UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA APLICADA
TESIS DOCTORAL
LIPIDOS BIOACTIVOS EN PRODUCTOS LÁCTEOS: ESTRATEGIAS PARA SU INCREMENTO Y EFECTOS DEL PROCESADO Y LA CONSERVACIÓN.
LUIS MIGUEL RODRÍGUEZ ALCALÁ
MADRID, 2009
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA APLICADA
TESIS DOCTORAL
LÍPIDOS BIOACTIVOS EN PRODUCTOS LÁCTEOS: ESTRATEGIAS PARA SU INCREMENTO Y EFECTOS DEL PROCESADO Y LA CONSERVACIÓN.
LUIS MIGUEL RODRÍGUEZ ALCALÁ
MADRID, 2009
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA APLICADA SECCIÓN DEPARTAMENTAL DE CIENCIAS DE LA ALIMENTACIÓN
LÍPIDOS BIOACTIVOS EN PRODUCTOS LÁCTEOS: ESTRATEGIAS PARA SU INCREMENTO Y EFECTOS DEL PROCESADO Y LA CONSERVACIÓN.
Memoria presentada por LUIS MIGUEL RODRÍGUEZ ALCALÁ Para optar al grado de Doctor en Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Dirección: Dr. Fco. Javier Fontecha Alonso. Instituto del Frío (CSIC)
FRANCISCO JAVIER FONTECHA ALONSO, DOCTOR EN CIENCIAS QUÍMICAS E INVESTIGADOR CIENTÍFICO DEL INSTUTO DEL FRÍO DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
CERTIFICA:
Que el trabajo titulado: “LIPIDOS BIOACTIVOS EN PRODUCTOS LACTEOS: ESTRATEGIAS PARA SU INCREMENTO Y EFECTOS DEL PROCESADO Y LA CONSERVACION”, que constituye la Memoria de la que es autor Luis Miguel Rodríguez Alcalá, ha sido realizada en el Instituto del Frío del C.S.I.C. bajo mi dirección y cumple las condiciones exigidas para optar al grado de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid y, por tanto, autorizo su presentación.
Y para que conste a los efectos oportunos, firmo el presente Certificado en Madrid a 16 de Noviembre de 2009
Francisco Javier Fontecha Alonso
Este trabajo ha sido relaizado con la finaciación aportada por el Ministerio de ciencia y tecnología al proyecto de investigación:
Trazabilidad de compuestos saludables y no saludables de la fraccion lipidica
de
productos
lacteos
durante
procesos
tecnológicos
convencionales y alternativos. potencial utilización como indicadores de calidad.
AGL2003-01712
Tantas veces he visto los agradecimientos en las tesis doctorales y ahora me encuentro escribiendo la mía. Y ahora, al volver la vista atrás me doy cuenta de que aunque me esperan más retos y grandes momentos en mi vida, siempre recodaré los años en los que hice el doctorado, por el gran esfuerzo que me ha supuesto, por todas las experiencias que me ha hecho vivir, por todo lo que me ha enseñado y porque de todos lo periodos hasta ahora, este es el que más me ha influenciado. En un tesis aparecen sólo el nombre del doctorando y del director o directores pero es imposible olvidar a toda la gente sin la cual todo este trabajo no hubiera sido posible. Quisiera expresar mi más sincero agradecimiento, Al Ministerio de Ciencia y tecnología por la concesión de una beca predoctoral FPI y al CSIC por haberme permitido desarrollarla en el instituto del Frío. A todo el personal de instituto del Frío, administración, compras, calidad, informática, estadística, biblioteca, conserjería, almacén y los distintos departamentos de productos vegetales, carnes y pescados e ingeniería por la gran calidad humana de sus integrantes. Al Dr Javier Tabera Galvan por la formación que me dio durante mis años en la licenciatura de Tecnología de alimentos en la Univesidad Autónoma y su atención y consejos en los años posteriores. A la Dra. Laura Jaime de Pablo, profesora titular del departamento de quimica física aplicada de la Universidad Autónoma de Madrid por la formación que me dio en la carrera de Ciencia y tecnología de los alimentos y por acceder a ser mi tutora. Al Dr. Atanasio Carrasco por sus conocimientos en el analisis de volátiles. A los investigadores del departamento de productos lácteos, Dr. Miguel Ángel de la fuente., Dr. Fran Morales, Dra Gloria Marquez (por la simpatia y cariño que siempre me ha demostrado y por su ayuda en la comprensión de los fenómenos de oxidación, en los que ella es una gran experta), Dra. Teresa Requena, por lo que me ha enseñado sobre microbiología y a la Dra. Manuela Juarez, que siempre ha tenido palabras motivadoras para mi y me ha demostrado un
gran afecto, que me ha enseñado sobre muchos aspectos ciéntificos y que es un claro ejemplo a seguir, no solo a nivel profesional sino como persona. A mis amigos del instituto del frio: A Maria, Carlos, Miguel Angel, Gonzalo, Ester, Sara, Sanja, Oscar, Francisco Javier, Montse, Raquel, Luz, Irene, Tomás, Elena Peñas, Cristina, Ana, Valle, por tantos buenos momentos. A mis compañeros de despacho Nacho, Sonia, Mayte, Beatriz, Luci, Elena y Sonia Ramos (que siempre será “tesoro nacional” y me siento orgulloso de contar con su amistad). Y no puedo dejar de destacar a quienes he tenido muy cerca en el laboratorio, Rosa, Marta “Dra” Ávila, Mariví, Lola, Lucia, Gema, Maricarmen, Pilar “pila” y Paquita “esto esta a 2 minutos”. Pero esta tesis sería imposible sin Javier Fontecha, mi director de tesis, que confío, apostó y tuvo fé siempre en mi, quién creo que ha conseguido en todo momento hacerme sacar lo mejor, motivándome, que me ha enseñado todo lo que se sobre ciencia y a disfrutar de esta tesis y a quien siempre le guardaré cariño y gratitud y un gran respeto. Sin mi familia, que me ha dado apoyo, alegrías, otros puntos de vista y un “extra” porque siempre he querido no defraudarlos. Gracias Vicky, Javier, Iñigo, Victoria, Manolo, Marga y Samuel. No os haceis una idea de lo importantes que sois. Sin Marcos, al que siento como un hermano, que cada semana me has preguntado que tal iba, por tantas tardes de guitarras, porque tú si que “pones a todos de pié y eres lo más Rock n´Roll de por aquí“ y por volver a hacerme disfrutar con G, Bb y E. Pero el lugar más especial, el papel decisivo, lo han jugado mi madre Pilar y Ligia, Ligia y mi madre Pilar. Sencillamente me habeis dado fuerzas, inspiración, ganas, paciencia, buen juicio, alegría. Sin vosotras nada de esto tendría significado. Sois un patrón a seguir. Os admiro porfundamente.
A mi madre, Pilar, A Ligia A mi familia, todo esto es gracias a vosotros.
Los grandes saltos se consiguen a través de pequeños brincos.
ABREVIATURAS.
LISTA DE ABREVIATURAS AA: ácido araquidónico Ag+-HPLC: cromatografía de líquidos con columnas de plata ligada. CLA: ácido linoleico conjugado CLnA: ácido linolénico conjugado DHA: ácido docosahexanoico ELSD: detector “evaporative light scattering” EPA: ácidos eicosapentanoico FFA: ácidos grasos libres FID: detector de ionización de llama GC: cromatografía de gases LA: ácido linoleico LNA: ácido linolénico LPC: lisofosfatidilserina MFGM: membrana del glóbulo graso de la leche MG: monoglicérido MUFA: ácidos grasos monoinsaturados PA: ácido fosfatídico PC: fosfatidilcolina PE: fosfatidiletanolamina PI: fosfatidilserina PLs: fosfolípidos PS: fosfatidilserina PUFA: ácidos grasos poliinsaturados RA: ácido ruménico SFA: ácidos grasos saturados SP: esfingomielinas TFA: ácidos grasos trans TG: triglicérido TVA: ácido trans vacénico
ABREVIATURAS.
ÍNDICE
ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ---------------------------------------------------------------------------- 1
1.1 LÍPIDOS LÁCTEOS Y SALUD ---------------------------------------------------------- 2 1.2 MEJORA DE LA COMPOSICION DE LA GRASA LACTEA ------------------- 13 1.2.1 Biohidrogenación en el rumen de ácidos grasos poliinsaturados ---------- 13 1.2.2 Bacterias productoras de CLA ------------------------------------------------------ 22 1.2.3 Derivados lácteos suplementados/enriquecidos en PUFA ------------------ 26 1.2.3.1 Derivados lácteos suplementados con CLA ---------------------------------- 27 1.2.3.2 Derivados lácteos de alto contenido en PUFAs ------------------------------ 28 1.2.3.3 Fórmulas infantiles ------------------------------------------------------------------ 30 1.3 PROCESADO Y CONSERVACIÓN DE LACTEOS Y DERIVADOS -------- 32 1.3.1 Efecto del procesado de productos lácteos en los ácidos grasos --------- 32 1.3.1.1 Nuevas tecnologías de procesamiento: Las altas presiones ------------- 36 1.3.2 Efectos de las condiciones y tiempo de conservación en la fracción lipídica de productos lácteos y derivados --------------------------------------------- 38 2. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO ------------------------------------------------- 45 3. RESULTADOS Y DISCUSION --------------------------------------------------------- 51 3.1. Desarrollo, optimización y validación de métodos cromatográficos para el estudio de la fracción lipídica de productos lácteos --------------- 53 3.1.1 Analysis of milk fat, vegetable and fish oil fatty acids using a short time GLC method --------------------------------------------------------------------------------- 55 3.1.2 Major lipid classes separation of buttermilk, and cows, goats and ewes milk by HPLC-ELSD focused on the phospholipid fraction ----------------------- 79 3.2. Estudio de la mejora nutricional del perfil lipídico de la leche mediante la incorporación a la dieta de rumiantes de suplementos ricos en PUFA, o mediante empleo de bacterias lácticas con capacidad para transformar el ácido linoleico en isómeros del ácido linoleico conjugado (CLA) ---------------------------------------------------------------------------------------- 101 3.2.1 Influence of feeding linseed at different levels on fatty acid profile focused on the CLA isomers composition of goat milk ------------------------------------- 103 3.2.2 Quantitative and qualitative determination of CLA produced by Bifidobacterium and LAB combining spectrophotometric and Ag+-HPLC techniques ---------------------------------------------------------------------------------- 134 3.3. Evaluación del efecto de los tratamientos industriales convencionales (pasterización, UHT y esterilización) frente a los no convencionales (microondas, altas presiones y homogenización a alta presión) sobre el perfil lipídico y el contenido en fosfolípidos de leche de vaca, oveja y cabra ---------------------------------------------------------------------------------------- 161 3.3.1 Influence of heat treatments, high pressure and microwave processing of naturally PUFA enriched milk on CLA isomers distribution and trans fatty acids content ------------------------------------------------------------------------------- 163
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ÍNDICE
3.3.2 Fatty acid profile and CLA isomers content of cow, ewe and goat milks processed by high pressure homogenization -------------------------------------- 192 3.3.3 Cow milk processed at very high pressure: effects on the fatty acids and phospholipids composition ------------------------------------------------------------- 198 3.4. Determinación de la posible alteración de la fracción lipídica de fórmulas infantiles en polvo y derivados lácteos de alto contenido en CLA durante su periodo de conservación -------------------------------------- 214 3.4.1 Evolution of the fatty acid composition in Spanish commercial dairy products and infant formula during refrigerated storage ------------------------ 216 3.4.2 Hot Topic: Fatty Acid and Conjugated Linoleic Acid (CLA) Isomer Composition of Commercial CLA-Fortified Dairy Products: Evaluation After Processing and Storage----------------------------------------------------------------- 220 3.4.3 Changes in the Lipid Composition of Powdered Infant Formulas during Long-Term Storage ---------------------------------------------------------------------- 222 4. DISCUSIÓN GENERAL ---------------------------------------------------------------- 231 4.1 Desarrollo, optimización y validación de métodos cromatográficos para el estudio de la fracción lipídica de productos lácteos ------------- 232 4.1.1 Optimización de un método rápido por cromatografía de gases para el análisis rutinario de la composición en ácidos grasos de grasas y aceites alimentarios -------------------------------------------------------------------------------- 232 4.1.2 Validación de un método de análisis mediante HPLC-ELSD, de las distintas clases lipídicas presentes en grasa láctea, con especial interés en la fracción de fosfolípidos ------------------------------------------------------------------ 236 4.2 Estudio de la mejora nutricional del perfil lipídico de la leche mediante la incorporación a la dieta de rumiantes de suplementos ricos en PUFA, o mediante empleo de bacterias lácticas con capacidad para transformar el ácido linoleico en isómeros del ácido linoleico conjugado (CLA) ---------------------------------------------------------------------------------------- 239 4.2.1 Efectos de la suplementación de la dieta de cabras con semillas de lino en la composición de la grasa de la leche ------------------------------------------ 241 4.2.2 Estudio de la capacidad de bacterias lácticas y bifidobacterias para la transformación de ácido linoleico en isómeros del ácido linoleico conjugado (CLA)------------------------------------------------------------------------------------------- 74 4.3 Evaluación del efecto de los tratamientos industriales convencionales (pasterización, UHT y esterilización) frente a los no convencionales (microondas, altas presiones y homogenización a alta presión) sobre el perfil lipídico y el contenido en fosfolípidos de leche de vaca, oveja y cabra ---------------------------------------------------------------------------------------- 244 4.3.1 Procesado convencional (pasterización, UHT y esterilización) y no convencional (microondas y altas presiones) aplicado a leches de vaca -- 244 4.3.2 Tratamiento por homogenización a altas presiones (HPH) aplicado a leches de vaca, oveja y cabra --------------------------------------------------------- 245 4.3.3 Tratamiento a muy altas presiones de hasta 900 MPa aplicado a leche vaca ------------------------------------------------------------------------------------------ 246
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ÍNDICE
4.4 Determinación de la posible alteración de la fracción lipídica de productos lácteos comerciales, fórmulas infantiles en polvo y derivados lácteos de alto contenido en CLA durante su periodo de conserva 248 4.4.1. Alteraciones en la fracción lipídica durante la conservación de fórmulas infantiles en polvo ------------------------------------------------------------------------ 248 4.4.2 Alteraciones en derivados lácteos de alto contenido en CLA ------------- 250 5. CONCLUSIONES ------------------------------------------------------------------------ 255 REFERENCIAS ------------------------------------------------------------------------------ 262
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ÍNDICE
INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN La idea según la cual, la salud puede ser mejorada o preservada a través de la alimentación no es un término ideado en el siglo XX. Ya desde la antigüedad se tenía constancia de ello, como así lo atestiguan las palabras de Hipócrates (siglo.V. aC): “Que tu alimento sea tu medicina y que tu medicina sea tu alimento”. No obstante, es a partir de la segunda mitad del siglo XX, cuando el concepto se materializa en productos y/o suplementos alimenticios cuya intención clara es provocar un efecto positivo sobre el estado de salud del consumidor y que han supuesto un descenso en la morbilidad y mortalidad, así como un incremento en la calidad de vida de la población (Jones & Jew, 2007). Fue en Japón en 1980, con el progresivo envejecimiento de la población y buscando disminuir el gasto sanitario en geriatría, cuando el Ministerio de salud nipón inicia y promueve estudios para el desarrollo de estos alimentos “funcionales” (Arai, 1996). El concepto incluía la relación y equilibrio entre el cumplimiento de los requerimientos en nutrición, la satisfacción sensorial y la modulación de los sistemas fisiológicos del consumidor, entendiendo estos alimentos como un remedio o forma de prevención y no un fármaco para el tratamiento de la enfermedad, como lo muestran las legislaciones aprobadas para crear una nueva categoría de alimentos (FOSHU; food for specific health uses) y el establecimiento de las alegaciones permitidas, en los productos japoneses (Menrad, 2003). En la Unión europea, se consideran alimentos funcionales aquellos que además de nutrir, afectan satisfactoriamente a una o más funciones corporales o fisiológicas, además de prevenir la incidencia de enfermedades crónicas (Urala & Lahteenmaki, 2007). La importancia de este tipo de alimentos queda claramente puesta de manifiesto, a tenor de su impacto económico, que en el mercado mundial de los funcionales fue en 2007 de 56 millones de € (21 en EE.UU, 7 en Europa, 28 en
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1. INTRODUCCIÓN
Asia) y se espera que para 2012 sea de aproximadamente de 74 millones de € (Datamonitor analysis, 2007)
1.1 LÍPIDOS LÁCTEOS Y SALUD Las recomendaciones nutricionales relativas a la dieta de los países industrializados, inciden en la necesidad de reducir el consumo total de grasa, principalmente saturada, (SFA) ácidos grasos trans (TFA) y de colesterol (Jenkins & McGuire, 2006; Kris-Etherton & Innis, 2007) ante el hecho del incremento en enfermedades cardiovasculares y su relación con la dieta actual. La Organización mundial de la salud recomienda que el consumo de grasas no debe representar más del 15-30% del aporte energético, no excediendo el 10% para SFA, 6-10% de poliinsaturados (PUFA) (8-5% de 6 y 2-1% de 3), 280.000 sujetos) y tiempos de estudio de 20 años, en 5 de ellos no encontró una asociación directa entre la ingesta de productos lácteos y CVD (German et al., 2009). En otros ensayos clínicos llevados a cabo con 28.886 mujeres con edades por encima de los 45 años y comparando los posibles efectos de una dieta que incluía lácteos de bajo contenido graso frente a otra de alto contenido, encontraron que el consumo de los lácteos de bajo contenido graso estuvo asociado a una disminución del 11% en el riesgo de padecer hipertensión (Wang et al., 2008), mientras que con lácteos de alto contenido graso no pudo encontrarse ninguna asociación. El síndrome metabólico (MS) ha emergido recientemente como un concepto clínico con importantes implicaciones en términos de riesgo de desarrollo de CVD. La prevalencia del MS ha sido estimada en torno al 25% en países industrializados (Ford et al., 2002). En muchos estudios el consumo de lácteos se ha asociado inversamente con la aparición de uno o más facetas del MS. En el estudio CARDIA, que fue llevado a cabo con 3157 adultos de edades comprendidas entre los 18-30 años y comparando un consumo de productos lácteos 5 raciones/día frente a
