Portada: Paisaje rural de la vereda Brasilia, municipio de Tello, sobre la Cordillera Oriental, dentro de la zona endemo-epidémica para leishmaniasis cutánea en el departamento del Huila, ubicada aproximadamente a 1600 m.s.n.m. La región es dominada por cafetales tecnificados al sol y pastizales; los bosques y cafetales tradicionales se presentan en fragmentos ocupando solo una pequeña parte del paisaje. Las viviendas, dispersas, son construidas principalmente en bahareque con techos de zinc y presentan muchas aperturas que facilitan acceso de los flebótomos.

Raúl H. Pardo Grupo de Entomología Subdirección de Investigación Instituto Nacional de Salud

Biomédica Instituto Nacional de Salud Volumen 26, Suplemento No. 1, Leishmaniasis - Bogotá, D.C., Colombia - Octubre, 2006 EDITORES INVITADOS

NANCY GORE SARAVIA CIDEIM Cali, Colombia

RUBÉN SANTIAGO NICHOLLS Instituto Nacional de Salud Bogotá, D.C., Colombia

COMITÉ EDITORIAL EDITOR INVITADO MIGUEL A. GUZMÁN Bogotá, D.C., Colombia

EDITORES ASOCIADOS

ELIZABETH CASTAÑEDA, editora jefe Instituto Nacional de Salud Bogotá, D.C., Colombia

CARLOS ARTURO HERNÁNDEZ, editor ejecutivo Bogotá, D.C., Colombia

LEONARD MUNSTERMANN Yale University School of Medicine New Haven, CN, Estados Unidos

ÁNGELA RESTREPO Corporación para Investigaciones Biológicas Medellín, Colombia

LUIS ALBERTO GÓMEZ Instituto Nacional de Salud Bogotá, D.C., Colombia

RICARDO SÁNCHEZ Universidad Nacional de Colombia Bogotá, D.C., Colombia

MARÍA CRISTINA FERRO Bogotá, D.C., Colombia

OMAR SEGURA Instituto Nacional de Salud Bogotá, D.C., Colombia

SECRETARIA DEL COMITÉ LINDA GRACE MOLANO C OMITÉ C IENTÍFICO JUAN MANUEL ANAYA Corporación para Investigaciones Biológicas Medellín, Colombia

LUIS GABRIEL CUERVO Organización Panamericana de la Salud Washington, D.C., Estados Unidos

ARNOLDO BARBOSA RAMÍREZ Hospital Clínic, Universidad de Barcelona, Barcelona, España Centro de Investigação Em Saude Da Manhiça, Manhiça, Mozambique

PATRICIA DEL PORTILLO Corpogén Bogotá, D.C., Colombia

ANTONIO BERMÚDEZ Instituto Nacional de Salud Bogotá, D.C., Colombia JORGE H. BOTERO Universidad de Antioquia Medellín, Colombia VÍCTOR CÁRDENAS University of Texas El Paso, TX, Estados Unidos ALBERTO CONCHA-EASTMAN Organización Panamericana de la Salud Washington, D.C., Estados Unidos ZOILO CUÉLLAR Academia Nacional de Medicina Bogotá, D.C., Colombia

ANDRÉS DE FRANCISCO Foro Global para la Investigación en Salud Ginebra, Suiza FERNANDO DE LA HOZ Universidad Nacional de Colombia Bogotá, D.C., Colombia JOSÉ LUIS DI FABIO Organización Panamericana de la Salud Washington, D.C., Estados Unidos JORGE HERNANDO DONADO Universidad Pontificia Bolivariana Medellín, Colombia JOSÉ FIGUEROA World Health Organization Ginebra, Suiza LUIS FERNANDO GARCÍA Universidad de Antioquia Medelín, Colombia

ALBERTO GÓMEZ Pontificia Universidad Javeriana Bogotá, D.C., Colombia ENRIQUE GONZÁLEZ University of Texas Health Science Center at San Antonio San Antonio, TX, Estados Unidos JOHN MARIO GONZÁLEZ Universidad de los Andes Bogotá, D.C., Colombia FELIPE GUHL Universidad de los Andes Bogotá, D.C., Colombia ANTONIO IGLESIAS Universidad Nacional de Colombia Bogotá, D.C., Colombia JORGE JARA BID/Secretaría de Salud Tegucigalpa, Honduras ERNESTO JARAMILLO Organización Mundial de la Salud Ginebra, Suiza MARCELO LABRUNA Universidade de São Paulo São Paulo, Brasil

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JAIRO LIZARAZO Hospital Universitario Erasmo Meoz Cúcuta, Colombia JUAN GUILLERMO MCEWEN Corporación para Investigaciones Biológicas Medellín, Colombia

VÍCTOR E. REYES University of Texas Medical Branch Galveston, TX, Estados Unidos GERZAÍN RODRÍGUEZ Universidad de la Sabana Bogotá, D.C., Colombia

ROBERTO MENDOZA The Hospital for Sick Children Toronto, Ontario, Canada

GUSTAVO ROMÁN University of Texas Houston, TX, Estados Unidos

ALVARO MONCAYO Universidad de los Andes Bogotá, D.C., Colombia

PEDRO ROMERO Ludwig Institute for Cancer Research, Lausanne branch Lausana, Suiza

RICARDO NEGRONI Hospital de Infecciosas Francisco Javier Muñiz Buenos Aires, Argentina MARÍA TERESA OCHOA University of California Los Ángeles Los Ángeles, CA, Estados Unidos JUAN P. OLANO University of Texas Medical Branch Galveston, TX, Estados Unidos BLANCA RESTREPO University of Texas San Antonio, TX, Estados Unidos

ÁLVARO RUIZ Pontificia Universidad Javeriana Bogotá, D.C., Colombia GIOCONDA SAN BLAS Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas Caracas, Venezuela ÁLVARO SANABRIA Pontificia Universidad Javeriana Bogotá, D.C., Colombia

NANCY GORE SARAVIA CIDEIM Cali, Colombia ROBERT TESH University of Texas Galveston, TX, Estados Unidos ORLANDO TORRES-FERNÁNDEZ Instituto Nacional de Salud Bogotá, D.C., Colombia BRUNO TRAVI University of Texas San Antonio, TX, Estados Unidos GUSTAVO VALBUENA University of Texas Galveston, TX, Estados Unidos JUAN MIGUEL VILLALOBOS Universidade Federal de Rondônia Porto Velho, Brasil JOHN WALKER Cideim Cali, Colombia MOISÉS WASSERMAN Universidad Nacional de Colombia Bogotá, D.C., Colombia

 Instituto Nacional de Salud La revista Biomédica del Instituto Nacional de Salud es una publicación trimestral, eminentemente científica. Está amparada por la resolución número 003768 de 1981, emanada del Ministerio de Gobierno, y con tarifa postal reducida según resolución número 1128 del 5 de mayo de 1982. Ninguna publicación, nacional o extranjera, podrá reproducir ni traducir sus artículos ni sus resúmenes sin previa autorización escrita del editor. Ni la revista, ni el Instituto asumen responsabilidad alguna por los puntos de vista expresados por los autores. La revista no publicará ningún tipo de propaganda comercial. Los nombres de equipos, materiales y productos manufacturados que eventualmente puedan mencionarse, no implican recomendación ni propaganda para su uso y sólo se mencionan como identificación genérica. La revista Biomédica aparece reseñada en Index Medicus/Medline de la National Library of Medicine, en el índice de la Literatura Latinoamericana en Ciencias de la Salud (LILACS), en el Sistema de Información Bibliográfica Regional Andina (SIBRA), en CAB Abstracts, Review of Medical and Veterinary Entomology, y forma parte del Índice Nacional de Publicaciones Seriadas Científicas y Tecnológicas Colombianas de Colciencias y del Índice Latinoamericano de Revistas Científicas y Tecnológicas (LATINDEX). INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Avenida Calle 26 No. 51-60 Apartado aéreo 80334 y 80080 Bogotá, D.C., Colombia, S.A. URL: http://www.ins.gov.co [email protected]

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Contenido Editorial Leishmaniasis: un reto para la salud pública que exige concertación de voluntades y esfuerzos Nancy Gore Saravia, Rubén Santiago Nicholls ............. 5 Imágenes en biomedicina Historia natural de la leishmaniasis cutánea y mucocutánea Carlos Arturo Hernández ............................................... 10 Presentación de caso Tratamiento con miltefosina de la leishmaniosis cutánea diseminada Lina María González, Iván Darío Vélez ........................ 13 Artículos originales Estudio ultraestructural de la fagocitosis de promastigotes y amastigotes de Leishmania mexicana por la línea de células dendríticas FSDC Ladys Sarmiento, Martha Ayala, Sandra Peña, Gerzaín Rodríguez, Zelandia Fermín, Felix J Tapia ..... 17 Papel de la vacuola parasitófora de macrófagos de ratón infectados por Leishmania amazonensis en la adquisición de moléculas Tania M. Cortázar, Joselín Hernández, María Clara Echeverry, Marcela Camacho ................... 26

Lutzomyia longiflocosa, posible vector en un foco de leishmaniasis cutánea en la región subandina del departamento del Tolima, Colombia, y el conocimiento que tiene la población sobre este insecto Raúl H. Pardo, Olga Lucía Cabrera, Jorge Becerra, Patricia Fuya, Cristina Ferro .......................................... 95 Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) en un foco suburbano de leishmaniosis visceral en el Cañón del Chicamocha en Santander, Colombia Mónica Flórez, Junny Patricia Martínez, Reinaldo Gutiérrez, Katherine Paola Luna, Víctor Hugo Serrano, Cristina Ferro, Víctor Manuel Angulo, Claudia Magaly Sandoval ................................ 109 Seroprevalencia de leishmaniosis visceral canina en la comuna 8 de Neiva y en cuatro municipios de Huila, Colombia José Fernández, Felio Bello, Myriam Consuelo López, Ligia Inés Moncada, Jimmy Jolman Vargas, Martha Stella Ayala, Rubén Santiago Nicholls, Carlos Alberto Lozano .................................................. 121 Transmisión de Leishmania panamensis en ambientes domésticos: resultados de un estudio epidemiológico prospectivo en Santander, Colombia Gerardo Muñoz, Clive R. Davies ................................ 131

Análisis inmunohistopatológico comparativo de la reacción a la prueba cutánea de Montenegro en infección asintomática y en leishmaniasis cutánea aguda y crónica Nora Guarín, Gloria I. Palma, Claude Pirmez, Liliana Valderrama, Rafael Tovar, Nancy Saravia ......... 38

Distribución geográfica de especies de Leishmania aisladas de pacientes consultantes al Instituto Nacional de Dermatología Federico Lleras Acosta, E.S.E, 1995-2005 Clemencia Elena Ovalle, Luisa Porras, Maritza Rey, Melania Ríos, Yenny Carolina Camargo ..................... 145

Actividad fotodinámica de ftalocianina de aluminio (iii) y zinc (ii) en promastigotes de Leishmania Patricia Escobar, Indira P. Hernández, Cesar M. Rueda, Fernando Martínez, Edgar Páez .................................... 49

Prevención de leishmaniasis cutánea americana en Colombia mediante una intervención múltiple: resultados de un ensayo de grupos aleatorios Carlos A. Rojas, Kristen A. Weigle, Rafael Tovar, Alba L. Morales, Bruce Alexander ................................ 152

Efecto del tipo de sangre en la supervivencia y fecundidad del flebotomino Lutzomyia ovallesi Ortiz (Diptera:Psychodidae) vector de Leishmania Pedro Noguera, Maritza Rondón, Elsa Nieves .............. 57 Distribución de los vectores de Leishmania infantum (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) en Colombia Camila González, Olga L. Cabrera, Leonard E. Munstermann, Cristina Ferro ......................................... 64

Efecto del conocimiento y nivel socioeconómico sobre las actividades de control realizadas por la población en riesgo de adquirir leishmaniasis cutánea en la región subandina del departamento del Huila, Colombia Raúl H. Pardo, Alexander Carvajal, Cristina Ferro, Clive R. Davies ............................................................. 167

Flebotomofauna al sureste del estado Lara, Venezuela Luis Eduardo Traviezo ................................................... 73

Eficacia de un ácido kaurénico extraído de la planta venezolana Wedelia trilobata (Asterácea) contra Leishmania (Viannia) braziliensis Solanny Brito, Oscar Crescente, Alexis Fernández, Aura Coronado, Noris Rodriguez ................................. 180

Presencia en el peridomicilio de vectores infectados con Leishmania (Viannia) panamensis en dos focos endémicos en el occidente de Boyacá, piedemonte del valle del Magdalena medio, Colombia Erika Santamaría, Nubia Ponce, Yaneth Zipa, Cristina Ferro .................................................................. 82

Eficacia y tolerancia de la pentamidina en el tratamiento de la leishmaniasis cutánea producida por Leishmania (V.) panamensis en Colombia Sara María Robledo, Juan Alberto Puerta, Diana Lorena Muñoz, Mónica Guardo, Iván Darío Vélez ........................................................... 188

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Revisión de tema Estado actual y futuro de la terapia anti-leishmaniásica en Colombia Jaime Soto, Paula Soto ................................................. 194 Miltefosina oral para el tratamiento de la leishmaniasis Jaime Soto, Paula Soto ................................................ 207 Comunicación breve Especies de género Lutzomyia (Psychodidae, Phlebotominae) en áreas de transmisión de leishmaniasis tegumentaria y visceral en el departamento de Santander, en la cordillera oriental de los Andes colombianos Claudia Magaly Sandoval, Reinaldo Gutiérrez, Rocío Cárdenas, Cristina Ferro ................................... 218 Primer hallazgo de Lutzomyia tihuiliensis (Diptera: Psychodidae) en el valle de Aburrá, Colombia Eduar Elías Bejarano, Diana Sierra, Alveiro Pérez-Doria, Iván Darío Vélez ........................................................... 228

Leishmania (Leishmania) mexicana en el corregimiento de San Matías, municipio de Gómez Plata, Antioquia, Colombia Diana Sierra, Marcela Ochoa, José Ignacio Calle, Gisela García, Diana Colorado, Iván Darío Vélez ..... 232

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Foco de leishmaniasis en El Hobo, municipio de El Carmen de Bolívar, Bolívar, Colombia Luis Alberto Cortés ....................................................... 236 Infectividad del perro (Canis familiaris) para Lutzomyia youngi en Trujillo, Venezuela Dalila Hernández, Elina Rojas, José Vicente Scorza, Alicia Jorquera .............................................................. 242 Infección por Leishmania (Viannia) braziliensis en dos perros colombianos: una nota sobre infectividad para flebótomos y respuesta al tratamiento Bruno L. Travi, Carlos Javier Tabares, Horacio Cadena ............................................................ 249 Nota técnica Cuantificación de citocinas caninas mediante reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa en tiempo real Omar A. Saldarriaga, Bruno L. Travi, Peter C. Melby 254 Instrucciones para los autores

Contents Editorial Leishmaniasis: A public health challenge that demands concerted effort and will Nancy Gore Saravia, Rubén Santiago Nicholls ............. 5

sub-andean region of Tolima department, Colombia, and the knowledge on sandflies by the inhabitants Raúl H. Pardo, Olga Lucía Cabrera, Jorge Becerra, Patricia Fuya, Cristina Ferro ........................................... 95

Images in biomedicine Natural history of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis Carlos Arturo Hernández ................................................ 10

Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) at a suburban focus of visceral leishmaniasis in the Chicamocha Canyon, Santander, Colombia. Mónica Flórez, Junny Patricia Martínez, Reinaldo Gutiérrez, Katherine Paola Luna, Víctor Hugo Serrano, Cristina Ferro, Víctor Manuel Angulo, Claudia Magaly Sandoval ................................. 109

Case presentation Miltefosine for disseminated cutaneous leishmaniasis Lina María González, Iván Darío Vélez ......................... 13 Original articles Phagocytosis of promastigotes and amastigotes of Leishmania mexicana by the FSDC dendritic cell line: Ultrastructural study Ladys Sarmiento, Martha Ayala, Sandra Peña, Gerzaín Rodríguez, Zelandia Fermín, Felix J Tapia ...... 17 Role of the parasitophorous vacuole of murine macrophages infected with Leishmania amazonensis in molecule acquisition Tania M. Cortázar, Joselín Hernández, María Clara Echeverry, Marcela Camacho .................... 26 Comparative immunohistological analysis of the Montenegro skin test reaction in asymptomatic infection and in acute and chronic cutaneous leishmaniasis Nora Guarín, Gloria I. Palma, Claude Pirmez, Liliana Valderrama, Rafael Tovar, Nancy Saravia .......... 38 Photodynamic activity of aluminium (III) and zinc (II) phthalocyanines in Leishmania promastigotes Patricia Escobar, Indira P. Hernández, Cesar M. Rueda, Fernando Martínez, Edgar Páez ..................................... 49 Effect of blood source on the survival and fecundity of the sandfly Lutzomyia ovallesi Ortiz (Diptera: Psychodidae), vector of Leishmania Pedro Noguera, Maritza Rondón, Elsa Nieves ............... 57 Distribution of Leishmania infantum vector species in Colombia. Camila González, Olga L. Cabrera, Leonard E. Munstermann, Cristina Ferro .......................................... 64 Phlebotomine sandflies in the southeast of Lara state, Venezuela Luis Eduardo Traviezo .................................................... 73 Presence of infected vectors of Leishmania (V.) panamensis within dwellings in two endemic foci in the foothill of the middle Magdalena valley, western Boyacá, Colombia Erika Santamaría, Nubia Ponce, Yaneth Zipa, Cristina Ferro ................................................................... 82

Lutzomyia longiflocosa as suspected vector of cutaneous leishmaniasis in a focus of cutaneous leishmaniasis on the

Seroprevalence of canine visceral leishmaniasis in sector 8 of Neiva and in four municipalities of Huila, Colombia José Fernández, Felio Bello, Myriam Consuelo López, Ligia Inés Moncada, Jimmy Jolman Vargas, Martha Stella Ayala, Rubén Santiago Nicholls, Carlos Alberto Lozano ................................................... 121

Leishmania panamensis transmission in the domestic environment: the results of a prospective epidemiological survey in Santander, Colombia Gerardo Muñoz, Clive R. Davies ................................. 131 Geographic distribution of Leishmania species isolated from patients at the National Institute of Dermatology Federico Lleras Acosta E.S.E. 1995-2005 Clemencia Elena Ovalle, Luisa Porras, Maritza Rey, Melania Ríos, Yenny Carolina Camargo ...................... 145 A multifaceted intervention to prevent American cutaneous leishmaniasis in Colombia: results of a group-randomized trial Carlos A. Rojas, Kristen A. Weigle, Rafael Tovar, Alba L. Morales, Bruce Alexander ................................. 152 Effect of knowledge and economic status on sandfly control activities by householders at risk of cutaneous leishmaniasis in the subandean region of Huila department, Colombia Raúl H. Pardo, Alexander Carvajal, Cristina Ferro, Clive R. Davies .............................................................. 167 Efficacy of a kaurenic acid extracted from the Venezuelan plant Wedelia trilobata (asteracea) against Leishmania (Viannia) braziliensis Solanny Brito, Oscar Crescente, Alexis Fernández, Aura Coronado, Noris Rodriguez .................................. 180 Efficacy and tolerance of pentamidine for treatment of cutaneous leishmaniasis caused by por L. (V) panamensis in Colombia Sara María Robledo, Juan Alberto Puerta, Diana Lorena Muñoz, Mónica Guardo, Iván Darío Vélez ............................................................ 188 Topic review Current situation and future of antileishmanial therapy in Colombia Jaime Soto, Paula Soto .................................................. 194

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Oral miltefosine to treat leishmaniasis Jaime Soto, Paula Soto ................................................. 207 Brief communication Species of Lutzomyia (Psychodidae, Phlebotominae) in endemic cutaneous and visceral leishmaniasis foci of the department of Santander, in the eastern range of the Colombian Andes Claudia Magaly Sandoval, Reinaldo Gutiérrez, Rocío Cárdenas, Cristina Ferro .................................... 218 First finding of Lutzomyia tihuiliensis (Diptera: Psychodidae) in the Valle de Aburrá, Colombia Eduar Elías Bejarano, Diana Sierra, Alveiro Pérez-Doria, Iván Darío Vélez ............................................................ 228

Leishmania (Leishmania) mexicana in the village of San Matias, municipality of Gomez Plata, North West of Antioquia, Colombia Diana Sierra, Marcela Ochoa, José Ignacio Calle, Gisela García, Diana Colorado, Iván Darío Vélez ...... 232

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Leishmaniasis transmission focus in El Hobo, Carmen de Bolívar, Bolívar, Colombia) Luis Alberto Cortés ........................................................ 236 Dog (Canis familiaris) infectivity to Lutzomyia youngi in Trujillo, Venezuela Dalila Hernández, Elina Rojas, José Vicente Scorza, Alicia Jorquera ............................................................... 242

Leishmania (Viannia) braziliensis infection in two Colombian dogs: a note on infectivity for sand flies and response to treatment Bruno L. Travi, Carlos Javier Tabares, Horacio Cadena ............................................................. 249 Technical note Quantification of canine cytokines using real time reverse transcriptase polymerase chain reaction Omar A. Saldarriaga, Bruno L. Travi, Peter C. Melby . 254 Instructions for authors

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Biomédica Instituto Nacional de Salud Volumen 26, Suplemento No. 1, Leishmaniasis - Bogotá, D. C., Colombia - Octubre, 2006 Editorial Leishmaniasis: un reto para la salud pública que exige concertación de voluntades y esfuerzos En su conjunto, las diversas formas clínicas de la leishmaniasis constituyen un serio problema de salud pública en el mundo. Según las estadísticas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (1), 350 millones de personas están en riesgo de contraer la infección, existen actualmente cerca de 12 millones de personas infectadas y cada año se presentan, aproximadamente, 2 millones de casos nuevos de las diferentes formas clínicas la leishmaniasis. En la matriz de énfasis estratégico del programa de investigación en enfermedades tropicales (Tropical Disease Research) de la OMS (2), la leishmaniasis está clasificada en la categoría I como una enfermedad emergente e sin control. Este suplemento especial de Biomédica se publica tres meses después de que el Consejo Ejecutivo de la OMS hubiera aprobado una resolución que se presentará a la Asamblea Mundial de Salud en el 2007, sobre el problema de la leishmaniasis a nivel mundial y las estrategias de control (1). La resolución pone de relieve la expansión y el impacto de la leishmaniasis en el mundo, y la necesidad de que los gobiernos de los países afectados fortalezcan sus programas nacionales de prevención, y de promoción de la investigación para encontrar métodos efectivos de control de los vectores, medicamentos alternativos menos tóxicos con reducidas dosis y duración del tratamiento, mejores métodos diagnósticos y para evaluar la efectividad y facilitar el acceso a las medidas de control. En Latinoamérica, Colombia incluida, se presentan casos de las tres formas clínicas principales de la enfermedad, la mayoría en los países andinos y en los que comparten la cuenca amazónica. En el 2005 se notificaron en Colombia 18.097 casos de leishmaniasis, cifra que incluye los casos de las fuerzas militares y que representa un incremento de 3.794 casos (21,9%) al compararla con el número de casos notificados en el 2004 (3). De ellos, 17.983 casos correspondieron a la forma cutánea (99,4%), 60 (0,3%) a la mucosa y 54 a la visceral (0,3%). La distribución de los casos de leishmaniasis cutánea por grupos de edad muestra que 4,4% ocurrieron en menores de 4 años, 8,8% en el grupo de 5 a 14 años, 81,3% en el de 15 a 44 años, y 5,5% en mayores de 45 años (3). El notorio aumento de la notificación de casos de leishmaniasis en los dos últimos años refleja un incremento de la transmisión de esta parasitosis, atribuible a diversos factores, entre otros, al aumento de las actividades humanas en ambientes silvestres en donde existe transmisión enzoótica; y a los cambios en los entornos de transmisión, que ahora incluyen el peridomicilio y el domicilio, y zonas periurbanas. Es oportuno, entonces, que en medio de la creciente incidencia de leishmaniasis en el país se encuentre disponible una publicación especial con los hallazgos obtenidos por la comunidad científica nacional y regional, relacionados con la epidemiología, la distribución de vectores y especies de Leishmania, las opciones terapéuticas, las medidas de control y sobre la relación huésped-parásito. En este suplemento convergen los esfuerzos de instituciones de educación superior, grupos de investigación, secretarías de salud y empresas prestadoras de servicios por encontrar respuestas al complejo problema de la leishmaniasis. Es notable la capacidad multidisciplinaria de la comunidad nacional y su persistente investigación sobre la leishmaniasis. Sin duda, la experiencia y el compromiso de la comunidad científica y médica nacionales aquí representadas constituyen el elemento crucial para acoger y dar respuesta a las recomendaciones contenidas en la resolución antes mencionada que se presentará el año entrante a la Asamblea Mundial de Salud.

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A pesar de su importancia como problema de salud pública, son pocos los estudios que se publican sobre la epidemiología y la evaluación de intervenciones para el control de las leishmaniasis. En este suplemento se presentan los resultados de tres estudios realizados por una nueva generación de investigadores colombianos. Sus resultados invitan a evaluar los efectos de medidas de intervención en focos con características eco-epidemiológicas conocidas de transmisión, resaltan la importancia de la educación a la comunidad sobre la transmisión de la leishmaniasis y la adopción de medidas para evitar el contacto con el vector, aportan información sobre la dinámica de la transmisión de la leishmaniasis cutánea americana y ofrecen evidencia adicional de su transmisión intra o peridomiciliaria. La vacunación podría constituirse en una medida preventiva pero el desarrollo de vacunas aún está en una fase incipiente y nos falta entender los diversos matices de la interacción huésped-parásito en este modelo exitoso de parasitismo de los macrófagos, fagocitos por excelencia. Varios artículos en este suplemento aportan hallazgos que contribuyen a comprender esta interacción. Se registra por vez primera una corriente iónica en la membrana de la vacuola parasitófora de los macrófagos infectados con Leishmania amazonensis; se describen las características ultraestructurales de la interacción entre una línea de células dendríticas y Leishmania mexicana, y se caracteriza el patrón de respuesta celular inmune encontrada en la prueba de leishmanina, comparándolo con el de lesiones activas; los resultados sugieren que la intradermoreacción simula la respuesta temprana a la infección. El artículo sobre la cuantificación de citocinas caninas mediante la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa en tiempo real brinda una herramienta para entender el comportamiento y el desenlace de la infección por Leishmania chagasi en este reservorio doméstico. El conocimiento de las especies de Lutzomyia spp. vectores de leishmaniasis y su comportamiento resulta fundamental para proponer medidas de control. Los resultados de los trabajos entomológicos adelantados, principalmente, en la región andina colombiana y venezolana presentan nuevos registros de especies de flebótomos, y evidencias para incriminar a algunas especies de Lutzomyia, entre ellas, L. youngi, L. trapidoi, L. longiflocosa y L. gomezi, como posibles vectores de especies de Leishmania causantes de leishmaniasis cutánea; todos resaltan la presencia de estos insectos vectores en el intra y peridomicilio. Otros dos trabajos confirman el papel de Lutzomyia longipalpis y Lutzomyia evansi como especies vectores de leishmaniasis visceral en zonas de bosque seco tropical. Si bien el papel del perro como reservorio doméstico de la leishmaniasis visceral es conocido, dos artículos presentan nuevas evidencias que implican a este animal como posible fuente de infección para especies de Lutzomyia transmisoras de leishmaniasis cutánea en zonas ecológicamente diferentes: Trujillo, en los Andes venezolanos, y la Costa Pacífica colombiana. El conocimiento de las especies de Leishmania y su distribución geográfica contribuye a la comprensión de su eco-epidemiología. La biodiversidad de Colombia se ve reflejada no sólo en la diversidad de especies de Lutzomyia sino, también, en la variedad de especies circulantes de Leishmania. Aunque Leishmania panamensis continúa siendo la especie más ampliamente distribuida, dos artículos complementan el conocimiento sobre las especies de Leishmania presentes en Colombia y llaman especialmente la atención sobre el hallazgo de L. mexicana en departamentos en los que no se había registrado anteriormente. El desarrollo de nuevos medicamentos para el tratamiento de las diferentes formas clínicas de la leishmaniasis constituye una prioridad en el mundo. Varios artículos en este suplemento informan sobre alternativas al tratamiento convencional con antimoniales pentavalentes. Dos de ellos presentan hallazgos promisorios de estudios in vitro o in vivo, con el uso de un ácido kaurénico extraído de una planta y con la terapia fotodinámica, respectivamente. Otro evalúa a la pentamidina como una alternativa eficaz y segura, mientras que dos artículos abordan el uso de la hexadecilfosfocolina, o miltefosina, para la quimioterapia de la leishmaniasis. Este último compuesto presenta varias ventajas frente a los antimoniales pentavalentes, la anfotericina B y la pentamidina, siendo la principal de ellas su administración oral. Aunque los estudios de eficacia y seguridad de la miltefosina demuestran que este medicamento es eficaz y seguro para el tratamiento de la leishmaniasis visceral causada por L. donovani 8

y de la cutánea causada por L. panamensis, algunos resultados de estudios publicados muestran que su eficacia puede variar según la especie infecciosa de Leishmania. Esto, aunado a que el medicamento es teratogénico y a que presenta una vida media prolongada, permite recomendar que su introducción se haga con las debidas provisiones para garantizar su uso adecuado y seguro y evitar así el acortamiento de su vida útil. En el 2005, el Estado colombiano invirtió un poco más de Col$ 9.609 millones (cantidad equivalente a más de US$ 4,5 millones) en la adquisición de los medicamentos necesarios para el tratamiento de la leishmaniasis (4,5). Su alto costo y el riesgo de tratamiento incompleto o efectos adversos resaltan la importancia de garantizar no sólo su uso adecuado sino, también, de evaluar permanentemente su eficacia y seguridad. Esto podría lograrse mediante una estrategia de farmacovigilancia en sitios centinela, como se propone en la revisión sobre el “Estado actual y futuro de la terapia antileishmaniásica en Colombia”. Una respuesta efectiva e integral al problema de la leishmaniasis requiere la concertación de esfuerzos por parte de la comunidad científica y médica, el Ministerio de la Protección Social y las secretarías de salud, departamentales y municipales. Este compendio de trabajos hace evidente que en Colombia existe una comunidad “doliente” dispuesta a servir y a apoyar técnica y científicamente al Ministerio de la Protección Social para que, en conjunto con el Instituto Nacional de Salud, sea posible reducir el impacto de las leishmaniasis en el país con base en la evidencia científica. Nancy Gore Saravia, Directora Científica del Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Médicas (CIDEIM) Cali, Colombia; Directora del Centro Colaborador de la OMS en Leishmaniasis y otras Enfermedades Transmisibles Cali, Colombia Rubén Santiago Nicholls, Grupo de Parasitología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia Referencias 1. Organización Mundial de la Salud. Control de leishmaniasis. Resolución No. EB 118.R3 del Consejo Ejecutivo de la OMS en sesión del 30 de mayo de 2006. [Consultado: 8 de agosto de 2006]. Disponible en: http://www.who.int/gb/ebwha/pdf_files/EB118/B118_R3-sp.pdf. 2. Remme JHF, Blas E, Chitsulo L, Desjeux PMP, Engers HD, Kanyok TP et al. Strategic emphases for tropical disease research: a TDR perspective. Trends Parasitol 2002;18:421-6. [Consultado: 8 de agosto de 2006]. Disponible en: http://www.who.int/tdr/publications/publications/pdf/ strategic_emphases.pdf. 3. Zambrano P. Informe de leishmaniasis, Colombia, semanas 1 a 52 de 2005. Inf Quinc Epidemiol Nac 2006;11:40-3. [Consultado: 8 de agosto de 2006]. Disponible en: http://www.ins.gov.co/iquen/ 2006_iqen_03.pdf 4. Ministerio de la Protección Social. Resolución No. 2004 de 2005 del 30 de junio de 2005. [Consultado: 14 de agosto de 2006]. Disponible en: http://www.minproteccionsocial.gov.co/ VBeContent/library/documents/DocNewsNo595002.pdf 5. Ministerio de la Protección Social. Resolución No. 3831 de 2005. 1 de noviembre de 2005. [Consultado: 14 de agosto de 2006]. Disponible en: http://www.minproteccionsocial.gov.co/ VBeContent/library/documents/DocNewsNo632301.pdf

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HERNÁNDEZ Biomédica 2006;26(Supl.1):10-2 C.A.

Biomédica 2006;26(Supl.1):10-2

IMÁGENES EN BIOMEDICINA

Historia natural de la leishmaniasis cutánea y mucocutánea Carlos Arturo Hernández Grupo de Parasitología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.

Las manifestaciones clínicas de la leishmaniasis cutánea y mucocutánea siguen siendo el primer paso para la sospecha de la infección y, por consiguiente, para su diagnóstico y obtención de muestras para su confirmación parasitológica. A pesar de ser una de las patologías parasitarias de mayor incremento en los últimos años en Colombia, no es fácil encontrar en la literatura imágenes de las lesiones clínicas y de su evolución. Por esta razón, y con el ánimo de brindarle imágenes de referencia al personal de salud que se enfrenta al diagnóstico de esta parasitosis, se presenta una serie de fotos que resumen la evolución del cuadro clínico desde los lesiones iniciales en el momento de la picadura de la hembra de Lutzomyia hasta las manifestaciones graves por destrucción de la mucosa nasal y oral. Palabras clave: leishmaniasis cutánea, leishmaniasis mucocutánea, Colombia Natural history of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis The clinical picture of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis is still the first step in infection suspicion and, consequently, for its accurate diagnosis and sample obtention for parasitological confirmation. Even though leishmaniasis is the parasitic infection with the greatest increase in the last years in Colombia, it is difficult to find in the literature photographs of its clinical manifestations and evolution. For this reason, and hoping to offer a reference article for health personnel dealing frequently with this pathology, a series of pictures is presented that summarize the clinical picture and its evolution from the incipient lesion after the bite of a Lutzomyia female until the severe nasal and oral cartilaginous destruction. Key words: leishmaniasis, cutaneous; leishmaniasis, mucocutaneous; Colombia

Figura 1. Manchas eritematosas con ligero tinte violáceo que desaparecen a la vitropresión; aparecen poco tiempo después de la picadura de la hembra de Lutzomyia, sin importar si está infectada o si no lo está. Los pacientes refieren una sensación de “quemadura” o “pringue” en el momento de la picadura.

Correspondencia: Carlos Arturo Hernández, Grupo de Parasitología, Instituto Nacional de Salud, Avenida calle 26 Nº 51-60, Bogotá, D.C., Colombia. Pensionado de la institución desde 01/01/2006 Teléfono: (571) 220 7700, extensión 225. [email protected] Recibido: 01/07/06; aceptado: 01/08/06

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Biomédica 2006;26(Supl.1):10-2

Figura 2. Entre los 3 y 8 días, aproximadamente, después de la picadura aparece una pequeña pápula indurada en el sitio de la picadura si hubo transmisión de promastigotes de Leishmania sp. Nótese que no hay eritema ni descamación de la piel alrededor de la lesión; además, el paciente no refiere ninguna sintomatología; no hay dolor, ni prurito, ni molestia alguna.

HISTORIA NATURAL DE LA LEISHMANIASIS

Figura 5. Ocasionalmente, se puede observar la presencia de linfadenopatías en el sitio de drenaje de la lesión, como fue el caso de este paciente con una lesión en el hombro derecho; la frecuencia de este hallazgo clínico todavía no se ha logrado precisar.

Figura 3. A las dos semanas, aproximadamente, después de la picadura, la lesión continúa su proceso de ulceración y la costra central es más evidente, al igual que la induración alrededor de la lesión. Los demás signos permanecen sin variación. Figura 6. Cicatriz “típica” en la que se observa ligera hiperpigmentación, con presencia de líneas radiadas centrípetas y, necesariamente, de menor grosor que la piel normal dado el compromiso importante que hubo en la epidermis y en la dermis.

Figura 4. Hacia la tercera semana de evolución de la lesión ya aparece la imagen de la úlcera típica, la cual es simétrica, redondeada u ovalada, con bordes indurados y levantados, y fondo limpio de aspecto granulomatoso que sangra fácilmente; si no hay infección bacteriana ni micótica asociada el paciente no presenta eritema ni descamación de la piel.

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HERNÁNDEZ C.A.

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Figura 7. Una de las primeras manifestaciones del compromiso de la mucosa nasal es el enrojecimiento de la mucosa del tercio distal del tabique nasal. Es posible que el paciente consulte por epistaxis o rinorrea frecuentes, o por sensación de dificultad para respirar. El tiempo de aparición de este signo es totalmente impredecible con las técnicas que se cuenta en la actualidad. Figura 10. Si la lesión mucosa es más agresiva, el paciente puede presentar no sólo la deformación, el ensanchamiento y la perforación del tercio distal del tabique sino, también, la pérdida del soporte cartilaginoso de las aletas nasales y la consecuente caída de la punta nasal a la que se le conoce comúnmente como “nariz de tapir” o “pico de loro”.

Figura 8. Posteriormente, se inicia un proceso de ulceración de la mucosa con ligera elevación e induración de los bordes de la lesión y, por consiguiente, epistaxis frecuente con el más leve estímulo mecánico.

Figura 11. Si el compromiso es de la mucosa de la cavidad oral –menos frecuente que el de cavidad nasal– el paciente presenta pérdida de la úvula y compromiso de los velos del paladar, y el paladar duro tiene aspecto de “empedrado”. El compromiso puede también extenderse a la mucosa de la laringe y la faringe e, incluso, a la de la tráquea superior.

Figura 9. Algunos pacientes presentan, días o meses después, destrucción del soporte cartilaginoso de la nariz; en este caso, hubo perforación del tercio distal del tabique por una lesión cutánea en el dorso de la nariz para la cual la paciente no recibió tratamiento alguno.

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Conflicto de intereses El autor manifiesta que no tiene ningún tipo de conflicto de intereses.

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MILTEFOSINA EN LEISHMANIOSIS CUTÁNEA DISEMINADA

PRESENTACIÓN DE CASOS

Tratamiento con miltefosina de la leishmaniosis cutánea diseminada Lina María González, Iván Darío Vélez Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (PECET), Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.

La leishmaniosis cutánea diseminada es una forma escasa de leishmaniosis, que se caracteriza por la diseminación sanguínea del parasito que lleva a la aparición de múltiples nódulos y placas en la piel de todo el cuerpo y aun de la mucosa nasal. Se diferencia de la leishmaniosis cutánea difusa en que la alteración de la inmunidad celular es menor y las lesiones pueden tener una descamación epidérmica, en cambio en la leishmaniosis difusa las lesiones son nodulares y hay una anergia celular específica contra el parásito. En este artículo se describe el caso de un paciente colombiano con Leishmaniosis cutánea diseminada causada por L(V) panamensis que inicialmente tuvo falla terapéutica al ser tratado con Glucantime y Anfotericina B y quien curó de sus lesiones al recibir tratamiento con Miltefosine. Palabras claves: Leishmaniosis cutánea diseminada, tratamiento, miltefosine Miltefosine for disseminated cutaneous leishmaniasis Disseminated cutaneous leishmaniasis is a rare presentation characterized by hematogenous dissemination of the parasite that causes the appearance of multiple nodules and plaques in the skin of the whole body and even including the nasal mucous membrane. It differs from diffuse cutaneous leishmaniasis because the alteration in cellular immunity is lower and the lesions may have epidermal desquamation. On the other hand, diffuse cutaneous leishmaniasis presents nodular lesions and a specific anergy in the immune response directed against the parasite. This article describes the case of a Colombian patient with disseminated cutaneous leishmaniasis caused by L. (V) panamensis . The initial treatments with Glucantime® and Amphotericin B failed, but his lesions healed after treatment with miltefosine. Key words: Disseminated Cutaneous Leishmaniasis, treatment, Miltefosine

La leishmaniosis cutánea diseminada es una forma poco frecuente de leishmaniosis que puede ser causada por Leishmania amazonensis (1), L. panamensis (2) y L. guyanensis (3). La enfermedad empieza con una lesión primaria tipo nódulo o placa con descamación epidérmica en el sitio de picadura del vector flebotomíneo y, semanas o meses después, por la diseminación hematógena Correspondencia: Iván Darío Vélez, Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales, PECET, Universidad de Antioquia, Sede de Investigaciones Universitaria, SIU, Lab. 632, Calle 62 No. 52-59. Medellín, Colombia. Teléfono: (574) 210 6501, fax: (574) 210 6511 [email protected] Recibido: 29/08/05; aceptado: 27/06/06

de los parásitos, aparecen múltiples lesiones tipo nódulo o placas redondeadas, indoloras, sin ulceración, de diferente tamaño y velocidad de crecimiento, distribuidas por todo el cuerpo, incluidas la mucosa nasal. En Colombia se han informado varios casos, con compromiso mucoso, producidos por L. (V) panamensis (2). Para algunos autores, la leishmaniosis cutánea diseminada es sinónimo de leishmaniosis cutánea difusa pero otros autores diferencian ambas entidades y reservan esta última denominación a la presentación clínica caracterizada por la aparición de múltiples lesiones nodulares que, al confluir en la cara, pueden dar el aspecto de facies leonina semejante al de la lepra lepromatosa, acompañadas de anergia específica contra el 13

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parásito, una pobre respuesta al tratamiento con antimoniales, frecuentes recaídas y la ausencia de infiltrado inflamatorio en la piel, a pesar de la gran cantidad de parásitos, como consecuencia de la falta de respuesta celular inmune, específica contra la Leishmania (4). L. amazonensis es la especie más frecuentemente implicada y se acepta que depende no sólo de la especie del parásito sino, también, de factores propios del hospedero que lo hacen susceptible a que se inhiba la inmunidad celular cuando está en contacto con el parásito (5). En los últimos años se ha informado un incremento en el número de casos y para algunos investigadores brasileros la leishmaniosis cutánea diseminada es una nueva forma emergente de la leishmaniosis cutánea (6). La respuesta terapéutica con antimoniales pentavalentes (Sb5) es variable. Algunos responden bien a la dosis corriente de 20 mg de Sb5/kg IM por día por 20 días (2) pero en otros, como el que se presenta en esta comunicación, la respuesta terapéutica a los antimoniales pentavalentes es mala. Para alcanzar una mejor respuesta terapéutica se ha sugerido la utilización de antimoniales pentavalentes por periodos más prolongados (30 días) y con seguimiento estricto (6). El disponer de alternativas terapéuticas para todas las formas de leishmaniosis es una necesidad sentida de los médicos, los investigadores y las autoridades de salud de todos los países en donde se presentan casos de esta enfermedad. Una alternativa terapéutica debe tener entre sus características una alta eficacia -aun para las cepas resistentes a los antimoniales-, baja toxicidad, bajo costo, disponibilidad en las regiones apartadas en donde se presentan los casos clínicos y vía de administración oral o tópica. Desde hace varios años se ha investigado un tratamiento oral efectivo para la leishmaniosis cutánea y la visceral. Luego de múltiples ensayos clínicos fallidos con mefloquina (7), alopurinol (8) y ketoconazol (9), la miltefosina (1 hexa-decilfosfocolina), un fosfolípido alcalino desarrollado inicialmente como agente antineoplásico, demostró buena actividad anti-Leishmania y fue avalado por la Organización Mundial de la Salud 14

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como tratamiento de primera elección para la leishmaniosis visceral producida por L. (L) donovani en India y Sudán, donde la resistencia a los antimoniales pentavalentes es del orden del 60% (10,11). Este mismo tratamiento fue evaluado en Colombia para el establecimiento de una dosis óptima para el tratamiento de la leishmaniosis cutánea (12) y, posteriormente, en estudio multicéntrico realizado en Colombia y Guatemala, se encontraron eficacias de 91% y 53%, respectivamente, diferencia terapéutica causada al parecer por la diferencia en las especies de Leishmania prevalentes en ambos países, siendo tan sólo del 33% para L. (V) braziliensis (13). No conocemos ningún informe del uso de miltefosina para el tratamiento de la leishmaniosis cutánea diseminada, la cual se empleó en el paciente que se presenta en este informe, ante la falla terapéutica previa a dos ciclos de Glucantime® y uno de anfotericina B y, luego de haber aceptado, mediante consentimiento informado, recibir este tratamiento. Presentación del caso Se trata de un hombre de 26 años, proveniente del área rural del municipio de Urrao (Antioquia, Colombia). Consultó al hospital local por primera vez en noviembre de 2002, con manifestaciones clínicas de una lesión de un mes de evolución tipo placa, localizada en el cuello. Se diagnosticó leishmaniosis cutánea y se inició tratamiento con Glucantime®, 20 mg Sb5/kg por día por un período de 20 días. Al final del tratamiento el paciente no sólo no presentó mejoría de la lesión sino que, por el contrario, aparecieron múltiples lesiones por todo el cuerpo. Se consideró falla terapéutica y en enero de 2003 se le inició un segundo ciclo de Glucantime® a la misma dosis, sin lograrse ninguna mejoría. En marzo de 2003 el paciente fue remitido al Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (PECET) de Medellín. Al ingreso el paciente presentaba aproximadamente 300 lesiones en piel, tipo nódulo y placa con costras epidérmicas, sin compromiso mucoso y sin síntomas constitucionales. No presentaba

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antecedentes personales de importancia. Se realizaron de nuevo exámenes diagnósticos y se encontró un examen directo positivo, la prueba intradérmica de Montenegro de 10 mm a las 48 horas y cultivo positivo. La identificación de la cepa por la técnica de anticuerpos monoclonales mostró que se trataba de L. (V) panamensis. Al paciente se le inició tratamiento hospitalario con anfotericina B, 1 mg/kg IM por día por nueve días, con respuesta parcial, pero el tratamiento debió suspenderse por toxicidad renal con un incremento de la concentración de creatinina sérica de 2,4 mg/dl y disminución significativa de la función renal. En julio de 2003 se inició la administración de Miltefosine®, gentilmente suministrado por H. Sindermann de Zentaris, a la dosis de 150 mg/ día por 28 días. Antes de iniciar el tratamiento, el paciente ya presentaba normalidad de su función renal y hepática y las cifras del hemograma estaban en los valores normales. Se siguieron las instrucciones del fabricante del fármaco y se hizo seguimiento clínico y de laboratorio (hematológico, renal y hepático) semanalmente durante el tratamiento. Todos los exámenes resultaron normales; sólo presentó un incremento leve del valor de la creatinina sérica en la tercera semana (1,68 mg/dl), que se normalizó en la cuarta semana. El paciente no presentó ninguna reacción adversa seria ni complicaciones durante el tratamiento. Al final de los 28 días del tratamiento las lesiones eran más pequeñas o habían desaparecido y no se presentaron nuevas lesiones. Se realizó seguimiento clínico a los 45 días, cuatro meses y dos años luego de finalizado el tratamiento. El paciente no presentó recaídas y las lesiones se encontraban completamente curadas. Discusión Se trata de un paciente con leishmaniosis cutánea diseminada, toda vez que tenía una diseminación de una lesión inicial, con la aparición de cerca de 300 lesiones cutáneas tipo nódulo y placa en todo el cuerpo, con respuesta positiva a la prueba intradérmica de Montenegro de 10 mm, que no presentó respuesta terapéutica a los antimoniales

MILTEFOSINA EN LEISHMANIOSIS CUTÁNEA DISEMINADA

pentavalentes y no toleró la administración de anfotericina B. Es un nuevo un caso de diseminación de la enfermedad a partir de una lesión inicial, causada por L. (V) panamensis, especie que predomina en la región norte y occidental de Colombia y que produce un gran polimorfismo clínico con compromisos cutáneos, mucosos y diseminados (2,14). La dosis seleccionada para el tratamiento con Miltefosina® fue de 150 mg por día por 4 semanas, equivalente a 2 mg/kg por día por 28 días, que fue la mejor respuesta terapéutica obtenida por Soto et al. para el tratamiento de leishmaniosis cutánea en Colombia (12). A pesar que se trata de un solo caso clínico, esta buena respuesta terapéutica en un paciente que no respondió al tratamiento con antimoniales pentavalentes señala la posibilidad de emplear la Miltefosina® para el tratamiento de la leishmaniasis cutánea que no respondan a los antimoniales; también, presenta una buena alternativa terapéutica para la leishmaniosis cutánea diseminada que debería evaluarse, igualmente, para el tratamiento de la leishmaniasis cutánea difusa. Diferentes estudios han reportado algunas reacciones adversas como cefalea, mareos, dolor abdominal, náuseas, vómito y diarrea y aumento de la creatinina y de las transaminasas hepáticas. La Miltefosina® está contraindicada en el embarazo. En este reporte el paciente no presentó ningún efecto secundario, excepto un aumento transitorio de la creatinina. Los estudios con mayores series de casos permitirán concluir sobre la eficacia de la Miltefosina® en el tratamiento de la leishmaniosis cutánea resistente a los antimoniales y su utilidad en el tratamiento de la leishmaniosis cutánea diseminada y de la leishmaniosis cutánea difusa. Conflicto de intereses Los autores manifestamos que no existe conflicto de intereses. Agradecimientos Al Dr. J. Soto por su gestión para la consecusión de la Miltefosine. 15

GONZÁLEZ L.M., VÉLEZ I.D.

Financiación Este estudio fue financiado por el Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales PECET, Universidad de Antioquia. Referencias 1. Silveira FT, Lainson R, Corbett CE. Further observations on clinical, histopathological, and immunological features of borderline disseminated cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (Leishmania) amazonensis. Mem Inst Oswaldo Cruz 2005;100:52534. 2. Vélez I, Agudelo S, Robledo S, Jaramillo L, Segura I, Soccol V et al. Diffuse cutaneous leishmaniasis with mucosal involvement in Colombia, caused by an enzymatic variant of Leishmania panamensis. Trans R Soc Trop Med Hyg 1994;88:199. 3. Couppie P, Clyti E, Sainte-Marie D, Dedet JP, Carme B, Pradinaud R. Disseminated cutaneous leishmaniasis due to Leishmania guyanensis: case of a patient with 425 lesions. Am J Trop Med Hyg 2004;71:558-60. 4. Salman SM, Rubeiz NG, Kibbi AG. Cutaneous leishmaniasis: clinical features and diagnosis. Clin Dermatol 1999;17:291-6. 5. World Health Organization. Control of the leishmaniases. Report of WHO Expert Committee. Technical Report Series. Geneva: WHO; 1990. 6. Salaiza-Suazo N, Volkow P, Tamayo R, Moll H, Gillitzer R et al. Treatment of two patients with diffuse cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania mexicana modifies the inmunohistological profile but

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not the disease outcome. Trop Med Int Health 1999;4:801-11. 7. Hendrickx EP, Agudelo SP, Muñoz DL, Puerta JA, Vélez ID. Lack of efficacy of mefloquine in the treatment of New World cutaneous leishmaniasis in Colombia. Am J Trop Med Hyg 1998;59:889-92. 8. Vélez I, Agudelo S, Hendrickx E, Puerta J, Grogl M, Modabber F et al . Inefficacy of allopurinol as monotherapy for Colombian cutaneous leishmaniasis. A randomized, controlled trial. Ann Intern Med 1997;126:232-6. 9. Arana B, Rizzo N, Díaz A. Chemotherapy of cutaneous leishmaniasis: a review. Med Microbiol Immunol (Berl) 2001;190:93-5. 10. Sundar S, Gupta LB, Makharia MK, Singh MK, Voss A, Rosenkaimer F et al. Oral treatment of visceral leishmaniasis with miltefosine. Ann Trop Med Parasitol 1999;93:589-97. 11. Sundar S, Rosenkaimer F, Makharia Mk, Goyal AK, Mandal AK, Voss A et al. Trial of oral miltefosine for visceral leishmaniasis. Lancet 1998;352:1821-3. 12. Soto J, Toledo J, Gutiérrez P, Nicholls RS, Padilla J, Engel J et al . Treatment of American cutaneous leishmaniasis with miltefosine, an oral agent. Clin Infect Dis 2001;33:E57-61. 13. Soto J, Arana BA, Toledo J, Rizzo N, Vega JC, Díaz A et al . Miltefosine for New World Cutaneous leishmaniasis. Clin Infect Dis 2004;38:1266-72. 14. Saravia NG, Segura I, Holguín AF, Santrich C, Valderrama L, Ocampo C. Epidemiologic, genetic, and clinical associations among phenotypically distinct populations of Leishmania (Viannia) in Colombia. Am J Trop Med Hyg 1998;59:86-94.

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FAGOCITOSIS DE LEISHMANIA POR CÉLULAS FSDC

ARTÍCULO ORIGINAL

Estudio ultraestructural de la fagocitosis de promastigotes y amastigotes de Leishmania mexicana por la línea de células dendríticas FSDC Ladys Sarmiento1, Martha Ayala 2, Sandra Peña 1, Gerzaín Rodríguez Zelandia Fermín 5, Felix J Tapia 6 1 2 3 4 5 6

3,4

,

Unidad de Microscopía y Análisis de Imágenes, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia Laboratorio de Parasitología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia Laboratorio de Patología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia Facultad de Medicina, Universidad de la Sabana, Bogotá, D.C., Colombia Laboratorio de Inmunología Celular, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela. Laboratorio de Biología Molecular, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

Introducción. Las células dendríticas están presentes en la mayoría de los tejidos, ellas capturan y presentan antígenos para activar a los linfocitos T. Objetivo. Se describe ultraestructuralmente la fagocitosis de Leishmania mexicana por la línea de células dendríticas FSDC, una línea de células de Langerhans obtenida de la epidermis fetal de ratón, e inmortalizada por la transducción retroviral del oncogen v-myc. Materiales y métodos. Se obtuvieron amastigotes de la lesión de ratones Balb/c y promastigotes a partir del cultivo (24 °C) de la lesión. Las FSDC se cultivaron con los parásitos en una proporción de 5 parásitos por célula, en medio IMDM, durante 24 horas. Los cultivos infectados y los controles se procesaron para microscopía electrónica de transmisión. Se hicieron cortes semifinos contrastados con azul de toluidina para evaluar porcentaje de fagocitosis y finos, contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo. Resultados. El 13,42% de las FSDC fagocitaron promastigotes; de ellas el 8% contenían un parásito y el restante 5,2% fagocitó dos o más. El 20% de las FSDC fagocitaron amastigotes; 10% contenían un parásito y 10% dos o más. Ultraestructuralmente se observaron promastigotes en contacto con las células por el flagelo o por el polo posterior. Los fagosomas que contenían promastigotes eran organelos estrechos con uno ó dos parásitos. Los que contenían amastigotes eran de gran tamaño (8 µm) con uno o varios parásitos, libres o adosados a la membrana del fagosoma por su polo posterior. Conclusión. La infección de las FSDC se caracterizó por una baja tasa de células infectadas al ser expuestas a promastigotes o amastigotes. La vacuola parasitofora presentó características similares a las de los macrófagos. En su mayoría las FSDC presentaban 1 a 3 parásitos por célula. Las observaciones plantean la necesidad de estudiar la relación entre capacidad de fagocitosis y función. Palabras clave: células de Langerhans, Leishmania, fagocitosis, microscopía electrónica. Phagocytosis of promastigotes and amastigotes of Leishmania mexicana by the FSDC dendritic cell line: Ultrastructural study Introduction. Dendritic cells, which capture and present antigen to activate unprimed T cell, are found in most tissues. Objective. This work describes the ultrastructure of Leishmania mexicana phagocytosis by the fetal skin dendritic cell (FSDC) line, a Langerhans cell line isolated from mouse fetal epidermis immortalized by retroviral transduction of the v-myc oncogene. Materials and methods. Leishmania amastigotes were obtained from mouse (BALB/c) lesion and promastigotes from culture (24°C) of the lesion. FSDC cells were cultured with parasites (5 parasites per cell) using IMDM medium, during 24 hours. Control and infected cultures were processed for transmission electron microscopy. Semi-thin sections counterstained with toluidine

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blue to evaluate phagocytosis and thin sections counterstained with uranyl acetate and lead citrate were made. Results. 13.42% of the FSDC phagocytosed promastigotes; 8% contained a single parasite and 5.2% phagocytosed 2 or more. 20% of the FSDC phagocytosed amastigotes; 10% contained a single parasite and 10% phagocytosed 2 or more. Ultrastructurally, promastigotes in contact with FSDC by the flagellum or the posterior pole were observed. The parasitophorous vacuoles harbouring promastigotes were small organelles containing one or two parasites each. Parasitophorous vacuoles containing amastigotes were larger (8µm diameter) with one or several parasites free or attached to the vacuole at the posterior pole. Conclusion. The low rate of infected FSDC cells was characteristic and the parasitophorous vacuole showed similar characteristics to those observed in macrophages. The parasite density in the infected cells was 1 to 3 parasites per cell. These observations highlight the need to study the relationship between phagocytic capacity and function. Key words: Langerhans cells, Leishmania, phagocytosis, electron microscopy.

Las células dendríticas son elementos clave del sistema inmune, centinelas en la periferia que alertan a los linfocitos T de antígenos invasores y dirigen el montaje de una respuesta eficiente (1). En la epidermis y otros epitelios estratificados, la célula de Langerhans es la representante por excelencia del sistema de células dendríticas (2). La leishmaniasis cutánea es producida por la inoculación intradérmica del parásito por el vector, lo que hace pensar que las células de Langerhans tienen una participación crítica no sólo durante el proceso inflamatorio sino en el inicio de una respuesta específica (3). La interacción de las células de Langerhans con parásitos de Leishmania sp. se demostró en 1990 cuando Moll et al., empleando estas células recién aisladas de la epidermis de ratones Balb/c, encontraron que 20% de ellas fagocitaban amastigotes de Leishmania major en 24 horas; sin embargo, no se produjo interacción con promastigotes, la forma inoculada por el vector en la piel (4). Más tarde, Udey et al. , empleando células expandidas de piel fetal de ratones C57BL6 (FSDDC), obtuvieron 36% de fagocitosis de amastigotes mientras que solamente el 7% fagocitaron promastigotes (5). Estos resultados con células dendríticas derivadas de la piel, Correspondencia: Ladys Sarmiento, Grupo de Microscopía y Análisis de Imágenes, Instituto Nacional de Salud, Avenida Calle 26 Nº 51-60, Oficina 233, Bogotá, D.C., Colombia Teléfono: (571) 220 7700, extensión 453 [email protected] Recibido: 08/06/05; aceptado: 12/12/05

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contrastan con los más altos porcentajes de fagocitosis que se logran cuando se emplean células dendríticas de otro origen, como las diferenciadas de médula ósea, en las que se han encontrado porcentajes de fagocitosis de amastigotes y promastigotes de 40% y 54%, respectivamente, y de 76% y 80% (6,7). Al emplear células dendríticas generadas a partir de monocitos de sangre periférica, se han obtenido porcentajes de fagocitosis de amastigotes y promastigotes de 58% y 38%, respectivamente, y en el caso de células dendríticas derivadas de bazo se encontró un porcentaje de fagocitosis de promastigotes del 33% (8,9). Las células dendríticas son una población celular muy heterogénea, por lo que las diferencias reportadas en la fagocitosis de las diferentes formas del parásito pueden ser producto de múltiples factores, entre ellos, su origen. El objetivo de este trabajo fue estudiar la capacidad de la línea de células dendríticas FSDC para fagocitar parásitos de Leishmania mexicana y determinar las características ultraestructurales de la interacción con cada una de las formas del parásito. Esta determinación ultraestructural no se había realizado previamente en el modelo estudiado, en el que la microscopía electrónica se ha empleado sólo como evidencia para documentar la infección. Materiales y métodos

Parásitos Se empleó la cepa de L. mexicana 000/00/WRL11 CL802, donada al banco de criopreservación

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del Laboratorio de Parasitología del Instituto Nacional de Salud (INS) por Robert Tesh de Yale University. La identidad de la cepa se confirmó por isoenzimas y anticuerpos monoclonales. Los amastigotes se extrajeron de la lesión desarrollada en la almohadilla plantar de ratones BALB/c inoculados 9 semanas antes con 1x106 promastigotes en 50 µl de solución salina estéril. El tejido obtenido se maceró en un filtro metálico con el émbolo de una jeringa plástica, adicionando lentamente 10 ml de medio de Schneider. Con el fin de liberar los amastigotes de los macrófagos, la mezcla se pasó a través de agujas calibre 21 y 26, se centrifugó a 246g por 5 minutos y el sobrenadante se colocó en hielo por 1 hora para retirar los residuos adheridos a los amastigotes. Luego de centrifugar a 1.120g por 5 minutos, el sedimento de amastigotes se resuspendió en medio de Schneider y se pasó por aguja número 29 para facilitar el recuento de los parásitos individuales (10). Antes de ponerlos en contacto con las células, los parásitos se lavaron en solución salina al 0,85% y se transfirieron a medio Iscove Modified Dubelcco Medium (IMDM). Los promastigotes obtenidos del cultivo de tejido de la lesión de los ratones infectados, se mantuvieron en medio Schneider a 24°C hasta incrementar la población y 10 días después del último pasaje se lavaron en solución salina al 0,85% y se transfirieron a medio IMDM para ser puestos inmediatamente en contacto con las células, de la misma manera en que se procedió con los amastigotes.

Células La línea FSDC fue amablemente suministrada por Paola Ricciardi-Castagnoli del Departamento de Biotecnología y Biociencias de la Universidad de Milán-Bicocca en Italia. La línea fue derivada de células dendríticas de piel fetal de ratón; si bien la suspensión de células se obtuvo de la epidermis, el crecimiento de algunos fibroblastos en los primeros pasajes no excluye contaminación dérmica. La línea fue inmortalizada por la transducción retroviral del oncogen v-myc (11); tiene características de célula de Langerhans como son la expresión de ATPasa de membrana (11), la hidrólisis de ADP pero no de ATP (12),

FAGOCITOSIS DE LEISHMANIA POR CÉLULAS FSDC

además de un fenotipo de célula dendrítica mieloide inmadura (13). El cultivo se realizó en medio IMDM con 5% de suero fetal bovino inactivado, 2mM de L-glutamina, 100 UI/ml de penicilina,100 µg/ml de estreptomicina y 0,05mM de mercaptoetanol, a 37ºC y 5% de CO2.

Cultivos de FSDC con los parásitos Las FSDC con una viabilidad mayor al 98% se colocaron en medio IMDM fresco (con 5% de suero fetal bovino inactivado, 2mM de L-glutamina, 100 UI/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 0,05mM de mercaptoetanol) y se incubaron durante 30 minutos, tiempo requerido para su adherencia, a 37°C y 5% de CO2. Luego, las monocapas de FSDC se pusieron en contacto con promastigotes o amastigotes, en una proporción de 5 parásitos por célula. Los cultivos se incubaron durante 24 horas a 37°C, con 5% de CO 2. Como control se emplearon FSDC cultivadas en medio IMDM en las mismas condiciones, pero sin la adición de parásitos.

Microscopía electrónica Veinticuatro horas después de poner en contacto las células con los parásitos, los cultivos se fijaron en glutaraldehído al 3% en solución tampón de fosfato 0,01M, pH 7,2, durante 1 hora, a temperatura ambiente. Luego se posfijaron en tetraóxido de osmio al 1% durante 1 hora, a la misma temperatura. Se deshidrataron en etanol de grados ascendentes, se infiltraron e incluyeron en resina epón-araldita. Se hicieron cortes semifinos de 1 µm de espesor y cortes finos de 60 nm que se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo (14). Las muestras se observaron en un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM 109.

Recuentos Por medio de la observación con microscopía de luz de los cortes de 1 µm teñidos con azul de toluidina, se efectuó el recuento para calcular el porcentaje total de células con parásitos fagocitados y el porcentaje de células que habían fagocitado 2 o más parásitos. Se contaron 200 células en cada uno de los tres experimentos independientes realizados por duplicado. 19

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Resultados Veinticuatro horas después de poner en contacto las FSDC con promastigotes de L. mexicana, un 13,42% de ellas habían fagocitado los promastigotes. Los cultivos de FSDC puestos en contacto con amastigotes produjeron un porcentaje de fagocitosis de 20%. Por lo menos, el 50% de las FSDC fagocitaron un solo parásito independientemente de su forma (cuadro 1). No fue posible inferir diferencias en los dos grupos, dada la dispersión de los datos. Ultraestructuralmente, en los cultivos control se observaron FSDC con abundantes dendritas, núcleo periférico y citoplasma con gran cantidad de retículo endoplásmico granuloso, algunas mitocondrias y pocas vacuolas (figura 1). Los cultivos de FSDC puestos en contacto con promastigotes mostraron la unión inicial del parásito a las células tanto por el flagelo como por el polo posterior (figuras 2 y 3). Los promastigotes se localizaban en vacuolas que adoptaban su forma y que presentaban un espacio muy reducido entre el parásito y la vacuola, máximo de 100 a 200 nm (figura 4). El 8% de las células presentaba vacuolas con un sólo parásito y el 3% contenían dos por vacuola como se muestra en la figura 3. Ocasionalmente se observaron parásitos en degradación dentro de la vacuola, como lo evidencia la pérdida de ribosomas que deja una apariencia de espacios

vacíos en el citoplasma del parásito (figura 5). Algunas células, aunque no habían fagocitado, presentaron abundante número de vacuolas citoplasmáticas (figura 6). Los cultivos puestos en contacto con amastigotes presentaron células con fagosomas más grandes que los observados cuando se emplearon promastigotes, que llegaban a tener de 5 a 8 um, aun cuando dentro de ellos se encontrara un solo parásito (figura 7). Los amastigotes se encontraron adosados a la vacuola por su polo posterior y libre (figuras 7 y 8). Se pudo observar desde un solo amastigote hasta diez dentro de un mismo fagosoma (figura 8). Discusión Las células dendríticas son una población muy heterogénea. Su susceptibilidad a infectarse con Leishmania sp. parece depender no sólo del tipo y procedencia de la célula dendrítica sino también de la especie y estadio de Leishmania sp. empleada (15). Cuando se emplean células dendríticas derivadas de la epidermis como las células de Langerhans, se obtienen menores porcentajes de fagocitosis que cuando se emplea cualquier otro tipo de célula dendrítica. La línea celular FSDC mostró un comportamiento similar al reportado con las FSDDC en cuanto al porcentaje de células capaces de fagocitar el parásito (36% de amastigotes y 7% de promastigotes) (5), bajo, si se compara con los

Cuadro 1. Porcentaje de fagocitosis de promastigotes y amastigotes de L. mexicana por la línea de células FSDC. Los resultados se expresan como el porcentaje promedio obtenido del recuento de 200 células en tres experimentos independientes realizados por duplicado.

Leishmania mexicana Amastigotes

% total de FSDC con parásitos fagosomas

Media DE Coeficiente de variación Promastigotes Media DE Coeficiente de variación Total Media Des. estándar Coeficiente de variación DE: desviación estándar

20

20,17 14,77 73,23 13,42 2,91 21,66 16,79 10,74 63,97

% de FSDC con un parásito 10,08 6,92 68,67 8,17 2,38 29,15 9,13 5,04 55,20

% de FSDC con dos parásitos 4,83 5,26 108,83 3,33 1,33 39,87 4,08 3,74 91,61

% de FSDC con tres parásitos 2,17 1,78 82,13 0,83 0,52 61,97 1,50 1,43 95,35

% de FSDC más de tres parásitos 3,08 2,04 66,00 1,08 0,74 67,94 2,08 1,79 86,13

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FAGOCITOSIS DE LEISHMANIA POR CÉLULAS FSDC

Figura 1. Electromicrografia de una célula FSDC del cultivo control. N: núcleo con nucléolo prominente; V: vacuola; : mitocondria; :microvellosidad; barra: 3 µm.

Figura 3. Electromicrografia de un promastigote de L. mexicana cuyo polo posterior está en contacto con una FSDC. Se observan dos parásitos (P) dentro de un fagosoma. Barra: 5 µm.

Figura 2. Electromicrografia de un promastigote de L. mexicana que se une a la célula a través del flagelo. P: promastigote; :flagelo; barra: 1,5 µm.

Figura 4. Electromicrografia de un promastigote dentro del fagosoma de la FSDC. Las flechas indican el pequeño espacio entre la membrana del parásito y el fagosoma. N: núcleo; barra: 1 µm.

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SARMIENTO L., AYALA M., PEÑA S. et al.

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Figura 5. Electromicrografia de una célula FSDC que contiene un promastigote (p) en degradación, como lo demuestra la apariencia vacía del citoplasma por la pérdida de ribosomas. Barra: 5 µm.

Figura 6. Electromicrografía de una célula FSDC del cultivo infectado. No contiene parásitos en su interior pero evidencia una gran cantidad de vacuolas (v) en su citoplasma. r: retículo endoplasmatico; barra: 5 µm.

reportados para tipos diferentes de células dendríticas. También presentan similitud con los obtenidos por Moll et al. en cuanto a amastigotes se refiere (4).

detectaron en células dendríticas en el ganglio sólo tres semanas después de la infección (16).

La aparente menor captación de parásitos por parte de una célula que se ha venido considerando la iniciadora de la respuesta inmunitaria al transportar el antígeno hasta el ganglio linfático, si bien es un hecho que no necesariamente tiene implicaciones biológicas, sí llama la atención sobre el verdadero papel que esta célula podría estar jugando en el inicio de la respuesta a la enfermedad. Trabajos recientes demuestran que aunque se pudieron detectar parásitos en el ganglio unas pocas horas después de la infección, éstos estaban en macrófagos. Ninguna célula dendrítica emigrante de la piel tenía parásitos, lo cual indica que no eran las transportadoras. Los parásitos se 22

Otra evidencia muestra que las células dendríticas que transportaban antígeno de Leishmania tres días después de la infección eran de origen dérmico y no epidérmico, concluyendo que las células dendríticas dérmicas y no las células de Langerhans eran las principales presentadoras de antígeno en leishmaniasis (17). Lemos et al. demostraron que no se requiere de las células de Langerhans para la presentación de antígenos ya que otras células dendríticas pueden desempeñar eficientemente el mismo papel (18). Prina et al. proponen que las células dendríticas en presencia de un bajo número de promastigotes no opsonizados podrían infectarse o no hacerlo por su baja actividad fagocítica, por la competencia con macrófagos residentes o, por el contrario, se infectarían permaneciendo

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FAGOCITOSIS DE LEISHMANIA POR CÉLULAS FSDC

Los trabajos que varios grupos están adelantando específicamente en células de Langerhans, permitirán en un futuro aclarar su verdadero papel en el inicio de la respuesta a la leishmaniasis. Los estudios por videomicroscopía han mostrado que los promastigotes de Leishmania major y Leishmania aethiopica se unen a la célula hospedera de manera predominante por el flagelo y, ocasionalmente, por el polo posterior, mientras que Leishmania donovani lo hace por los dos sitios en igual proporción (19); también se ha documentado que Leishmania amazonensis se une al macrófago por los dos polos (20). Nosotros observamos la unión de L. mexicana por los dos polos pero no medimos la frecuencia con la que esto ocurría. Figura 7. Amastigote de L. mexicana adosado por su polo posterior a un gran fagosoma dentro de la célula FSDC. VP: vacuola parasitófora; A: amastigote; barra: 1,5 µm.

Figura 8. Fagosomas en el citoplasma de una FSDC con gran número de amastigotes de Leishmania adosados y libres. Barra: 5 µm

inmaduras o en un estadio intermedio que no permitiría la estimulación de los linfocitos T. Por lo tanto, se retardaría el inicio de la respuesta lo que permitiría la amplificación del parásito para, luego, ya en presencia de opsoninas como los anticuerpos, fagocitar los amastigotes, madurar y amplificar la respuesta (6).

Una vez fagocitado, el promastigote se encuentra en una vacuola parasitófora característicamente muy estrecha, ajustada al parásito a manera de guante, que deja un espacio muy reducido entre el parásito y la membrana de la vacuola. En los macrófagos, las vacuolas parasitóforas que contienen L. mexicana son grandes (20,21). Se ha identificado un proteofosfoglicano secretado a través del saco flagelar de amastigotes de L. mexicana que causa vacuolización de los macrófagos in vitro (22,23). Aparentemente, los amastigotes de L. major no secretan esta molécula y el parásito no induce la formación de grandes vacuolas parasitóforas en macrófagos (23). También se ha encontrado que el agrandamiento de la vacuola parasitófora es menos acentuado en células dendríticas que en macrófagos, lo cual indica que la biogénesis de la vacuola parasitófora es diferente en estas dos células o que su formación es retrasada en células dendríticas (6). Los amastigotes de L. mexicana se encontraron adheridos a la membrana de la vacuola parasitófora en las FSDC por su polo posterior pero también se encuentran libres dentro de ella, de la misma manera como se ha reportado para las vacuolas parasitóforas formadas en macrófagos (24). Si bien la aparición de gran cantidad de vacuolas en las células que no fagocitaron puede tener 23

SARMIENTO L., AYALA M., PEÑA S. et al.

causas diversas, una posibilidad es que se deba a un estímulo por parte de las células infectadas, como se ha propuesto (6). Sin embargo, esto tendría que demostrarse por métodos de inmunomicroscopía electrónica para este caso. La estructura de la vacuola parasitófora y su composición bioquímica ya han sido estudiadas en macrófagos y, más recientemente, en células dendríticas generadas de médula ósea. Se deben hacer estudios encaminados a la caracterización de la vacuola parasitófora formada específicamente en células de Langerhans, en búsqueda de las diferencias que puedan existir con las vacuolas parasitóforas generadas en otros tipos de células dendríticas. La alta resolución que se logra con la microscopía electrónica (100-200Å), permite aprovechar esta herramienta para el estudio detallado del suceso. No fue posible inferir sobre la significancia estadística de los resultados entre los dos grupos de células de trabajo, debido a la alta dispersión que presentaron los datos, situación que se refleja en los altos porcentajes de los coeficientes de variación estimados. Sin embargo, se pudo observar que como célula dendrítica, ésta fagocita de manera preferencial un solo parásito. La variación observada podría estar relacionada con el tamaño reducido de las áreas de estudio para microscopía electrónica, de máximo 0,5 mm, y la forma como se distribuye la muestra; aunque la mezcla de células dendríticas y parásitos se hace homogénea, se observan diferencias entre los fragmentos de muestra escogidos. En conclusión, en cuanto a la estructura fina, se describieron las características de la interacción célula de Langerhans-Leishmania que se relacionaron con cada una de las formas del parásito fagocitado, especialmente en lo que tiene que ver con las diferencias morfológicas de la vacuola parasitófora. Algunas de estas características son similares a las descritas en macrófagos pero no habían sido estudiadas en detalle en células de Langerhans infectadas con Leishmania. Hasta ahora los pocos trabajos que muestran ultraestructuralmente la interacción célula de LangerhansLeishmania , han empleado la microscopía electrónica sólo para documentar la infección. 24

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Agradecimientos A María Carlina Castillo por su asesoría en el análisis estadístico. Conflicto de intereses Los autores manifiestan que no existe ningún conflicto de intereses. Financiación Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología - Colciencias (proyecto 2104-04-10240), Banco Interamericano de Desarrollo, Instituto Nacional de Salud y FONACIT, Proyecto S1-2001000847. Referencias 1. Brandonisio O, Spinelli R, Pepe M. Dendritic cells in Leishmania infection. Microbes Infect 2004;6:1402-9. 2. Sarmiento L, Peña S. La célula de Langerhans. Biomédica 2003;22:462-5. 3. Zuluaga M, Robledo SM. Las células de Langerhans en la inmunidad a leishmaniasis. Biomédica 2004;24:30217. 4. Blank C, Fuchs H, Rappersberger K, Rollinghoff M, Moll H. Parasitism of epidermal Langerhans cells in experimental cutaneous leishmaniasis with Leishmania major. J Infect Dis 1993;167:418-25. 5. von Stebut E, Belkaid Y, Jakob T, Sacks DL, Udey MC. Uptake of Leishmania major amastigotes results in activation and interleukin 12 release from murine skin derived dendritic cells: Implications for the initiation of anti Leishmania immunity. J Exp Med 1998;188:154752. 6. Prina E, Abdi SZ, Lebastard M, Perret E, Winter N, Antoine JC. Dendritic cells as host cells for the promastigote and amastigote stages of Leishmania amazonensis: the role of opsonins in parasite uptake and dendritic cell maturation. J Cell Sci 2004;117:31525. 7. Qi H, Popov V, Soong L. Leishmania amazonensis dendritic cell interactions in vitro and the priming of parasite specific CD4(+) T cells in vivo . J Immunol 2001;167:4534-42. 8. Marovich MA, Mc Dowell MA, Thomas EK, Nutman TB. IL 12p70 production by Leishmania major harboring human dendritic cells is a CD40/CD40 ligand dependent process. J Immunol 2000;164:5858-65. 9. Konecny P, Stagg AJ, Jebbari H, English N, Davidson RN, Knight SC. Murine dendritic cells internalize Leishmania major promastigotes, produce IL 12p40 and stimulate primary T cell proliferation in vitro. Eur J Immunol 1999;29:1803-11.

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FAGOCITOSIS DE LEISHMANIA POR CÉLULAS FSDC

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ARTÍCULO ORIGINAL

Papel de la vacuola parasitófora de macrófagos de ratón infectados por Leishmania amazonensis en la adquisición de moléculas Tania M. Cortázar 1,2, Joselín Hernández 1,2, María Clara Echeverry 1,3, Marcela Camacho 1,2 1

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Laboratorio de Biofísica, Centro Internacional de Física, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia. Laboratorio de Parasitología, Departamento de Salud Pública, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.

Introducción. Leishmania son parásitos intracelulares de macrófagos, confinados en compartimentos denominados vacuolas parasitóforas. La permeabilidad de este compartimento depende de su interacción con el tráfico vesicular y transportadores presentes en su membrana. Objetivo. En este trabajo se estudió la permeabilidad de la membrana de la vacuola parasitófora en la línea celular J774.A1 infectada con Leishmania amazonensis, in situ y en compartimentos aislados. Materiales y métodos. El aislamiento de vacuolas parasitóforas se hizo por gradiente de densidad. La permeabilidad de la membrana de estas se valoró por distribución de sondas fluorescentes y electrofisiología. Para establecer indirectamente el transporte de protones se usó naranja de acridina. La presencia de transportadores ABC sensibles a probenecid se estableció con amarillo lucifer y calceína. Por primera vez con la técnica de patch-clamp se registraron corrientes en la membrana de este compartimento aislado. Resultados. La vacuola parasitófora colorea de rojo con naranja de acridina indicando un pH ácido. Concentra amarillo lucifer a través de un transportador sensible a probenecid, pero excluye la sonda calceína. Vacuolas aisladas se marcan de rojo con naranja de acridina y concentran amarillo lucifer a través de un transportador sensible a probenecid. Estas vacuolas excluyeron calceína y presentaron en su membrana una corriente iónica que se activa a diferencias de potencial cercanas a 60 mV, con una conductancia de 46 ± 3 pS. Conclusiones. Se pueden aislar vacuolas parasitóforas con propiedades de permeabilidad que preservan mecanismos de transporte similares a los encontrados in situ. Se registra por primera vez la presencia de una corriente iónica poco selectiva en la membrana de este compartimiento. Palabras clave: Leishmania, membranas intracelulares, permeabilidad, proteínas de transporte de anión, transporte iónico, canales iónicos. Role of the parasitophorous vacuole of murine macrophages infected with Leishmania amazonensis in molecule acquisition Introduction. Leishmania are intracellular parasites of macrophages, confined into compartments known as parasitophorous vacuoles. The permeability of this compartment depends on its interaction with the endocytic pathway and transport proteins present on its membrane. Objective. The membrane permeability of the parasitophorous vacuole was studied in J774.A1macrophage like cells infected with Leishmania amazonensis , in situ and on isolated compartments. Materials and methods. The parasitophorous vacuoles were isolated by density gradients. Fluorescent probe distribution and electrophysiological recordings were used to determine parasitophorous vacuole membrane permeability. Proton transport was evaluated indirectly by acridine orange staining. Probenecid sensitive ABC transporters were detected using the fluorescent probes lucifer yellow and calcein. For the first time ion currents were recorded on the membrane of isolated parasitophorous vacuoles using the patch clamp technique.

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PERMEABILIDAD DE LA VACUOLA PARASITÓFORA DE LEISHMANIA

Results. The parasitophorous vacuole stains red with acridine orange indicating an acidic compartment. It concentrates lucifer yellow by means of a probenecid sensitive transporter but excludes calcein. Isolated vacuoles stained red with acridine orange and concentrated lucifer yellow by means of a probenecid sensitive transporter. These vacuoles excluded calcein and showed an ion current in their membrane which is activated at potentials close to 60 mV with a mean conductance of 46 ± 3 pS. Conclusions. Isolated parasitophorous vacuoles with permeability properties preserving transport mechanisms similar to those found in situ can be purified. A poorly selective ion current on the parasitophorous vacuole membrane is reported for the first time. Key words: Leishmania, intracellular membranes, permeability, anion transporter proteins, ion transport, ion channels.

Leishmania spp. son parásitos intracelulares obligatorios. Después de entrar al hospedero mamífero, el parásito es fagocitado por macrófagos y, posteriormente, confinado a un compartimiento denominado vacuola parasitófora que se caracteriza por ser ácido y rico en hidrolasas (1). Asumimos que para su supervivencia el parásito depende de la interacción de las tres membranas concéntricas presentes: la membrana plasmática del macrófago, la membrana de la vacuola parasitófora y su membrana plasmática. La permeabilidad de la vacuola parasitófora de Leishmania está determinada por la capacidad de este compartimiento de interactuar con la vía endocítica y la expresión de transportadores en su membrana. La membrana de la vacuola parasitófora se fusiona con vesículas provenientes de la ruta endocítica desde la membrana plasmática y moléculas que entran por endocitosis de fase líquida, como el dextrán, o por endocitosis mediada por receptores, como la albúmina, se sitúan con Leishmania (2). Además, la membrana de la vacuola parasitófora se fusiona por la ruta mediada por receptores de manosa-6-fosfato (2) y la de la autofagia (3). La evidencia de la expresión de los transportadores en la membrana de la vacuola parasitófora está dada por el pH ácido de Correspondencia: Marcela Camacho, Laboratorio de Biofísica, Centro Internacional de Física, Edificio de Programas Especiales “Manuel Ancízar”, Ciudad Universitaria, apartado aéreo 4948, Bogotá, D.C., Colombia. Telefax: (571) 368 1517, 369 0487 y 571 4286; fax: (571) 368 1335. [email protected] y [email protected] Recibido: 28/07/05; aceptado: 10/02/06

su luz en donde el transporte de protones está a cargo de una ATPasa vacuolar (4) y por la expresión de transportadores aniónicos de la superfamilia de transportadores ABC (3,5). En este estudio se indaga el papel de la membrana de la vacuola parasitófora que contiene Leishmania amazonensis en el transporte de moléculas entre el citoplasma de la célula hospedera y la luz de la vacuola parasitófora. Se confirma evidencia previa que indica acumulación de protones y expresión de transportadores ABC. Se reporta un protocolo para el aislamiento de la vacuola parasitófora que permite mantener las propiedades de permeabilidad estudiadas en compartimientos in situ, y se presentan, por primera vez, registros electrofisiológicos sobre la membrana de este compartimiento que muestran una corriente iónica poco selectiva. Materiales y métodos

Parásitos Se cultivaron promastigotes de L. amazonensis (FLA/BR/67/PH8), gentilmente donados por Nancy Gore Saravia, CIDEIM, Cali, Colombia, a 24ºC en medio Schneider (Sigma) con suplemento de suero fetal bovino al 10%. Los parásitos se cultivaron hasta alcanzar su fase estacionaria (107) y se concentraron para la infección o se diluyeron para mantener el cultivo.

Célula huésped La línea de macrófagos peritoneales de ratón J774.A1 ( EECACC Nº 91051511) se mantuvo en monocapa al 80% de confluencia en cajas de cultivo de 25 cm2 en medio de cultivo RPMI 1640 (Sigma) con suplemento de suero fetal bovino al 10% (Hyclone) a 37ºC y 5% de CO2. 27

CORTÁZAR T.M., HERNÁNDEZ J., ECHEVERRY M.C., CAMACHO M.

Infección y fagocitosis Se expusieron las células J774.A1 a promastigotes de L. amazonensis en fase estacionaria o a partículas de látex de 3 µm de diámetro, en una proporción de 1 a 10 y se mantuvieron a 35°C y 5% de CO2 por 4 horas (6). El excedente de parásitos o partículas de látex se removió por lavado con RPMI. Posteriormente, los cultivos se mantuvieron a 35°C y 5% de CO2 hasta por 5 días después de la infección.

Aislamiento de vacuolas parasitóforas de L. amazonensis En este estudio se partió de 5x106 macrófagos, con porcentajes de infección a las 48 horas de 75,5±0,8% para aislar vacuolas parasitóforas (7). Este tiempo de infección se eligió por el volumen de la vacuola parasitófora y el comportamiento durante la purificación. Tiempos menores de infección mostraban vacuolas parasitóforas de menor tamaño pero mayor variabilidad lo que dificultaba la separación en una fracción y, luego de las 72 horas después de la infección, los compartimientos aislados eran muy frágiles. Para el aislamiento se siguió un procedimiento modificado a partir del descrito por Chakraborty et al. (8). En éste se combina un choque osmótico en una solución hipotónica con ruptura mecánica de la membrana plasmática del macrófago. Una vez que se lisan las células, el homogenizado se separa en gradientes de densidad (8). A las 48 horas después de la infección, se removieron mecánicamente las células infectadas con L. amazonensis de la caja de cultivo en 2,5 ml de medio de lisis, compuesto por 20mM HEPES, 0,5mM EGTA, 0,25M sacarosa, 0,1% gelatina (Sigma G-9382), pH 7, más una mezcla de inhibidores de proteasas, así: ácido etilendiamino tetraacético, sal de sodio (EDTA) 0,5mM; etilen glicol bis(2-aminoetiléter)-N,N,N´,N´ácido tetracético (EGTA) 0,5mM, transepoxisuccinil-L-leucilamido-(4-guanidino)-butano (E-64) 2 µM, N-α-p-tosil-L-lisina clorometilcetona HCl (TLCK) 0,2µM, leupeptina 0,1mM y pepstatin 0,1µM. Una vez en el medio de lisis, las células infectadas fueron sometidas a ruptura mecánica por medio 28

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de una jeringa con aguja calibre 27G en un tubo Falcon de 15 ml y sobre hielo durante 10 minutos. El procedimiento se controló por microscopía de luz hasta lograr el 90% de lisis celular. Para remover células intactas y núcleos del homogenizado, la suspensión se diluyó a 10 ml en solución tamponada de lisis y se centrifugó a 50g por 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se llevó a un gradiente discontinuo de sacarosa (8). Con este tipo de gradiente no fue posible separar compartimentos que preservaran las características de las vacuolas parasitóforas. Por lo tanto, se modificó así: un colchón inferior de 60% de sacarosa, más colchones de 1 ml de Percoll (partículas coloidales de sílica cubiertas con polivinilpirrolidona) en concentraciones variables en una solución (en mM) de 145 de NaCl, 5 de KCl y 10 de HEPES. Este gradiente se centrifugó a 3.500g por 25 minutos a 4°C (7). Las fracciones recolectadas se visualizaron por microscopía de luz y aquéllas en las que se ubicaron vacuolas que contenían parásitos, se lavaron en una solución (en mM) 145 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES y 2 MgCl2, pH 7,34 (KOH 1N)-310 mOsm y se concentraron por centrifugación a 2.000g por 10 minutos. El sedimento con 0,5-1x103 compartimientos aislados se resuspendió suavemente en diferentes soluciones dependiendo del experimento que se iba a realizar.

Microscopía de los compartimentos aislados Para determinar la naturaleza del compartimiento aislado se realizaron inicialmente observaciones morfológicas con microscopía de luz siguiendo los criterios descritos por Lang para vacuolas parasitóforas de Leishmania (9): espacio delimitado por una membrana, con un diámetro entre 10 y 20 µm, con parásitos en su interior, generalmente, polarizados hacia la membrana del compartimiento. Una aproximación al pH de los compartimentos y la detección de ácidos nucleicos parasitarios en su interior se hizo mediante la sonda metacromática naranja de acridina en concentraciones entre 4 y 8 µM incubando los compartimentos aislados en los diferentes gradientes, durante 15 minutos en la oscuridad.

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PERMEABILIDAD DE LA VACUOLA PARASITÓFORA DE LEISHMANIA

Simultáneamente, se incubaron células infectadas en las mismas condiciones. La marcación de los compartimentos vesiculares purificados en cada uno de los gradientes se visualizó en microscopio de fluorescencia con un juego de filtros 480 nm/ 520 nm.

Actividad enzimática en los compartimentos aislados La actividad de β-glucoronidasa, enzima lisosómica, se determinó mediante la incubación de los productos aislados de los diferentes gradientes, en 0,1M de acetato de sodio, pH 4,4 y 0,25% Tritón X-100, y usando como sustrato 1mM de 4-metillimbreliferil-2-acetamido-2-deoxi-βD-glucopitanósido. La reacción se determinó por espectrofotometría a 448 nm.

Carga de sondas fluorescentes dentro del citoplasma de células J774.1 Se expusieron células J744.A1 (control, expuestas a partículas de látex o infectadas) adheridas a laminillas de vidrio por 24 horas a dos sondas aniónicas fluorescentes de diferente tamaño como se describe a continuación. Antes de las observaciones, bajo microscopía de luz en un microscopio invertido Zeiss IM-35, las células se lavaron tres veces con medio RPMI. La adquisición de imágenes se llevó a cabo con una videocámara CCD modelo IC-100 acoplada al microscopio y con el programa AIW 2.2. También se tomaron fotografías con cámara fotográfica Canon EOS 3000 QD.

Amarillo lucifer (521 da). Las células se expusieron a esta sonda, la cual absorbe a 427 nm y emite a 535 nm (Sigma), a una concentración de 0,5 mg/ ml, más ATP 5mM y ácido plurónico 5µM en RPMI, durante 5 minutos. La marcación fluorescente se detectó usando un juego de filtros de 480 nm/520 nm; se realizaron observaciones a los 5, 10, 30 y 60 minutos después de la carga. También se realizó la carga de amarillo lucifer en las mismas condiciones y en presencia de 5mM de probenecid, un inhibidor de transportadores ABC. Calceína/AM (995 da). Las células se expusieron a esta sonda, la cual absorbe a 494 nm y emite a 517 nm (Molecular probes, Eugene, Oregon), a una concentración de 25-40µM en RPMI durante

5 minutos. La fluorescencia se evidenció usando un juego de filtros de 480 nm/520 nm; se realizaron observaciones a los 5, 10, 30 y 60 minutos después de la carga.

Carga de sondas fluorescentes en vacuolas parasitóforas aisladas Las vacuolas parasitóforas aisladas en una solución (en mM) de 140 K glutamato, 2 KCl, 5 EGTA-K, 0,5 CaCl2, 4 MgCl2, 10 HEPES-K, 3 ATPNa2, 0,5 GTP-Na (pH 7,34, 300mOsm), para mantener condiciones iónicas similares a las del citoplasma, se cargaron con naranja de acridina para verificar el pH, y con amarillo lucifer para verificar su viabilidad (3). Así mismo, se cargaron con calceína (25µM), se incubaron con la sonda durante 5 minutos a 35°C y 5% CO2, y se lavaron una vez.

Calceína sal de potasio (622,5 da). Las células se inyectaron con 25µM de esta sonda disuelta en una solución cuya composición era (en mM) de 145 NaCl, 5 KCL, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPESNa, 5 glucosa, pH 7,2, 300 mOsm, mediante micropipetas hechas de capilares de hematocrito no heparinizados (Fisher Scientific No. 02-668-6) cuyas resistencias variaron entre 3-5MΩ y usando la configuración de célula entera de la técnica de electrofisiología patch clamp (10). En otras palabras, antes de perforar la membrana de la vacuola parasitófora se obtuvo un sello de alta resistencia entre la membrana de la vacuola parasitófora y la micropipeta de vidrio. Una vez alcanzada una resistencia superior a 1GΩ, se aplicó presión negativa sobre la membrana hasta lograr la ruptura controlada de ésta, al tiempo que se obtenía registro visual en fluorescencia con la cámara digital y el programa Axon Imaging Workbench 2.2. Registros electrofisiológicos Las técnicas de electrofisiología se usan para la detección de las propiedades eléctricas de la membrana tales como potenciales de membrana y corrientes iónicas. El montaje para el registro de estas propiedades constó de un amplificador Axopatch 1-C (Axon Instruments, Foster City, CA). Los pulsos de voltaje generados y las corrientes obtenidas, se digitalizaron con una interfase 29

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análogo-digital, Digidata 1200 (Axon Instruments, Foster City, CA). Las señales se filtraron y almacenaron en una computadora compatible con IBM. Para la generación de los potenciales y la obtención de los registros, se utilizó el paquete de programa electrofisiológico Pclamp6. Utilizando la configuración de vacuola adherida similar a la de célula adherida de la técnica de patch clamp (10), se hicieron registros en vacuolas parasitóforas aisladas suspendidas en una solución (en mM) de 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 10 HEPES. En esta configuración se acerca la punta de una micropipeta de vidrio a la membrana de la vacuola parasitófora y ejerciendo presión negativa se genera un sello de alta resistencia (>1GΩ). De esta manera, se pueden registrar los canales iónicos presentes en la porción de membrana que queda en la luz de la micropipeta.

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Las micropipetas de registro se hicieron con capilares de borosilicato cuyas resistencias variaron entre 3 y 5 MΩ en una solución (en mM) de 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 15 EGTA, tratando de conseguir condiciones electroquímicamente simétricas y potenciales de reversión cercanos a 0 para los iones más importantes. Los registros se analizaron con el programa Pclamp6 ( Axon Instruments ) y se graficaron con el programa Origin 7SR (OriginLag Corporation, Northampton, MA, USA). Resultados

Permeabilidad de la vacuola parasitófora a los protones La estructura de la sonda naranja de acridina hace que esta pueda pasar fácilmente a través de las membranas. Por lo tanto, permea la membrana del macrófago y al entrar en el núcleo se intercala

Figura 1. Permeabilidad a protones medida por distribución de la sonda fluorescente naranja de acridina. Células J774.A1 control, luego de fagocitosis de partículas de látex, infectadas por Leishmania amazonensis, o vacuolas parasitóforas aisladas, se cargaron con naranja de acridina a una concentración de 4-8 µg/ml y se observaron por microscopía de fluorescencia. A. Macrófago control, microscopía de luz. B. Macrófago control, después de la carga de la sonda. C. Macrófagos luego de la fagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. D. Macrófagos luego de la fagocitosis de partículas de látex, después de la carga de la sonda. E. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas después de la infección, microscopia de luz. F. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas después de la infección, después de la carga de la sonda. G. Vacuola parasitófora aislada, microscopía de luz. H. Vacuola parasitófora después de la carga de la sonda. Los datos son experimentos representativos de 10. Barra en A-F: 8 µm; en G-H: 5 µm; vp: vacuola parasitófora; flechas: parásitos. Nótese que la coloración verde es la marcación de ácidos nucleicos y la roja indica compartimientos con pH ácido.

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entre los ácidos nucleicos emitiendo una fluorescencia verde. Sin embargo, al pasar a compartimientos ricos en H+ como la vacuola parasitófora, adquiere carga neta positiva, su movilidad disminuye y su espectro de emisión cambia emitiendo en el rango del rojo. Esta marcación, indirectamente, sugiere la presencia de mecanismos que median el transporte de protones y generan un gradiente de este ion con respecto al citoplasma del macrófago.

látex o fueron infectados por Leishmania se pueden identificar por la presencia de partículas (figura 1C) o vacuolas de gran volumen con parásitos de tamaño similar a las partículas de látex en su interior. Las partículas de látex y Leishmania se ubican en compartimentos, fagosomas (figura 1D) y vacuolas parasitóforas (figuras 1E1H), respectivamente, cuyo pH es ácido lo que se evidencia por la coloración roja obtenida luego de la marcación con naranja de acridina.

En la figura 1 se observa un macrófago control (figura 1A) en donde la coloración verde corresponde al núcleo y el punteado rojo a compartimentos de la vía endocítica cuyo pH es ácido (figura 1B). Los macrófagos que fagocitaron

Permeabilidad mediada por transportadores en la membrana de la vacuola parasitófora Se cargaron células J744.A1 control, expuestas a partículas de látex o infectadas con L. amazonensis, con las sondas amarillo lucifer y

Figura 2. Permeabilidad de la vacuola parasitófora a través de trasportadores ABC determinada por distribución de la sonda fluorescente amarillo lucifer. Células J774.A1 control (A-C), vacuolas parasitóforas aisladas (D-F), células infectadas por L. amazonensis (G-L) o luego de fagocitosis de partículas de látex (M-R), se cargaron con amarillo lucifer a una concentración de 0,5 mg/ml y se observaron por microscopía de fluorescencia. A. Macrófago control, microscopía de luz. B. Macrófago control, 5 minutos y C. Macrófago control, 20 minutos después de la carga de la sonda. D. Vacuolas parasitóforas aisladas, microscopía de luz. E. Vacuolas parasitóforas, 15 minutos después de la carga y F. Vacuolas parasitóforas, 15 minutos después de la carga de la sonda en presencia de 5µM de probenecid. G. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de la infección, microscopía de luz. H. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de la infección, 10 minutos después de la carga de la sonda. I. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de la infección, microscopía de luz. J. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de la infección, 30 minutos después de la carga. K. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de la infección, microscopía de luz y L. 30 minutos después de la carga de la sonda en presencia de 5µM de probenecid. M. Macrófago luego de la fagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. N. Macrófagos luego de fagocitosis de partículas de látex, 10 minutos después de la carga. O. Macrófago luego de la fagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. P. Macrófago luego de la fagocitosis de partículas de látex, 30 minutos después de la carga. Q. Macrófago luego de la fagocitosis de partículas de látex, microscopía de luz. R. Macrófago luego de la fagocitosis de partículas de látex, 30 minutos después de la carga en presencia de de 5µM de probenecid. Los datos son experimentos representativos de 10 experimentos. Barra: en D-F, 5 µm y 8 µm para las demás imágenes; vp: vacuola parasitófora; flechas: parásitos.

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calceína. Se tuvo en cuenta la distribución de la sonda en el citoplasma y, en el caso de macrófagos que fagocitaron látex o fueron infectados, se observó la concentración o exclusión de las sondas en la luz del fagosoma o de la vacuola parasitófora, respectivamente. La sonda amarillo lucifer no atraviesa la membrana celular; por ello fue necesario cargarla permeabilizando la membrana plasmática del macrófago con ATP (11). En los macrófagos control (figura 2A), se observó el amarillo lucifer distribuido de manera uniforme por todo el citoplasma a los 5 minutos después de la carga (figura 2B). Luego, entre los 10 y los 45 minutos después de la carga, la sonda se concentró en compartimientos citoplasmáticos o fue liberada al medio extracelular (figura 2C). La permeabilidad de la vacuola parasitófora de Leishmania (figuras 2D, 2E, 2F) no presentó diferencias con el patrón observado en los macrófagos control, aunque fue un proceso relativamente más lento. En las células

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infectadas, a los 10 minutos después de la carga, el amarillo lucifer se observó en el citoplasma y en el núcleo, pero fue excluida de la vacuola parasitófora (figuras 2G, 2H). Después de 30 minutos de la carga, la sonda se encontró en las vacuolas parasitóforas y en pequeñas vesículas citoplasmáticas pero no en el citoplasma (figuras 2I, 2J). El inhibidor probenecid bloqueó la transferencia de amarillo lucifer a la luz de la vacuola parasitófora (figuras 2F, 2K, 2L). La distribución de amarillo lucifer en fagosomas de partículas de látex fue similar a los controles (figuras 2M-2P). La concentración de la sonda en el fagosoma se puede atribuir a un transportador ABC porque la presencia de probenecid, un inhibidor de este grupo de moléculas, evita esta distribución (figuras 2Q, 2R). Por encontrarse en su forma acetoximetil éster, la calceína/AM permea fácilmente las membranas celulares interactuando con los lípidos de la membrana. En este estado, la sonda no es

Figura 3. Permeabilidad de la vacuola parasitófora a través de trasportadores ABC determinada por distribución de la sonda fluorescente calceína. Células J774.A1 control, luego de fagocitosis de partículas de látex, infectadas por L. amazonensis, o vacuolas parasitóforas aisladas se cargaron con calceína a una concentración de 25µM y se observaron por microscopía de fluorescencia. A. Macrófago control, microscopía de luz. B. Macrófago control, después de la carga de la sonda. C. Macrófagos luego de la fagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. D. Macrófagos luego de fagocitosis de partículas de látex después de la carga de la sonda. E. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas después de la infección, microscopia de luz. F. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas postinfección, después de la carga de la sonda. G. e I. Vacuolas parasitóforas aisladas, microscopía de luz. H. Vacuolas parasitóforas aisladas, después de la carga de la sonda. J. Vacuolas parasitóforas aisladas, después de la inyección de la sonda con pipeta de vidrio. Los datos son experimentos representativos de 10 experimentos. Barra en A-F: 8 µm, en G-H, 5 µm y en I y J 6 µm; vp: vacuola parasitófora; flechas: parásitos

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Figura 4. Permeabilidad de la VP mediada por corrientes iónicas. VP aisladas fueron registradas con la técnica de patch-clamp en configuración de VP-adherida. A. Curva de corriente contra tiempo de un registro obtenido luego de la aplicación de una rampa de voltaje desde 60 hasta -60 mV desde un potencial de sostenimiento de 0 mV. B. Curva IV de donde se observa potencial de reversión de 1,6 mV. Los datos son experimentos representativos de 7 VP registradas. El potencial de reversión se relaciona con el potencial de equilibrio de los iones que pasan a través de la corriente detectada.

fluorescente; una vez ingresa en el citoplasma, los grupos éster son cortados por esterasas y la sonda pasa a su forma fluorescente. Por este mecanismo la calceína puede ser usada para determinar la viabilidad celular. En los macrófagos control (figura 3A), entre los 5 y los 60 minutos después de la carga, la calceína se distribuye por todo el citoplasma de manera uniforme y no es liberada al medio exterior (figura 3B). En las células que fagocitaron látex (figura 3C), la sonda se observó por todo el citoplasma, pero fue excluida del fagosoma (figura 3D). De la misma manera, en macrófagos infectados (figura 3E), las vacuolas parasitóforas excluyeron por completo la sonda en todos los tiempos después de la infección (figuras 3F, 3G, 3H), lo cual sugiere que no existe ningún mecanismo de transporte de calceína hacia el exterior del macrófago, la luz del fagosoma o de la vacuola parasitófora.

Permeabilidad de la vacuola parasitófora aislada El aislamiento de vacuolas parasitóforas se llevó a cabo siguiendo el método recomendado por Chakraborty et al. (8) y usado por Schaible et al. (3), para Leishmania mexicana. La separación se siguió por microscopía de luz y enriquecimiento de la actividad de la enzima β-glucoronidasa, un marcador lisosómico. En las fracciones

separadas, las vacuolas parasitóforas se identificaron por su tamaño, apariencia de la membrana y presencia de amastigotes. Se definió como vacuolas parasitóforas a toda estructura con diámetro alrededor de 10 µm y con parásitos en su interior, adosados a la membrana del compartimento. Debido a que las vacuolas parasitóforas aisladas con esta metodología presentaban morfología anormal y alteraciones de las propiedades de permeabilidad de su membrana que atribuimos al efecto osmolar ejercido por la sacarosa, se sustituyó parte de la sacarosa por un gradiente discontinuo de Percoll, así: un colchón inferior de 60% de sacarosa y colchones de 1 ml de Percoll que variaron de la siguiente manera: 40-30-15. Las vacuolas parasitóforas aisladas se encontraron en la interfase entre los colchones de 10% y 20% de Percoll, fracciones en las cuales se acumuló el 41% (22% y 19%, respectivamente) de la actividad de β-glucoronidasa. Los datos reportados a continuación se hicieron en vacuolas parasitóforas aisladas utilizando el gradiente de Percoll de 40-20-10%. La vacuola parasitófora in situ, colorea de rojo con la sonda naranja de acridina lo cual indica la presencia de un pH ácido. Este gradiente de pH se mantiene aún después del aislamiento de 33

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vacuolas parasitóforas (figura 1H) lo que sugiere que la membrana de la vacuola parasitófora no presenta alteraciones importantes de permeabilidad que lo disipen. En la figura 1H la marcación verde en el cuadrante inferior izquierdo de la vacuola parasitófora indica la marcación de ácidos nucleicos y sugiere la presencia de Leishmania. Como se describió para las vacuola parasitófora in situ, el amarillo lucifer se concentró en la vacuola parasitófora (figura 2E) y este proceso fue mediado por un transportador ABC ya que la presencia del inhibidor probenecid evitó el transporte de la sonda la luz de la vacuola parasitófora (figura 2F). La presencia del gradiente de protones y el transporte de amarillo lucifer sugiere, además, que las vacuolas parasitóforas aisladas son capaces de mantener procesos dependientes de la hidrólisis de ATP. El transporte de la sonda calceína también fue restringido por vacuolas parasitóforas aisladas (figura 3H) y la exclusión no es debida a alteraciones en la capacidad de emisión de la sonda en un compartimento ácido, ya que es posible visualizarla luego de su inyección directa (figuras 3I, 3J).

Detección de corrientes iónicas en vacuolas parasitóforas aisladas Las técnicas electrofisiológicas se usan para la caracterización de las propiedades eléctricas de la membrana. El uso de esta técnica en membranas de compartimientos intracelulares es escaso. Los estudios aquí reportados se hicieron sobre grupos de vacuolas parasitóforas provenientes de aislamientos en los que se había hecho verificación de la presencia del parásito por observación en microscopía y en los que las marcaciones con naranja de acridina y amarillo lucifer eran satisfactorios. Usando la técnica de patch clamp (10) en la configuración de vacuola parasitófora adherida y en soluciones con concentraciones iónicas simétricas se lograron sellos de alta resistencia (>1 GΩ). Estos sellos fueron de difícil obtención por las dificultades para inmovilizar las vacuolas parasitóforas y la fragilidad de este compartimento. No se lograron registros en la configuración de vacuola parasitófora completa. Por lo tanto, 34

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los datos presentados corresponden a vacuolas parasitóforas en configuración de vacuola parasitófora adherida, en las que se registran las corrientes a través de los canales iónicos presentes en la zona de la membrana en donde se ubica la pipeta de registro, y provenientes de 7 vacuolas parasitóforas. Las vacuolas parasitóforas se estimularon con rampas de potencial desde 60 hasta -60 mV que se usan para detectar todas las corrientes iónicas presentes. Las corrientes observadas se favorecen a diferencias de potencial de 55±1,5 mV (figura 4A) en la que se observa una deflexión que corresponde a la apertura y cierre de la corriente registrada. El promedio de corriente cuando se observaron aperturas fue de 2,5±0,3 pA (n=20) y la conductancia calculada fue de 46±3 pS (n=20). La curva IV que relaciona la corriente con el voltaje que la activa, muestra que el potencial de reversión, potencial al cual la corriente neta es igual a 0 y que al relacionarse con el potencial de equilibrio para los iones presentes indica cuál es el ión que permea, es cercano a 0 lo que sugiere poca selectividad (figura 4B). Discusión La vacuola parasitófora que contiene a Leishmania parece satisfacer los requerimientos nutricionales del parásito y soporta su crecimiento y replicación. Los datos obtenidos durante el presente estudio sugieren que las vacuolas parasitóforas de Leishmania amazonensis pueden transportar iones desde el citosol de la célula hospedera. El secuestro de la sonda amarillo lucifer (521 da) en la luz de la vacuola parasitófora de L. mexicana se ha atribuido a la presencia de transportadores de aniones de la familia de glicoproteínas transportadoras ABC en la membrana de dicho organelo (2,3) y confirmada en las vacuolas parasitóforas de L. amazonensis en el presente estudio (figuras 2F, 2L). Representantes de la familia de transportadores ABC o Pgp son capaces de transportar un rango de sustratos heterogéneo. Se ha descrito el transporte de carboxifluoresceína (376 da) hacia el interior de vacuolas citosólicas y hacia el medio extracelular en macrófagos peritoneales de ratón, y atribuido a la presencia

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de transportadores ABC sensibles a probenecid, incluidos en la membrana celular y vacuolar (12).

pero se ha observado que fura-2 marca otros compartimentos endosómicos (6,19,20).

Este tipo de transportadores expresados en la membrana de macrófagos de ratón pueden secretar antibióticos como penicilina G (546 da) y norfloxacina (320 da) (13,14) y su inhibición disminuye la producción de IL-12, y la regulación de moléculas MHC II (15). Se encuentran, además, en células tumorales humanas (16) y en Leishmania (17), están implicados en el transporte de aniones orgánicos como urato y p-aminohipurato (16) y en el transporte de tioles y metales (17).

La vacuola parasitófora de Chlamydia trachomatis excluye la calceína (21) y en fibroblastos infectados con Toxoplasma gondii, los péptidos y las moléculas de más de 1.900 da no cruzan la membrana de la vacuola parasitófora (22). Esto nos permite especular que los fagosomas de partículas de látex y las vacuolas parasitóforas de L. amazonensis no interactúan con algunos compartimentos endosómicos excluyendo en este proceso la expresión de trasportadores aniónicos como los que concentran fluo y fura-2.

Muchas moléculas sintetizadas por los macrófagos son empacadas en vesículas y liberadas luego de la fusión de éstas con la membrana plasmática. Transportadores como los aquí reportados podrían estar mediando la transferencia de moléculas aniónicas, cuyos pesos moleculares oscilan entre 350 y 600 da, de cuya vía secretora no se conoce nada. Entre estas moléculas aniónicas se encuentran leucotrienos y prostaglandinas que juegan un papel importante en las respuestas inmune e inflamatoria, glutatión, bilirrubina y lactato producido durante la glucólisis (18). Los transportadores de aniones podrían funcionar como sistema de concentración de pequeños productos orgánicos, péptidos y toxinas, para ser exportados de la célula vía exocitosis. La exclusión de una molécula del tamaño de la calceína de fagosomas de partículas de látex y de vacuolas parasitóforas de L. amazonensis se observó por primera vez en el presente estudio. En el citoplasma, la calceína/AM se convierte en un derivado polianiónico de la fluoresceína, el cual emite fluorescencia al perder sus grupos éster por la acción de esterasas inespecíficas. La pérdida de los grupos éster hace que la molécula pierda movilidad a través de membranas, quedando atrapada en el citosol. Podría ser concentrada en la luz de los fagosomas y vacuolas parasitóforas, pero los trasportadores presentes (figuras 2J, 2P, 3D, 3F) no permiten su paso, probablemente, por el tamaño. Así mismo, las sondas fluorescentes fluo-3 (781 da) y fura-2 (832 y 880 da) no se equilibran entre el citoplasma y la vacuola parasitófora de macrófagos infectados con L. amazonensis (19),

Los estudios presentados en vacuolas parasitóforas aisladas confirman los hallazgos in situ y la evidencia previa (2,3). Sin embargo, este es el primer estudio en el que se presenta evidencia microscópica de luz de vacuolas parasitóforas aisladas demostrando algunas de sus propiedades de permeabilidad, aunque Kima y Dunn (23) muestran la ultraestructura de vacuolas parasitóforas purificadas usando el marcador calnexín. Sugerimos que las modificaciones hechas en el proceso de purificación de este compartimento, es decir, el reemplazo por un gradiente de Percoll, mejoran el aislamiento de las vacuolas parasitóforas. Este estudio, además, reporta por primera vez datos electrofisiológicos obtenidos de vacuolas parasitóforas aisladas. Estudios previos con esta técnica en eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum (24), registran una conductancia a aniones, aunque no queda claro si los registros se obtuvieron de la membrana del eritrocito o de la vacuola parasitófora que contiene Plasmodium. A pesar de esto, existe evidencia que argumenta a favor de cambios en la permeabilidad del eritrocito por modificación de canales iónicos constitutivos de su membrana (25,26) y por expresión de transportadores de origen parasitario (26,27). La conductancia calculada a partir de la corriente registrada en la membrana de la vacuola parasitófora aislada (figura 4) podría ser el resultado de la expresión de un transportador ABC, canales iónicos del retículo endoplasmático del macrófago o porinas. La presencia de trans35

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portadores ABC ha sido documentada en compartimentos de la vía endocítica de macrófagos control e infectados y en la membrana de la vacuola parasitófora (2,3) (figuras 2F, 2L, 2R). La evidencia reciente que sugiere que la membrana del retículo endoplasmático (28) es incorporada para la formación de fagosomas, abre la posibilidad que los canales de calcio dependientes de ligando y voltaje, presentes en la membrana de este compartimento (18), puedan estar asociados con la membrana de la vacuola parasitófora. En cuanto a la presencia de porinas se sabe que los protozoarios Trypanosoma cruzi y Entamoeba histolytica (29,30), expresan proteínas con características similares a estas moléculas. Más aún, los promastigotes de L. amazonensis contienen una hemolisina capaz de causar lisis coloidosmótica de eritrocitos, y extractos de este parásito que contienen esta actividad reaccionan con anticuerpos contra perforina y C9 mostrando que Leishmania también sintetiza porinas. Noronha et al. sugieren que esta porina estaría mediando la salida de Leishmania del macrófago (31). Nuestros hallazgos electrofisiológicos no nos permiten determinar el tipo de molécula que genera la corriente registrada y su significado fisiológico. Sin embargo, la expresión de porinas puede ser un mecanismo de entrada de iones y nutrientes a través de la membrana de la vacuola parasitófora como se ha sugerido para otros parásitos (22,24), parte del proceso de salida del parásito (32) o servir en la exclusión de péptidos del parásito limitando así presentación de antígeno. Los estudios futuros incluyen la caracterización electrofisiológica de la corriente descrita en la membrana de la vacuola parasitófora, la determinación de su origen y su función. Los trabajos de los mecanismos de adquisición de moléculas por la vacuola parasitófora contribuirán al entendimiento de la nutrición, la supervivencia y el desarrollo del parásito en infecciones in vitro e in vivo. Más aún, la investigación del transporte de fármacos a través de la vacuola parasitófora que contiene a Leishmania podría ser de gran valor, por ser este compartimento un sitio blanco para la quimioterapia. 36

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Agradecimientos Agradecemos a las entidades que financiaron este trabajo, al Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, y al Centro Internacional de Física de Bogotá, Colombia. Conflicto de intereses Los autores de este manuscrito garantizamos que no tenemos conflicto de intereses. Financiación Este trabajo fue financiado por: Colciencias, proyecto: 2228-04-12899, Programa Nacional de Ciencia y Tecnología de la Salud; División de Investigaciones, proyecto: 903835, Universidad Nacional de Colombia; Joselín Hernández recibió apoyo de la DINAIN (División Nacional de Investigaciones, Universidad Nacional de Colombia), programa apoyo a estudiantes: DI00C352. Referencias 1. Antoine JC, Prina E, Jouanne C, Bongrand P. Parasitophorous vacuoles of Leishmania amazonensisinfected macrophages maintain an acidic pH. Infect Immun 1990;58:779-87. 2. Russell DG, Xu S, Chakraborty P. Intracellular trafficking and the parasitophorous vacuole of Leishmania mexicana-infected macrophages. J Cell Sci 1992;103:1193-210. 3. Schaible UE, Schlesinger PH, Steinberg TH, Mangel WF, Kobayashi T, Russell DG. Parasitophorous vacuoles of Leishmania mexicana acquire macromolecules from the host cell cytosol via two independent routes. J Cell Sci 1999;112:681-93. 4. Sturgill-Koszycki S, Schlesinger PH, Chakraborty P, Haddix PL, Collins HL, Fok AK et al . Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science 1994;263:678-81. 5. Lipman BJ, Silverstein SC, Steinberg TH. Organic anion transport in macrophage membrane vesicles. J Biol Chem 1990;265:2142-7. 6. Cortázar T. Estudios de permeabilidad del fagosoma que contiene al protozoario Leishmania amazonensis (trabajo de grado). Bogotá: Universidad Nacional de Colombia; 2000. 7. Hernández J. Permeabilidad de membrana del compartimiento que contiene a Leishmania mexicana amazonensis en macrófagos J774.1 (trabajo de grado). Bogotá: Universidad Nacional de Colombia; 2001.

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PERMEABILIDAD DE LA VACUOLA PARASITÓFORA DE LEISHMANIA

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ARTÍCULO ORIGINAL

Comparative immunohistological analysis of the Montenegro skin test reaction in asymptomatic infection and in acute and chronic cutaneous leishmaniasis Nora Guarín 1, Gloria I. Palma 2, Claude Pirmez 3, Liliana Valderrama 1, Rafael Tovar 1,2,4, Nancy Gore Saravia 1* 1 2 3 4

Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Médicas, Cali, Colombia. Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali, Colombia. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil. Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas, Pontificia Universidad Javeriana, Cali, Colombia.

Introduction. The Montenegro skin test reaction and leishmaniasis lesions share fundamental characteristics of a delayed type hypersensitivity reaction. Objectives. To determine whether the Montenegro skin test reaction (response to leishmanin) might approximate and thereby provide insight into the early inflammatory and immune response to Leishmania infection. Materials and methods. We compared the inflammatory response in biopsies of acute (evolution time ≤one month), and chronic lesions (evolution time ≥6 months) with the Montenegro skin test reaction in the corresponding patients, and with the Montenegro skin test of asymptomatically infected volunteers. Results. The proportion of CD4+ and CD8+ T lymphocytes, mononuclear phagocytes and granulocytes were similar in acute lesions and in their corresponding Montenegro skin test reactions. In contrast, CD4+ lymphocytes (32.6%) represented a significantly lower, and B cells (20%) and macrophages (27%) a significantly higher proportion of the cellular infiltrate in chronic lesions as compared to reactions in the corresponding skin test site (CD4+: 43.7%, B cells: 0.9%; macrophages: 17.5%). CD8+ T lymphocytes and macrophages were positively associated (P=0.038) in the Montenegro skin test of asymptomatically infected individuals whereas CD8+ and CD4+ T cells were positively associated in the Montenegro skin test of chronic patients (P=0.002). Notably, B cells were markedly more frequent in chronic lesions (20%) than in acute lesions (5.3%) (P=0.002). Conclusion. The Montenegro skin test distinguished the cellular immune response to Leishmania in asymptomatic infection and chronic disease and may provide a surrogate of the early response to infection. Key words: cutaneous leishmaniasis, delayed hypersensitivities, immune response, histopathology, immunoenzyme techniques, B-lymphocytes. Análisis inmunohistopatológico comparativo de la reacción a la prueba cutánea de Montenegro en infección asintomática y en leishmaniasis cutánea aguda y crónica Introducción. La reacción a la prueba cutánea de Montenegro (a leishmanina) y la lesión de leishmaniasis comparten características fundamentales de la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado. Objetivos. Determinar si la respuesta cutánea a leishmanina se aproxima y podría modelar la respuesta inflamatoria e inmune temprana a la infección por Leishmania. Materiales y métodos. Este estudio comparó la respuesta inflamatoria de biopsias de lesiones agudas (tiempo de evolución ≤1 mes) y lesiones crónicas (tiempo de evolución ≥6 meses) con su respectiva reacción a la prueba cutánea de Montenegro, y con la reacción a la prueba de Montenegro de individuos infectados asintomáticos. Resultados. La proporción de linfocitos T CD4+ y CD8+, células fagocíticas mononucleares y granulocitos fue similar entre lesiones agudas y sus reacciones a la prueba cutánea a

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MONTENEGRO SKIN TEST VS. CUTANEOUS LESION

leishmanina. En contraste, los linfocitos CD4+ (32,6%) representaron una proporción significativamente mas baja, y los linfocitos B (20%) y macrófagos (27%) una proporción significativamente más alta del infiltrado celular en lesiones crónicas que en sus correspondientes reacciones a la prueba cutánea de Montenegro (CD4+: 43,7%, linfocitos B: 0.9%; macrófagos: 17,5%). Se encontró una asociación positiva entre linfocitos T CD8+ y macrófagos (P=0,038) en la reacción a la prueba cutánea de Montenegro de los individuos con infección asintomática, mientras que los linfocitos T CD8+ y CD4+ estuvieron asociados positivamente en las reacciones a la prueba cutánea de Montenegro de pacientes crónicos (P=0,002). Adicionalmente, la proporción de linfocitos B en lesiones crónicas (20%) fue más alta que en lesiones agudas (5,3%) (P=0,002). Conclusión. La reacción cutánea de Montenegro permitió diferenciar la respuesta celular inmune entre infección asintomática y enfermedad crónica, y simula la respuesta temprana a la infección. Palabras clave: leishmaniasis cutánea, hipersensibilidad retardada, inmunología, histopatología, técnicas inmunoenzimaticas, linfocitos B.

Tegumentary leishmaniasis presents a broad clinical spectrum ranging from self-healing lesions, to chronic mucosal involvement and the hyporesponsive diffuse form. Furthermore, a high proportion of individuals are infected but have no clinical manifestations (1,2). Both the Leishmania strain and the immune status of the host influence the development of T-cell mediated specific immune responses. The balance between T helper (Th) 1 and 2 mediators, which exert mutually modulating effects, can become polarized and this may be determined at onset of the infection (3,4). Locally, the interaction between infected antigen presenting cells and T lymphocytes is fundamental for the development and control of the leishmaniasis lesions. Other cells with immunological functions also participate in the in situ response including dendritic cells (5), plasma cells, mast cells, neutrophils, eosinophils, keratinocytes and natural killer cells (6-9). The delayed hypersensitivity reaction to Leishmania antigens, also known as the Montenegro skin test, is a marker of exposure and specific sensitization to the parasite. Previous descriptions of the histological characteristics of the Montenegro skin test in human leishmaniasis have indicated that cutaneous leishmaniasis lesions and the Corresponding: Nancy Gore Saravia, CIDEIM, Apartado Aéreo 5390, Cali Colombia. Telephone: (572) 668 2164; fax: (572) 667 2989 [email protected] Recibido: 09/06/05; aceptado: 05/09/05

Montenegro skin test share the fundamental features of a delayed hypersensitivity reaction due to the persistent presence of the parasite or its antigens (10,11). Notably both the Montenegro skin test response and lesions present a predominantly Th1 cytokine profile in localized tegumentary leishmaniasis (12). The intensity of the skin test response has been associated with the clinical presentation of the disease. Hence in the diffuse form there is no inflammatory reaction to the antigen, whereas mucosal leishmaniasis typically presents an exacerbated response (13,14). Lesions in tegumentary leishmaniasis have a variable duration and are notoriously heterogeneous, even during the early stages of the disease. The initial events in the immune response to Leishmania have not been readily accessible, nor have early markers that might differentiate the response in clinically resistant individuals and susceptible patients. If leishmaniasis lesions and the Montenegro skin test share similar cellular responses, the skin test could be a surrogate for the study of the in situ events occurring during the early stages of cutaneous leishmaniasis. We have conducted a comparative histopathologic study of biopsies of lesions of cutaneous leishmaniasis with differing time of evolution and their respective Montenegro skin test, and biopsies of the skin test site in individuals having asymptomatic infection and in normal volunteers. The spectrum of individuals included in the study sought to examine the local response of putative susceptible individuals, here operationally defined 39

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as patients with chronic lesions, and putative resistant individuals, defined as asymptomatically infected residents of endemic areas (15). In addition to T lymphocytes and macrophages, we evaluated other cell types such as eosinophils and B cells, whose role in human leishmaniasis have not been established. Materials and methods Subjects Participants in the study were recruited among patients consulting the Hospital Regional San Andrés in Tumaco (Colombian Pacific coast), the outpatients in CIDEIM (Cali) and individuals participating in an epidemiological survey conducted in endemic areas of leishmaniasis transmission of the municipality of Tumaco. None of the participants had been previously treated with antimonial drugs. Volunteers residing in Cali, who had never lived in endemic areas of leishmaniasis transmission participated as controls. All protocols were reviewed and approved by the ethical committees of the participating institutions in accordance with the requirements of the Ministerio de la Protección Social de Colombia. A signed informed consent was obtained in all cases. The study groups were defined as follows: Chronic lesion group (putative susceptible individuals): individuals presenting active cutaneous leishmaniasis lesions having a duration of 6 months or more, with or without previous history of cutaneous leishmaniasis or presence of scars consistent with prior leishmaniasis. Acute lesion group: patients presenting active lesions with an evolution time of one month or less, without evidence of previous cutaneous leishmaniasis. Asymptomatically infected (putative resistant individuals): Montenegro skin test positive individuals residing in an endemic area of leishmaniasis transmission, without clinical history or evidence of leishmaniasis. Normal controls: healthy subjects who had always resided in areas free of leishmaniasis transmission. Specificity controls: in order to control the specificity of the inflammatory reaction, Montenegro 40

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skin test antigen was applied to one forearm while the diluent of this antigen was applied to the other forearm in two individuals of the healthy control group. Diagnosis Parasitological methods (lesion scraping and/or aspiration, culture or biopsy) were utilized for diagnosing most patients (16/18). Diagnosis was achieved in two patients based on clinical signs, histopathological findings, epidemiologic exposure and Montenegro skin testing reactivity. Montenegro skin testing antigen (leishmanin) Skin testing was carried out using 0.1 ml of Montenegro antigen (leishmanin). This antigen consisted of a suspension of 1x107 heat killed and thimerosal-fixed Leishmania panamensis and Leishmania amazonensis promastigotes (Instituto Nacional de Salud, Colombia). The test was read at 48 hours using the ballpoint pen method (16); induration of 5 mm or more in diameter was considered positive. The presence of vesiculation or ulceration was also noted. Biopsies Two punch biopsies, one from the lesion and one from the Montenegro skin testing site, were obtained using a 4 mm disposable scleral punch. The OCT (Miles Laboratories, Naperville, IL, USA) embedded biopsies were snap-frozen and later transferred to long term storage at –70°C until used. A single biopsy (skin test site) was obtained from individuals in the healthy control and asymptomatically infected groups. Staining techniques Five-micrometer sections conventionally stained with hematoxylin and eosin were used to study the morphology of the inflammatory reactions and to evaluate the eosinophil population. Macrophages and lymphocyte subpopulations were evaluated using immunohistochemical methods of characterization (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Briefly, the frozen sections were fixed in cold acetone, endogenous peroxidase was blocked with 3% hydrogen peroxide in methanol, and then incubated with the primary antibody at a dilution based on prior titration followed by incubation with

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MONTENEGRO SKIN TEST VS. CUTANEOUS LESION

biotinylated secondary antibody and a preformed avidin-biotin-horseradish peroxidase complex. Monoclonal antibodies used to distinguish the infiltrating cell populations included anti-Leu (CD4) 1:50, anti-Leu-2a (CD8) 1:50 (Becton Dickinson, CA, USA), anti-human B cell (CD20) 1:50 and antihuman monocyte (CD14) 1:10 (Dako, Carpinteria, CA, USA). The chromogen reaction was developed with a diaminobenzidene solution. Evaluation of tissue sections Quantification of cell populations was carried out blindly: slides were assigned a code number and were read by two different evaluators or by one evaluator performing two independent readings of the same slide. The following determinations were made for each slide: the total area of the section, the area of inflammation and the number of cells staining positive for each particular monoclonal antibody. Readings were carried out using a Nikon Labophot-2 microscope with a grid fitted to the ocular. The grid covered an area of 0.04 mm2, and this area contained approximately 325 inflammatory cells. Three different fields (0.12 mm2, equivalent to approximately 975 cells) were randomly selected in order to count the number of positive cells for each monoclonal antibody. The total number of positive cells in the biopsy was calculated using the following formula: (Inflamed area x number of positive cells in 3 fields) /0.12 mm2 The inflamed area of the tissue sections varied among the biopsies. In order to compare the inflammatory response of the biopsies, a unit area of 0.19 mm2, corresponding to the mean area of

inflammation of the Montenegro skin testing of healthy volunteers, was operationally defined as the basis of comparison of cell densities. Statistical analysis The percentage of each cell subpopulation was calculated in order to compare cell densities in the Montenegro skin testing sites and in the lesions. Cell density data were transformed to logarithms (base 10) in order to normalize the distribution for statistical analysis. Descriptive statistics were calculated for each cell population using the variation coefficient as an indicator of internal dispersion in each group. One way ANOVA with contrast tests of Duncan was used for comparing the results obtained independently for the different study groups. Because the CD4+/CD8+ lymphocyte ratio was not normally distributed, a KruskalWallis test was performed to analyze the differences in this variable. Correlations among results of the groups were established with the correlation coefficient of Spearman. All of the analyses were conducted considering a significance level of 0.05. Results The general characteristics of the individuals participating in the study are summarized in table 1. There was no significant difference in age of the patients included in the different groups. Females predominated in the active chronic lesion (putative susceptible group), whereas males predominated in the acute lesion and asymptomatically infected groups. The mean time of evolution of lesions was 0.7 months for the group having acute lesions and 26 for the chronic lesions.

Table 1. Characteristics of study population groups and biopsies evaluated. Group

Age mean (years)

Sex F

M

Age of lesions Number of lesion mean (months) biopsies

Number of Montenegro biopsies

Acute lesions (n=9)

24

1

8

0.7

9

Chronic lesions (n=9)

29

7

2

26

9

9 6

Asymptomatic individuals (n=11)

34

2

9

-

-

11

Normal controls (n=8)

33

5

3

-

-

8

41

GUARÍN N., PALMA G.I., PIRMEZ C. et al.

Montenegro skin testing in normal controls Healthy individuals presented a scarce and superficial inflammatory response to Montenegro skin testing (figure 1A) consisting of a few perivascular macrophage, CD4+ and CD8 + T lymphocytes and polymorphonuclear (PMN) leukocytes (non-specific response) including scarce eosinophils. The diluent of leishmanin containing thimerosal induced an inflammatory response similar to that observed in Montenegro skin testing of normal controls involving the same cell subsets (figure 1B). The number of inflammatory cells was significantly lower in normal controls than in the other groups (mean for control group: 712; acute: 10,057; chronic: 14,884; and asymptomatic individuals: 14,129. P15.00

ED50 and ED90 values in µM with P95 confidence limits (CL); light intensity in J/cm2.

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PHOTODYNAMIC ACTIVITY OF PHTHALOCYANINES IN LEISHMANIA

Biomédica 2006;26(Supl.1):49-56

Table 2. Photoactivity of zinc phthalocyanine against Leishmania spp. promastigotes. Experiment 1 J/cm2

L. panamensis

10.0 5.0 2.5 0.0

L. chagasi

10.0

Experiment 2

ED50 (CL)

ED90 (CL)

ED50 (CL)

ED90 (CL)

6.05 (5.00-7.11) 7.78 (7.53-8.03) 12.38 (958-15.18) >15.00

>15.00

4.89 (4.65-5.13) 6.71 (5.48-7.93) 10.22 (9.39-11.06) >15.00

>15.00

>15.00 >15.00 >15.00

>15.00

2.5

6.45 (5.77-7.13) 11.58 (10.77-12.39) >15.00

0.0

>15.00

>15.00

5.0

>15.00

>15.00

3.31 (2.07-4.55) 6.68 (5.46-7.87) 12.36 (12.00-12.71) >15.00

>15.00 >15.00 >15.00 >15.00 >15.00 >15.00 >15.00

ED50 and ED90 values in µM with P95 confidence limits (CL); light intensity in J/cm2.

against L. panamensis and L. chagasi with ED50 values of 0.11 µg/mL (P95 confidence limits 0.100.12 µg/mL) and 0.025 µg/mL (P95 confidence limits 0.021-0.028 µg/mL) respectively.

photosensitivity was showed by transgenic Leishmania promastigotes after ultraviolet illumination previously treatment with aminolevulinic acid (20).

Discussion

There are two types of mechanism that could be involved in the parasites inhibition after photodynamic therapy. The type I mechanisms due to the production of hydroxyl radicals and other active oxygen species that react with biomolecules in situ with subsequent cytotoxic results. The type II mechanism induced by the reactions between singlet oxygen with molecules involved in the maintenance of cell-wall/membrane structures such as phospholipids, peptides and sterols. Because it is known that Leishmania promastigotes are very susceptible to active oxygen species (29-31), it is possible to suggest that the low concentration of AlPc used in this study induces the release of activated oxygen species to inhibit the parasite. The mechanisms involved in Leishmania photodamage are under study.

The phototoxic effect of phthalocyanines against strains of two Leishmania species was determined for the first time in this work. The antileishmanial activity induced by the photodynamic treatment in vitro was strongly dependent on both the Leishmania species and the type and concentration of phthalocyanine used.

Leishmania chagasi promastigotes were highly susceptible to photodynamic therapy in vitro using AlPc treatment and red light illumination at 670 nm. The range of activities induced by AlPc (between ED50 of 0.0033 to 0.0093 µM) was lower than other antileishmanial drug activities such as hexadecylphosphocholine and amphotericin B (25-27). The efficacy of photodynamic therapy on trypanosomatids has been demonstrated in previous studies. The ability to inactivate Trypanosoma cruzi parasites from blood components was observed using photosensitizers such as amotosalen or psoralen and ultraviolet illumination (11,28) and cationic silicon phthalocyanines and red light illumination (28). In addition, a high

The difference in drug sensitivity between the two strains pertaining to two species of Leishmania such as L. chagasi and L. panamensis was notable. Over fifteen species of Leishmania are known to cause disease in humans with a wide clinical spectrum from visceral to cutaneous manifestations. Each species of Leishmania has 53

ESCOBAR P., HERNÁNDEZ I.P., RUEDA C.M. et al.

specific biochemical and molecular characteristics that provide the basis for the taxonomy of this genus. These differences are reflected in the variable sensitivity of Leishmania species to drugs, for example, pentavalent antimonials (32), the aminoglycoside antibiotic paromomycin (aminosidine) (33), several azoles (34), the pyrazolopyrimidines allopurinol and allopurinol riboside (35) and hexadecylphosphocholine (27). But why the strain of L. chagasi used was almost 50 times more sensitive than L. panamensis to photodynamic therapy it is not known. Almost all the literature about the in vitro photodynamic therapy activities is coming from the cancer models. In these models, the cell toxicity induced by phthalocyanines in vitro has been shown to be dependent on factors such as type of tumour cell, metal phthalocyanine and its derivatives, cell uptake, phthalocyanine incubation time, light intensity and/or phthalocyanine localization and distribution in the cells (16,36-40). In this work two types of phthalocyanines were compared. Aluminium phthalocyanine treatment showed a higher phototoxic effect than ZnPc. This result could be attributed to the amphiphilic properties of AlPc that could facilitate cell uptake and intracellular localization, contrary to the hydrophobicity of ZnPc. The AlPc used in this study was soluble in culture medium, whereas ZnPc was less soluble. In general, phthalocyanines are prone to self-aggregation and dimers are reported to be inactive or much more inefficient than monomers as photosensitizers (17). In water, ZnPc displays a strong tendency to form aggregates as a result of the propensity of the large hydrophobic skeleton to avoid contact with the aqueous medium. On the other hand, it is known that the central metal ligand plays a crucial role in the photobiological activity influencing the excited triplet state yield and lifetime (16,17). Another important reason which could justify the difference in AlPc versus ZnPc activity against parasites was the type of illumination system used in this study. It could be possible to obtain a higher ZnPc activity using a wide range of wavelength for illumination. In this paper, we have demonstrated that AlPc and ZnPc treatment after red light illumination at 54

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670 nm effectively inhibits L. chagasi and L. panamensis promastigotes. In order to confirm the useful of photodynamic therapy in leishmaniasis, it is imperative to continue this study testing the phothoactivity of these compounds in axenic or intracellular amastigotes and further in animal models. However the results shown in this paper, using only the promastigote free form of the parasite, give us an idea about the effects of photodynamic therapy on Leishmania and open a new perspective for an alternative treatment against this insidious parasite. Acknowledgements The authors would like to thank Professor Raymond Bonnett, Emeritus Professor of Organic Chemistry at Queen Mary, University of London, for his scientific support and advice during the development of the project. Conflict of interest The authors declare that there are no conflicts of interest on the results published in this paper. Financial support This work was supported by the Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnologia “Francisco Jose de Caldas” COLCIENCIAS (Grant 1102-04-14130; RC No 4802003), by the Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia and by the Program “Apoyo a los doctorados nacionales”, from COLCIENCIAS. References 1. Desjeux P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2004;27:305-18. 2. Croft SL, Coombs GH. Leishmaniasis-current chemotherapy and recent advances in the search for novel drugs. Trends Parasitol 2003;19:502-8. 3. Ouellette M, Drummelsmith J, Papadopoulou B. Leishmaniasis: drugs in the clinic, resistance and new developments. Drug Resist Updat 2004;7:257-66. 4. Berman JD. Human leishmaniasis: clinical, diagnostic, and chemotherapeutic developments in the last 10 years. Clin Infect Dis 1997;24:684-703. 5. Croft SL, Karbwang J. Antiparasitic drugs: the current status. Curr Opinion Anti Infec Inves Drugs 2000;2:21-3.

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EFFECT OF BLOOD SOURCE ON THE SANDFLY

ARTÍCULO ORIGINAL

Effect of blood source on the survival and fecundity of the sandfly Lutzomyia ovallesi Ortiz (Diptera: Psychodidae), vector of Leishmania Pedro Noguera, Maritza Rondón, Elsa Nieves Laboratorio de Parasitología Experimental (LAPEX), Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes, Mérida, Estado Mérida, Venezuela.

Introduction. The reproductive potential of sandflies depends on various factors, one of which is the type of host available as blood source, which is important in determining their capacity to serve as vectors. Objective. The present study evaluated the effect of the animal blood source on various biological parameters of Lutzomyia ovallesi (Ortiz) under laboratory conditions. Materials and methods. Two-day-old females from a L. ovallesi colony were artificially fed to repletion using a chicken skin membrane with blood from seven different species of vertebrate hosts, horse, dog, cow, chicken, goat, pig and human. Life-span, time of oviposition, time for blood digestion, number of eggs laid, number of eggs retained and the total number of eggs were recorded. Results. The results show the influence of blood source on different biological parameters of L. ovallesi. The results showed that in L. ovallesi, chicken blood is the most quickly digested (3.34 days) and gives the longest time of oviposition (5.88 days), the greatest number of eggs retained (10.20 eggs per female) and the greatest fecundity (30.80 eggs per female) compared with the other sources of blood studied. The most satisfactory animal blood source was chicken followed, in descending order, by goat, cow, pig, human, dog and horse. Conclusions. The data showed that, in bio-ecological terms, the best blood source for L. ovallesi was chicken and the least satisfactory one was horse. These results contribute to the understanding of the factors that influence the rearing of the sand fly L. ovallesi under laboratory conditions, and of how dietary factors for adult sand flies affect their biological potential and could have important consequences on the transmission of Leishmania. Key words: Blood, Psychodidae, biology, fertility, Leishmania. Efecto del tipo de sangre en la supervivencia y fecundidad del flebotomino Lutzomyia ovallesi Ortiz (Diptera: Psychodidae) vector de Leishmania Introducción. El potencial reproductivo de los flebotominos depende de varios factores, uno de los cuales es el tipo de hospedador disponible como fuente sanguinea, este es importante en determinar su capacidad de servir como vectores. Objetivo. Se estudia el efecto de la fuente de alimentación sanguínea sobre varios parámetros biológicos de L. ovallesi en condiciones de laboratorio. Materiales y métodos. Se utilizaron hembras de dos días de edad de L. ovallesi de colonia, alimentadas artificialmente a repleción usando membrana de pollo, con sangre de siete hospedadores vertebrados, caballo, perro, vaca, gallina, chivo, cochino y humano. Se determinó el tiempo de vida, tiempo de oviposición, tiempo de digestión sanguínea, número de huevos puestos, número de huevos retenidos y número de huevos totales. Resultados. Los resultados muestran la influencia de la fuente sanguínea sobre diferentes parámetros biológicos de L. ovallesi estudiados. Los resultados demuestran que con la sangre de gallina se obtienen mayor tiempo de oviposición (5,88 días), digestión más rápida (3,34 días), mayor número de huevos retenidos (10,20 huevos por hembra) y mayor fecundidad (30,80 huevos por hembra) en comparación con los otros tipos de sangre. La sangre más

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satisfactoria fue la de gallina seguida, en orden descendente, por las de chivo, vaca, cochino, humano, perro y caballo. Conclusión. Los datos muestran que la sangre de gallina es la mejor fuente sanguínea en términos bio-ecológicos para L. ovallesi, y la sangre de caballo la menos adecuada. Los resultados contribuyen al entendimiento de los mecanismos que influyen en las condiciones de cría en el laboratorio del flebotomino L. ovallesi y también de cómo ciertos factores de la dieta en los adultos afectan el potencial biológico y que podrían tener importante consecuencias en la transmisión de Leishmania. Palabras clave: sangre, Psychodidae, biología, fertilidad, Leishmania.

Sandflies (Diptera: Psychodidae) are hematophagic insects that need bloodmeal to complete their reproductive cycle. Only the females feed on blood which provides proteins indispensable for egg production (1-3). The reproductive potential of sandflies, as other hematophagic insects, depend mainly to find a host that will provide blood capable to mature a significant number of eggs besides a suitable site for laying them (4-7). The feeding habits of the vectors constitute an important aspect of their bionomics, affecting directly the Leishmania transmission (8-10). It also was demonstrated that the rate of blood meal digestion in Phlebotomus langeroni varied according to the source of the vertebrate blood and Leishmania species involved (11). Chaniotis 1967(12) noticed that Lutzomyia vexator laid more eggs after feeding on lizards than on snakes. Ward 1977 (13) reported that L. flaviscutellata laid more eggs after feeding on rodents than on humans. Ready 1979 (14) observed that for L. longipalpis the number of eggs matured with the blood of seven mammal hosts increased in direct proportion to the weight of blood ingested and its source, some blood seems to be more nutritive than others; similarly, Benito De Martin et al. 1994 (15) and Hanafi et al. 1999 (16) showed for Phlebotomus that fecundity also dependeds on the blood source. Nutritional quality of blood varies between host species and may influence egg productivity, reduce development Corresponding: Elsa Nieves, Laboratorio de Parasitologia Experimental (LAPEX), Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Universidad de Los Andes, La Hechicera, Mérida, Estado Mérida, 5101. Venezuela. Teléfono: (02 74) 240 1244; fax: (02 74) 240 1286. [email protected] Recibido: 26/05/05; aceptado: 13/10/05

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rates, longevity and fecundity of the insects (17). For understanding the role of blood meal sources on sandfly biology, physiology and Leishmania transmission more field observations and laboratory studies comparing egg productivity of sandflies fed on differents hosts (17-19) are necessary.

L. ovallesi (Ortiz) is one of the main vectors of Leishmania braziliensis in Venezuela (20). It is frequently found in the vicinity of human habitation and it is considered an anthropophilic species (21,22). However, L. ovallesi feeds upon a variety of vertebrate hosts, and could be considered as an opportunistic species (23,24). Thus, the present work studies the effect of blood from different domestic animals on the fecundity of L. ovallesi in laboratory conditions. Materials and methods

Sandflies Females of L. ovallesi were obtained from a closed laboratory colony established with specimens collected during 2001 at 1,360 m above sea level in the locality of El Arenal, Ejido, Mérida state, Venezuela. The colony was maintained in the Laboratorio de Parasitología Experimental, at the Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela, with techniques described by Killick-Kendrick et al. in 1977 (25), in an incubator at 25±1°C with a relative humidity of 80±10%.

Blood sources Blood from healthy animals was collected in tubes containg 0.2 ml of citrate per ml of blood. The blood sources were: horse (Equus caballus), chicken (Gallus domesticus), pig (Sus scrofa domestica), cow (Bos taurus), goat (Capra hircus), dog (Canis familiaris) and human (Homo sapiens sapiens).

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Artificial feeding Two-day-old females were artificially fed to repletion using chicken membrane, with water circulating at a temperature of 39°C. Groups of ≈100 sand flies were exposed to the feeder over each carton during 4 hours. In each fedeer blood was mixed every 30-45 minutes using a pipette, to prevent cell sedimentation. Blood-fed sandflies were separated, counted and individually placed into glass tubes, mantained in an incubator at 25±1°C with relative humidity of 80±10%, with 12 hours of light and 12 hours of darkness. As a dietary supplement they were given a 50% fresh sucrose solution, renewed daily.

EFFECT OF BLOOD SOURCE ON THE SANDFLY

gestion time for chicken blood and all the others, and between digestion time of horse blood and blood from chicken, pig, cow, and goat (p