuerza la unión del colorante. Las bacterias GRAM POSITIVAS debido a la estructura y composición bioquímica de su pared celular retiene el complejo cristal violeta-lugol y aún después del tratamiento con el decolorante conserva el colorante básico, por lo que se observan al microscopio de color azul oscuro o violeta una vez concluida la técnica de tinción.

Las bacterias GRAM NEGATIVAS pierden el colorante básico cuando son tratadas con el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lípidico de la pared celular lo que aumenta la permeabilidad celular, dando como resultado la pérdida del complejo cristal violetalugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste, razón por la cual estas células bacterianas se observan al microscopio de color rosado una vez concluida la técnica de tinción. TÉCNICA 1. Marcar y realizar un extendido delgado de la muestra clínica o de una colonia sobre un portaobjetos (placa) y dejar secar. 2. Fijar el material a estudio a la placa pasándola 2 o 3 veces por la llama de un mechero evitando el excesivo calentamiento. 3. Colocar la placa sobre un soporte y cubrirla con cristal violeta durante un minuto. 4. Lavar con agua corriente. 5. Cubrir la placa con lugol de Gram durante un minuto. 6. Lavar con agua corriente. 7. Cubrir la placa con alcohol-acetona durante 5 segundos. 8. Lavar con agua corriente. 9. Cubrir la placa con fuscina ( safranina) durante un minuto. 10. Lavar con agua corriente. 11. Dejar secar al aire 12. Observar al microscopio con aceite de inmersión, objetivo de 100X, condensador abierto totalmente para que la luz pase y se obtenga buena iluminación INFORME DE RESULTADOS. Una tinción de Gram a partir de un espécimen clínico debe contener la siguiente información:
Respuesta leucocitaria y su tipo ya sea PMN o MN (polimorfonuclear o mononuclear respectivamente) en términos de escasa moderada o abundante cantidad.
Forma, coloración y a veces agrupación bacteriana en términos de escasa moderada o abundante cantidad.
En muestras de esputo sirve para evaluar la calidad de la muestra y se deben contar los PMN y las células epiteliales con objetivo de 10X además de informar los morfotipos bacterianos. OBSERVACIÓN La flora bacteriana observada con la tinción de Gram se informa por género y a veces agrupación pero no se indica la especie ya que solo la identificación mediante pruebas bioquímicas a partir de cultivos permite precisar la especie. REQUERIMIENTOS DEL ESTUDIANTE  Traer preparado este material para su discusión  Guantes, tapabocas y bata de manga larga,  Jabón y toalla para el secado de manos  Traer Colores: entre otros Azul oscuro y Rosado

ATENCION ESTUDIANTES MEDICINA Y ENFERMERIA: Para mejorar su aprendizaje en el área de Bacteriología Clínica le recomiendo la asistencia puntual a las clases y laboratorios, usted deberá ampliar algunos conceptos de manera independiente y para lograrlo al finalizar este documento hay unos textos que orientaran su búsqueda, también se le recomienda el uso del diccionario médico para aclarar algunos términos que usted debe dominar.