Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

* 2018 *

Biología Celular y Molecular

2

A. PRESENTACIÓN DE LA ASIGNATURA I. Introducción El presente curso de Biología Celular y Molecular intenta proporcionar al estudiante una visión esencial de los patrones de estructura, función y organización de las células. Se procurará que el alumno conozca y aplique el método científico, poniendo especial énfasis en el concepto de que el conocimiento científico es provisorio y sometido a constante revisión. En el transcurso del cursado de la asignatura se presentará al alumno una visión de la estructura y ultraestructura celular, los distintos niveles de organización y tipos de células, la relación entre forma y función, el metabolismo de las células y la reproducción celular. II. Objetivos Al finalizar el cursado de la asignatura, se pretenden alcanzar los siguientes objetivos, que los docentes de la cátedra tratarán de promover activamente.  Desarrollar destreza en el manejo de los instrumentos de laboratorio, técnicas empíricas y microscopía.  Conocer los fundamentos, resultados y limitaciones de los principales métodos empleados para el estudio de las células, sus productos y sus interacciones.  Reconocer las características fundamentales de las células, patrones, diversidad de formas, actividad metabólica y regulación.  Conocer las bases moleculares del funcionamiento celular.  Establecer relaciones integradoras entre la estructura y la función de las células.  Examinar a la célula como un organismo autónomo, consolidando el concepto de niveles de organización subcelular.  Instruirse en el empleo de la terminología básica de las ciencias biológicas, tanto en su expresión gráfica, como escrita y oral.  Estimular el desarrollo del pensamiento reflexivo sobre la base del método científico.  Desarrollar la capacidad de obtener, seleccionar y registrar la información biológica pertinente. III. Programa Analítico 1. Introducción al estudio de la biología celular. La biología celular dentro de las ciencias biológicas. Historia e importancia de su conocimiento. Descubrimiento de la estructura microscópica. Morfología al microscopio óptico y electrónico. El concepto de la relación estructura-función. 2. Métodos de estudio en biología celular. Análisis de la estructura y ultraestructura celular. Fraccionamiento celular. Electroforesis. Cultivo de tejidos. Ultracentrifugación. Histoquímica. Inmunohistoquímica. Inmunofluorescencia. 3. Características generales de las células. La célula como unidad funcional y estructural de la vida. Teoría celular. Niveles de organización: protoplásmico, celular, tisular, órganos y sistemas. Envejecimiento, degeneración y muerte de las células.

Biología Celular y Molecular

3

4. Membrana Celular. Composición molecular de las membranas biológicas. Modelos de membranas. Propiedades de las membranas. Diferenciaciones de la membrana. Interacciones de las células entre sí y con las matrices extracelulares. Cubiertas externas. 5. Transporte a través de la membrana. Permeabilidad de la membrana. Transporte activo y pasivo. Difusión simple y facilitada. Osmosis. Transporte de Iones y macromoléculas. Bombas o ATPasas. Proteínas transportadoras. 6. Citosol o Matriz citoplasmática. Citoesqueleto: características generales y organización. Microtúbulos. Organoides microtubulares. Microfilamentos. Filamentos intermedios. Movimiento de las células. Cilios y flagelos. 7. Organelos citoplasmáticos. Organelos membranosos y no membranosos. Retículo endoplasmático liso y rugoso. Aparato de Golgi. Ribosomas. Vesículas con cubierta. Lisosomas. Peroxisomas. Descripción y funciones. Endocitosis específica e inespecífica. Fagocitosis. 8. Mitocondrias. Aspectos generales. Membrana interna y externa. Transporte. Composición y estructura molecular de las membranas. Acople de la cadena respiratoria. Fosforilación oxidativa. 9. La célula vegetal. Morfología y fisiología. Pared celular: composición y estructura. Interacción y comunicación entre células vegetales. Organización interna. Plástidos. Vacuolas. Cloroplastos: modelos estructurales y metabolismo. Fotosíntesis. 10. Núcleo interfásico. Descripción general. Envoltura nuclear. Las bases químicas de la herencia. Estructura del ADN. Modelo de Watson y Crick. Cromatina. Nucleosomas. Empaquetamiento. Proteínas histónicas y no histónicas. Replicación del ADN. Cromosomas: morfología y estructura. Eucromatina y heterocromatina. 11. Mitosis. Ciclo celular. Descripción detallada de la mitosis. Consecuencias genéticas. Aspectos moleculares. Aparato mitótico en células vegetales y animales. Cinetocoros. Citocinesis. Control del ciclo celular. Proteínas reguladoras. 12. Meiosis y Reproducción Sexual. Descripción detallada de la meiosis. Consecuencias genéticas. Recombinación. Metabolismo del ADN en la meiosis. Recombinación a nivel molecular. Estructura de la cromatina en espermatozoides. Dominio físico de los pronúcleos masculino y femenino en las primeras células del embrión. 13. El material genético en acción. Función del ADN. Tipos de ARN: estructura, función y transcripción. Síntesis, regulación y maduración de los ARN. Composición del nucléolo. 14. Código genético. Síntesis de proteínas. Traducción del ARN mensajero. Ribosomas en procariotas y eucariotas. Ensamblaje de los ribosomas. Estructura proteica. Síntesis de proteínas citosólicas y membranosas. IV. Bibliografía General Alberts, B., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & P. Walter. 2004. Biología Molecular de la Célula. 4º edición. Ed. Omega, Barcelona. (2) Alberts, B., D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & P. Walter. 2007. Introduccion a la Biología Molecular. 2º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. (6). De Robertis, M. F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. 12º edición. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. (1). Karp, G. 1998. Biología Celular y Molecular. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México. (2) Karp, G. 2005. Biología Celular y Molecular. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México. (3)

Biología Celular y Molecular

4

Lodish, H., A. Berk, S.L Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4º edición. Ed. Panamericana, Buenos Aires (2) Lodish, H., A. Berk, P. Matsudaira, C. A. Kaiser, M. Krieger, M. P. Scott, S. Zipursky, S. Lawrence & J. Darnell. 2008. Biología Celular y Molecular. 5º edición. Ed. Panamericana, Buenos Aires. (7) Purves, W. K., D. Sadava, G. H. Orians & H. C. Heller. 2006. Vida : la ciencia de la biología. 6º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. (6) V. Bibliografía Específica Beadle, G. W. 1961. Las bases físicas y químicas de la herencia. Ed. Eudeba, Buenos Aires. Bianchi, N. O. 1978. Duplicación cromosómica y heterocromatina a nivel molecular citológico. OEA. Serie de Biología. Monografía Nº 19. Burns, G. W. 1983. The science of genetics: An introduction to heredity. Ed. Macmillan & Co., New York. Gardner, E. J., M. J. Simmons & D. P. Snustad. 1998. Principios de Genética. 4º edición. Ed. Limusa-Wiley. México. Griffiths, A. J. F., J. H. Miller, D. T. Suzuki, R. C. Lewontin & W. M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lacadena, J. R. 1988. Genética. Ed. Agesa, Madrid. Lacadena, J. R. 1996. Citogenética. 1º edición. Ed. Complutense, Madrid. Puertas, M. J. 1992. Genética: fundamentos y perspectivas. 1º edición. Ed. McGraw - Hill Interamericana, Madrid. Sanchez-Monge, E. & N. Jouve. 1989. Genética. Ed. Omega, Barcelona. Sinnott, E. W., Dunn, L. C. & T. Dobzhansky. 1961. Principios de Genética. Ed. Omega. Barcelona. Stern, C. 1963. Principios de genética humana. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Strickberger, M. W. 1978. Genética. 2º edición. Ed. Omega, Barcelona. Thompson, J. S. & M. W. Thompson. 1977. Genética humana. Ed. Salvat, Buenos Aires.

VI. Programa de Examen Bolilla 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Temas 1 2 3 4 5 2 5 1 2 1

11 12 12 11 7 6 7 6 4 2

14 13 14 13 10 9 8 8 9 10

Biología Celular y Molecular

5

B. ORGANIZACIÓN DE LA ASIGNATURA I. Personal Docente Profesor Titular Dr. Massimiliano Dematteis Jefe de Trabajos Prácticos Dra. María de las Mercedes Sosa Dra. María Betiana Angulo Auxiliar de Primera Adscripto Dra. Gabriela Elizabeth Farco Dra. Gisela Mariel Via do Pico Auxiliares de Segunda Carina Daniela Elena Roxana Soledad Molina

II. Características Generales El curso comprende la realización de clases teóricas y prácticas, realizándose 3 evaluaciones parciales con sus respectivos recuperatorios y un recuperatorio extraordinario. III. Clases Teóricas Las clases teóricas están destinadas al conjunto de los alumnos y constituyen una actividad no obligatoria, dónde se desarrollan los aspectos fundamentales y la orientación general de la materia. Para facilitar la comprensión de los contenidos desarrollados durante las clases teóricas, es importante la lectura o estudio previo de los temas dictados. IV. Clases Prácticas Las prácticas de laboratorio o trabajos prácticos son una actividad obligatoria para todos los alumnos inscriptos y se desarrollan dos veces por semana, guiados por uno o más auxiliares de docencia. Las bases conceptuales de los temas de los trabajos prácticos son desarrolladas previamente en las clases teóricas. Para poder integrar los conocimientos teóricos y prácticos, que conduzcan a la comprensión global de la materia, es imprescindible que los alumnos concurran a los trabajos prácticos habiendo estudiado o preparado previamente el tema a desarrollar. Las clases tendrán una duración aproximada de 2 horas, aunque ocasionalmente algunos prácticos puedan demandar mayor o menor cantidad de tiempo. Los temas a desarrollar en los prácticos, así como los materiales necesarios y actividades, se detallan en la guía de trabajos prácticos. Al final de cada práctico, en la guía de actividades prácticas se incluyen referencias bibliográficas a las que el alumno podrá recurrir para aclarar conceptos o estudiar el tema. Para cada clase práctica el alumno deberá concurrir conociendo la finalidad del trabajo y trayendo la guía de trabajos prácticos y los materiales necesarios mencionados en la misma. Se recomienda el uso de guardapolvo o chaquetilla durante los prácticos, pero su empleo no es obligatorio. La realización de cada trabajo práctico implica la comprensión de los principios

Biología Celular y Molecular

6

teóricos del fenómeno en estudio, el adiestramiento manual del alumno, la práctica en el manejo instrumental y entrenamiento en la presentación de datos e interpretación de resultados. Al finalizar cada trabajo práctico, el alumno deberá entregar en forma individual las actividades realizadas durante la clase para su evaluación (ilustraciones, respuestas del cuestionario, problemas resueltos, etc.). Si dicho informe se presenta en estado deficiente o incompleto se considerará que no ha cumplido con la clase práctica. Igualmente, cuando el alumno se encuentre ajeno al trabajo, sea por ignorar los fundamentos teóricos o por permanecer inactivo en la práctica, se considerará que no ha cumplido esa clase práctica. V. Evaluaciones Estarán destinadas a determinar el grado de comprensión de los diferentes temas por parte de los alumnos y evaluar el grado en que los objetivos propuestos por la asignatura se cumplen. a.- Evaluaciones de las Actividades Prácticas: tienen como objetivo determinar si el grado de comprensión de los fundamentos del tema es satisfactorio y verificar si el alumno es capaz de aplicar dichos conocimientos en la resolución de problemas hipotético-deductivos. La evaluación de las mismas se realizará a partir de los trabajos o problemas realizados por los alumnos, que serán entregados al finalizar cada clase. b.- Evaluaciones Parciales: se realizarán tres evaluaciones parciales, que comprenderán temas estrechamente relacionados, cuya comprensión es fundamental para la correcta asimilación de los temas posteriores. Los parciales tendrán como objetivo fundamental evaluar la capacidad de análisis y de las diferentes situaciones que pudieran plantearse. Todos los parciales se desarrollarán por escrito. Los mismos se considerarán aprobados con una calificación de 6 (seis) o superior. Dentro de los 7 días posteriores a cada evaluación se realizará el recuperatorio correspondiente, el cual tendrá modalidad escrito y con preguntas a desarrollar. VI. Regularización de la Asignatura Serán considerados alumnos regulares los que cumplieran con las siguientes exigencias: a) Alcanzar el 75 % de asistencia en las clases prácticas. b) Aprobar el 75% de las clases prácticas. c) Aprobar el 100% de las evaluaciones parciales con calificación 6 (seis) o superior. Los alumnos que no alcanzaran al 75% de aprobación de las clases prácticas o no aprobaran los parciales con un mínimo de 6 (seis) serán considerados alumnos libres. VII. Horarios de Consultas Las consultas que quieran realizar los alumnos, tanto sobre temas teóricos como prácticos, las deberán efectuar al Profesor responsable de la asignatura los días miércoles y viernes de 14 a 15 hs., previos al inicio de las clases teóricas. Cualquier duda que surgiera los días restantes, las consultas podrán ser realizadas en el Instituto de Botánica del Nordeste, Sargento Cabral 2131, de 8 a 10 hs.

Biología Celular y Molecular

7

VII. Cronograma de Actividades Clases teóricas: Clase

Fecha

Módulo/Tema

Docente/s

1

09/03/2018

Dematteis, Massimiliano

2

14/03/2018

3

16/03/2018

4

21/03/2018

5

23/03/2018

6

28/03/2018

7 8

30/03/2018 04/04/2018

10

06/04/2018

12

11/04/2018

13 14

13/04/2018 18/04/2018

15

20/04/2018

16

25/04/2018

17

27/05/2018

18

02/05/2018

19

04/05/2018

20

09/05/2018

21

11/05/2018

Introducción al estudio de la biología celular. La biología celular dentro de las ciencias biológicas. Historia e importancia de su conocimiento. Métodos de estudio en biología celular. Análisis de la estructura y ultraestructura celular. Microscopía óptica y electrónica. Fraccionamiento celular. Cromatografía. Electroforesis. Cultivo de tejidos. Ultracentrifugación. Histoquímica. Inmunohistoquímica. Autorradiografía. Inmunofluorescencia. Teoría celular. Células procariotas y eucariotas. Características de las células vegetales y animales. Morfología y fisiología de las células. Envejecimiento, degeneración y muerte de las células. Membrana Celular. Composición molecular de las membranas biológicas. Modelos de membranas. Propiedades de las membranas. Diferenciaciones de la membrana. Interacciones de las células entre sí y con las matrices extracelulares. Cubiertas externas. Viernes Santo Transporte a través de la membrana. Permeabilidad de la membrana. Transporte activo y pasivo. Bombas o ATPasas. Proteínas transportadoras. Citosol o Matriz citoplasmática. Citoesqueleto: características generales y organización. Microtúbulos. Organoides microtubulares. Microfilamentos. Filamentos intermedios. Movimiento de las células. Cilios y flagelos. Organelos citoplasmáticos. Organelos membranosos y no membranosos. Retículo endoplasmático liso y rugoso. Aparato de Golgi. Primer parcial Ribosomas. Vesículas con cubierta. Lisosomas. Peroxisomas. Descripción y funciones. Endocitosis específica e inespecífica. Fagocitosis. Mitocondrias. Aspectos generales. Membrana interna y externa. Transporte. Composición y estructura molecular de las membranas. Acople de la cadena respiratoria. Fosforilación oxidativa. La célula vegetal. Morfología y fisiología. Pared celular: composición y estructura. Organización interna. Plástidos. Vacuolas. Cloroplastos. Núcleo interfásico. Descripción general. Envoltura nuclear. Las bases químicas de la herencia. Estructura del ADN. Modelo de Watson y Crick. Cromatina. Nucleosomas. Empaquetamiento. Proteínas histónicas y no histónicas. Replicación del ADN. Cromosomas. Eucromatina y heterocromatina. Mitosis. Ciclo celular. Descripción detallada de la mitosis. Consecuencias genéticas. Aparato mitótico en células vegetales y animales. Cinetocoros. Citocinesis. Aspectos moleculares. Control del ciclo celular. Proteínas reguladoras. Segundo Parcial

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano Dematteis, Massimiliano

Biología Celular y Molecular

22

16/05/2018

23

18/05/2018

24

23/05/2018

25 26

25/05/2018 30/05/2018

27

01/06/2018

28

13/06/2018

Meiosis y Reproducción Sexual. Descripción detallada de la meiosis. Consecuencias genéticas. Recombinación. Metabolismo del ADN en la meiosis. Recombinación a nivel molecular. Estructura de la cromatina en espermatozoides. Dominio físico de los pronúcleos masculino y femenino en las primeras células del embrión. El material genético en acción. Función del ADN. Tipos de ARN: estructura, función y transcripción. Síntesis, regulación y maduración de los ARN. Composición del nucléolo. Feriado Código genético. Síntesis de proteínas. Traducción del ARN mensajero. Ribosomas en procariotas y eucariotas. Ensamblaje de los ribosomas. Estructura proteica. Síntesis de proteínas citosólicas y membranosas Tercer Parcial

8

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano Dematteis, Massimiliano

Dematteis, Massimiliano Dematteis, Massimiliano

Clases Prácticas: Clase

Fecha

Módulo/Tema

Docente/s

1

16/03/2018

Práctico Nº 1

2

21/03/2018

Práctico Nº 2

3

23/03/2018

Práctico Nº 3

4

28/03/2018

Práctico Nº 4

5

30/03/2018

Feriado

6

04/04/2018

Práctico Nº 5

7

06/04/2018

Práctico Nº 6

8

11/04/2018

Práctico Nº 7

9

13/04/2018

Primer Parcial

10

18/04/2018

Práctico Nº 8

11

20/04/2018

Recuperatorio Primer Parcial

12

25/04/2018

Práctico Nº 9

13

27/04/2018

Práctico Nº 10

14

02/05/2018

Práctico Nº 11

15

04/05/2018

Práctico Nº 12

16

09/05/2018

Práctico Nº 13

17

11/05/2018

Segundo Parcial

18

16/05/2018

Práctico Nº 14

19

18/05/2018

Recuperatorio Segundo Parcial

Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes

Biología Celular y Molecular

20

23/05/2018

Práctico Nº 15

21

25/05/2018

Feriado

22

30/05/2018

Práctico Nº 16

23

01/06/2018

Práctico Nº 17

24

06/06/2018

Práctico N° 18

25

13/06/2018

Tercer Parcial

Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana Sosa, María de las Mercedes Angulo, María Betiana

Parciales Actividad 1º Examen parcial Recuperatorio 1º examen parcial 2º Examen parcial Recuperatorio 2º examen parcial 3º Examen parcial Recuperatorio 3º examen parcial Recuperatorio Extraordinario

Fecha 13/04/2018 20/04/2018 11/05/2018 18/05/2018 13/06/2018 22/06/2018 29/06/2018

Horario 15-17 17-19 15-17 17-19 15/17 15/17 15-17

Docente responsable Dematteis, Massimiliano Dematteis, Massimiliano Dematteis, Massimiliano Dematteis, Massimiliano Dematteis, Massimiliano Dematteis, Massimiliano Dematteis, Massimiliano

9

Biología Celular y Molecular

TRABAJOS PRÁCTICOS

10

Biología Celular y Molecular

11

Trabajo Práctico Nº 1 MICROSCOPÍA ÓPTICA Y ELECTRÓNICA El microscopio óptico o fotónico de campo claro está compuesto por una parte mecánica o estativo y por un sistema óptico que incluye fuente de luz, condensador, diafragma, objetivos y oculares, a través de los cuales se refractan los rayos luminosos provenientes del objeto en estudio para proporcionar una imagen final de mayor tamaño, invertida y virtual. Para ello, el objeto estudiado debe ser transparente y poseer suficiente contraste para poder discriminar sus componentes. La transparencia se logra mediante la realización de cortes muy delgados del material en estudio o bien realizando extendidos celulares. El contraste adecuado se alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o por medio de sistemas ópticos particulares (por ejemplo: microscopio de contraste de fases). El microscopio de campo claro es de gran utilidad para el estudio de células y tejidos previamente fijados (muertos) y coloreados. La coloración de las preparaciones citohistológicas tiene por finalidad provocar la absorción diferencial de luz, con el propósito de visualizar las diversas estructuras en distintos colores. Por el contrario, para estudiar células u organismos vivos que no se pueden colorear, es necesario recurrir casi siempre a otros sistemas ópticos especiales, como el microscopio de contraste de fases o el microscopio de interferencia. En estos dos casos, se aprovecha una característica propia de los diferentes componentes celulares, que aunque son transparentes a la luz, poseen densidades relativas distintas. Existen básicamente dos tipos de microscopio electrónico: el microscopio electrónico de barrido o tridimensional (MEB) y el microscopio electrónico de transferencia (MET). Estos microscopios, a diferencia del microscopio óptico, forman imágenes a partir de una radiación de electrones emitida por un filamento de tungsteno y un sistema de electroimanes que funcionan como lentes. Otra de las características es que proporcionan una resolución mayor que el microscopio óptico, requieren de procedimientos más elaborados para la preparación del material y sólo se pueden examinar células deshidratadas y muertas. El MET se utiliza ampliamente para examinar la estructura interna de la célula, mientras que el MEB examina con detalle la superficie de las muestras, las cuales se observan tridimensional mente debido a la profundidad de foco que posee este último tipo de microscopio. Tanto el MET como el MEB son indispensables para el estudio de la biología celular y molecular. El microscopio electrónico de transmisión es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas, tiene un límite de resolución de cerca de 2 nm. Un MET mira células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados Las partes principales de un microscopio electrónico son:  Cañón de electrones, que emite los electrones que chocan contra el espécimen, creando una imagen aumentada.  Lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones.  Sistema de vacío es una parte muy importante del microscopio electrónico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características.

Biología Celular y Molecular  

12

Placa fotográfica o pantalla fluorescente que se coloca detrás del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una computadora.

El microscopio electrónico de barrido (MEB) también tiene un límite de 2 nm. El MEB permite mirar a células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados. Con esta técnica los electrones son reflectados sobre la superficie del espécimen.

El presente Trabajo Práctico tiene la finalidad de observar las partes integrantes y el

Biología Celular y Molecular

13

funcionamiento del microscopio óptico y un microscopio electrónico, que son los más utilizados en el área de las ciencias biológicas. Objetivos:      

Reconocer las diferentes partes que componen un microscopio. Analizar las características del instrumental óptico Adquirir destreza en el uso del microscopio óptico. Aprender las normas básicas para su cuidado y manejo. Conocer las características del microscopio electrónico. Entender las aplicaciones de la microscopía electrónica de transmisión y barrido.

Materiales:      

Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.) Papel tissue Puerro Agujas Pinzas Portaobjetos y cubreobjetos

Actividades: 1. Desprender cuidadosamente la epidermis de la planta con una pinza de punta fina y colocar sobre un portaobjetos. Colocar una gota de agua y luego el cubreobjetos. Observar el preparado a través del microscopio óptico empezando por el menor aumento. Estos preparados les permitirán instruirse en la utilización del microscopio óptico hasta adquirir relativa destreza. 2. Para el buen manejo del microscopio se sugiere seguir el procedimiento que se detalla a continuación, hasta que el enfoque de una preparación sea una maniobra automática y sencilla.  Encender la luz del microscopio, colocar el objetivo de menor aumento (5x o 10x) en el eje óptico, subir el condensador hasta el tope superior y abrir completamente el diafragma.  Colocar la preparación sobre la platina con el cubreobjetos hacia arriba y el material en el orificio de la platina.  Acercar el objetivo al preparado mediante el control o tornillo macrométrico, mirando desde el costado del microscopio hasta llegar casi hasta el tope o a unos 4-5 mm del preparado.  Mirar por el ocular y separar lentamente el objetivo hasta visualizar la preparación. Completar el enfoque mediante el control micrométrico.  Regular la iluminación ajustando la altura del condensador y la apertura del diafragma.  Para pasar a objetivos de mayor aumento, bajar un poco la platina. Si se trata de un objetivo de inmersión, colocar una gota de aceite sobre el preparado y mirar desde el costado acercando el objetivo con el tornillo macrométrico hasta hacer contacto con la gota de aceite. Se debe actuar con precaución para evitar la rotura del portaobjetos del preparado o de la lente frontal del objetivo.  Mirar por el ocular y maniobrar con el control micrométrico hasta visualizar la preparación y enfocar correctamente.

Biología Celular y Molecular

14

 Al finalizar las observaciones se debe apagar la luz del microscopio, separar el objetivo de la platina y colocar el objetivo de menor aumento. Si se utilizó aceite de inmersión se debe limpiar el preparado con xilol y las lentes con papel (especial para lentes).  Una vez terminado esto, se deben guardar los preparados en la caja correspondiente y cubrir el microscopio con la funda o estuche. Para el adecuado uso de un microscopio óptico, también pueden ser importantes algunas de las recomendaciones que se detallan a continuación:  Antes de comenzar a trabajar con un microscopio binocular se debe ajustar el sistema óptico a sus ojos.  Si utiliza anteojos correctores de miopía, no necesita usarlos para mirar al microscopio. En cambio, si emplea anteojos para astigmatismo, si es necesario utilizarlos.  Los microscopios utilizados para las clases prácticas varían en cuanto a la forma y posición de sus controles de acuerdo a la marca y el modelo del microscopio. Solicite ayuda siempre al JTP sobre las semejanzas y diferencias para su uso.  Recuerde siempre que, cuanto mayor es el aumento utilizado, menor es el campo microscópico observado. En todos los casos, se debe empezar a observar una preparación con el objetivo de menor aumento.

3. Dibujar lo observado en el mayor aumento (400X). 4. Examinar las fotografías que se hallan a continuación e indique en cada caso que tipo de microscopio fue utilizado. 5. Explicar qué tipo de información brinda la utilización de cada uno de estos microscopios.

A……………………………………………

B……………………………………..

Biología Celular y Molecular

C……………………………………………

D………………………..…………………

E…………………………………………………

F……………………………..

6. Completar el siguiente esquema indicando sus partes ópticas y mecánicas.

15

Biología Celular y Molecular

16

Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. Curtis, H. & N. S. Barnes. 1987. Invitación a la Biología. Ed. Médica Panamericana, México. Curtis, H. & N. S. Barnes. 1993. Biología. 5º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. De Robertis, M. F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. 12º edición. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Karp, G. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México. Villee, C. A. 1996. Biología. 8º Edición. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México.

Biología Celular y Molecular

17

Trabajo Práctico Nº 2 TÉCNICAS CITOQUÍMICAS El propósito inmediato de la citoquímica consiste en la identificación y localización de los diferentes compuestos químicos dentro de la célula. La histoquímica hace lo propio a nivel tisular. Este propósito es tanto cualitativo como cuantitativo. Puede realizarse con fines diagnósticos, y en tal sentido debemos señalar que los procedimientos cito-histoquímicos (en especial los referidos a la inmunohistoquímica) se convirtieron en un instrumento invalorable en el diagnóstico o pronóstico de innumerables alteraciones histopatológicas. Las técnicas cito-histoquímicas como instrumento de investigación involucran el estudio de los cambios dinámicos en la organización citoquímica durante los distintos estadios funcionales. En tal sentido, es posible establecer el papel que desempeñan los diferentes componentes celulares en los procesos metabólicos de la célula. El método citohistoquímico en sentido estricto es microscópico, porque comprende una serie de procedimientos químicos y físicos que se emplean para individualizar con el microscopio diferentes componentes químicos en el interior de las células o en las matrices extracelulares. Objetivos:  Identificar compuestos químicos mediante técnicas citoquímicas dentro de la célula.  Conocer la base química de las diferentes reacciones. Detección de almidón Los azúcares, glúcidos o hidratos de carbono son compuestos formados por átomos de carbono, hidrógeno y oxígeno. Representan la principal fuente de energía de los organismos y además son parte de la extensa variedad de componentes estructurales de la pared celular y de las sustancias intercelulares. De acuerdo al número de moléculas que la componen, se clasifican en: monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos (de cuatro a diez), polisacáridos (más de diez). Estos junto con las proteínas y los ácidos nucleicos forman las macromoléculas. Entre estos compuestos se encuentran la glucosa, fructosa, sacarosa, almidón, glucógeno, celulosa, quitina, etc. Materiales:     

Almidón de origen vegetal, suspendido en agua al 10 %. Reactivo de Lugol (Iodo en solución de Ioduro de potasio). Tres tubos de ensayo. Papa, arroz, trigo, etc. Agua destilada.

Procedimiento: 1. 2. 3. 4.

Rotular con números los tres tubos de ensayo. Agregar al Tubo 1: 4 ml de agua destilada + tres gotas de solución de Lugol. Al Tubo 2 incorporar 4 ml de suspensión de almidón al 10% + tres gotas de Lugol. En el Tubo 3 poner 4 ml de agua destilada + cantidad necesaria de arroz, trigo o raspado de papa + tres gotas de Lugol. 5. Agitar los tres tubos durante unos segundos. 6. Observar, dibujar e interpretar los resultados.

Biología Celular y Molecular

18

Las moléculas de yodo se intercalan en los bucles de la hélice de amilosa formando un complejo de color azul-violáceo. Detección de ADN Los ácidos nucleicos son macromoléculas de gran importancia biológica, debido a que contienen la información para codificar la síntesis de proteínas. Todos los organismos vivos contienen ácidos nucleicos en forma de ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN); algunos virus contienen solo ADN y otros solo ARN. Los ácidos nucleicos resultan de la polimerización de nucleótidos. Los nucleótidos son las unidades estructurales de los ácidos nucleicos y están formado por tres subunidades: una base nitrogenada ligada a un azúcar (pentosa), que se combina a su vez con una molécula de ácido fosfórico. Las pentosas pueden ser la ribosa en el ARN o la desoxirribosa en el ADN. Las bases nitrogenadas son moléculas cíclicas y están formadas por carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno. Existen dos tipos de bases nitrogenadas, las pirimídicas que se llaman citosina, timina y uracilo; y las púricas que son la adenina y la guanina. Las bases pirimídicas están formadas por una sola molécula cíclica, mientras que las púricas tienen dos anillos fusionados en su molécula. Las bases púricas se encuentran en todos los ácidos nucleicos, en cambio la timina se halla solo en el ADN y el uracilo solo en el ARN, salvo contadas excepciones. Los nucleótidos se unen entre sí formando enlaces entre el fosfato de uno y la pentosa del siguiente, formando largos polímeros que están integrados solo por ribonucleicos en el ARN o desoxirribonucleicos en el ADN. Las funciones de ambos tipos de ácidos nucleicos están vinculadas a la codificación de la información genética y la síntesis de proteínas. Materiales:     

Portaobjetos y cubreobjetos 2 Pinzas de disección Papel secante 1 Aguja histológica Elementos de dibujo

Procedimiento: 1. Colocar las raíces previamente pretratadas y fijadas en un tubo de ensayo con ácido clorhídrico 1N. 2. Incubar en baño maría a 60°C durante 8 minutos. 3. Pasar las raíces a otro tubo de ensayo que contenga reactivo de Schiff. 4. Inmediatamente después, colocar el tubo en cámara oscura durante unos 20 o 30 minutos. Luego de transcurrido ese lapso controlar las raíces y verificar si han tomado color. 5. Una vez realizada la técnica de Feulgen se podrá observar coloreada en color violeta la zona de activo crecimiento de la raíz. 6. Colocar las raíces bajo la lupa e ilustrar detalladamente lo observado. 7. Bajo la lupa, en primer lugar se deberá retirar la cofia de la raíz (que cubre la región meristemática). 8. Posteriormente se debe cortar una solamente la parte coloreada que corresponde al ápice de la raíz (unos 2 o 3 mm). 9. Una vez cortado el extremo se debe colocar sobre un portaobjetos y agregarle una gota de orceína acética o ácido acético. 10. Macerar suavemente la región meristemática utilizando una varilla de vidrio o la parte posterior de una aguja histológica. 11. Por último colocar el cubreobjetos y realizar el aplastado o squash.

Biología Celular y Molecular

19

12. Observar en el microscopio el aspecto de las células y esquematizar una que se encuentre en división. Es importante tener cuidado con el reactivo de Schiff porque colorea todo tipo de elemento, por ello se debe utilizar una pinza específica para cada caso. La hidrólisis ácida extrae las purinas a nivel de la unión desoxirribosa purina del ADN y de esa manera libera los grupos aldehídos de la desoxirribosa. Los grupos aldehídos libres reaccionan con el reactivo de Schiff. Cuando se aplica a la célula, la reacción es positiva en el núcleo y negativa en el citoplasma. El nucleolo es Feulgen negativo. Con los resultados observados, elabore un informe sintético detallando las sustancias detectadas, los reactivos utilizados y las características de la reacción. Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. Curtis, H. & N. S. Barnes. 1987. Invitación a la Biología. Ed. Médica Panamericana, México. Curtis, H. & N. S. Barnes. 1993. Biología. 5º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. De Robertis, M. F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. 12º edición. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Karp, G. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México. Villee, C. A. 1996. Biología. 8º Edición. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México.

Biología Celular y Molecular

20

Trabajo Práctico N° 3 USOS Y MANIPULACIÓN DEL EQUIPAMIENTO EN LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR La seguridad en el Laboratorio de Biología Molecular es tan importante como conocer los usos de cada uno de los equipos que posee. Los laboratorios en los que se desarrollan las prácticas, son lugares de trabajo en los que se pueden emplear gran diversidad de productos químicos, seres vivos y numerosas técnicas instrumentales, lo que implica que existan siempre riesgos en ellos. Los riesgos que se presentan más frecuentemente implican exposición a agentes químicos, agentes biológicos y agentes físicos, además del consabido riesgo de explosión e incendio. Por otra parte, la biología molecular estudia la composición, estructura y función de las moléculas biológicamente importantes, así como los procesos en los que estén implicadas. Engloba principalmente a proteínas y ácidos nucleicos. Esta práctica introduce a las técnicas de pipeteo y pipeteo en esterilidad, técnicas usadas a través del curso. Dominar estas técnicas es sumamente importante para obtener buenos resultados en el resto de las prácticas. La mayoría de los laboratorios usan volúmenes muy pequeños de ADN y reactivos. Esto requiere el uso de una micropipeta ajustable que pueda medir volúmenes tan pequeños como 1 microlitro. Por lo tanto, es importante mantener las condiciones de esterilidad, minimizar la oportunidad de contaminar un experimento con bacterias u hongos foráneos. Se debe usar material estéril para todo lo que entra en contacto con un cultivo bacteriano; medio nutritivo, soluciones, pipetas, puntas, asas de inoculación y esparcidores, frascos, tubos y placas de cultivo. Pipetas de precisión de volumen variable (micropipetas): Este tipo de instrumento permite el pipeteo de pequeños volúmenes de líquidos con precisión y reproducibilidad. Es un instrumento de precisión que, como tal, es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo. Las mismas son autoclavables y utilizan un cono, punta o tip descartable, con el que se toman las muestras. Requerimos leer atentamente este apéndice para evitar una mala manipulación de las mismas. A. Tapa para control del volumen B. Visor donde se observa el volumen a calibrar C. Botón para eyectar los tips D. Rango de volumen que permite la pipeta E. Eyector de tips

Biología Celular y Molecular

21

Descripción general de una micropipeta tipo.

Precauciones al momento de usar una micropipeta Nunca rotar el ajustador de volumen más allá del rango inferior o superior de la pipeta. Nunca usar la micropipeta sin el tip en su lugar; esto puede arruinar el pistón. Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con un tip lleno; el líquido podría entrar dentro del pistón. Nunca liberar violentamente el émbolo después de vaciar el líquido; esto podría dañar el pistón. Nunca meter el cono de la pipeta en líquido. Nunca flamear la punta de la micropipeta. Objetivos:  Conocer los riesgos dentro de un laboratorio de biología molecular y sobre la importancia de la esterilidad.  Reconocer los diferentes equipos dentro del laboratorio y relacionarlos con sus diferentes usos y riesgos de seguridad y contaminación.  Conocer la importancia y cuidado del manejo de los equipos/instrumentales.  Adquirir destreza en el uso y manipulación de micropipetas. Materiales:  Guía de normas para el trabajo en el laboratorio (Anexo)  Micropipetas y tips 

Tubos Eppendof



Vaso de precipitados



Agua con colorante

Actividades: 1-Responder: a- Nombrar los elementos de protección que se requieren para entrar a un laboratorio.

Biología Celular y Molecular

22

b- Si debo preparar una solución que lleva un reactivo que emite vapores y es irritante ¿Bajo qué condiciones debo preparar la solución? c-¿Qué debo hacer si ocurre un derrame o salpicadura y toma contacto con mi piel o los ojos? 2- Colocar los nombres a los equipos que se encuentran en las figuras y nombrar las actividades/usos que se realizan con este, con sus posibles riesgos de contaminación y/o riesgo de seguridad. Nombre: ________________________________ Usos: ___________________________________ ________________________________________ ________________________________________ Riesgos:_________________________________ _________________________________________

Nombre: ___________________________ Usos: ______________________________ ___________________________________ ___________________________________ Riesgos:____________________________ ___________________________________

Nombre: ________________________________ Usos: ___________________________________ ________________________________________ ________________________________________ Riesgos:_________________________________ _________________________________________

Nombre: _________________________________ Usos: _________________________________________ _________________________________________ _________________________________________ Riesgos:_________________________________ _________________________________________

Biología Celular y Molecular

23

Nombre: ________________________________ Usos: ___________________________________ ________________________________________ ________________________________________ Riesgos:_________________________________ _________________________________________

Nombre: ________________________________ Usos: ___________________________________ ________________________________________ ________________________________________ Riesgos:_________________________________ _________________________________________

Nombre: ________________________________ Usos: ___________________________________ ________________________________________ ________________________________________ Riesgos:_________________________________ _________________________________________

3- Seguir los pasos para la utilización de micropipetas realizando el pipeteo con agua coloreada. Procedimiento para la utilización de micropipetas: Observar que el botón de eyección tiene tres posiciones. T0 (B y E), T1, primer tope (AC), T2, segundo tope (D) Para la carga: 1. Calibración del volumen, tener mucho cuidado en no sobrepasar los límites operativos de cada pipeta. Colocar el tip. 2. Llevar el émbolo a la posición de carga T1 (ver A). 3. Dentro del líquido a pipetear, liberar el émbolo lentamente hasta la posición T0 (ver B). 4. Para la descarga: 5. Bajar el émbolo suavemente, este debe pasar por primer tope (ver C), y para la descarga total llegar hasta el final, posición T2 (ver D). 6. Finalmente, fuera del líquido dispensado, liberar el émbolo hasta T0 (ver E). 7. Descartar el tip.

Biología Celular y Molecular

24

Conversiones métricas Es muy importante familiarizarse con las unidades métricas de medida y sus conversiones. Vamos a ejemplificar con las medidas de líquidos basadas en el litro, pero los mismos prefijos (mili- y micro-) se aplican para las medidas en gramos. Las dos medidas que más se usarán en el laboratorio son mililitro (ml) y microlitro (µl). 1 µl = 1 000 ml = 0,000001 litro 1 000 000 µl = 1 litro 1 ml = 0,001 µl = 0,001 litro 1 000 ml = 1 litro 4- Responder la siguiente situación: -Tengo que hacer una solución de 25µL para realizar la digestión del ADN de una muestra (Tabla 1). ¿Qué tipos de micropipetas debo usar y cuáles son sus límites operativos? ¿Cuántos tips diferentes tengo debo usar? Tabla 1. Componentes de mezcla de digestión EcoRI-MseI Componentes Concentración Concentración Volumen para 1 inicial final muestra (25 μL) Buffer OPA

5X

1X

5 μL

DTT

250 mM

5 mM

0,5 μL

BSA

10000 ng/μL

50 ng/μL

0,125 μL

EcoRI

12 U

5 unidades

0,4 μL

MseI

10 U

5 unidades

0,5 μL

ADN

300 ng/μL

1 μg

3,4 μL

Agua U.P.

15,075 μL

Biología Celular y Molecular

25

ANEXO NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO Normas para el trabajo en el laboratorio: 1. Se implementará el uso de guardapolvo de preferencia que sea largo y con mangas largas. Es recomendable no usar faldas, shorts o zapatos abiertos. Las personas de cabello largo deberán sujetarlos mientras estén en el laboratorio. 2. No fumar, comer o beber (incluye mate y/o tereré) en el laboratorio. Lavar bien las manos al salir del lugar. 3. Es importante conocer la localización de los accesorios de seguridad: -Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego pueden apagar. -Localizar las salidas de emergencia. -Localizar la llave general de electricidad del laboratorio. -Localizar la manta anti-llama. -Localizar el lava-ojos y ducha más cercanos 4. Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse. 5. No devolver los reactivos a los frascos originales, aunque no hayan sido usados. 6. No usar ningún instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a utilizar. 7. Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo. Cuando los instrumentos no estén siendo usados deben permanecer desenchufados. 8. Nunca pipetear líquidos con la boca. En este caso usar peras de plástico o pipetas especiales para tal fin. 9. Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias química o material biológico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberá tocar objetos, ni superficies, tales como: teléfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, 10. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. 11. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, aquellas que pueden ser riesgosas por inhalación deben llevarse a cabo bajo campana. 12. Está prohibido descartar líquidos inflamables o tóxicos o corrosivos o material biológico por los desagües de las piletas, sanitarios o recientes comunes para residuos. En cada caso se deberán seguir los procedimientos establecidos para la gestión de residuos. * Material de Vidrio 1. Al usar material de vidrio, verificar su condición. Cualquier material de vidrio que esté astillado debe ser rechazado. 2. Los vidrios rotos así como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente apropiado. * Residuos Consultar siempre la vía de descarte de cada uno de los reactivos utilizados. * Al retirarse, verificar que el instrumental utilizado esté apagado y en su lugar. La mesada de trabajo debe quedar libre y limpia. Cualquier desperfecto, rotura o accidente deberá ser informado a los docentes

Biología Celular y Molecular

26

Bibliografía Suárez-Baron H. & G. Gallego 2014. Guía de Laboratorio de Biología Molecular Básica. Publicación CIAT N° 397. https://www.researchgate.net/publication/275639881

Biología Celular y Molecular

27

Trabajo Práctico Nº 4

ELECTROFORESIS La electroforesis es una técnica de separación o resolución de moléculas de una mezcla por aplicación de un campo eléctrico. Constituye uno de los métodos más aplicados en Biología Celular cuando se necesita separar, aislar y/o identificar componentes subcelulares o macromoléculas. En la electroforesis, la separación aprovecha una característica de la mayoría de los compuestos biológicos: la de poseer carga eléctrica. Por lo tanto, colocados bajo la influencia de un campo eléctrico de corriente continua, esos compuestos son capaces de desplazarse en forma característica sobre un soporte mantenido en condiciones definidas. Las moléculas disueltas se desplazan o migran a una velocidad determinada por la relación entre sus cargas. Por ejemplo, si dos moléculas tienen masa y formas iguales, la de mayor carga neta se desplazará con mayor velocidad hacia un electrodo. La separación de moléculas pequeñas como los aminoácidos y los nucleótidos, es una de las muchas aplicaciones de la electroforesis. En este caso se deposita una pequeña gota de muestra sobre una tira de papel de filtro u otra sustancia porosa, que luego es embebida en una solución conductora. Cuando se aplica un campo eléctrico sobre los extremos de la tira, las moléculas pequeñas disueltas en la solución conductora se desplazan a lo largo de la tira, en correspondencia con la magnitud de su carga. Así, las moléculas biológicas pueden ser separadas y caracterizadas según la velocidad con que se mueven y esta propiedad puede ser utilizada para aislar ácidos nucleicos, alcaloides, proteínas, etc. de una mezcla compleja, determinar el PM, identificar moléculas similares con diferente carga neta, determinar la pureza de una fracción molecular, aislar diferentes compuestos, etc. Existen varios sistemas electroforéticos, aunque el más usado es la llamada electroforesis zonal. En este sistema la muestra es sembrada en un soporte semisólido (papel) o gelatinoso (almidón, agar, poliacrilamida) que, al someterse a un campo eléctrico, permite que las moléculas migren a través de ellos.

Biología Celular y Molecular

28

Objetivo: 

Comprender los fundamentos de las técnicas electroforéticas.

Actividades: 1. Observar la fotografía de la corrida electroforética y determinar las bandas proteicas en la muestra. 2. Medir las distancias relativas de migración (Rf) de cada una de las muestras y del marcador de peso molecular. 3. A partir de los datos obtenidos, calcular el peso molecular de la muestra. Rf (muestra)

yo * Rf

a - yo * Rf

4. Contestar las siguientes preguntas: a- ¿Cuáles son las aplicaciones de la cromatografía y la electroforesis? b- ¿Cuál es el fundamento de la electroforesis zonal?

PM

Biología Celular y Molecular

29

Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. Acquaah, G. 1992. Practical protein electrophoresis for genetic research. Dioscorides Press, Oregon. Avers, C. J. 1991. Biología Celular. Ed. Iberoamérica, México. De Robertis, M. F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. 12º edición. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Karp, G. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México. Lehningher, A., D.L. Nelson & M. Cox. 1995. Principios de Bioquímica. 2ª ed. Ed. Omega. Barcelona. Lodish, H., A. Berk, S.L Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4ª ed. Ed. Panamericana. España. Puertas, M. J. 1992. Genética: fundamentos y perspectivas. 1º edición. Ed. McGraw - Hill Interamericana, Madrid.

Biología Celular y Molecular

30

Trabajo Práctico Nº 5 CÉLULA La teoría celular fue formulada a principios del siglo XIX antes de la presentación de la teoría de la evolución de Darwin, pero estas dos grandes teorías están estrechamente vinculadas. Las similitudes entre las células nos permiten hacer una rápida mirada a la historia evolutiva que vincula a los organismos actuales con las primeras células que se originaron hace 3500 m.a. La teoría celular se ha modificando a lo largo del tiempo y se han agregado o modificado algunos puntos. La teoría actual considera que:  la célula constituye la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos  las propiedades de un organismo dependen de las propiedades individuales de sus células  las células se originan únicamente a partir de otras células preexistentes por medio de división celular  la unidad más pequeña de vida es la célula La teoría celular es de una importancia enorme para la biología porque hace énfasis en la similitud de los sistemas vivos y por lo tanto brinda la base para unificar una gran variedad de estudios que implican a muchas clases de organismos diferentes.

Objetivos:    

Asimilar el concepto de célula como unidad estructural y funcional de los seres vivos. Reconocer las diferencias entre células procariotas y eucariotas. Distinguir las características especiales de las células. Relacionar las estructuras observadas con la función que cumplen.

Materiales:  Portaobjetos y Cubreobjetos  Pinzas y Agujas  Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.)

Biología Celular y Molecular

31

Observaciones: Para la observación de células procariotas se analizarán las bacterias presentes en el yogur, para ello se deberá colocar una gota de yogur en un portaobjetos y se colocará una gota de agua. Luego de ello, se observará a distintos aumentos. El reconocimiento de células eucariotas se realizará a partir de preparaciones provistas por la cátedra y otras realizadas por los alumnos. Para la realización de preparados se requerirá de cebolla (bulbo), hojas de Elodea sp. o Vallisneria sp. Para la observación se deberá desprender una porción del material y colocar con una gota de agua, sobre el portaobjetos, luego se coloca el cubreobjetos. Una vez realizada la muestra se lleva al microscopio y observa en distintos aumentos. En ambos casos se deberá esquematizar las células y tejidos. Actividades: 1. Esquematizar los diferentes tipos de células observadas durante el trabajo práctico e indicar las semejanzas y diferencias que pueden apreciarse. 2. Hacer un cuadro comparativo con las diferencias entre células procariotas y eucariotas. 3. Resumir los postulados de la teoría celular indicando los autores de la misma. Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. Curtis, H. & N. S. Barnes. 1993. Biología. 5º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. De Robertis, M. F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. 12º edición. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Karp, G. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México. Lodish, H., A. Berk, S. L. Zipursky, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. Villee, C. A. 1996. Biología. 8º Edición. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México.

Biología Celular y Molecular

32

Trabajo Práctico Nº 6 MEMBRANA PLASMÁTICA Las células tienen una composición química diferente al medio que la rodea y dicha diferencia es mantenida durante toda la vida por la membrana plasmática o celular, que es la encargada de regular el intercambio de iones y moléculas entre la célula y el medio extracelular. Debido a ello la comprensión de la estructura y funcionamiento de la membrana plasmática resultan fundamentales para la comprensión de la mayoría de las actividades celulares. Objetivos:  

Reconocer las partes constitutivas de la membrana plasmática. Asimilar el concepto de Modelo de Mosaico Fluido.

Actividades: 1. Completar con referencias el esquema de la membrana plasmática de acuerdo al modelo actual e indicar los diferentes componentes que puede presentar.

2. La unidad estructural de las membranas biológicas son los lípidos, de los cuales los más abundantes son los fosfolípidos. Hacer un esquema representando la estructura de un fosfolípido típico, indicando sus componentes mediante flechas.

Biología Celular y Molecular

33

3. Según el modelo del “mosaico fluido”, los lípidos constituyen la unidad estructural de la membrana, pero la unidad funcional son las proteínas. Describir las propiedades de los tres tipos diferentes de proteínas de membrana, indicando las diferencias y similitudes de unas con otras.

Bibliografía: ALBERTS, B., D. BRAY, J. LEWIS, M. RAFF, K. ROBERTS & J. D. WATSON. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. DE ROBERTIS, E.M.F., J. HIB & R. PONZIO. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. LODISH, H., A. BERK, S. L. ZIPURSKY, D. BALTIMORE & J. DARNELL. 2002. Biología Celular y Molecular. 4º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. VILLEE, C. A. 1996. Biología. 8º Edición. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México.

Biología Celular y Molecular

34

Trabajo Práctico Nº 7 TRANSPORTE DE MEMBRANA Como resultado de las diferencias en la concentración de solutos a ambos lados de la membrana plasmática, el agua tiende a entrar o a salir de la célula por ósmosis. Si el medio extracelular tiene una concentración más alta de sales, o sea es hiperosmótico o hipertónico, el agua tiende a salir de la célula y por lo tanto el volumen celular disminuye. Por el contrario, si el medio extracelular tiene una concentración menor de sales, es hiposmótico o hipotónico con respecto al citoplasma y el agua tiende a ingresar a la célula. Cuando el medio extracelular posee la misma concentración de sales que el citoplasma, los compartimentos son isosmóticos o isotónicos y no se modifica el volumen de la célula.

Objetivos:  

Asimilar los distintos mecanismos de transporte a través de la membrana plasmática Comprender la naturaleza dinámica de la membrana.

Observaciones:     

Con ayuda de un bisturí cortar un fragmento pequeño de hoja de la planta acuática Vallisneria sp. (Hydrocharitaceae). Colocar en el portaobjetos, agregar una gota de agua y poner el cubreobjetos. Observar en el microscopio e ilustrar las células, poniendo especial atención al volumen celular. Por otro lado, sumergir unos minutos las hojas de Vallisneria sp. en una solución salina. Posteriormente realizar el paso 2 y 3 descriptos anteriormente.

Actividades: Una vez realizadas las observaciones y los dibujos correspondientes, conteste las siguientes preguntas: 1. ¿Qué sustancia/s han atravesado la membrana plasmática? 2. ¿Cómo es el medio extracelular en ambos casos? ¿es hipertónico, hipotónico o isotónico con respecto al citoplasma? 3. ¿Las sustancias transportadas se movilizaron a favor o en contra de su gradiente de concentración?

Biología Celular y Molecular

35

4. Analizar las características de los distintos mecanismos de transporte a través de la membrana plasmática (difusión simple, difusión facilitada, ósmosis, transporte activo) y realizar un cuadro comparativo indicando las particularidades de cada uno en cuanto a consumo de energía, gradiente de concentración y las moléculas involucradas en el transporte. 5. Hacer un cuadro con los diferentes tipos de bombas o ATPasa, señalando su estructura, sustancia que transportan y localización más frecuente. 6. Una solución es hipertónica respecto a otra cuando posee: a) b) c) d) 7

Una célula vegetal colocada en un medio cuya concentración de solutos es menor que la de la célula: a) b) c) d) e)

8

Se plasmoliza. Aumenta su presión de turgencia. Pierde sus solutos por difusión. Activa su sistema de vacuolas contráctiles. No experimenta ningún cambio.

Indique que ocurrirá respecto al movimiento de solutos y agua, si: a) b) c) d) e) f) g)

9

Menor concentración de soluto. Mayor concentración de soluto. Igual concentración de soluto. Mayor demanda de soluto.

Se somete a un glóbulo rojo a una solución hipertónica. Se somete a un glóbulo rojo a una solución isotónica. Se somete a un glóbulo rojo a una solución hipotónica. Se somete a un glóbulo rojo a una solución muy hipotónica. Se coloca a un alga marina en agua destilada. Se sumerge una planta de Vallisneria sp. en una solución salina hipertónica. Se coloca una planta de Vallisneria sp. en una solución hipotónica.

Un recipiente se halla dividido por una membrana semipermeable delimitando dos compartimentos: A y B. En A se coloca una solución de glucosa 3 M y se le agrega almidón, que conforma una suspensión. En B se coloca agua destilada. Indique qué cambios espera observar en cuanto al movimiento de solutos y de solvente, y los cambios esperables en la variación de volúmenes de solvente en ambos compartimentos.

Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. De Robertis, M. F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. 12º edición. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Karp, G. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México. Lodish, H., A. Berk, S. L. Zipursky, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires.

Biología Celular y Molecular

36

Trabajo Práctico Nº 8 CITOESQUELETO El citoesqueleto es un sistema citoplasmático de fibras, esencial para la movilidad y estructura celular. Está constituido por tres tipos de fibras citosólicas: microfilamentos (filamentos de actina), filamentos intermedios y microtúbulos. Estas fibras citoesqueléticas están compuestas por polímeros bien ordenados, construidos a partir de pequeñas subunidades proteicas que se mantienen unidas mediante enlaces no covalentes. El citoesqueleto no es una estructura estática, sino que está sometido a reordenamientos constantes, capaces de producir movimientos. Desempeña un papel estructural importante, al sostener la membrana plasmática y formar carriles a lo largo de los cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol. Así, el citoesqueleto interviene en el mantenimiento de la forma celular, la movilidad celular y los cambios coloidales que experimenta el citoplasma.

Objetivos:   

Analizar los distintos componentes del citoesqueleto. Comprender las funciones de los diferentes elementos del esqueleto celular. Reconocer los mecanismos básicos de movimiento de las células. Observación de elementos del citoesqueleto en microscopio óptico

Actividades: Para el presente práctico se observarán preparados permanentes y realizarán preparaciones para microscopio óptico a los efectos de observar diferentes elementos del citoesqueleto. Los materiales a observar en cada caso, se detallan a continuación: 1. Colocar una gota de agua de charco sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos. Observar detenidamente el preparado hasta hallar algún organismo ciliado o flagelado. Esquematizar y colocar las referencias pertinentes. 2. Observar los preparados de espermatozoides de Mamíferos provistos por la cátedra. Analizar la preparación y esquematizar detalladamente los flagelos.

Biología Celular y Molecular

37

3. Observar preparados permanentes de corte transversal de tráquea. Esquematizar las células ciliadas. 4. Observar células en división mitótica de Allium cepa con y sin pretratamiento. Analizar y esquematizar las células.

Observación de elementos del citoesqueleto en microfotografías electrónicas Actividades: En la presente clase se observarán microfotografías electrónicas de distintos organelos y de componentes del citoesqueleto. En las mismas se deberá identificar el componente del citoesqueleto de que se trata e indicar las diferentes partes que lo componen. 5. Microfotografía electrónica de un corte transversal de la cola de un espermatozoide humano.

6. Centríolos.

Biología Celular y Molecular

38

7. Microfotografía electrónica de cilios, en cortes longitudinal y transversal y del cuerpo basal.

Contestar el siguiente cuestionario: 1. ¿En qué fases del ciclo celular encontramos mayor cantidad de tubulina polimerizada? 2. ¿En qué etapa de la división de una célula animal, y de qué manera, se organiza el huso mitótico? Compare con lo que ocurre en células vegetales. 3. ¿Qué función de la actividad celular se vería alterada por la acción de la colchicina? 4. Señale las principales diferencias entre un cilio y un flagelo a través del siguiente cuadro: Cilios

Flagelos

Cantidad Longitud Diámetro Forma de movimiento Ejemplos Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1994. Biología molecular de la célula. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona, España. Avers, C. J. 1991. Biología Celular. Ed. Iberoamérica, México. Cooper, G. M. 2002. La Célula. 2° Edición. Ed. Marbán, España. De Robertis, M. F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. 12º edición. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Karp, G. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México. Lodish, H., A. Berk, S.L Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4ª ed. Ed. Panamericana. España.

Biología Celular y Molecular

39

Trabajo Práctico Nº 9 ORGANELOS CITOPLASMÁTICOS La mayor parte de las células eucariotas contienen abundantes membranas internas que cierran compartimentos específicos, las organelas, y los separa del resto del citoplasma, la región de la célula que está por fuera del núcleo. Casi todas las organelas están rodeadas por una única membrana fosfolipídica, pero varias de ellas, entre ellas el núcleo, están encerradas por dos membranas. Cada tipo de organela desempeña una función singular en el crecimiento y metabolismo de la célula, y cada una contiene un conjunto de enzimas específicas que catalizan las reacciones químicas requeridas. Las membranas que definen estos compartimentos subcelulares controlan su composición iónica interna, de manera que estas suelen ser diferente a la del citosol y a las otras organelas. Objetivos:  Conocer la morfología de los organelos membranosos presentes en eucariotas.  Relacionar la morfología con la fisiología de dichos organelos.  Reconocer el tipo de célula en que se encuentran presentes los organelos. Materiales:     

Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.). Pinzas de disección Portaobjetos y cubreobjetos. Gotero Hoja de afeitar o bisturí

Actividades: Durante la clase práctica se efectuará la observación de diferentes tipos de organelos citoplasmáticos. Pare ello se realizarán preparaciones para microscopio óptico que serán examinadas detenidamente. En todos los casos se deberán esquematizar las células con cada organelo observado indicando sus respectivas referencias. Una vez finalizado el trabajo práctico, se deberán entregar los dibujos realizados. 1. Cloroplastos La observación de cloroplastos se efectuará en hojas de Vallisneria, para lo cual se deberá seguir procedimiento que se detalla a continuación: 1. Tomar una hoja de la planta y cortarla mediante un bisturí. 2. Colocar el fragmento sobre un portaobjetos. 3. Agregar una gota de agua y colocar encima un cubreobjetos. 4. Observar en el microscopio, primero con el menor aumento y luego pasar a 40x. 5. Examinar detenidamente, esquematizar las células con cada organelo e indicar las respectivas referencias. En las células se podrá observar, la pared celular, los cloroplastos, que rodea la zona de las vacuolas. El núcleo no se observa con facilidad debido a su transparencia y a la abundancia de cloroplastos que lo enmascaran. 2. Núcleo y nucleolo Para la visualización de núcleos y nucleolos se emplearán células de la epidermis

Biología Celular y Molecular

40

interna de la túnica reservante de Allium cepa (Liliaceae) o sea la cebolla. El procedimiento a realizar es el siguiente: 1. Tomar un trozo de túnica reservante con una pinza de puntas finas y arrancar de la cara cóncava una parte de la epidermis. 2. Colocar la epidermis sobre un portaobjetos. 3. Agregar una gota de safranina. 4. Colocar el cubreobjetos y observar en el microscopio. 5. Examinar detenidamente, esquematizar las células con cada organelo e indicar las respectivas referencias. Con menor aumento podrá observar la forma de las células, con mayor aumento podrá ver el núcleo coloreado de rojo y uno o más nucleolos. En el citoplasma podrá observar inclusiones lipídicas, que se presentan como gránulos refringentes. Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1994. Biología molecular de la célula. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona, España. Cooper, G. M. 2002. La Célula. 2° Edición. Ed. Marbán, España. Karp, G. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México. Lodish, H., A. Berk, S.L Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4ª ed. Ed. Panamericana. España.

Biología Celular y Molecular

41

Trabajo Práctico Nº 10 ESTRUCTURA DE ORGANELOS MEMBRANOSOS La célula eucariótica tiene un alto grado de organización estructural. Una vasta red membranosa de túbulos, vesículas y sacos aplanados subdivide al citoplasma en dos compartimentos fundamentales: uno comprendido dentro de las membranas y el otro situado por fuera de ellas (matriz citoplasmática o citosol). Las membranas internas proporcionan a las células un soporte para la localización ordenada de múltiples sistemas enzimáticos diferentes y de subcompartimientos funcionales cerrados (organelas), cada uno de ellos con estructura, dotación enzimática y propiedades funcionales que lo caracterizan, tales como: a) separación y asociación de sistemas enzimáticos, b) digestión intracelular de sustancias, c) distribución de las diferentes proteínas hacia sus destinos finales, d) regulación de potenciales de membrana de gradientes iónicos y de diferentes valores de pH intracelular, etc. Objetivos:  Entender las funciones de los organelos citoplasmáticos membranosos y no membranosos.  Conocer la estructura de los diferentes organelos.  Relacionar la morfología y fisiología de dichos organelos con el tipo de célula en que se encuentran presentes. Actividades: 1. Se deberán observar detenidamente las ilustraciones y fotografías que se encuentran a continuación. 2. En cada caso se deberá indicar el organelo citoplasmático de que se trata. 3. Posteriormente se colocarán las respectivas referencias. 4. Describir la función de cada uno de los organelos dentro de la célula. a-

Biología Celular y Molecular

42

Cuestionario: 1. ¿Cuáles son los organelos membranosos que puede tener una célula eucariota?. 2. ¿Qué organelos no forman parte del sistema de endomembranas? ¿Qué actividades desempeñan dichos organelos?. 3. Las mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas están rodeados por membrana ¿Por qué no se los considera parte del sistema de endomembranas?. Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. De Robertis, E.M.F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Esau, K.1982. Anatomía de las plantas con semillas. Ed. Hemisferio Sur S. A. Lodish, H., A. Berk, S. L. Zipursky, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. Selosse, M. A. & S. Loiseaux-de Goër. 1997. La saga de la endosimbiosis. Mundo Científico 179: 436-441. Strasburger, E., 1986. Tratado de Botánica.8va. ed. Ed. Omega S. A. Villee, C. A. 1996. Biología. 8º Edición. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México.

Biología Celular y Molecular

43

Trabajo Práctico: Nº 11 CÉLULA VEGETAL Las células vegetales poseen, típicamente, una pare celular semi-rígida y el protoplasto. El protoplasto incluye el citoplasma y el núcleo. La matriz citoplasmática está frecuentemente en movimiento, fenómeno que se denomina flujo citoplasmático o ciclosis. Una de las características mas sobresalientes de las células vegetales es la presencia de una pared celular, la cual tiene diversas funciones. La pared celular protege los contenidos de la célula, da rigidez a la estructura celular, provee un medio poroso para la circulación y distribución de agua, minerales, y otras pequeñas moléculas nutrientes; además de contener moléculas especializadas que regulan el crecimiento de la planta y la protegen de las enfermedades. De afuera hacia dentro de la célula presenta varias capas que se desarrollan con la maduración celular: la laminilla media, la pared primaria y la pared secundaria. En la pared primaria es dominante la matriz amorfa, formada por hemicelulosas y polisacáridos no celulósicos. En la pared secundaria domina la fase fibrilar (celulosa, 60%) y la matriz amorfa está formada por hemicelulosas y lignina (30%). Las comunicaciones intercelulares como los plasmodesmos, puntuaciones y perforaciones permiten que los protoplastos de las células vegetales puedan intercambiar material y funcionar de forma armónica. Las células vegetales también se caracterizan por la presencia de vacuolas en el citoplasma, las que tiene el importante papel de la rigidez tisular, la degradación de macromoléculas y el reciclaje de sus componentes dentro de la célula. En una célula adulta las vacuolas ocupan casi todo el interior de la célula limitando el protoplasma a una delgada capa parietal. La membrana que limita la vacuola, el tonoplasto es selectivamente permeable, e interviene especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y en el crecimiento. El contenido de la vacuola es el jugo celular y está constituido por agua y una variedad de compuestos orgánicos e inorgánicos. Las vacuolas actúan también como lisosomas, orgánulos digestivos capaces de descomponer y reciclar los componentes de orgánulos innecesarios. Las sustancias ergásticas son productos del metabolismo celular, de reserva o de desecho, que se acumulan en la pared celular, en las vacuolas o en plástidos como hidratos de carbono o cristales. Los plastos (cloroplastos, cromoplastos y leucoplastos) están rodeados por una envoltura formada por dos unidades de membrana y se clasifican según los tipos de pigmentos que contiene. Objetivos:   

Reconocer la célula como unidad estructural de los tejidos vegetales. Identificar las partes constitutivas y los orgánulos que componen la célula vegetal. Reconocer las estructuras en que se acumulan sustancias ergásticas en la célula vegetal.

Actividades: 1- Observar, analizar y dibujar: a) Puntuaciones areoladas en corte longitudinal o tangencial de rama joven de pino (Pinus sp.). b) Esclereidas (braquiesclereidas) en extendido de parénquima de fruto de pera (Pyrus communis)

Biología Celular y Molecular

44

c) Cristales de oxalato de calcio (drusas y rafidios) en corte transversal de pecíolo de sandalia de pescador (Philodendron sp.). d) Idioblatos con cistolito de Carbonato de Calcio en corte transversal de hojas de gomero (Ficus elastica) e) Cromoplastos en células de la pared del fruto (pericarpo) de Capsicum annuum (pimiento). Las células que observará son poliédricas con paredes celulares delgadas. En el citoplasma podrá observar cromoplastos ahusados o esféricos de color rojo vivo o amarillo. f) Leucoplastos en tubérculos de Solanum tuberosum (papa). 2- Responder el siguiente cuestionario: a) ¿Cuáles son las principales diferencias entre las células animales y las vegetales? b) Marque el los siguientes esquemas las paredes celulares de las plantas. c) ¿Qué características de la estructura del cloroplasto son especialmente importantes para la fotosíntesis? 3.- Colocar las referencias a)- Porción de pared entre dos células

b)- Plasmodesmos

c) Puntuaciones

Biología Celular y Molecular

45

d) Perforaciones

Bibliografía: De Robertis, M. F., J Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. 12º edición. Ed . El Ateneo, Buenos Aires. Esau, K. 1976. Anatomía Vegetal. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. Karp, G. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed McGraw-Hill Interamericana, México. Raven, P. H., Evert, R. F. & Einchhorn, S. E. 1992. Biología de las Plantas. Ed. Reverté S.A., Barcelona. Strasburger, E., Noll, F. Schench, H. & Schimper, A. F. W. 1994. Tratado de Botánica. 2º ed. Ed. Omega. Zarlavski, G. E. 2014. Histología Vegetal técnicas simples y complejas. 1º edición. Ed. Sociedad Argentina de Botánica SAB, Buenos Aires, Argentina.

Biología Celular y Molecular

46

Trabajo Práctico Nº 12 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS El término cromosoma (del griego chromo = color y soma = cuerpo) es utilizado para referirse a los filamentos del núcleo que se tiñen con colorantes básicos y que son los portadores de los genes. Actualmente se lo define como una molécula de ADN asociado a proteínas, que porta información genética dispuesta en secuencia lineal. En el caso de los procariotas solamente hay un cromosoma circular, mientras que en los eucariotas hay varios cromosomas lineales, cada uno compuesto siempre por una sola cadena de ADN. Antes de la división celular cada cromosoma eucariótico se encuentra formado por dos cromátidas hermanas genéticamente idénticas ya que una es la copa exacta de la otra. Cada cromátida se encuentra formada por una única hebra de ADN que se extiende desde un extremo a otro del cromosoma. Cada uno de estos extremos se denomina telómero. El punto en que se encuentran unidas las dos cromátidas hermanas es la constricción primaria o centrómero. El centrómero contiene una región especial llamada cinetocoro que es la que se une a las fibras del huso acromático durante la división celular. Algunos cromosomas suelen presentar una constricción secundaria también llamada región organizadora de nucleolos (NOR) debido a que es donde se encuentran los genes que sintetizan el ARNr. La posición de la constricción secundaria determina la existencia de un satélite que es la parte distal del brazo que lleva la constricción secundaria. El centrómero divide al cromosoma en dos brazos cromosómicos y determina la forma del cromosoma.

Objetivos:  Comprender la estructura de los cromosomas.  Conocer las diferentes formas de cromosomas. Materiales:  Lápiz negro y goma Hojas blancas Actividades: Se proveerá a los alumnos de preparados permanentes de cromosomas mitóticos de diferentes organismos. A partir de los mismos, deberán realizar las siguientes actividades:

Biología Celular y Molecular

47

1. Determinar el número de cromosomas característico de la especie analizada. 2. Esquematizar una metafase mitótica de cada preparado observado. 3. Según la morfología de los cromosomas, determinar los distintos tipos que presenta cada especie. Bibliografía: Gardner, E.J., M.J. Simmons & D.P. Snustad. 1998. Principios de Genética. 4ª. ed. Ed. Limusa Wiley. México. Lacadena, J.R. 1988. Genética. 4º edición. Ed. Agesa, Madrid. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona.

Biología Celular y Molecular

48

Trabajo Práctico Nº 13 CARIOTIPO La representación gráfica o fotográfica de los cromosomas somáticos característicos de una especie determinada se conoce como cariotipo. A través de este se puede establecer el número, tamaño y forma de los cromosomas, e identificar los miembros de cada par de cromosomas homólogos. Muchas especies poseen cromosomas bastante semejantes en su morfología, por lo que se utilizan técnicas de bandeo cromosómico para posibilitar la distinción de los cromosomas del mismo tamaño e identificar los homólogos. El cariotipo se determina a partir de los cromosomas que están en metafase mitótica, cada uno de los cuales está formado por dos cromátidas hermanas unidas a la altura de sus centrómeros. El conocimiento del cariotipo de una especie posibilita la detección de ciertas enfermedades genéticas que son causadas por anormalidades en el número o en la estructura de los cromosomas. Rhodolirium speciosum (Amaryllidaceae)

Placa metafásica

Cariotipo

Idiograma

Biología Celular y Molecular

49

Objetivos:  Comprender la importancia del cariotipo.  Conocer los pasos para la realización de un cariotipo.

Materiales:     

Lápiz negro y goma Hojas blancas lisas Regla milimetrada Tijera Goma de pegar

Actividades: Se proveerá a los alumnos de fotografías de células vegetales en metafase mitótica, a partir de las cuales se confeccionará el cariotipo. El primer lugar se les deberá asignar un número arbitrario a cada cromosoma y se medirá el brazo corto y el largo total de cada uno, calculando el correspondiente índice centromérico (brazo corto x 100 / largo total del cromosoma). Luego se formarán los pares de cromosomas de acuerdo a los parámetros obtenidos anteriormente; se recortará cada cromosoma y de construirá el cariotipo. Para ello se colocarán en primer término los cromosomas m, luego los sm, los st, los ac y por último los t. Dentro de cada grupo, serán ordenados de acuerdo a su tamaño, en forma decreciente (de mayor a menor). Una vez finalizado el trabajo práctico se deberá entregar los cariogramas realizados, incluyendo las medidas de los pares de cromosomas de cada especie y las respuestas de las preguntas que se detallan a continuación. 1. ¿Qué se representa a través del cariotipo? 2. Indique los pasos para la realización de un cariotipo. 3. ¿En que etapa de la mitosis se encuentran los cromosomas observados en el cariotipo y como se los observa? Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. Curtis, H. & N. S. Barnes. 1993. Biología. 5º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. De Robertis, E.M.F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Lacadena, J. R. 1988. Genética. Ed. Agesa, Madrid. Lodish, H., A. Berk, S. L. Zipursky, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. Villee, C. A. 1996. Biología. 8º Edición. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México.

Biología Celular y Molecular

50

Trabajo Práctico Nº 14 ETAPAS DEL CICLO CELULAR El ciclo celular comprende todas las etapas que experimentan las células durante su proceso vital, es decir, proliferación, (eventualmente reposo proliferativo), diferenciación, envejecimiento y muerte celular. Todas estas etapas están finamente reguladas. Durante el ciclo proliferativo (en ocasiones se usa como sinónimo de ciclo celular) la célula replica su DNA y se divide, con lapsos de tiempo entre estas dos etapas, de tal manera que este proceso se puede dividir en 4 fases: Fase S (síntesis de DNA), G1 (lapso entre la división celular y la fase S), G2 (lapso entre la fase S y la división siguiente) y M (mitosis y citocinesis). En ocasiones y dependiendo del tipo celular y las condiciones del entorno, una célula puede salir del ciclo proliferativo, sin necesariamente seguir el camino de la diferenciación. Este período de tiempo se denomina G0 y se dice que la célula está en reposo proliferativo. La salida del ciclo proliferativo ocurre normalmente en G1. En el control del ciclo proliferativo participan un conjunto de proteínas kinasas que son reguladas a su vez por otras proteínas denominadas ciclinas. Luego que el DNA se replica, se activan mecanismos de revisión del material genético que detectan y reparan posibles fallas en el DNA, para proceder a la división celular. Otros puntos de control importantes (check points) están en G1 y la mitosis. La entrada en mitosis está finamente controlada por un complejo proteico denominado MPF (factor promotor de la mitosis). Este complejo consiste en una proteína denominada ciclina B y una enzima kinasa denominada cdk2 y está regulado por fosforilaciones y desfosforilaciones de manera tal que se activa dando inicio la mitosis y se inactiva (por degradación de la ciclina) al término de ésta. Un complejo similar regula la entrada en fase S y el proceso en su conjunto está controlado por señales extracelulares denominadas, en general, factores de crecimiento. Los organismos pluricelulares forman su cuerpo mediante divisiones celulares sucesivas, a partir de una sola célula original, el cigoto, el cual porta dos dotaciones cromosómicas, una derivada del padre y otra de la madre. El fenómeno de la división celular es denominado mitosis y se la divide convencionalmente en cuatro fases diferentes, aunque los acontecimientos que se suceden ocurren en forma continua. Las etapas se denominan: profase, metafase, anafase y telofase. Durante la mitosis ocurren una serie de cambios característicos dentro de la célula y especialmente en los cromosomas. Estos comienzan a contraerse por condensación de la cromatina, hasta llegar a individualizarse (profase a metafase), luego se ordenan en la placa ecuatorial (metafase), separan sus cromátidas y migran a polos opuestos (anafase); por último se reconstituye la membrana nuclear alrededor de cada polo (telofase). La célula finalmente se divide por invaginación de la membrana citoplasmática en el caso de los animales, o por formación de un tabique en las células vegetales. Objetivos:     

Analizar las etapas del ciclo celular y sus relaciones. Distinguir las distintas fases de la mitosis. Interpretar el mecanismo de distribución de los cromosomas durante la división mitótica. Observar el efecto de las sustancias químicas sobre la proliferación celular. Establecer la duración comparativa de las diferentes etapas de la mitosis.

Materiales:  Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.)  Calculadora

Biología Celular y Molecular

51

Observaciones: Se deberán observar los preparados de mitosis provistos por la cátedra y diferenciar los distintos estadios de la mitosis. Se deberá poner especial énfasis en los fenómenos que ocurren en cada fase de la división mitótica. Una vez finalizado el trabajo práctico, se deberán entregar los dibujos realizados, junto con las respuestas que se detallan a continuación. Actividades: 1. Identificar y dibujar por separado cada estadio del ciclo celular en especial la mitosis observado en el microscopio óptico. 2. Indicar cuantos cromosomas se pueden distinguir en el material estudiado. 3. ¿En qué fase resulta más fácil el recuento de los cromosomas? 4. ¿Cuáles son las diferencias entre los preparados con pretratamiento y sin pretratamiento? 5. Determinar la proporción de células en interfase y en división celular y la proporción de células en cada fase de la mitosis. Para ello, elegir al azar varios campos de la preparación y contar entre 200 células la cantidad de éstas que se encuentran en: interfase, profase, metafase, anafase y telofase. Con los datos obtenidos, se deberá calcular el Indice Mitótico (IM), que es la razón entre el número de células que se encuentran en división y el número total de células observadas, multiplicado por 100. IM = Nº cél. en división x 100 = Nº de cél. observadas 6 También se deberá calcular el Indice de Fases (IF), que es la razón entre la cantidad de células en cada fase y el número total de células en división, multiplicado por 100. IF = Nº cél. en una fase x 100 = Nº de cél. en división Una vez finalizado el trabajo práctico, se deben entregar todos los datos obtenidos y las respuestas que se detallan a continuación. 7. ¿Cuál es el porcentaje de células que se encuentran en división en cada caso? 8. ¿Cuál es la fase más frecuente? 9. ¿Qué proporción de células se observan en cada fase de la mitosis? 10. Dibuje el ciclo celular indicando sus etapas. Bibliografía: Alberts, B., Johnson A., Lewis, J., Raff, M., Keiths, R. y Walter P. 4ta. Edición. 2002. Molecular Biology of the Cell. Garland Science, Taylor and Francis Group, New York. USA. De Robertis, E.M.F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo,

Biología Celular y Molecular

52

Buenos Aires. Gardner, E. 1971. Principios de Genética. Ed. Limusa-Wiley. México. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lacadena, J.R. 1988. Genética. 4º edición. Ed. Agesa, Madrid. Lacadena, J.R. 1996. Citogenética. 1º edición. Ed. Complutense. Madrid. Lodish, H., A. Berk, S. L. Zipursky, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. Strickberger, M. W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. Villee, C. A. 1996. Biología. 8º Edición. Ed. McGraw-Hill Interamericana, México.

Biología Celular y Molecular

53

Trabajo Práctico Nº 15 MEIOSIS La meiosis es un tipo especial de división celular que ocurre en los organismos superiores durante la formación de las gametas. La palabra “meiosis” significa reducción o disminución, debido a que su función es la reducción del número de cromosomas a la mitad. En la meiosis ocurren una serie de fenómenos característicos y particulares: la disminución del número cromosómico a la mitad, el apareamiento y recombinación entre cromosomas homólogos y la distribución al azar de los cromosomas a las células hijas.

Objetivos:     

Reconocer las distintas fases de la división meiótica. Observar el apareamiento de los cromosomas homólogos. Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meióticos. Esquematizar todas las etapas de la división meiótica. Establecer las diferencias entre los dos ciclos celulares.

Materiales:         

Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.) Agujas Mechero Botones florales Tubos de ensayo Portaobjetos y cubreobjetos Alcohol Ácido acético Orceína acética

Biología Celular y Molecular

54

Actividades: 1. Se eligen botones florales todavía en un estado de desarrollo incipiente, antes de que se llegue a abrir la flor. 2. Para interrumpir la meiosis se deben fijar las células, para ello se sumergen en tubos de ensayo con una mezclas de seis partes de etanol, tres partes de ácido acético y una parte de cloroformo (fijador Carnoy), es este estado se puede conservar el material de estudio durante meses e incluso años. (Es preferible mantenerlo en frío). La otra mezcla que se puede utilizar es la de Farmer (3 de alcohol etílico absoluto y 1 de ácido acético). 3. Lavar el material de estudio con agua y diseccionar el botón para extraer las anteras. 4. Colocar varias anteras directamente en un portaobjetos para abrirlas y proceder a teñir con orceína acética o ácido acético. Presionar las anteras con aguja histológica para la salida de las células madres de los granos de polen. Esparcir las células y desechar el resto de la antera. Dejar actuar el colorante y luego colocar el cubreobjetos. Con la punta de un lápiz con goma presionar suavemente para aplastar las células. Flamear el preparado 2 o 3 veces evitando la ebullición del líquido. Con un papel de filtro retirar el excedente y luego realizar suavemente un aplastado con el dedo pulgar. 5. Observar al microscopio, para ver con nitidez en qué fase de la división celular se encuentra será necesario utilizar el objetivo de inmersión. 6. Esquematizar cada una de las etapas de la meiosis observada. 2. Indicar cuantos bivalentes se observan durante diacinesis y metafase I en el material estudiado. 3. Calcular cuantas células y con cuantos cromosomas se obtendrán al final de la meiosis del material estudiado.

Una vez finalizado el trabajo práctico, se deberán entregar los dibujos de meiosis realizados. Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. De Robertis, E.M.F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lacadena, J.R. 1988. Genética. 4º edición. Ed. Agesa, Madrid. Lacadena, J.R. 1996. Citogenética. 1º edición. Ed. Complutense. Madrid. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. Zarlavski, G. E. 2014. Histología Vegetal técnicas simples y complejas. 1º edición. Ed. Sociedad Argentina de Botánica SAB, Buenos Aires, Argentina.

Biología Celular y Molecular

55

Trabajo Práctico Nº 16 GAMETOGÉNESIS En los animales la reproducción ocurre mediante la formación de gametos haploides que se unen en el proceso de fecundación formando un cigoto diploide. El proceso de fecundación puede ser externo o interno. En la fecundación externa, como ocurre en los anfibios y peces, los gametos son liberados al exterior y allí se ponen en contacto. En la fecundación interna se produce la unión de los gametos dentro del tracto genital femenino. La fecundación interna constituye una adaptación a la vida terrestre presente en muchos animales, principalmente los vertebrados superiores. Tanto en la fecundación externa como la interna, se distinguen dos tipos de gametos, el gameto masculino o espermatozoide que es móvil y de tamaño pequeño, y el gameto femenino llamado óvulo que tiene mayor tamaño y es inmóvil. La gametogénesis es el proceso por el cual se producen los gametos masculinos y femeninos. La gametogénesis incluye a la meiosis y la diferenciación de las células resultantes en óvulos y espermatozoides. Los óvulos animales se caracterizan por acumular nutrientes para el posterior desarrollo del embrión, mientras que los espermatozoides generalmente desarrollan un flagelo que le permite moverse y fecundar al óvulo. Objetivos:  Reconocer las distintas fases de la gametogénesis.  Visualizar diferentes estadios de la espermiogénesis.  Esquematizar todas las etapas de la espermatogénesis. Materiales:  Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.) Actividades: 1. Se realizará la observación de preparados meióticos provistos por la cátedra y dibujarán los estadios de la espermatogénesis. 2. Indicar en el siguiente diagrama los diferentes estadios de la ovogénesis y espermatogénesis.

Biología Celular y Molecular

56

Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. De Robertis, E.M.F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lodish, H., A. Berk, S. L. Zipursky, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires.

Biología Celular y Molecular

57

Trabajo Práctico Nº 17 ACCIÓN GÉNICA: SÍNTESIS DE ARNr Además de la constricción primaria o centrómero, algunos cromosomas suelen presentar una constricción secundaria conocida como “Región Organizadora Nucleolar” (NOR). Mediante las técnicas citológicas convencionales, esta región aparece como una zona heteropicnótica negativa (sin teñir) ubicada generalmente en posición subterminal en el brazo del cromosoma, denominándose satélite a la parte distal del brazo. Por la presencia de dicho satélite, a los cromosomas que llevan la región NOR se los denomina también cromosomas SAT o satelitados. En las regiones NOR se encuentran los genes que codifican el ARN ribosómico (ARNr), el cual formará parte de los ribosomas. Estos genes ribosómicos se hallan reunidos en “clusters” o grupos que contienen numerosas copias y forman la región NOR. La cantidad de copias de los genes ribosómicos presentes en el genoma varía entre diferentes organismos. Por ejemplo en la bacteria Escherichia coli hay de 5 a 10 copias, en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster hay unas 130 copias y en el anfibio Xenopus laevis alrededor de 400 o 500 copias por genoma haploide. Las regiones organizadoras de nucléolo, que portan los genes ribosómicos, pueden detectarse mediante la tinción con nitrato de plata (NO3Ag). Una particularidad importante de la tinción con plata o tinción argéntica, es que solamente se tiñen los NORs que estuvieron activos durante la interfase anterior. Ello significa que, la tinción argéntica puede ser usada para analizar la actividad génica en las regiones organizadoras de nucléolo. Objetivos:  Comprender las características y fundamentos de la tinción argéntica.  Identificar los genes que sintetizan el ARNr mediante la tinción argéntica.  Observar la estructura de los nucleolos. Materiales:  Elementos para dibujar (hojas blancas, lápices, etc.) Actividades: En el desarrollo del trabajo práctico se observarán preparaciones de cromosomas en mitosis, teñidas mediante la técnica de impregnación con nitrato de plata o tinción argéntica. Se deberán esquematizar células en interfase con el/los nucleolos y además metafases en dónde se observen los cromosomas portadores de los genes ribosómicos o regiones NOR. Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. De Robertis, E.M.F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lodish, H., A. Berk, S. L. Zipursky, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires.

Biología Celular y Molecular

58

Trabajo Práctico Nº 18 CÓDIGO GENÉTICO Las reacciones que ocurren en los organismos vivos están siempre mediadas por enzimas, las cuales son proteínas. Una proteína es un polímero de subunidades menores (monómeros) llamados aminoácidos. Cada enzima consiste de un determinado número de aminoácidos, unidos en una secuencia específica. En las proteínas naturales se observan un total de 20 aminoácidos, que de acuerdo a como se ordenen, formarán los diferentes tipos de proteínas. El molde para formar las proteínas esta codificado en la cadena de ADN. Cada aminoácido es codificado por 3 nucleótidos, los cuales constituyen un codón. Debido a que existen cuatro bases diferentes (A, T, C, G) el número posible de combinaciones y por ende de aminoácidos sería 43=64. Como los aminoácidos son solamente 20, se deduce que existe más de un codón para la mayoría de los aminoácidos. La información del ADN es transcripta primeramente a ARNm, utilizando al primero como molde. El mensajero pasa del núcleo al citoplasma, donde ocurrirá la síntesis proteica. La lectura del mensajero es mediada por otro tipo de ARN, llamado ARN de transferencia (ARNt), que posee una secuencia complementaria a cada codón, llamada anticodón. Debido a que cada codón posee una secuencia específica, existen tantos ARNt como aminoácidos.

Objetivos:  Asimilar los conceptos de transcripción y traducción.  Comprender la naturaleza y características del código genético.  Entender el mecanismo por el cual se transmite la información del ADN hasta las proteínas. Materiales:  Elementos de dibujo (hojas blancas, lápices, etc.)  Fibras de diferentes colores  Un libro de texto de Genética general Actividades: A partir de la secuencia hipotética de ADN entregada por la Cátedra, los alumnos deberán transcribir el ARN mensajero correspondiente. Suponiendo que este no posee intrones, se deberá formar un polipéptido valiéndose de una tabla con los codones que

Biología Celular y Molecular

59

codifican cada tipo aminoácido. Se deberá tener en cuenta que la lectura se realiza en dirección 5’-3’ y que el codón de inicio es siempre AUG.

Resultados: Se deberá detallar mediante un esquema el ARN mensajero resultante. También se deberá especificar e ilustrar a que aminoácidos corresponden los codones, utilizando un color diferente para cada uno de ellos. Por último, mediante un esquema se detallará la cadena polipeptídica resultante. Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. De Robertis, E.M.F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lodish, H., A. Berk, S. L. Zipursky, D. Baltimore & J. Darnell. 2002. Biología Celular y Molecular. 4º edición. Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires.

Biología Celular y Molecular

60

Trabajo Práctico Nº 19 EXTRACCIÓN DE ADN VEGETAL En la literatura se han descripto varios procedimientos de extracción de ADN de tejidos vegetales; los cuales varían dependiendo de la clase del material que se quiere analizar (especie vegetal) y la calidad del mismo (tejido fresco, liofilizado, etc.). Sin embargo, los protocolos utilizados son básicamente similares y se caracterizan por utilizar un detergente catiónico (CTAB: cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide o SDS: sodium dodecyl sulfate) en el buffer de extracción. Cuando se trabaja con un gran número de plantas, como es el caso de los bancos de germoplasma, se requiere un método rápido y eficiente de extracción que permita obtener ADN de alta calidad. La metodología de extracción de ADN es rápida, sencilla y permite la obtención de ADN genómico de buena calidad, libre de compuestos secundarios, proteínas y polifenoles que coprecipitan con el ADN, los cuales inhiben la reacción de amplificación de ADN. Estos protocolos involucran varias etapas básicas que se describen a continuación. Objetivos:  Conocer los fundamentos de la extracción y purificación de ADN.  Reconocer los pasos indispensables para la extracción de ADN en un protocolo.  Comprender y analizar cada una de las etapas. Materiales:  Elementos de dibujo (hojas blancas, lápices, etc.) PROTOCOLO a) Material Fresco: 1) Pulverizar con nitrógeno líquido tejido foliar joven recién cortado. 2) Agregar 1,5 ml de buffer de extracción: El buffer de extracción consiste en 1ml de CTAB II, 400 ul de Cloroformo – alcohol isoamilico y 20 ml de 2-mercaptoetanol. 3) Trasvasar el contenido a un tubo eppendorf de 1,5 o 2 ml, e incubar por 10 minutos a 55ºC, agitando cada 3 minutos. (Mucho cuidado en esta operación ya que el cloroformo a esta temperatura produce gases que tienden a abrir las tapas de los tubitos) 4) Centrifugar por 10 minutos a máxima revolución 5) Recuperar el sobrenadante, con mucho cuidado de no tocar el pellet. 6) Agregar 1,2 volúmenes de isopropanol mezclar suavemente y centrifugar 7) Descartar el sobrenadante, con mucho cuidado de no generar reflujo en el tubo a fin de no re-suspender el pellet y perderlo. 8) Realizar 2 lavados con etanol (1ml) descartar el sobrenadante, y dejar secar. 9) Homogeneizar en Agua bidestilada y agregar 2 µl de RNasa. b) Material en Sílica - Gel: En general es lo mismo que en material fresco, con la excepción de que no es necesario el nitrógeno líquido para pulverizar el tejido foliar.

Biología Celular y Molecular

61

Responder: 1- ¿Cuál es la diferencia entre ADN genómico y ADN cromosómico? 2- ¿Qué son las nucleasas? 3- Describa cuál es el objetivo de cada una de las siguientes etapas: a- Extracción de ácidos nucleicos b- Purificación de los ácidos nucleicos Bibliografía: Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J. D. Watson. 1989. Molecular biology of the Cell. 2º edición. Ed. Garland Publ. Inc., New York. Ferreira, M. E. & D. Grattapaglia. 1998. Introducción al Uso de Marcadores Moleculares en el Análisis Genético. 1 ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGE. Pp. 220. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York.