ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL EXTRACTO ALCALOIDAL DE LA ESPECIE NATIVA Berberis tabiensis (LAC) BERBERIDACEAE

LORENA PAOLA NUÑEZ ARÉVALO

GRUPO DE INVESTIGACIÓN HACIA LA SINTESIS Y TRANSFORMACIÓN DE NETABOLITOS SECUNDARIOS UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUIMICA BOGOTÁ 2010

1

ESTUDIO FITOQUÍMICO DEL EXTRACTO ALCALOIDAL DE LA ESPECIE NATIVA Berberis tabiensis (LAC) BERBERIDACEAE

LORENA PAOLA NUÑEZ ARÉVALO

Trabajo presentado como requisito parcial para optar al título de Magíster en Ciencias-Química

DIRECTOR: RODOLFO QUEVEDO PASTOR Químico Dr.Sc Profesor Asociado Departamento de Química Universidad Nacional de Colombia

GRUPO DE INVESTIGACIÓN HACIA LA SINTESIS Y TRANSFORMACIÓN DE NETABOLITOS SECUNDARIOS UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUIMICA BOGOTÁ 2010

2

AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mis más sinceros agradecimientos: Primero que todo a DIOS y a mis ángeles porque sin ellos nada de esto hubiera sido posible. A mi familia, mi MAMI, JAIME, NATALIA Y MANOLO, que siempre estuvieron y están siempre apoyándome y colaborándome en todo, dándome su amor y cariño incondicional. A mi motor de ahora en adelante YANN JERÓNIMO por darme la motivación para culminar este proceso. A CRISS… por su amor y apoyo incondicional durante estos últimos años. . A la UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA - DIB por permitirme realizar mis estudios de Maestría y apoyarme en la financiación de la misma. Al profesor RODOLFO QUEVEDO por haberme dado su orientación, colaboración y apoyo total en este proceso de formación. Porque con todo y todo siempre nos entendimos y formamos un buen equipo. A la profesora BÁRBARA MORENO la oportunidad de trabajar en su grupo de investigación Productos Naturales Vegetales Bioactivos y Química Ecológica y por ser más que una profesora una amiga. Al profesor LUIS ENRIQUE CUCA porque siempre recibí de el muchos consejos y enseñanzas que me enriquecieron personal y profesionalmente. A los profesores del Dpto. de Química aportarme su conocimiento y siempre estar presentes para resolver cualquier duda. A amigas y compañeras Litta, Sonia y Carolina, con quienes compartí muchos momentos inolvidables y quienes fueron mi apoyo en aquellos momentos difíciles de este proceso. A mis compañeros de laboratorio, July y Karen, a mis otros amigos los de arriba (os pupilos del profe Cuca y a todas aquellas personas que de una u otra forma me aportaron diferentes cosas, desde sonrisas, tiempo y demás a lo largo de este trayecto. Y por supuesto a mis gatos, mi mejor forma de desestresarme cuando hubo momentos de presión, porque si que los hubo!!!!

3

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN

12

CAPITULO 1. Estado actual del tema

13

1.1

13

Familia Berberidaceae

1.1.1 Clasificación taxonómica y distribución geográfica

14

1.1.2 Química

15

1.2

15

Género Berberis

1.2.1 Clasificación taxonómica

15

1.2.2 Distribución geográfica

16

1.2.3 Usos

17

1.2.4 Química 1.3

20

Actividad Insecticida

27

1.3.1 Actividad insecticida en el género Berberis 1.4

28

Alcaloides

28

1.4.1 Generalidades

29

1.4.2 Alcaloides isoquinolínicos del género Berberis

31

1.4.3 Biosíntesis CAPITULO 2. Metodología

34

2.1

Procedimientos generales

34

2.2

Material biológico

35

2.2.1 Metodología propuesta por McLaughlin

35

2.3

Material vegetal

36

2.4

Obtención del extracto etanólico

37

2.5

Obtención del extracto alcaloidal

37

2.6  

Fraccionamiento

37  

4

29

CAPITULO 3. Resultados y discusión 3.1

Elucidación del compuesto A4.3

3.2

Berberina

3.3

Elucidación del compuesto C3.4

3.4

Actividad Insecticida

31 44 47

CONCLUSIONES 53

RECOMENDACIONES REFERENCIAS

55

ANEXOS: Espectros RMN 1D y 2D para tabienina B y columbamina 54

Mecanismo biosintético para tabienina B

55 77

5

ABREVIATURAS AcOEt

Acetato de etilo

°C

Grados centígrados

CC

Cromatografía en Columna por gravedad

CCD

Cromatografía en Capa Delgada

CG-EM

Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas

CE50

Concentración efectiva del 50%

d

Doblete

dd

Doble de doblete

EM

Espectrometría de Masas

ESI

Ionización por electrospray

IR

Espectro Infrarrojo

J

Constante de acoplamiento

m

Multiplete

m/z

Relación masa/carga

MeOH

Metanol

min

Minutos

PF

Punto de fusión

PM

Peso molecular

ppm

Partes por millón 6

RMN 1H

Resonancia Magnética Nuclear Protónica

RMN 13C

Resonancia Magnética Nuclear de carbono trece

s

Singlete

uma

Unidades de masa atómica

δ

Desplazamiento químico

7

INDICE DE TABLAS

38

Tabla 1.

Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción A1

Tabla 2. 

Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción C1

40

Tabla 3. 

Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción C3

40

Tabla 4. 

Datos espectroscópicos para tabienina B

Tabla 5. 

Datos espectroscópicos del compuesto C3.4

49 63

Comparación de datos espectroscópicos del compuesto C3.4 con Tabla 6. 

65

compuestos de literatura

8

INDICE DE FIGURAS Figura 1.

Clasificación taxonómica de la familia Berberidaceae

14

Figura 2.

Esqueleto base de un alcaloide protoberberínico

17

Figura 3.

Esqueleto base de una bencilisoquinolina

18

Figura 4.

Estructura de aporfina: aporeina

18

Figura 5.

Esqueleto base de pavina

19

Figura 6.

Estructuras de alcaloides bbi: berbamina y oxiacantina

20

Figura 7.

Estructura de la rotenona

23

Figura 8.

Piretrinas

25

Figura 9.

Nicotina

26

Figura 10.

Algunos núcleos comunes de alcaloides.

29

Figura 11.

Esqueleto base de los alcaloides isoquinolínicos

29

Figura 12.

Estructura de tabienina A

31

Figura 13.

Biosíntesis general de los alcaloides bbi I

32

Figura 14.

Biosíntesis general de los alcaloides bbi II

33

Figura 15.

Fotografía de los frutos y hojas de la especie B. tabiensis

36

Figura 16.

Esquema general del proceso de purificación de los compuestos aislados

43

Figura 17.

Espectro de masas de alta resolución en modo ESI de Tabienina B

43

Figura 18.

Espectro RMN 1H de la zona aromática de Tabienina B

44

Figura 19.

Espectro COSY de la zona aromática de Tabienina B

45

Figura 20.

Espectro RMN 1H de la zona alifática de Tabienina B

46

Figura 21.

Espectro RMN 13C de la zona aromática de Tabienina B

47

Figura 22.

Datos espectroscópicos para Tabienina B

48

Figura 23.

Correlaciones (H - C) de tabienina B observado en el espectro

48

HMBC.

52

Figura 24.

Ruta biosintética de la formación de N-metilcoclaurina

Figura 25.

Formas canónicas lábiles a sufrir reacción de acoplamiento

53

fénolico monooxidativo Figura 26.

54

Dimerización cola-cola en la formación de tabienina B 9

Figura 27.

Hidroxilación orto al puente éter en la formación de tabienina B

Figura 28.

Unión cabeza-cabeza vía radicales libres en la formación de

55  

tabienina B Figura 29.

56 

Unión cabeza-cabeza vía reacciones polares en la formación de tabienina B

Figura 30.

Berberina, alcaloide característico del género Berberis

Figura 31.

Diagrama general de la biosíntesis de berberina

Figura 32.

Estructura y numeración de 5,6-dihidro-2-hidroxi-3,9,10-

  57  58 

trimetoxidibenzo[a,g]quinolizinium: columbamina Figura 33.

Espectro RMN 1H de la zona aromática para el compuesto C3.4

Figura 34.

Espectro COSY del compuesto C3.4

Figura 35.

Espectro RMN 13C del compuesto C3.4

Figura 36.

Correlaciones (H - C) del compuesto C3.4 observadas en el

59    60 

espectro HMBC. Figura 37.

Esquema de realización de bioensayos iniciales

Figura 38.

Esquema de realización de bioensayos siguiendo la purificación

61  61 

de compuestos de tipo alcaloidal Figura 39.

Espectro RMN 1H de tabienina B, zona aromática y alifática

Figura 40.

Espectro RMN 13C de tabienina B, zona aromática y alifática

Figura 41.

Espectro COSY de tabienina B, zona aromática

Figura 42.

Espectro COSY de tabienina B, zona alifática

Figura 43.

Espectro HMQC de tabienina B

Figura 44.

Espectro HMBC de tabienina B

Figura 45.

Espectro RMN 1H de columbamina

Figura 46.

Espectro RMN 13C de columbamina

Figura 47.

Espectro COSY de columbamina

Figura 48.

Espectro HMQC de columbamina

Figura 49.

Espectro HMBC de columbamina

62  64  66    68  87  88  89  90  91  10

INTRODUCCIÓN El estudio de los productos naturales puede verse como una herramienta que permite ampliar el conocimiento a nivel científico de diferentes organismos, teniendo presente los criterios actuales enfocados hacia el mantenimiento y aprovechamiento de las especies animales, vegetales u otras. Reconociendo este campo como la búsqueda continúa de rutas alternas y amigables con el ecosistema, involucrando investigación multidisciplinaria y generando resultados más asertivos. En este sentido, la química de los productos naturales muestra una gama de propuestas acordes a los principios ecológicos y científicos, aportando al estudio químico de los organismos que pueden presentar actividad biológica promisoria. Dentro de estos organismos se encuentran las especies vegetales que en su proceso evolutivo han adquirido la capacidad de sintetizar sustancias que poseen estructuras novedosas útiles en solución de diferentes afecciones de salud humana, animal y vegetal; en su gran mayoría presentan variados usos a nivel etnobotánico, medicinal, farmacéutico e industrial y son la base o principio en el desarrollo de nuevos productos de síntesis. Hoy en día se sabe que estos metabolitos secundarios desempeñan un papel importante en el mecanismo defensivo de las plantas. Por lo tanto en los últimos años se está retornando al uso de las plantas como fuente de pesticidas más seguros para el medio ambiente y la salud humana (Jacobson, 1989). Es conocido que tanto la fauna como la flora colombiana se encuentran dentro de las más diversas y exóticas del planeta. Por lo que se hace necesario contribuir al conocimiento de nuestras especies, aportar desde nuestras bases al desarrollo social y económico de nuestro país, de manera que se den a la 11

sociedad nuevas herramientas que puedan ser aplicadas a nivel científico y cultural. Se ha creado la necesidad de evaluar y conservar el patrimonio ambiental y ecológico a nivel mundial que a futuro representará una riqueza invaluable para aquellos que la posean. Desde esta perspectiva, la investigación

y

los

estudios

de

bioactividad,

fitoquímicos

y

quimiotaxonómicos que puedan avalar el desarrollo socio-cultural y científico de una especie merecen ser realizados y evaluados. CAPITULO 1. ESTADO ACTUAL DEL TEMA 1.1 . Familia BERBERIDACEAE 1.1.1. Clasificación taxonómica y distribución geográfica La familia Berberidaceae, pertenece al orden de la Ranunculales,

está

conformada por 15 géneros y 650 especies distribuidas en ambos hemisferios (Romero, 2005). Incluye cuatro subfamilias: Berberidoideae, que agrupa 6 géneros,

siendo

los

más

representativos

Berberis

y

Mahonia;

Podophylloideae, Leonticoidaeae y Nandinoideae, esta última se caracteriza por ser rica en alcaloides

bencilisoquinolínicos y en compuestos como

nandinina, amentoflavona y benzaldehido-4-O-glucosido (Yong, 2006). En la Figura 1, se presenta la clasificación taxonómica de la familia Berberidaceae.

12

Figura 1. Clasificación taxonómica de la familia Berberidaceae En Colombia, está familia se encuentra ampliamente distribuida a lo largo de todo el país, encontrándose entre los 1800 y 2500 msnm, en zonas húmedas y con temperaturas de páramo principalmente (Camargo, 1981). 1.1.2. Química La familia Berberidaceae contiene principalmente compuestos de tipo isoquinolina, lignano y flavonoide. Su composición química característica muestra alcaloides derivados de la L-tirosina (Romero, 2005), siendo la berberina el compuesto más representativo de los alcaloides de tipo isoquinolínico presentes en esta familia; especialmente en los géneros Berberis y Mahonia.

13

1.2 Género Berberis 1.2.1 Clasificación taxonómica El género Berberis cuenta con más de 500 especies distribuidas en ambos hemisferios. Este género está dividido en 4 grandes subgrupos de acuerdo a su ubicación geográfica y a la combinación de caracteres morfológicos: Septentrionales, Australes, Occidentales y Orientales; los dos primeros subgrupos corresponden a especies con hojas simples, Septentrionales como Euroasiáticas, con excepción de 2 especímenes en Norte América y 4 en el norte de África; las Australes, están divididas en 2 subgrupos Aequinoctiales, al cual pertenecen las Berberis colombianas y Euaustrales, que son exclusivamente del sur de Sur América; las Occidentales se encuentran en Norte y Centro América y las Orientales, en el Sureste asiático, con excepción de la especie B. nervosa originaria de Norte América (Kim, 2004; Landrum, 1999). 1.2.2 Distribución geográfica 1.2.2.1 Distribución mundial Este género predominantemente holártico, con más de 500 especies, presenta una importante distribución en Sudamérica, donde crecen más de 35 especies en la franja paramuna. Aunque se había asignado un origen norteño para los Berberis sudamericanos (Ahrendt 1961), parece difícil que este supuesto pueda explicar la gran diversificación morfológica del género en la cadena de 14

los Andes y en la zona austral de Sudamérica. Los análisis recientes, muestran afinidades entre las Berberis sudamericanas y los del pacífico austral (Landrum 1999, Meléndez 2000). 1.2.2.2 Distribución en Colombia En los Andes, la mayor concentración de especies se presenta en Colombia con alrededor de 70 taxones, de acuerdo con la información depositada en herbario. A su vez, el mayor número de taxones con distribución restringida se presenta en la cordillera Oriental de Colombia donde se concentran alrededor 25 de ellas. Dentro de este grupo, se diferencia el sistema de páramos de Cundinamarca y Boyacá que cuentan con mayor número de endemismos (ca. 18 taxones). En la Sierra Nevada de Santa Marta se encuentran cuatro especies endémicas (Camargo, 1991; Meléndez, 2000). 1.2.3 Usos Las especies del género Berberis se caracterizan por presentar una morfología variada con una coloración amarilla característica en su madera, raíz y corteza; tradicionalmente usada para dar coloración a los textiles; sus frutos son comestibles fermentados para producir bebidas alcohólicas y en culinaria (Bernal, 1989). De En medicina tradicional se emplea para el tratamiento encuentran enfermedades del sistema circulatorio, especialmente la raíz como hemostático y febrífugo (Shamsa, 1999), la infusión de las flores se utiliza para tratar la anemia y sus síntomas (Fatehi, 2005), para el sistema linfático como diurético, tónico y diaforético (Kupeli, 2002; Zeng, 200), para el sistema 15

digestivo en el tratamiento de disentería amebiana, como purgante y analgésico (Lohombo-Ekombaa, 2004). 1.2.4 Química Los alcaloides encontrados en el género Berberis se pueden agrupar de acuerdo al núcleo del cual se derivan, como se muestra a continuación (Bentley, 1995): (R = H, -OCH3, -O-CH2-O)  Protoberberinas En este grupo normalmente se pueden encontrar bases cuaternarias con las posiciones 2,3 y 9,10 (Figura 2) oxigenadas (Grycova, 2007).

4

RO

3

RO

2

5 6 +

N

8

1 13

9

12

10 11

OR

OR

Figura 2. Esqueleto base de un alcaloide protoberberínico

16

 Bencilisoquinolinas Su biosíntesis se da a partir de la tirosina y son precursores de otros compuestos alcaloidales que en su gran mayoría conservan las sustituciones oxigenadas presentes en este núcleo base (Figura 3).

RO NH

RO

RO RO

Figura 3. Esqueleto base de bencilisoquinolina  Aporfinas Los esqueletos aporfínicos se producen biogenéticamente por oxidación de los grupos fenólicos de las benciltetrahidroquinolinas por medio de un acoplamiento oxidativo mono-electrónico entre los carbonos 8 y 10 (Figura 4). O O

N

aporeina

H

CH 3

Figura 4. Estructura de aporfina: aporeina 17

Pueden encontrarse moléculas cargadas como la magnoflorina, que al igual que la aporeina, muestran oxigenación típica en las posiciones 5 y 6. Esta clase de compuestos ha demostrado tener propiedades antiinflamatorias y citoprotectoras que se supone están relacionados con su carácter antioxidante (Cassels, 2001).  Pavinas Clase de alcaloides derivados biogenéticamente de los bencilisoquinolinas (Figura 5), se encuentran en la familia Lauraceae (Gözler, 1983). Han demostrado tener variada actividad biológica tales como efectos del comportamiento (Meisenberg, 1984) y efectos antitumorales (Wu, 1989).

O

R O

R

N R R

O

O

R

Figura 5. Esqueleto base de pavina  Bisbencilisoquinolinas (bbi) Este tipo de alcaloides posee por lo general un puente éter que une dos estructuras bencilisoquinolínicas. Pueden estar metiladas en el nitrógeno del anillo heterocíclico y presentar alguna actividad dependiendo de su estereoquímica en las posiciones 1 y 1´ (Figura 6) (Ratsimamanga-Urverg, 1992; Mambu, 2000).

18

O CH3

CH3 O

N O CH3

H3C

N CH3

O

OH O

berbamina

CH3 CH3

N H3C

O

O

O

CH3

N CH3

O

O

oxiacantina

HO

Figura 6. Estructuras de alcaloides bbi: berbamina y oxiacantina La estereoquímica de esta clase de alcaloides se ha podido determinar haciendo el rompimiento del dímero por medio de una fisión sódica en amoniaco líquido, luego se analizan los compuestos utilizando técnicas como dicroísmo circular o poder rotatorio para cada uno de los fragmentos obtenidos (Fajardo, 1984). 1.3 Actividad Insecticida Evaluar la actividad insecticida involucra todo un legado de conocimientos y de historia que se mencionará brevemente; un insecticida es una sustancia o mezcla de sustancias usadas para prevenir, destruir, repeler o controlar 20

organismos indeseados (Isman, 2005). Desde tiempos remotos la búsqueda del hombre por lograr un bienestar propio y de su entorno ha propiciado el empleo de productos químicos para destruir plagas, principalmente insectos. En el siglo XVI, los chinos empleaban arsenicales como insecticidas y poco después, empezó a usarse la nicotina extraída del tabaco, en Europa a principios del siglo XIX se utilizaban elementos como cenizas, tabaco molido, cianuro de hidrógeno, compuestos de mercurio, zinc, fósforo y plomo, etc. Los anteriores, forman el grupo de los llamados insecticidas de 1ª generación, los cuales, son en general muy tóxicos, poco efectivos en la lucha contra la plaga y muy persistentes en el ambiente, hoy día todavía en muchas zonas existen rastros de ellos, que provocaron grandes contaminaciones, enfermedades en hombres y animales, aguas contaminadas y una lista enorme de defectos. La agroquímica surgió debido a las dos grandes guerras mundiales, los avances de la ciencia y de la industria química que hicieron posible la aparición de mejores insecticidas que se suelen denominar de 2ª generación, como los organoclorados, organofosfatos y carbamatos. Posteriormente, los insecticidas del grupo del parathion como órganofosforados y el DDT (Zadoks and Waibeu, 2000; Beard, 2006). Actualmente, un gran número de investigaciones referentes a los insecticidas se enfocan a la producción, distribución y uso de estos, pero en muy pocos casos se hace referencia al control ambiental y ecológico. Los insecticidas empleados en el control de plagas pueden llegar a ser generadores de severos problemas alimentarios, convergiendo a la contaminación de acuíferos, suelos, aire, sedimentos y biota (Després, 2007) .

22

Sin lugar a dudas, los insecticidas naturales obtenidos a partir de extractos vegetales surgen como una interesante alternativa en el control de insectos. Algunos de los metabolitos que han sido utilizados con este fin son: rotenona, flavonoide que se extrae de las raíces de Derris elliptica y Lonchocarpus utilis, Fam. Leguminosae, Figura 7. Este compuesto es un insecticida de contacto e ingestión, y repelente. Su modo de acción implica una inhibición del transporte de electrones a nivel de mitocondrias bloqueando la fosforilación del ADP a ATP, inhibiendo el metabolismo del insecto (Yenesew, 2006; Lummen, 1998). H2C CH3 H O

O

O

H O

H3C O O H3C

Figura 7. Estructura de la rotenona Las piretrinas Figura 8, son esteres con propiedades insecticidas obtenidos de las flores del piretro (Chrysantemum cinaerifolium, Fam. Compositae). Estos esteres están formulados por la combinación de los ácidos crisantémico y pirétrico y los alcoholes piretrolona, cinerolona y jasmolona, atacan tanto el sistema nervioso central como el periférico ocasionando descargas repetidas, seguidas de convulsiones; conocido como efecto irritante o "knock down" que hace que el insecto apenas entre en contacto con la superficie tratada deje de alimentarse y caiga. (Marshall, 1997). 23

CH3

H3C CH3

H O

O H3C

H O

piretrina I H 3C

H H3C

CH2

CH3

H 3C

H

H OH

H 3C

O

H H3C

O

ácido crisantémico

O

O

HO

CH2

ácido pirétrico

Figura 8. Piretrinas La nicotina Figura 9, es un alcaloide derivado principalmente del tabaco (Nicotiana tabacum Fam. Solanaceae). Sus propiedades insecticidas fueron reconocidas en la primera mitad del siglo XVI.. Su modo de acción consiste en mimetizar la acetilcolina al combinarse con su receptor en la membrana postsináptica de la unión neuromuscular. El receptor acetilcolínico, es un sitio de acción de la membrana postsináptica que reacciona con la acetilcolina y altera la permeabilidad de la membrana; la actividad de la nicotina ocasiona la generación de nuevos impulsos que provocan contracciones espasmódicas, convulsiones y finalmente la muerte (Danielson, 1996).

25

N CH 3 N

nicotina Figura 9. Nicotina La azadirachtina es un tetraterpenoide característico de la familia Meliaceae aisalda principalmente del árbol Neem (Azadirachta indica), originario de la india. Este compuesto se encuentra en la corteza, hojas y frutos de este árbol pero la mayor concentración se ubica en la semilla. En el extracto se han identificado alrededor de 18 compuestos entre los que destacan salanina, meliantrol y azadiractina que es el que se encuentra en mayor concentración. Muestra acción antialimentaria, reguladora del crecimiento, inhibidora de la oviposición y esterilizante. (Silva, 2002)

Con el crecimiento de la industria y la población mundial, se ha incrementado el número y la diversidad de plagas resistentes a los diferentes insecticidas hasta ahora utilizados, y como consecuencia han proliferado las enfermedades pandémicas transmitidas por estos insectos vectores, tal es el caso del paludismo, enfermedad transmitida por la hembra del género Anopheles y que causa cerca de 900.000 muertes al año en Africa (Stratton, 2008, Opreh, 2008). La filariosis, enfermedad tropical endémica transmitida por el vector Culex quinquefasciatus, considerado como una especie acentuadamente antropofágica transmisor de filarias como Wuchereria bancrofti y Dirofilaria 26

immitis (Isman, 1997; Sukumar, 1991), del virus del Nilo occidental y de los virus causantes de la encefalitis de San Luís y la encefalitis equina venezolana, entre otros (Coto, 2000). C. quinquefasciatus, habita en regiones tropicales y subtropicales y abarca hasta las isotermas de 20°C; abunda principalmente en América y África tropical, Medio y Lejano Oriente, sur de Asia, Nueva Guinea, Australia y en el sur de Estados Unidos (Salazar, 2004). Este zancudo se encuentra asociado con mayor frecuencia al hábitat humano tanto urbano como rural en Colombia y a pesar de que no existe riesgo de transmisión de agentes patógenos, constituye un problema de salud pública. Una situación crítica se presenta en el municipio de Sibaté en la sabana de Bogotá, en donde se reproduce en cantidades descomunales que alcanzan la concentración más alta del mundo: 74 millones de insectos que enloquecen a 32 mil habitantes (2312,5 por persona) (Sarmiento, 1999). 1.3.1 Actividad insecticida en el género Berberis Como se mencionó, las especies del género Berberis tienen variados usos y entre estos estan los relacionados con la actividad insecticida: el extracto alcaloidal de la raíz de la especie B. lycium L., mostró actividad promisoria frente ejemplares adultos de Aphis craccivora (Koch), Tetranychus urticae (Koch), frente a larvas de segundo estadio de Helicoverpa armígera (Hubner), y Plutella xylostella (Linnaeus), con valores de porcentaje de mortalidad de 68, 43, 44 y 44% respectivamente, evaluados en extractos no polares de éter de petróleo y con el extracto etanólico, con valores de porcentaje de mortalidad de 98, 26, 28 y 28% respectivamente (Tewary, 2005). En otro estudio, las especies B. samacana y Berberis saboyana mostraron actividad insecticida frente a Tecia solanivora con un porcentaje de reducción de 27

población de 21.5 % y 53.7% respectivamente (Castillo, 1998); la especie B. glauca mostró actividad antialimentaria frente a larvas de 3° y 4° estadío de la polilla Spodoptera sunia (Lepidoptera), con porcentaje de mortalidad de 46% para concentraciones de 1% (p/v) (Moreno, 1995). Sobre la especie

B.

tabiensis, se evaluó la actividad insecticida frente a larvas de tercer estadio del mosquito Culex quinquefasciatus (Say) (CE50: 350 ppm) y realizando ensayos guía de toxicidad frente a nauplios del crustáceo Artemia salina (Leach) (CE50: 476 ppm), concluyéndose que esta es una especie con actividad insecticida promisoria (Quevedo, 2007). 1.4

Alcaloides

1.4.1 Generalidades Son compuestos heterocíclicos nitrogenados de carácter básico de donde se deriva su nombre “alkali”, obtenidos principalmente de plantas superiores, hongos y organismos marinos, mostrando actividades farmacológicas muy variadas (Trevor, 1981; Gros, 1985). La clasificación de estos compuestos es basada en el esqueleto químico de su precursor, es decir, la biogénesis de los alcaloides se puede dar por la vía del ácido acético o del ácido shikímico, por reacción con los aminoácidos se forman los núcleos base que dan origen a los diferentes estructuras. Algunos de estos núcleos se muestran en la Figura 10.

28

H N

H N

pirrolidina

piperidina

H N

piridina

N N

indol

N

N

isoquinolina

quinolina

H N

CH3 N

N

tropano

N

N

purina

bencilisoquinolina

Figura 10. Algunos núcleos comunes de alcaloides. Físicamente la mayoría de los alcaloides son compuestos incoloros, sólidos ligeramente solubles en soluciones acuosas neutras o alcalinas, pero muy solubles en soluciones ácidas y en disolventes como éter, cloroformo o etanol. Algunos alcaloides como la nicotina y la coníina son líquidos a temperatura ambiente y algunos son coloreados como la berberina y la sanguinarina (Trevor, 1981). 1.4.2 Alcaloides isoquinolínicos del género Berberis Para que un alcaloide sea llamado isoquinolínico debe poseer en su estructura o ser derivado de la siguiente unidad básica:

N

Figura 11. Esqueleto base de los alcaloides isoquinolínicos 29

Es conocido que las especies del género Berberis poseen un ordenamiento característico

de

sus

compuestos

de

tipo

alcaloidal

derivados

biogenéticamente de la tirosina y que a su vez están agrupados según su núcleo alcaloidal que caracteriza quimiotaxonómicamente las especies del género Berberis. En Colombia existen cerca de 70 especies nativas pertenecientes al género Berberis, único representativo de la familia Berberidaceae en el hemisferio sur (Camargo, 1981), de las cuales se han descrito alrededor de 50 que son utilizadas en medicina tradicional en diversas regiones del país. Se conocen pocos estudios sobre la composición química de las plantas del género Berberis colombianas; los primeros se realizaron en la especie B. rigidifolia de donde se aisló berberina, el alcaloide mayoritario y común en plantas de este género (Aristizabal, 1989). A la especie B. monguiensis se realizó

una

caracterización

espectroscópica

preliminar

encontrándose

berberina y protoberberina (Jimenez, 1995). De la especie B. glauca se han idenificado

varios

derivados

bisbencilisoquinilinicos,

tales

como:

isothalicberina, O-metilisothalicberina y 7-O-demetilisothalicberina (Moreno, 1995), estos alcaloides se aislaron previamente de B. chilensis de Chile y B. laurina originaria de Uruguay (Martinez, 1997; Falco, 1968). En un estudio reciente de la fracción alcaloidal de los tallos de la especie B. tabiensis, se logró aislar un nuevo alcaloide bisbenciltetrahidroisoquinolínico, denominado tabienina A (Figura 12); (Quevedo, 2008).

30

N H3C

1

O CH3

H3C O

O CH3

H3C O

1´

N CH3

13

O 11

12´

OH

11´

O CH3

H3C O

tabienina

Figura 12. Estructura de tabienina A Este nuevo alcaloide mostró un patrón de sustitución con metoxilos sobre los carbono 11 y 11´ y unión cola-cola entre los carbonos 13 y 12´ poco común en alcaloides aislados de este género. 1.4.3 Biosíntesis Los alcaloides bisbencilisoquinolínicos son producto de la dimerización por acoplamiento oxidativo de bencilisoquinolinas como coclaurina, que a su vez se deriva de un núcleo isoquinolínico formado biogenéticamente a partir del aminoácido tirosina como se muestra a en la Figura 13 (Dewick, 2007):

31

tirosina

HO O NH 2

HO ión P PL inac am ns tra

-CO2 PLP

OH

NH2 O HO

HO ácido-4-hidroxifenilpiruvico

tiramina

-CO2

O

NH2

HO

H O

HO

HO

dopamina

HO

4-hidroxifenilacetaldehido

H3C O

H3C O

NH HO SAM

HO

NH HO SAM

HO

(S)-norcoclaurina

N CH3

HO

(S)-coclaurina

HO (S)-metilcoclaurina

Figura 13. Biosíntesis general de los alcaloides bbi I

A partir de metilcoclaurina o norcloclaurina, pueden darse reacciones secundarias posteriores de metilación, reducción, oxidación, deshidratación, y condensaciones cola-cola, seguida de condensaciones cabeza-cabeza por

32

medio de enlaces difeniléter formando compuestos diméricos como la tubocurarina y la tetrandrina, Figura 14 (Dewick, 2007). OMe

Me N

.

OMe

OH

.

MeO Me N OH

Me O

N Me O

OH N Me HO

O2 NADPH Me O

Acoplamiento oxidativo vía radicales libres

OH O

SAM

HO N Me O

OMe MeO Me N O

OMe

N Me O

O Me

O

tetrandrina

Figura 14. Biosíntesis general de los alcaloides bbi II

33

CAPITULO 2. METODOLOGÍA 2.1. Procedimientos generales Para cromatografía en capa delgada (CCD) se utilizaron cromatofolios de gel de sílice 60 F254 Merck, para algunos controles de cromatografía en columna se utilizó alúmina neutra, fase reversa RP-8 y RP-18 y celulosa. Para cromatografía en columna (CC) de compuestos de baja y mediana polaridad se emplea como fase estacionaria gel de sílice (70-230 Mesh) Merck y para CC al vacío se utilizó gel de sílice (230-400 Mesh) Merck. Para la fracciones polares se empleó como soporte Sephadex LH-20 (3.0 cm x 85 cm). El revelado en CCD se realizó con ácido sulfúrico con posterior calentamiento a 100 °C, vapores de iodo, lámpara de luz ultravioleta de 254 nm y 360 nm y reactivo de Dragendorff . Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) de las fracciones y compuestos puros se registraron en un equipo Brucker AVANCE 400 (400 MHz para 1H y 100 MHz para

13

C). Se empleó como disolventes CDCl3

(99.8%) y MeOD (99.8%) referenciados con TMS como patrón interno. Los análisis por cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) acoplado a espectrometría de masas de alta resolución (MS) se hicieron en un cromatógrafo Shimadzu con un detector UV/vis L-4250 a 210 nm usando una columna LichroCART RP-18 (250 x 10 mm d.i.), como eluente se utilizó 34

mezcla de MeOH:H2O 80:20 a un flujo de 3 mL/min. La interfase utilizada ESI-TOF-MS-MS. La actividad óptica fue medida en un polarímetro Polartronic E, Schmidt+Haensch, las concentraciones se expresan como g/100 mL, utilizando metanol (R.A) como disolvente. Los solventes utilizados fueron de grado R.A. Para la realización de los bioensayos se utilizaron placas multipozos con 96 reservorios. 2.2 Material biológico Para la realización de los bioensayos de actividad larvicida se empleó como material

biológico

larvas

de

tercer

estadio

del

mosquito

Culex

quinquefasciatus. El material entomológico fue suministrado por el Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá y los ensayos se realizarán siguiendo la metodología propuesta por JL McLaughlin (McLaughlin, 1998). 2.2.1 Metodología propuestas por McLaughiln. Se toman 2 mg de compuesto puro o 20 mg de una mezcla de compuestos y se disuelven en 2 ml de etanol (R.A), para obtener la muestra patrón, a partir de la cual se preparan las diluciones correspondientes a 5000, 1000, 500, 100 y 10 ppm. En placas multipozos de 96 reservorios, se colocan 8 aplicaciones de 35

cada una de las disoluciones correspondientes y se completa volumen de 250 l con agua reposada. De esta forma se dejan las placas en reposo y se realizan lecturas de actividad larvicida (conteo de larvas muertas y vivas), a las 24 y 48 horas. Los resultados son evaluados utilizando el método estadístico Probit (Therone, 1995). 2.3 Material Vegetal La muestra de tallos de la especie Berberis tabiensis fue recolectada en junio del 2005, en la vereda La Valvanera, municipio de Chía, departamento de Cundinamarca, Colombia. La identificación de la especie fue realizada por el Dr. L.A. Camargo y un ejemplar reposa en el herbario del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia con el número de colección COL198116 (Camargo, 1981).

Figura 15. Fotografía de los frutos y hojas de la especie B. tabiensis

36

2.4 Obtención del extracto etanólico Una muestra seca (255 g de tallos) triturada y molida, se sometió a extracción por maceración utilizando como solvente etanol al 96%, haciendo renovación del solvente cada 24 horas por 7 días, se reunieron todos los extractos, se eliminó el solvente a presión reducida para obtener el extracto crudo (24,20g). 2.5 Obtención del extracto alcaloidal El extracto crudo, se concentró y aprovechando las propiedades básicas de los alcaloides presentes (fracción de interés), se realizó una extracción ácido-base; primero se trató con HCl al 10%; la parte soluble en HCl se neutralizó con una solución de NH4OH al 10% y seguido a esto se realizó una partición líquidolíquido con CH2Cl2 y posteriormente con AcOEt, obteniéndose las correspondientes fracciones A (1,05g) y B (2,88g), además de la fracción acuosa C (19,02g). 2.6 Fraccionamiento Fracción A Esta fracción sometidó a procesos de purificación sucesivos por cromatografía en columna CC: se realizó una primera separación CCA1, utilizando un sistema de elución isocrático AcOiPr:MeOH:NH3 (76:19:5), obteniéndose un total de 135 fracciones, reagrupadas posteriormente en 10 fracciones que fueron evaluadas por CCD, con la fase móvil AcOiPr:MeOH:NH3 (76:19:5) y como patrón de referencia berberina. Los resultados se muestran en la Tabla 1: 37

Tabla 1. Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción A1 Fracción Peso (mg) A1.1

20

A1.2

27

A1.3

13

A1.4

88

A1.5

38

A1.6

213

A1.7

63

A1.8

142

A1.9

275

A1.10

289

Rendimiento de columna 91.7%. Por las cantidades obtenidas y los grupos de compuestos presentes se decide reunir las fracciones A1.2 – A1.5 (A2) (166mg) y A1.7 – A1.8 y continuar la purificación de la fracción A2. Se

realizó

otro

proceso

de

purificación

CCA2,

eluyendo

con

AcOiPr:MeOH:NH3 (76:19:5). Se obtuvieron 8 fracciones, de las cuales A2.5 y A2.6 mostraron compuestos de tipo alcaloidal cuando se reveló con el reactivo de Dragendorff. La reunión de A2.5 y A2.6, A3 (37 mg), se sometió nuevamente a purificación utilizando una microcolumna con fase estacionaria en gel de sílice de 43 – 60 mesh, AcOiPr:MeOH:NH3 (73:22:5), se recogieron 50 fracciones de 0.5 ml aproximadamente. Las fracciones A3.30 – A3.40, A4 (28 mg), contenían los compuestos de interés. Los compuestos mayoritarios observados en el control de la fracción A4, se separaron por cromatografía en capa delgada preparativa en gel de silice 38

utilizando como fase móvil la mezcla AcOiPr:MeOH:NH3 (73:22:5). Se separaron 4 compuestos de tipo alcaloidal, A4.1 (3mg), A4.2 (5mg), A4.3 (10mg) y A4.4 (1mg); de los compuestos obtenidos solo fue posible elucidar completamente el compuesto A4.3 y se realizó una elucidación parcial de los compuestos A4.1 y A4.2, debido a la poca cantidad obtenida de cada uno de estas compuestos. Fracción B La fracción de B (2,88g), se sometió a purificación por CC, en gel de sílice y elueyndo con AcOiPr:MeOH:NH3 (76:19:5). Se recogieron 80 fracciones de 0.5 ml, las fracciones B42 a B61 correspondieron a berberina (112mg). Fracción C La fracción acuosa resultante de la particiones liquido – liquido se purificó utilizando una columna de exclusión por tamaño en Sephadex LH-20 como fase estacionaria y un gradiente continuo de metanol - agua como fase móvil, el rendimiento de columna fue 98,6%.

39

Tabla 2. Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción C1 Fracción Peso (g) C1.1

1,68

C1.2

1,80

C1.3

1,58

C1.4

0,68

C1.5

12,01

C1.6

1,01

La fracción C1.5, (C2) fue nuevamente purificada por CC, utilizando como fase estacionaria Sephadex LH-20 y un gradiente discontinuo de fase móvil (MeOH - H2O: 100:0, 70:30, 50:50, 30:70 y 0:100). Se obtuvieron 9 fracciones. De estas fracciones, la 6 y la 7 contenian compuestos de tipo alcaloidal. La reunión de estas 2 fracciones (C3) (100 mg), se sometió nuevamente a purificación por CC, utilizando como fase estacionaria alúmina tipo I y un sistema de elución AcOiPr:MeOH:NH3 (70:25:5), se recogieron 20 fracciones, reagrupadas en 4 fracciones, con un rendimiento de columna del 71,0%. Tabla 3. Fracciones obtenidas en la purificación de la fracción C3 Fracción Peso (mg) C3.1

12

C3.2

10

C3.3

2

C3.4

47 40

De estas 4 fracciones se tomo la fracción C3.4, se purificó por solubilidad y filtración para obtener finalmente 20 mg de un compuesto de color naranja oscuro, en forma de agujas muy finas.

41

CAPITULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudios previos de bioactividad y fitoquímicos sobre especies del género Berberis colombianas (Jiménez, 1995; Aristizabal, 1989; Moreno, 1995; Castillo, 1998) y sobre la especie B. tabiensis (Quevedo, 2007; Quevedo, 2008), permitieron concluir que esta es una especie promisoria tanto por su actividad insecticida como por los constituyentes novedosos. Continuando con la búsqueda de nuevas moléculas e tipo alcaloidal, biológicamente activas y con estructuras novedosas que puedan orientar posteriores trabajos sintéticos que conduzcan finalmente al desarrollo de moléculas orgánicas útiles en el control de insectos plaga se realizó el estudio químico del extracto alcaloidal proveniente de los tallos de la especie nativa B. tabienis. Siguiendo la metodología descrita, fue posible aislar y caracterizar mediante el uso de técnicas espectroscópicas 3 compuestos; uno de ellos corresponde a un nuevo alcaloide bisbencilisoquinolínico (tabienina B) que presenta un novedoso patrón de sustitución tanto en el género Berberis como en la familia Berberidaceae; los otros dos son alcaloides protoberberinicos, berberina el compuesto más representativo del género Berberis y columbamina aislada de B.buxifolia (Cava, 1965) Figura 16.

42

Extracto  CH2Cl2

Extracto  AcOEt

Extracto  acuoso

• A4.3

• berberina

• C3.4

Figura 16. Esquema general del proceso de purificación de los compuestos aislados 3.1 Elucidación del compuesto A4.3 (Tabienina B) El espectro de masas de alta resolución mostró un ion molecular pseudomolecular [M+H] = 595,3269, que corresponde a un peso calculado PM = 594.2730 u.m.a y a la fórmula molecular C36H38N2O6.

Figura 17. Espectro de masas de alta resolución en modo ESI de Tabienina B 43

En los espectros RMN 1H y COSY, se observaron 36 señales: 9 señales que corresponden a 10 protones aromáticos (Figura 18 y Figura 19): 4 dobles dobletes (dd) que aparecen a : 6,46; 6,59; 7,08 y 7,38 ppm, para un sistema p-disustituido AA’BB’.

 

   

Figura 18. Espectro RMN 1H (MeOD, 400 MHz)) de la zona aromática de Tabienina B 44

Figura 19. Espectro COSY de la zona aromática de Tabienina B Se observa un doblete a : 6,70 ppm correspondiente a un

sistema de

acoplamiento en orto con un protón a : 6,40 ppm; las otras 4 señales aparecen como singletes a : 5,96; 6,38; y una señal que integra para 2 protones aromáticos a 6,72 ppm. En la zona alifática, se observan 2 grupos metoxilo a : 3,74 (s, 3H) y 3,66 (s, 3H) y dos grupos metilo unidos a nitrógeno, en este caso el nitrógeno del anillo isoquinolínico a : 2,24 (s, 3H) y 2,55 ppm (s, 3H), señales características de los esqueletos tetrahidroisoquinolínicos. Aparecen otras 4 señales integradas para un total de 12 protones a : 2,97; 2,86; 2,48 y 2,24 45

ppm, además de la señal de solvente a : 3.31 ppm y una impureza del proceso de purificación a : 3.34 ppm.

Figura 20. Espectro RMN 1H de la zona alifática de Tabienina B En el espectro RMN 13C (Figura 21) se observan 36 carbonos, 24 aromáticos y 12 alifáticos. En la región aromática se presentan 8 carbonos desplazados hacia campo bajo indicando su unión a heteroátomo que en este caso es oxígeno: 2C (O-Me, 149,8 y 151,6 ppm), 2C (R-OH, 145,4 y 149,0 ppm) y 4C (144,2; 145,8; 156,3 y 158,7 ppm) que corresponden a puentes éter. La unión cabeza-cabeza entre C-6 y C-7’ (145,8 y 144,2 ppm) y la unión cola-cola entre C-12 y C-11’ (156,3 y 158,7 ppm) asignadas con la información obtenida del

46

espectro HMBC; las señales en la región alifática se observan por parejas indicando la presencia de las dos subunidades bencilisoquinolínicas.

,Figura 21. Espectro RMN 13C de la zona aromática de Tabienina B Con los experimentos COSY, HMQC (Figura 43) y HMBC (Figura 44), se obtuvieron correlaciones y desplazamientos ilustrados en las Figuras 22 y 23.

47

Figura 22. Datos espectroscópicos de Tabienina B

Figura 23. Correlaciones (H

C) de tabienina B observadas en el espectro HMBC.

48

Tabla 4. Datos espectroscópicos para tabienina B Posición 1 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a  9 10 11 12 13 14 1´ 2´ 3´ 4´ 4a’ 5´ 6´ 7´ 8´ 8a’ ’ 9´ 10´ 11´ 12´ 13´ 14´ 6’-OMe 12-OMe

 1H, m, HZ 4,03 (1H, m) N-Me 2,24 (3H, s) 2,85*(m) 2,45*(m) --6,38 (1H, s) ----6,72 (2H, s) --2,75*(m) --------6,40 (1H, brs) 6,70 (1H, d, J = 1,6, 8,1) 3,89 (1H, m) N-Me 2,55 (3H, s) 2,75 (m)* 2,95 (m)* --6,72 (2H, s) ----5,96 (1H, s) --2,85* (m) --6,59 (1H, dd, J = 2,4, 8,0) 6,46 (1H, dd, J = 1,9, 8,3) --7,08 (1H, dd, J = 2,5, 7,5) 7,38 (1H, dd, J = 2,1, 8,1) 3,66 (3H, s) 3,74 (3H, s)

 13C 63,0 43,1 45,7 25,8 124,5** 106,0 144,2 145,4 111,4 125,1 38,9 136,4 149,0 158,7 149,8 113,6 122,7 65,0 42,6 46,5 26,3 117,4** 113,1 151,6 145,8 116,6 134,4** 37, 133,5** 121,5 131,5 156,3 122,9 130,0 56,4 56,3

1

H - 1H COSY  --4 3 ------------1 --------14 13  --4’ 3’ --6’ --------1’ --11’,14’ 10’,13’ --11’,14’ 10’,13’ -----

HMBC 1,3 ------4,6 5 8 7 1 --------13 --12 2 1,3 2’ 3’ --4a’,6’ 5 8 --------12’ 9’ 10’,13’ 11’ 12’ 6’ 12

*Estas señales se presentan como multipletes no definidos que integran para 12 protones en total. **Son señales de C-cuaternarios que pueden ser intercambiables entre sí, se asignaron teniendo en cuenta las estructuras encontradas en Schiff, 1997.

49

Al hacer una búsqueda en Scifinder y en bases bibliográficas como ScienceDirect, Springerlink y ACS reportado

con

las

características

no se encontró espectroscópicas

ningún compuesto o

estructurales

mencionadas, así concluimos que es la primera vez que se aísla en la naturaleza este compuesto que se denomino tabienina B. Los alcaloides bbi aislados del género Berberis muestran patrones estructurales y de sustitución característicos; generalmente tienen los puentes éter entre los carbonos C-8 y C- 7’ para la unión cabeza-cabeza y entre C-11 y C-12’ par la unión cola-cola, además de presentar su estereoquímica como (R, S), característica de los alcaloides bbi aislados de especies pertenecientes a la familia Berberidaceae. Un estudio previo de la especie B. tabiensis condujo al aislamiento de un nuevo alcaloide bbi altamente oxigenado denominado tabienina; este alcaloide presenta las posiciones 6, 7, 12, 6’ 7’ y 13’ oxigenadas (-O-Me), la posición 12 por un grupo hidroxilo y unión cola-cola entre C-11 y C-12’, las posiciones 5, 8, 5’ y 8’ sin sustituyentes oxigenados. Analizando las sustituciones encontradas en tabienina B, puede notarse que presenta la última característica citada para tabienina, es decir, posee sólo dos grupos metoxilo ubicados sobre los carbonos 12 y 6’, siendo una característica estructural que lo diferencia de tabienina A y de los otros bbi aislados de la familia Berberidaceae, que usualmente presentan al menos 3 de estos grupos. La unión cola-cola, entre C-11 y C-12’ en común en los bbi aislados de la familia Berberidaceae, teniendo usualmente en C-12 un sustituyente oxigenado y en el anillo C’ un sistema AA’BB’ con protones que muestran desplazamientos químicos distintos en RMN 1H debido a la posición espacial en la que presentan estas moléculas, es decir, uno de los monómeros puede localizarse encima del otro monómero estando unidos por los puentes éter, lo 50

que se aplica a esta nueva estructura. La posición C-10 está sustituida por un grupo hidroxilo, característica poco común previamente reportada en la especie B. buxifolia en el alcaloide bbi chillanamina (Leet, 1983), ya que esta posición generalmente tiene un sustituyente de tipo metoxi o se encuentra libre. Usualmente, la unión cabeza - cabeza para esta clase de alcaloides aislados en la familia Berberidaceae se observa entre C-7 y C-8’ ò entre C-8 y C-6’, pero en tabienina B se encuentra entre C-6 y C-7’; esta unión se ha reportado solamente en las familias Menispermaceae (Chang, 2005) y Monimiaceae (Shiff, 1997).

Biosíntesis Los alcaloides bbi son producto de la dimerización por acoplamiento oxidativo de bencilisoquinolinas como coclaurina (Anexo 1), que a su vez se deriva de un núcleo isoquinolínico formado biogenéticamente a partir del aminoácido tirosina. Este aminoácido sufre dos procesos de transformación catalizados por enzimas: el primero de ellos es una descarboxilación para la formación de tiramina y el segundo es un proceso de transaminación para formar el ácido-4-hidroxifenilprúvico, en ambos casos utilizando PLP como coenzima y las correspondientes enzimas. La tiramina, sufre un proceso de oxidación para formar dopamina, mientras que por la otra via se genera el 4hidroxifenilacetaldehído por medio de una descarboxilación. Estos dos compuestos formados reaccionan entre sí, vía reacción de Pictet-Spengler para formar un compuesto de carácter alcaloidal de núcleo isoquinolínico (norcoclaurina) (Dewick, 2007).

51

HO

O PL P

PL P NH 2

E. C. 4. 1. 1 .2 5

E .C . 2 . 6. 1. 5

HO

tirosina

D esca box il aci ón

T ra nsa m in aci ón

CO 2 OH H O N H2

O

HO

HO

4-hidroxife nilp irúvico

tira min a O2

T PP

E. C. 1. 1 4. 18 . 1

E. C. 4 .1 . 1. 1

CO 2

H

HO

O

NH 2

HO

HO

4-hidroxife nila ce taldehíd o

dopa min a

E.C. 4 .2 . 1. 78

HO

NH

HO

no rcoclaurina HO

H 3C O

H 3C O

HO S AM HO

NH

NH

E.. 2 .1 . 1. 12 8 H O 6O M T

HO

norco clau rina

SAM E .. 2 . 1.1. 14 0

HO

N

HO

CH 3

HO

cocla urina

N -me tilcoclaurina

Figura 24. Ruta biosintética de la formación de N-metilcoclaurina

52

A partir de N-metilcoclaurina o norcoclaurina, pueden darse reacciones secundarias posteriores de metilación, reducción, oxidación, deshidratación (Dewick, 2007). Para la formación de los bbi, es necesario que ocurra una reacción catalizada enzimáticamente por la enzima E.C.1.14.3 (N-metilcoclaurina oxidasa) que genera unidades radicalarias de tipo fenólico, especies que por acoplamiento fénolico monooxidativo vía radicales libres forman la unión difeniléter colacola, seguida de la unión cabeza-cabeza. H 3C O

H

N

O

CH 3

H

A

O2

Estructuras resonantes de E.C.1.14.21.3

O

H

O

H

B

(S) -N-m etilcoclaurina

NH 2

2 N

+

NADP+

R

E.C.1.14.3: N-metilcoclaurina oxidase (C-O acoplamiento fenólico) A H 3C O

H 3C O N

O

CH 3

HO

O

H 3C O

N CH 3

HO

O

H 3C O

N CH 3

O

HO

HO

O CH H 3 3C O

H 3C O

N CH 3

B H 3C O

N

HO

N CHH 3 3C

O

OH

O

HO

O

N CH 3

HO

N CH 3

O

H

Figura 25. Formas canónicas lábiles a sufrir reacción de acoplamiento fénolico monooxidativo 53

De esta forma, para tabienina B se propone una biosíntesis basada en reportes previos, en donde se da una unión cola-cola entre los carbonos C-13 y C-12’. O CH3

B

H3C O

A

N

OH

H3C

N

HO

CH3

C O

O H

O CH3

N

OH

H3C

14

H3C O

O 13

OH

N

HO

CH3

12’

Figura 26. Dimerización cola-cola en la formación de tabienina B Seguida a esta unión ocurre la oxidación en C-14 y una O-metilación sobre C12 (SAM); lo anterior se propone analizando los sustituyentes del anillo aromático, que muestra una activación del anillo en posición orto al puente difeniléter, para obtener un primer intermediario, un compuesto previamente aislado de Berberis buxifolia, llamado chillanamina, Figura 27 (Leet, 1983).

54

O CH3

N

OH

H3C

12

14 13

H3C O

N

HO

CH3

O 12’

OH

O-metilación C12 Hidroxilación orto al puente èter

SAM

O CH3

N H3C

OH

O

CH3

H3C O

HO

O

O CH3

H3C O

N CH3

N

OH

H3C

O2 E.C.1.14.18.1 NADP+

HO

O

CH3

N

HO

CH3

O

chillanamina

Figura 27. Hidroxilación orto al puente éter en la formación de tabienina B Posteriormente, se da una reacción de acoplamiento radicalario que forma la unión cabeza-cabeza entre los carbonos 6 y 7’. Se propone una ruta vía radicales libres catalizada enzimáticamente que genera dos formas canónicas, muy reactivas, una en C6 que contiene un grupo metoxilo que será el grupo saliente posterior a la reacción radicalaria y a la regeneración de la aromaticidad del anillo de la isoquinolina, y otro estará como un radical fenóxido en el carbono 7’.

55

.

Vía radicales libres

O2 E.C.1.14.21.3

N

O CH3

H3C O

O

H3C

N

O

CH3

NADP+

OCH3

HO

H3C O

O

O

CH3

N

N O

H3C

HO

CH3

O

H

O

O CH3

H3CO N

N

- CH3

O.

H3C

HO

OH

O

O CH3

O

CH3

Figura 28. Unión cabeza-cabeza vía radicales libres en la formación de tabienina B Otra posible ruta, es similar a la propuesta para la biogénesis de trilobina, alcaloide bbi aislado previamente de Cocculus hirsulus y Anisocyclea grandidieri, especies pertenecientes a la familia Menispermaceae que presenta 3 puentes éter en su estructura (Fajardo, 1984).

56

O CH3

Vía reacciones polares CH3

O

N

H3C O

OH

H3C

HO

O

O

N

-

CH3

O

CH3

H3C O N

N H3C

HO

OH

O

O CH3

O

CH3

H3CO N

N OH

H3C

O

CH3

- CH3O+ HO

O CH3

O

Figura 29. Unión cabeza-cabeza vía reacciones polares en la formación de tabienina B La Figura 29, muestra una posible ruta biogenética para formar la unión cabeza-cabeza en la que se genera la formación de un ión oxonio sobre el carbono 7’, quien por medio de una reacción de sustitución electrofílica aromática forma el puente éter, seguido de la restauración de la aromaticidad. 3.2 Berberina Este compuesto fue encontrado como el alcaloide mayoritario en la fracción extraída con AcOEt, se aisló como un sólido fino de color amarillo, con un punto de fusión, PF: 196 – 198°C y un comportamiento cromatográfico igual al presentado por el patrón de referencia utilizado (cloruro de berberina de la casa Merck). 57

La berberina fue aislado por primera vez en 1824 por Hûttenschmid en lo que pensaba era Geoffroya inermis, en 1826 Chevallier y Pelletan encontraron esta sustancia amarilla en Xanthoxylum clava herculis, a la cual denominaron xanthopicrita. Buchner y Herberger en 1830, encontraron esta misma sustancia en Berberis vulgaris de donde proviene su nombre actual (Benjamin, 2009). La

berberina

pertenece

al

grupo

de

los

alcaloides

cuaternarios

protoberberinicos, alcaloides que se encuentran ampliamente distribuidos en las familias Papaveraceae, Berberidaceae, Fumariaceae Mensperaceae, Ranunculaceae, Rutaceae, Annonaceae y en algunos especímenes de las familias Magnoliaceae y Convolvulaceae (Bentley, 1995). La berberina ha sido empleada en la tumefacción esplénica, en el tratamiento de la malaria y leishmaniasis cutánea, se ha demostrado que tienen actividad antiprotozoaria, antibacteriana, antimicótica y fungicida utilizándose en tratamientos de úlceras externas y como antiséptico de baja toxicidad (Bernal, 1989).

O +

O

berberina

N

O CH3 O CH3

Figura 30. Berberina, alcaloide característico del género Berberis

58

Biosintesis La biosíntesis de los alcaloides isoquinolínicos, fue investigada en Hidrastis canadensis Ranunculaceae por Gear y Spenser en 1963. La tirosina es el precursor de esta clase de compuestos, se forman en primer lugar intermediarios de tipo benzilisoquinolina, como la (+)-reticulina, que posteriormente se oxida dado origen a un ion iminio (Grycová, 2007).

Figura 31. Diagrama general de la biosíntesis de berberina El ion iminio reacciona vía reacción de Pictet-Spengler con el carbono en posición orto al fenol del anillo D, generando un intermediario tautomérico que pasa a la forma de enol, correspondiente a (S)-scoulerina, que a su vez es metilado para formar la (-)- tetrahidroberbernina y finalmente la berberina. 59

3.3 Elucidación del compuesto C3.4* Este compuesto se obtuvo como un sólido fino de color naranja (20mg) con punto de fusión PF: 196 - 198°C. El compuesto tiene un peso molecular de 338,1392 que corresponde a la formula C20H20NO4. Del espectro RMN 1H (MeOD), se obtuvo la siguiente información: un total de 6 señales de protones aromáticos, uno de ellos se presenta como un doblete : 8,00 (C12), que está acoplando con un doblete : 7,92 (C11). Las otras señales se presentan como singletes y fueron asignadas de acuerdo al análisis detallado de los demás espectros. En la zona alifática se presentaron 5 señales, 3 de ellas corresponden a protones de grupos metoxilo : 4,13; 4,03 y 3,94, las otras 2 señales corresponden a protones de grupo metileno, una a campo alto : 3,13, y otra que no es claramente observable en el espectro de RMN 1H, pero si se observan las respectivas correlaciones en los experimentos 2D, presentando un desplazamiento aproximado de : 4,90.

H3C O HO

4

5

A

B

3

6 +

N

2

8

1

C 13

9

O CH3

10

O CH3

D 12 11

Figura 32. Estructura y numeración de 5,6-dihidro-2-hidroxi-3,9,10trimetoxidibenzo[a,g]quinolizinium: columbamina 60

Figura 33. Espectro RMN 1H de la zona aromática para el compuesto C3.4

Figura 34. Espectro COSY del compuesto C3.4 61

En el espectro de RMN 13C se observan 20 carbonos: 15 carbonos aromáticos, de los cuales 6 corresponden a metinos, 4 carbonos cuaternarios, 5 carbonos unidos a heteroátomo: 4 unidos a oxígeno, 3 de grupo metoxi y uno de grupo hidroxi, y otro unido al nitrógeno de la sal del compuesto aislado.

Figura 35. Espectro RMN 13C del compuesto C3.4 De los espectros HMQC (Figura 48) y HMBC (Figura 49), se tomó la información necesaria para realizar las asignaciones presentadas en la Tabla 5.

62

Tabla 5. Datos espectroscópicos del compuesto C3.4 Posición  1H, m, HZ 7,55 1 --2* --3* 6,76 4 --4a 3,13 5 4,90 6 9,64 8 --8a --9 --10 7,92 11 8,00 12 --12a 8,66 13 --13a --13b 3,94 C2*-OR C3*-OR 4,03 9-R 4,13 10-R * Estas asignaciones pueden ser intercambiables

13C 110,0 150,0 153,2 116,2 130,4 27,8 57,7 145,7 135,6 151,6 146,0 124,4 128,2 123,1 120,7 140,5 118,8 57,5 57,8 62,6

HMBC 4a, 13a, 2*, 3* ----2*, 5, 13b --4a, 13a 4a 8a, 13a ------9, 12a 8a, 10 --12a ----2* --9 10

Del análisis de los espectros anteriores se establece la estructura del alcaloide protoberberinico columbanina, previamente aislado y reportado en el género Berberis y en la familia Berberidaceae (Grycová, 2007).

63

H3C O

4

5

3

6

2

N

+

HO

8

1 13

12 11

Figura 36. Correlaciones (H

9

O CH3

10

O CH3

C) del compuesto C3.4 observadas en el

espectro HMBC. La revisión bibliográfica (Grycová, 2007) de los datos espectroscópicos muestra que dos isómeros: columbamina (C-2 = OH; C-3 = OCH3) y jatrorrhizina (C-2 = OCH3; C-3 = OH) son congruentes con los datos encontrados en el compuesto aislado Tabla 6, donde no se observa una diferencia contundente entre los valores de desplazamiento químico del compuesto aislado y los isómeros referentes.

64

Tabla 6. Comparación de datos espectroscópicos del compuesto C3.4 con compuestos de literatura C3.4 Posición 1 2 3 4 4a 5 6 8 8a 9 10 11 12 12a 13 13a 13b C2-OR C3-OR 9-R 10-R

Jatrorrhizina

 H (ppm) 7,55 ----6,76 --3,13 4,90 9,64 ------7,92 8,00 --8,66 -----

 C (ppm) 110,0 150,0 153,2 116,2 130,4 27,8 57,7 145,7 135,6 151,6 146,0 124,4 128,2 123,1 120,7 140,5 118,8

3,94

57,5

4,03 4,13

57,8 62,6

1

13

 H (ppm) 7,33 ----6,50 --3,07 4,79 9,50 ------7,96 7,85 --8,44 ----3,89 --4,06 4,16 1

 C (ppm) 110,9 149,4 146,4 116,3 130,2 29,1 57,6 145,2 119,2 151,5 145,1 122,9 125,7 128,2 119,3 134,9 120,9 58,3 --63,0 57,0 13

Columbamina  H (ppm) 7,52 ----6,80 --3,30 4,97 9,45 ------7,58 8,11 --8,45 ------3,98 4,08 4,08 1

 13C (ppm) 114,9 143,7 150,4 109,4 133,6 26,3 55,6 144,8 117,4 148,0 149,9 126,5 123,3 128,2 119,8 138,3 121,4 --56,9 61,8 57,0

*Se utilizo CDCl3 en los compuestos de referencia

La comparación de los valores de literatura no es suficiente para determinar con exactitud la identidad del compuesto aislado, pero el análisis fisicoquímico (PF) sugiere que el compuesto aislado es columbamina, ya que el PF para columbamina y jatrorrihizina es 194 y 206°C respectivamente (Merck Index, 2001).

65

3.4 ACTIVIDAD INSECTICIDA Como ya se ha mencionado la gran mayoría de enfermedades pandémicas son transmitidas por insectos vectores, los cuales han sido controlados en gran parte por insecticidas químicos, que a su vez han causado muchos problemas de contaminación en diferentes sistemas ecológicos y son cada vez menos eficientes debido a la resistencia que día a día crean estas plagas a ellos. Con este estudio se quiso aportar a esta problemática realizando pruebas de actividad larvicida frente a larvas del mosquito C. quinquefasciatus, utilizando varios de los extractos y fracciones obtenidas durante el proceso de obtención y purificación de compuestos de tipo alcaloidal de la especie B. tabiensis. Los ensayos de actividad insecticida se realizaron en los extractos mostrados en la Figura 37. Se presentan los resultados obtenidos a las 48 horas de contacto de los extractos con las larvas del mosquito. CE50 (mg/L) • Extracto etanólico >1000

938

803 >1000 >1000

• Extracto alcaloidal

• Extracto CH2Cl2 • Extracto AcOEt • Extracto acuoso

Figura 37. Esquema de realización de bioensayos iniciales

66

Al evaluar la actividad larvicida de forma bioguiada se observa una actividad relevante en el extracto en diclorometano (A1) 803 (mg/L) a las 48 horas. El fraccionamiento de este extracto: CCA1, produjo 10 fracciones que son reagrupadas de acuerdo al criterio químico, presencia de compuestos de tipo alcaloidal, se seleccionó la fracción A2 y se evalúo su actividad. Esta fracción se sometió a purificación, para obtener 8 fracciones, de las cuales por criterio químico se seleccionó la fracción A3. Finalmente, se evalúo su actividad, se purificó por CC, se obtuvieron 50 fracciones, la fracción A4, que contenía la tabienina B fue evaluada, encontrándose un valor de 78 (mg/L) a las 48h (Figura 38).

24h: 234

• Fracción  A2 24h: 357

48h: 148

• Fracción  A3

• Fracción  A4

48h: 184

24h: 173 48h: 78

Figura 38. Esquema de realización de bioensayos siguiendo la purificación de compuestos de tipo alcaloidal Estos resultados muestran que los compuestos alcaloidales provenientes de la especie B. tabiensis pueden presentarse como posibles compuestos de referencia para la búsqueda y la síntesis de nuevos pesticidas de origen natural que ayuden a controlar los problemas que generan estos insectos vectores.

67

CONCLUSIONES En el presente trabajo se realizó el estudio de la composición química de los tallos de Berberis tabiensis como una contribución al estudio químico de especies colombianas de la familia Berberidaceae y del único género que la representa en Colombia, el género Berberis. Los métodos espectroscópicos y espectrométricos permitieron elucidar un nuevo alcaloide BBI, tabienina B, que presenta un novedoso patrón de unión cabeza-cabeza, del cual no se conocen reportes en la familia Berberidaceae. De esta forma, se muestra un nuevo patrón de sustitución y ordenamiento en los alcaloides bbi no solo del género Berberis (subdivisión Aequinoctiales), sino también para la familia Berberidaceae. Se aislaron 2 alcaloides protoberberinicos cuaternarios: berberina, como el alcaloide mayoritario en el género Berberis y columbamina, previamente aislado de especies foráneas del género, siendo un aporte a la correlación quimiotaxonómica de las Berberis colombianas con otras especies del subgrupo Australes. Se contribuyó así a la quimiotaxonomía de las Berberis colombianas, tomando como referencia la especie B. tabiensis, especie con compuestos promisorios en el control de insectos plaga mostrando valores de CE50: 78 mg/L frente al vector C. quinquefasciatus.

68

RECOMENDACIONES Es muy importante incentivar el estudio químico de productos naturales, ya que está demostrado que estos tienen un gran potencial en diversos campos de aplicación, tales como medicina, agroquímica, biotecnología, los compuestos aislados sirven como referentes en la síntesis de nuevas moléculas, entre otros. Se recomienda continuar con la evaluación de la actividad larvicida de los compuestos presentes en la especie B. tabiensis, no solo frente al insecto vector C.quinquefasciatus, sino evaluar dicha actividad con otras especies de plagas tales como Aedes aegypti, Anopheles sp, entre otros. Además, se recomienda continuar con la elucidación estructural de los compuestos presentes en las fracciones no alcaloidales ya que estos pueden presentar otras propiedades biológicas no evaluadas en las especies del género Berberis.

69

REFERENCIAS Ahrendt, L. 1961. Berberis and Mahonia, a taxonomic revisión. Bot. J. Linn. Soc. 57, 1-410. Aristizabal, C.; Castro, D.; Young. S. 1989. Estudio químico de Berberis rigidifolia. Rev. Col. Quím. 18, 61-65. Beard, J. DDT and human healt. 2006. Science of the Total Environment. 355, 78– 89. Benjamin, A. 2009. Organic Analysis: A Manual of the Descriptive and Analytical Chemistry of Certain Carbon Compounds I. Prescott A B. BiblioBazaar, 329-331. Bentley, K. W. The Isoquinoline Alkaloids. Pergamon Press. 1995. Bernal, H. Y.; Correa, J. E. 1989. Especies Vegetales Promisorias de los Países del Convenio Andrés Bello Tomo II. 1° Edición. Bogotá. SECAB. Camargo, L.A. 1981. Especies nuevas del género Berberis. Caldasia. 13, 62, 203-223. Cassels, B and Asencio, M. 2001. Propiedades antioxidantes, citoprotectoras y relacionadas de compuestos aporfínicos. Instituto Milenio de Estudios Avanzados en Biológia Celular y Biotecnológica. Dpto. Química Universidad de Chile. 183- 201. Castillo, G.; Luque, E.; Moreno, B. 1998. Evalución en condiciones de laboratorio de la actividad insecticida de extractos etanólicos

de cinco

especies de plantas sobre Tecia solanivora (Lepidoptera: Gelechiidae). Agronomia Colombiana. Vol. XV. 34-40. Cava, M.P.; Reed, T.A. 1965. An efficient separation of the common alkaloids of the berberine group; the isolation and characterization of columbamine. Lloydia 28, 73–83. 70

Coto, M.M.; Lazcano, J.A.; Fernández, D.M.; Soca, A. 2000. Malathion resistance in Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus after its use in Aedes aegypti control programs. J. Am. Mosq. Contro.l Assoc. 16, 324-330. Chang, F.R., and Wu, Y.C. 2005. New Bisbenzylisoquinolines, Fatty Acid Amidic Aporphines, and a Protoberberine from Formosan Cocculus orbiculatus. J. Nat. Prod. 68, 1056 – 1060. Danielson, P.; Gloor, S. 1996. Cytochrome P450-Mediated Resistance to Isoquinoline Alkaloids and Susceptibility to Synthetic Insecticides in Drosophila. Pesticide Biochemistry and Physiology. 55, 172–179. Després, L.; David, JP.; Gallet, C. 2007. The evoltioanry ecology of insect resistance to plant chemicals. Trends in Ecology and Evolutions. 22, 298- 307. Dewick, P. 2007. Medicinal natural products: a biosynthetic approach. John & Wiley Sons. Second Ed. England. 322-325. Fajardo, V. 1984. Estudio químico de las Berberis de Chile. Tesis de Doctorado. Facultad de Ciencias básicas y farmacéuticas. Universidad de Chile, Santiago. Falco, M.R., De Vries, J., de Brovetto, A., Maccio, Z., Rebuffo, S., Bick, I., 1968. Two new alkaloids from Berberis laurina. Tetrahedron Lett. Vol. 9, 16, 1953-1959 Fatehi, M.; Saleh T.; Fatehi-Hassanabad , Z.; Farrokhfal, K.; Jafarzadeh, M.; Davodi, S. 2005. A pharmacological study on Berberis vulgaris fruit extract. Journal of Ethnopharmacology. 102, 46–52. Gözler, B.; Lantz, M.S.; Shamma, M. 1983. The pavine and isopavine alkaloids. J. Nat. Prod. 46, 293–309. Gros, E.; Pomillo, A.; Seldes, A.; Burton, G. 1985. Introducción al Estudio de los Productos Naturales. Secretaría General de la Organización de los Estados Americanos. Washington, D.C. Capítulo 9. 71

Isman, M.B.; Gunning, P.J.; Spollen, K.M. 1997. Tropical timber species as sources of botanical insecticides. Phytochemicals for pest control. Chap 3, 2737. Isman, M.B. 2005. Tropical forests as sources of natural insecticides. Rec. Adv. Phytochem. 39: 145-161. Grycová, L.; Jirlí, D.; Marek, R. 2007. Quaternary protoberberine alkaloids Phytochemistry. 68, 150–175. Jacobson, M.; Arnason, J. T.; Philogene, B. J. R.M.; Morand, P. 1989. Botanical Pesticides: Past, present and future. Insecticides of Plant Origin. ACS Symposium Series. 387, 1-10. Jimenez, J.C. 1995. Contribución a la evaluación biológica de la potencial actividad insecticida de las plantas Berberis monguensis (Berberidaceae) y Duranta mutisii (Verbenaceae). Tesis de Grado. Departamento de Farmacia. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Kim, Y.D.; Kim, S.H.; Landrum, L. 2004. Taxonomic and phytogeographic implications from ITS phylogeny in Berberis (Berberidaceae). J. Plant. Res. 117, 175–182. Kupeli, E.; Muberra, k.; Yesilada, E.; Husnu, K.; Baser, C. 2002. A comparative study on the anti-inflammatory, antinociceptive and antipyretic effects of isoquinoline alkaloids from the roots of Turkish Berberis species. Life Sciences. 72, 645–657. Landrum, L. 1999. Revision of Berberis (Berberidaceae) in Chile and adjacent Southern Argentina. Annals of the Missouri Botanical Garden. Vol. 86, 4, 793 – 834. Leet, J.E.; Fajardo, V.; Freyer, A.; Shamma, M. 1983. Some dimeric benzylisoqinoline alkaloids qith an unusual oxygenation pattern. J. Nat. Product. 46 (6), 908–912. 72

Lümmen, P. 1998. Complex I inhibitors as insecticides and acaricides. Biochimica et Biophysica Acta. 1364, 287–296. Lohombo-Ekombaa, M.L.; Okusa , P.N.; Penge , O.; Kabongoc , C.; Iqbal, M.; Kasende, O.E.

2004. Antibacterial, antifungal, antiplasmodial, and

cytotoxic activities of Albertisia villosa. Journal of Ethnopharmacology. 93, 331–335. McLaughlin, J.; Rogers, L. 1998. The use of biological assays to evaluate botanicals. J.Drug Inf. 32, 513. Mambu, L.; Martin, M.T.; Razafimahefa, D.; Ramanitrahasimbola, D.; Rasoanaivo,

P.;

Frappier,

F.

2000. Spectral

characterisation

and

antiplasmodial activity of bisbenzylisoquinolines from Isolona. Planta Medica. 66, 6, 537-540. Marshall, J. 1997. Insecticides as Tools in Probing Vital Receptors and Enzymes in Excitable Membranes. Pesticide Biochemistry and Physiology. 57, 235–254. Martinez, J.L., Torres, R., Morales, M.A. 1997. "Hipotensive effect of Omethylisothalicberine a bisbenzylisoquinoline alkaloid isolate from Berberis chilensis on normotensive rats. Phytotherapy Research. 11, 246-248. Meisenberg, G.; Simmons, W.H.; Collins, M.A. 1984. Effects of catecholamine-related mammalian alkaloids on spontaneous and vasopressininduced behavior in mice. Pharmacol. Biochem. Behavior. 20, 355–360. Meléndez, M. M. 2000. Prodromus del género Berberis en Colombia. Tesis Magister en Biología, Univ. de los Andes, Facultad de Ciencias Biológicas, Bogotá. Moreno, B.; Morgenszterm, C.; Luque, E.; Fajardo, V. 1995. Alcaloides bisbencilisoquinolinicos aislados de la especie nativa Berberis glauca (HBK) y evaluación de su actividad antialimentaria. Rev. Col. Quím. 24, 25-37. 73

Isman, M. 2005. Chapter Six Tropical forests as sources of natural insecticides Recent Advances in Phytochemistry. Vol. 39, 145-161. Opreh, O.; Abioye-Kuteyi, E.A.; Aboderin, A.; Giebel, H.; Bello, I.; Senbanjo, I. 2008. The pattern of malaria infection in under-fives in Ile-Ife, Nigeria. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 102, 868-874. Quevedo, R.; Antolinez, S.; Moreno-Murillo, B.; Fajardo, V. 2007. Tabienina A: un nuevo alcaloide aporfinabencilisquinolina oxidado. Scientia Et Technica. XIII. 33, 167-169. Quevedo, R.; Valderrama, K.; Moreno-Murillo, B.; Laverde, M.; Fajardo, V. 2008. A new bisbenzyltetrahydroisoquinoline alkaloid from Berberis tabiensis (Berberidaceae). Biochemical Systematic and Ecology. 36, 10, 812-814. Ratsimamanga-Urverg, S.; Rasoanaivo, P.; Ramiaramanana, L.; Milijaona, R.; Rafatro, H.; Verdier, F.; Rakoto-Ratsimamanga. A.; Le Bras, J. 1992. In vitro antimalarial

activity

and

chloroquine

potentiating

action

of

two

bisbenzylisoquinoline enantiomer alkaloids isolated from Strychnopsis thouarsii and Spirospermum penduliflorum. Planta Med. 58, 6, 540-543. Romero, R.; Sánchez, A. 2005. Berberidaceae Juss. Aportes botánicos de Salta - ser. Flora. Universidad Nacional de salta. Vol. 7, 9, 1-8. Salazar, M.J.; Moncada, L. Ciclo de vida de Culex quinquefasciatus Say, 1826 (Diptera: Culicidae) bajo condiciones no controladas en Bogotá. 2004. Biomédica. Vol.24, 4, 1-7. Sarmiento, M.J.; Idrovo, J.; Restrepo, M.; Díaz, M.P.; González A. 1999. Evaluación del impacto de la contaminación del embalse del Muña sobre la salud humana. Revista de Salud Pública. 1, 159-171.

74

Shamsa, F.; Ahmadiani, A.; Khosrokhavar, R. 1999. Antihistaminic and anticholinergic activity of barberry fruit (Berberis vulgaris) in the guinea-pig ileum. Journal of Ethnopharmacology. 64, 161–166. Schiff, P. L., Bisbenzylisoquinoline Alkaloids. 1997. J. Nat. Prod. 60, 9, 934-953. Silva, G., A. Lagunes, J. C. Rodríguez y D. Rodríguez. 2002. Insecticidas vegetales; Una vieja-nueva alternativa en el control de plagas. Revista Manejo Integrado de Plagas (CATIE). Stratton, L.; O’Neill, M.; Kruk, M.; Bell, M. 2008. The persistent problem of malaria: Addressing the fundamental causes of a global killer. Social Science & Medicine. 67.854–862. Sukumar, K.; Perich, M.; Boobar, L. 1991. Botanical Derivatives in Mosquito Control: A review. J. Am. Mosq. Control. Assoc. 72, 210-235. Tewary , D. K.; Bhardwaj, A.; Shanker , A. 2005. Pesticidal activities in five medicinal plants collected from mid hills of western Himalayas. Industrial Crops and Products. 22, 241–247. Therone, J.; Weaver, D.; Baker, J. 1995. Probit Analysis: Assessing Goodness-of-Fit Based on Backtransformation and Residuals. J. Econ. Entomol. 88, 5, 1513-1516. Trevor, R. 1981. The Biochemistry of Alkaloids. Second Edition. SpringerVerlag.. Chapter 1. Wu, Y.C.; Liou, Y.F.; Lu, S.T.; Chen, C.H.; Chang, J.J.; Lee, K.H. 1989. Cytotoxicity of isoquinoline alkaloids and their N-oxides. Planta Medica. 5, 163–165. Yenesew, A.; Kiplagat, J.; Derese, S.; Midiwo, J.; Kabaru, J.; Heydenreich, M.; Peter, M. 2006. Two unusual rotenoid derivatives, 7a-O-methyl-12a-

75

hydroxydeguelol and spiro-13-homo-13-oxaelliptone, from the seeds of Derris trifoliate. Phytochemistry. 67, 988–991. Yong, P.; Si-Bao, C.; Shi-Lin, C.; Yong, L.; Pei-Gen, X. 2006. A pharmacophylogenetic

study

of

the

Berberidaceae

(s.l.).

Acta

Phytotaxonomica Sinica. 44. 3: 241–257. Zadoks, J.E and Waibeu, H. 2000. From pesticides to genetically modified plants: history, economics and politics. Netherlands Journal of Agricultural Science. 48, 125-149. Zeng, X.; Dong, Y.; Sheng, G.; Dong, X.; Sun, X.; Fu, J. 2006. Isolation and structure determination of anti-influenza component from Mahonia bealei. Journal of Ethnopharmacology. 108, 317–319.

76

1) Formación de la tiramina OH

OH O

O +H

NH2

N

HO

HO

HO

H

O E.C. 4.1.1.25

PLP

OH

P O

OH

P O

CH3

N

CH3

N

H+ H

H-

O

OH O

O H2O

N HO

H

HO

O

N H

+

H OH

P O

OH

P O CH3

N

CH3

N

H+

CO2

H

H Restauración

N

H+

aromaticidad

HO

N HO

-

+

HO H OH

P O

OH

P O CH3

N H

CH3

N

Hidrólisis O

PLP

tiramina

H H

OH

PO

NH

+ N

CH3

NH2

HO H O

HO

OH

P O E.C.4.1.1.25: L-tirosina descarboxilasa N

CH3

77

2) Formación de la dopamina tiramina

dopamina H

HO

H

O2 E.C.1.14.18.1

NH2 HO

NH2 HO

H

NH2 O

H

H

NH2 O

NH2 O

E.C.1.14.18.1: monofenol monooxigenasa

78

3) Formación de 4-hidroxifenilpirúvico OH

OH O

O +H

NH2

N

HO

HO

HO

H

O E.C. 2.6.1.5

PLP

OH

P O

OH

P O

CH3

N

CH3

N

H+ H-

HO

OH

H O

O H2O

N HO

H

HO

O

N H

+

H

Base de Schiff OH

P O

OH

P O CH3

N

CH3

N

H+

OH H

O

Restauración

N H

HO

+

H HO

aromaticidad

+

HO

OH

P O

OH

P O N H

-

N

CH3

CH3

N

Hidrólisis OH

NH2

H

OH

O OH

PO

O

+ N

CH3

O

+

HO

O H

NH

OH

4-hidroxifenilpirúvico

OH

P O O

+

H

HO

N

CH3

O HO E.C.2.6.1.5: tirosina transaminasa

79

4) Descarboxilación de 4-hidroxifenilpiruvico hidroxifenilacetaldehído

para

formar

4-

OH

H

O 1

R

O HO

OH

+

S

N

O

E.C.4.1.1.1

+

H

O

R2

H3C

R

HO

4-hidroxifenilpirúvico

-

+

N

+

S

HO H N

H3C

S

OP

R

H3C

+

N

N

Cl

R2

-

Descarboxilación de CO2

CH3

NH2

B- iminioacido

R1 TPP O

H

tautomeria

OH

imina-enamina HO

R

+

H +

N

H3C

S

HO

R

N

R H3C

R

O

+

N

S

R

S

+ HO

H3C

R

4-hidroxifenilacetaldehído E.C.4.1.1.1: piruvato descarboxilasa

80

5) Reacción de Manich HO

HO

HO H

NH2

HO

H

HO

+

+

N

H

NH

HO

E.C.4.2.1.78 + O H

OH

O

H HO

HO

HO +

H HO

-

+

H

HO

HO

O

+H

NH

HO

N

HO

+

HO

HO

HO

N

HO

H

Base de Schiff

Restauración aromaticidad HO

NH

HO

HO

(S)-norcoclaurina

E.C.4.2.1.78: (S)-norcoclaurina sintetasa

6) Formación de SAM NH2 H3C

N

N

H3C

S ATP

ADP, P

N

H3C S

S

+

Ad

N

O

+

H2N

H2N OH O

HO

OH

OH

H2N OH

S-adenosilmetionina (SAM)

O

O

81

7) N-metilación y O-metilación de (S)-norcoclauirina H3C

H S

HO

+

Ad

H3C

+

O

+

NH

HO

NH

HO

H2N

E.C.2.1.1.128 OH O HO

HO

+

H

H3C

O

HO

H3C N

O

SAM CH3

NH

HO E.C.2.1.1.140

HO

(S)-N-metilcoclaurina

HO

(S)-coclaurina

E.C.2.1.1.140: (RS)-coclaurina-N-metiltransferasa E.C.2.1.1.128: (RS)-norcoclaurina-6-O-metiltransferasa, 6OMT

82

8) Cofactor NADP+ para deshidrogenaciones NH2 N

N

H2N

O

N

N

O

O

P

P

O O HO HO

O

O OH

OH

O

+

N

O

O

-

HO

P

OH

O R1 R

R1

+

H

O H R

O

O

H

O H

H

NH2

NH2

+

N

N

R NADP

R +

NADPH

NADP+: nicotinamida adeninadinucleotido fosfato

83

9) Estructuras resonantes para el acoplamiento oxidativo fenólico H3C O

H

N

O

CH3

H

A

O2 Estructuras resonantes de la (S) -N-metilcoclaurina E.C.1.14.3 H O

O

H

B

NH2

2 +

N R

E.C.1.14.3:(S)-N-metilcoclaurina oxidase (C-O acoplamiento fenólico) A H3C O

H3C O N

O

CH3

O

H3C O

N CH3

O

H3C O

N CH3

O

HO

HO

HO

HO

H3C O

H3C O

H3C O

H3C O

N CH3

B

N

HO

CH3

O

HO

O

N CH3

HO

O

N CH3

HO

N CH3

O

H

84

O CH3

B

H3C O

A

N

OH

H3C

N

HO

CH3

C O

O H

O CH3

N

H3C O

OH

H3C

14

O OH

13

O CH3

N

OH

H3C

12

14 13

CH3

O

OH

O

12’

N

HO

12’

OH

O CH3

N

CH3

H3C O

O-metilación C12 Hidroxilación orto al puente èter

SAM

H3C

N

HO

CH3

H3C O

HO

O

O CH3

H3C O

N CH3

N

OH

H3C

O2 E.C.1.14.18.1 NADP+

HO

O

CH3

HO

N CH3

O

chillanamina

EC 1.14.18.1 monofenol monooxigenasa

85

.

Vía radicales libres

O2 E.C.1.14.21.3

N

O CH3

H3C O

O

H3C

N

O

CH3

NADP+

OCH3

HO

H3C O

O

O

CH3

N

N O

H3C

O

O CH3

HO

CH3

O

H

H3CO N

N

- CH3

O.

H3C

HO

OH

O

O CH3

O

CH3

EC 1.14.21.3 berbamina sintetasa O CH3

Vía reacciones polares O

CH3

N

H3C O

OH

H3C

HO

O

O

N

-

CH3

O

CH3

H3C O N

N H3C

HO

OH

O

O CH3

O

CH3

H3CO N

N H3C

OH

O

CH3

- CH3O+ HO

O CH3

O

86

Figura 39. Espectro RMN 1H de tabienina B, zona aromática y alifática 87

Figura 40. Espectro RMN 13C de tabienina B, zona aromática y alifática 88

Figura 41. Espectro COSY de tabienina B, zona aromática

89

Figura 42. Espectro COSY de tabienina B, zona alifática

90

Figura 43. Espectro HMQC de tabienina B 91

Figura 44. Espectro HMBC de tabienina B

92

Figura 45. Espectro RMN 1H de columbamina 93

Figura 46. Espectro RMN 13C de columbamina

94

Figura 47. Espectro COSY de columbamina 95

Figura 48. Espectro HMQC de columbamina 96

Figura 49. Espectro HMBC de columbamina  97