Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012-

Trabajo Práctico N°3 BIOINFORMÁTICA Dra. Virginia H. Albarracín-Dr. Sergio A. Cuozzo-Dra. Marta A. Polti 1- Objetivos • Que el alumno comprenda los conceptos teóricos y prácticos que son área de estudio de la bioinformática. • Que el alumno comprenda la importancia de esta disciplina en la labor del biólogo contemporáneo. • Que el alumno conozca las aplicaciones de esta disciplina en las ciencias biológicas. • Que el alumno sea capaz de manejar bases de datos disponibles on line. • Que el alumno conozca y tenga un manejo básico de los distintos tipos de programas bioinformáticos disponibles on line. 2- Introducción La bioinformática es la aplicación de la tecnología de computadoras a la gestión y análisis de datos biológicos. Esta disciplina requiere el uso y/o el desarrollo de diferentes técnicas entre las que se incluyen informática, matemática aplicada, estadística, ciencias de la computación, inteligencia artificial, química y bioquímica. Es una disciplina muy utilizada actualmente para resolver problemas experimentales en las ciencias biológicas, y tiene utilidad para muchas especialidades desde la taxonomía, pasando por la fisiología hasta la biología molecular. Y es por ello que el biólogo contemporáneo debe conocer y trabajar con esta herramienta desde los primeros años de su formación universitaria. Hay tres sub-disciplinas importantes dentro de la bioinformática: • • •

El desarrollo de nuevos algoritmos y estadísticas para evaluar relaciones entre miembros de colecciones grandes de datos. El análisis y la interpretación de varios tipos de datos, incluyendo secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, dominios y estructuras de proteínas. El desarrollo y la puesta en práctica de herramientas que permitan el acceso y manejo eficiente de diversos tipos de información para correlacionarlos exactamente.

El uso de la bioinformática en el área de la Biología Molecular es importante porque: •

La sencillez de los métodos de clonado y secuenciación del ADN ha generado una enorme cantidad de datos de secuencias de nucleótidos. Pese a que

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satisface las ambiciones de precisión química de muchos biólogos, esta información es inútil hasta que puedan deducirse las características significativas de las secuencias. Los posibles patrones son difíciles de determinar, y las secuencias que contienen muchos pares de bases resultan de un análisis difícil de realizar. Este crecimiento explosivo en la cantidad de información biológica hizo necesario el uso de computadoras y el desarrollo de nuevos programas para poder almacenar, clasificar y acceder a los datos almacenados. Es posible realizar el análisis de expresión de miles de genes en un solo experimento. Mientras que antes un científico investigaba la expresión de un gen en particular implicado en una determinada enfermedad actualmente puede estudiarse la expresión de varios genes simultáneamente. La utilización de la bioinformática permite realizar este tipo de análisis. Permite la recuperación u obtención de mayores números de datos. Facilita el proceso por el cual se desarrollan hipótesis con respecto a la función o estructura de un gen o una proteína de interés. Hace posible la identificación de secuencias similares en diversos organismos. Por ejemplo, el descubrimiento de nuevas relaciones filogenéticos y nuevos patrones evolutivos. Durante los últimos quince años, el desarrollo de herramientas eficientes para el almacenamiento y manejo de datos ha permitido un aumento sin precedente de información acerca de secuencias, de estructuras y de la literatura. La similitud de secuencias entre genes de enfermedades humanas y genes en organismos modelos tales como levaduras y E. coli, en los que los estudios genéticos son mas fáciles de realizar, permite la generación de hipótesis con respecto al posible papel de los genes humanos. En este caso, el gen asociado con un tipo de cáncer de colon hereditario resultó ser similar a los genes MSH2 de la levadura y E. coli, que se saben están involucrados en la reparación del ADN. El conocimiento de la función normal del gen es la base fundamental para comprender la base molecular de la enfermedad, y posiblemente desarrollar estrategias de tratamiento y/o prevención.

Las aplicaciones de las técnicas bioinformáticas son múltiples pero se pueden citar algunos ejemplos: • • • •

Comparación y alineamiento de secuencias de ADN y proteínas, para determinar homología y relaciones de parentesco entre especies (TaxonomíaSistemática). En base a las secuencias de genes presentes en las bases de datos se pueden hacer predicciones sobre la secuencia, estructura y propiedades de las proteínas codificadas por los mismos de genes (Biología Molecular). Análisis de genomas. Interacciones proteína-proteína teniendo en cuenta las animaciones 3D generadas a partir de las secuencias de aminoácidos presentes en las bases de datos.

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012En esta clase te presentaremos direcciones de utilidad en Internet para el análisis de secuencias y búsquedas de información y realizaremos algunas actividades prácticas de tal manera que puedas hacer uso de los recursos de algunas de estas páginas: PARA BÚSQUEDA DE SECUENCIAS HOMÓLOGAS • • • • •

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi#! http://www.fasta.genome.ad.jp/ http://www.ebi.ac.uk/embl/ http://147.47.212.35:8080/index.jsp

PARA ALINEAMIENTOS MÚLTIPLES • • •

http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ http://www.toulouse.intra.fr/multalin.html http://dot.imagen.bcm.tmc.edu:9331/multi-align/multi-align.html

PARA COMPARACIÓN DE DOS SECUENCIAS •

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html

DISEÑO DE PRIMERS PARA SER UTILIZADOS EN PCR Y/O RT-PCR • • •

http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi#! http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primers/primers3_www.cgi http://insilico.ehu.es/

TRADUCCIÓN ADN A PROTEÍNAS • •

http://expasy.cbr.nrc.ca/tools/dna.html http://www2.ebi.ac.uk/translate/

IDENTIFICACIÓN DE PAUTAS DE LECTURAS Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS •

http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi#!

IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS CONSENSO Y DOMINIO ESTRUCTURALES • • •

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi http://www.smart.embl.heidelberg.de/ http://www.expasy.ch/

3- Actividades prácticas -3-

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3.1.

Búsqueda y comparación de secuencias de ADN en bases de datos.

El ARN ribosómico (ARNr) 16S es la macromolécula más ampliamente utilizada en estudios de filogenia y taxonomía bacterianas. Su aplicación como cronómetro molecular fue propuesta por Carl Woese (Universidad de Illinois) a principios de la década de 1970. Woese introdujo el término dominio para sustituir al reino como categoría taxonómica de rango superior, y distribuyó a los organismos celulares en tres dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya, el último de los cuales engloba a todos los seres eucariotas. Desde entonces, el análisis de los ARNr 16S se ha utilizado ampliamente para establecer las relaciones filogenéticas dentro del mundo procariota, causando un profundo impacto en nuestra visión de la evolución y, como consecuencia, en la clasificación e identificación bacteriana. En este primera actividad, vamos a buscar la secuencia de ADN que codifica para el ARNr 16S de una bacteria en la base de datos NCBI y la vamos a comparar utilizando el algoritmo BLAST con las secuencias cercanas para construir un árbol filogenético. El National Center for Biotechnology Information (NCBI) es parte de la Biblioteca Nacional de Medicina de Estados Unidos (National Library of Medicine), una rama de los Institutos Nacionales de Salud (National Institutes of Health o NIH). Está localizado en Bethesda, Maryland y fue fundado el 4 de noviembre de 1988 con la misión de ser una importante fuente de información de biología molecular. Almacena y actualiza la información referente a secuencias genómicas en GenBank, un índice de artículos científicos referentes a biomedicina, biotecnología, bioquímica, genética y genómica en PubMed, una recopilación de enfermedades genéticas humanas en OMIM, además de otros datos biotecnológicos de relevancia en diversas bases de datos. Todas las bases de datos del NCBI están disponibles en línea de manera gratuita, y son accesibles usando el buscador Entrez. El NCBI ofrece además algunas herramientas bioinformáticas para el análisis de secuencias de ADN, ARN y proteínas, siendo BLAST una de las más usadas. El BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) es un programa informático de alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN o de proteínas. El programa es capaz de comparar una secuencia problema (también denominada en la literatura secuencia query) contra una gran cantidad de secuencias que se encuentren en una base de datos. El algoritmo encuentra las secuencias de la base de datos que tienen mayor parecido a la secuencia problema. Es importante mencionar que BLAST usa un algoritmo heurístico por lo que no nos puede garantizar que ha encontrado la solución correcta. Sin embargo, BLAST es capaz de calcular la significación de sus resultados, por lo que nos provee de un parámetro para juzgar los resultados que se obtienen. Normalmente el BLAST es usado para encontrar probables genes homólogos. Por lo general, cuando una nueva secuencia es obtenida, se usa el BLAST para compararla con otras secuencias que han sido previamente caracterizadas, para así poder inferir su función. El BLAST es la herramienta más usada para la anotación y predicción funcional de genes o secuencias proteicas.

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Ingresa a http://www.ncbi.nlm.nih.gov Elige la opción “Nucleotide” y en el buscador ingresa “Amycolatopsis tucumanensis strain ABO 16S ribosomal RNA gene”.

Copia la secuencia y entra nuevamente a la página principal. Una vez allí, elige el link “Blast”

Dentro de esa página, elige la opción “nucleotide blast” (compara nuestra secuencia de ADN con otras secuencias de ADN en la base de datos).

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Pegar la secuencia en el casillero vacío y poner las opciones “others” y “highly similar sequences”, luego pinche en “blast” como se indica:

Se obtendrá una nueva página con el alineamiento y las secuencias:

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Selecciona 10 secuencias y clickea “get selected sequences”.

Obtendrás un archivo con las secuencias en formato FASTA (este formato permite trabajar con las secuencias en todos los programas bioinformáticos). Guárdalo para la siguiente actividad.

Ejemplo de secuencia en formato FASTA:

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012>gi|113957095|gb|DQ886938.1| Amycolatopsis tucumanensis strain ABO 16S ribosomal RNA gene, partial sequence AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGCTGA AGCACCTTCGGGTGTGGATGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTGTACTTT GGGATAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGAATATGACTCGCTAAGGCATCTTGGTGGGTGGA AAGTTTCGGCGGTACAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAA GGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGCGACGCCG CGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCGCCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTA CCTGGAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTT GTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCTGCTGTGAAAATCCGGGG CTTAACTCCGGACCTGCAGTGGATACGGGCAGGCTTGAGTTCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCTG GTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCCG ATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCT GTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGCGACTTCCACGTTGTCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCG CCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGC GGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGCACTGGAA ACCGGCAGAGATGTCGGCCCCCTTGTGGCCGGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTTGGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCGCGTAA TGGCGGGGACTCGCGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCA TCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCTGGTACAGAGGGCTGCGATACCGT GAGGTGGAGTGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAA GTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA CCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCCATGGCCCAACCCCGCTTGCGGGGAG GGAGTGGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTA

3.2.

Alineamiento múltiple de secuencias y construcción de arbol filogenético.

Un árbol filogenético es un árbol que muestra las relaciones evolutivas entre varias especies u otras entidades que se cree que tienen una ascendencia común. En biología se utilizan árboles parecidos a los genealógicos para representar cómo se encuentran emparentados los organismos vivos, se les conoce como árboles filogenéticos. A diferencia de los árboles genealógicos, en los que se utiliza información proporcionada por los familiares, para los árboles filogenéticos se usa información proveniente de fósiles, así como aquélla generada por la comparación estructural y molecular de los organismos. Tanto los árboles genealógicos como los filogenéticos tienen un tronco y ramas, pero en los últimos se muestran las relaciones entre taxas y no entre individuos. Los árboles filogenéticos se construyen tomando en cuenta la teoría de la evolución, que nos indica que todos los organismos son descendientes de un ancestro común. Así, todos los organismos, ya sean vivos o extintos, se encuentran emparentados en algún grado. Para la construcción de árboles se consideran un conjunto de taxas representadas por un conjunto de carácteres. Las taxas pueden ser distintos niveles jerárquicos: especies, familias, géneros, y se llaman generalmente Unidades Taxonómicas Operacionales (OTUs). Un carácter es cualquier característica bien definida de la OTU que permita dividir el conjunto de OTUs en grupos, según el valor que toma el carácter para cada OTU. Así un subconjunto de las OTUs formará un grupo respecto a dicho carácter si comparten una misma forma o valor de dicho carácter.

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En la filogenia clásica, los caracteres utilizados para la construcción de árboles son elementos del fenotipo, por ejemplo: tipo de anexos tegumentarios epidérmicos (escamas, plumas, pelos, etc.). En la filogenia molecular, los caracteres son las secuencias de nucléotidos del ADN o las secuencias de aminoácidos de una proteína. Para la construcción de un árbol filogenético se deben seguir los siguientes pasos: 1. Definir conjunto de secuencias a analizar (DNA, RNA o proteínas) provenientes de distintos organismos. 2. Alinear correctamente esas secuencias (Alineamiento múltiple). Alineamiento múltiple. La premisa básica de un alineamiento múltiple es que para cada columna en el alineamiento cada residuo de cada secuencia es homólogo. Esto significa que ha evolucionado desde la misma posición en una secuencia ancestral común sin inserción ni deleción. Los alineamientos se realizan mediante agrupamiento y comparación de secuencias entre sí, proceso que se denomina clustering. Hace un tiempo, estos agrupamientos se realizaban manualmente, hoy en día se utilizan programas de computación. Por ejemplo, el Programa CLUSTALW permite el alineamiento global para un conjunto de secuencias. Las secuencias son alineadas de a pares y los pares con puntaje (score) más alto son luego agrupados con otras secuencias y los grupos (clusters) son armados de acuerdo a la similitud. 3. Aplicar métodos adecuados para la construcción de árboles filogenéticos. Para la creación de árboles en estudios filogenéticos existen básicamente dos categorías de métodos: • Métodos basados en distancia o Método de agrupamiento de pares con la media aritmética no ponderada (UPGMA) o Método del vecino más cercano (NJ) o Método de Minima Evolución (ME). • Métodos basados en la composición de las secuencias o Método de máxima parsimonia (MP) o Método de máxima probabilidad (ML) Cada uno de estos métodos tiene sus fortalezas y sus debilidades, pero es más ampliamente usado NJ, ya que ha probado ser bastante eficaz. Una vez construidos, los árboles pueden visualizarse como enraizados (tomando una de las OTUs como referencia o outgroup) o no enraizados. A su vez, los árboles pueden construirse como filogramas, cladogramas o dendrogramas.

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012Cladograma: es el modelo básico y simplemente muestra la distancia al antecesor común en términos relativos. Las ramas son de igual longitud por lo cual no indican el tiempo evolutivo. Filograma: contiene información adicional dada por la longitud de las ramas. Los números asociados con cada rama corresponden a un atributo de las secuencias, tal como cantidad de cambio evolutivo. Es aditivo. Métricos. Dendrograma: tipo especial de árbol aditivo en el cual los extremos del árbol son equidistantes de la raíz y son proporcionales al tiempo de divergencia. Ultramétricos. 4. Evaluar estadísticamente el árbol filogenético obtenido. El test más simple para probar si el conjunto de datos “soportan” el árbol obtenido es el del bootstrap. Es un método estadístico que puede estimar las distribuciones por creación repetida y análisis de conjuntos de datos artificiales. Una forma de medir el error de muestreo es tomar muchas muestras de la población estudiada y compararlas. Bootstrap simula esto pero en lugar de muestrear de una población “remuestrea” los datos originando pseudorréplicas. Por ejemplo, un boostrap de 100 implica que el árbol se construyó 100 veces, para determinar si estadísticamente la constitución final del árbol fue la acertada. Ahora procedemos a hacer el alineamiento múltiple para construir el árbol:

Ingresa a http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ Copia y pega las secuencias obtenidas en el ejercicio anterior, en el espacio de Step 1 como a continuación:

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Luego presione el botón rojo en el step 4, esto iniciará el alineamiento múltiple:

Se obtendrá el siguiente alineamiento, debes guardarlo en tu computadora utilizando la opción “Download Alignment File”.

Ahora debes ir a la opción Philogeny, y dentro de esa opción debes subir tu archivo de alineamiento que guardaste anteriormente, luego presiona el botón rojo “Submit”, lo cual

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012te permitirá construir el árbol filogenético. Por default, utilizamos el método de NJ para construir el árbol.

Obtendras el siguiente árbol, donde se pueden observar las relaciones de parentezco del organismo problema en relación a otros organismos que existen en la base de datos.

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3.3.

Identificación de secuencia de proteínas en base de datos.

Tomando una secuencia de proteínas, podemos llevarla a la base de datos para compararla e identificar la función de la misma. La secuencia de aminoácidos de la proteína X es la siguiente (el docente se la facilitará via electrónica en formato fasta): >Proteína X TAAYQIEGAYNEDGRGMSIWDTFAHTPGKVKNGDNGNVACDSYHRVEEDVQLLKDLGVKVY RFSISWPRVLPQGTGEVNRAGLDYYHRLVDELLANGIEPFCTLYHWDLPQALQDQGGWGSRIT IDAFAEYAELMFKELGGKIKQWITFNEPWCMAFLSNYLGVHAPGNKDLQLAIDVSHHLLVAHG RAVTLFRELGISGEIGIAPNTSWAVPYRRTKEDMEACLRVNGWSGDWYLDPIYFGEYPKFMLD WYENLGYKPPIVDGDMELIHQPIDFIGINYYTSSMNRYNPGEAGGMLSSEAISMGAPKTDIGW EIYAEGLYDLLRYTADKYGNPTLYITENGACYNDGLSLDGRIHDQRRIDYLAMHLIQASRAIEDG INLKGYMEWSLMDNFEWAEGYGMRFGLVHVDYDTLVRTPK Siendo tu un especialista en bioinformática, debes comparar y otorgar toda la información posible acerca de la secuencia más cercana (con mayor identidad) que encuentres por comparación en la base de datos (NCBI). Para ello completa los datos que se requieren a continuación:

LOCUS __________________________________________________ DEFINITION _____________________________________________ ACCESSION ______________________________________________ VERSION ________________________________________________ KEDWORDS _______________________________________________ SOURCE _________________________________________________ ORGANISM _____________________________________________ REFERENCE ______________________________________________ AUTHORS ______________________________________________ TITLE ________________________________________________

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012JOURNAL _______________________________________________

3.4.

Diseño de oligonucléotidos

Para la detección de un gen específico dentro de un genoma se pueden utilizar diversas estrategias (por ej.: hibridación, análisis de expresión, PCR, etc.). El empleo de la PCR implica varias etapas, y su complejidad depende de varios factores, entre ellos podemos considerar, por ejemplo si: • • •

¿Es un gen ampliamente distribuído o es específico de un grupo de organismos en particular? ¿Se conoce la secuencia de ADN completa del gen o sólo se conoce la secuencia de la proteína codificada por ese gen? ¿Es un gen altamente conservado o varía considerablemente entre organismos relacionados?

En el TP Nº1 (PCR) se encuentran las consideraciones más importantes a tener en cuenta para el diseño de primers. En este práctico, aprenderemos a cómo diseñar los oligonucleótidos para realizar una reacción de PCR para detectar el gen de la enzima Superóxido Dismutasa de Niquel (SodN) en la cepa Streptomyces sp. BM. 1. Búsqueda en base de datos de secuencias de la SodN. a. Abrir un navegador de internet b. En la barra de direcciones pegar: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ c. En la pestaña All databases seleccionar Nucleotide (se conoce la secuencia del gen SodN) d. En la pestaña Search escribir Ni-containing superoxide dismutase. Presionar Search.

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2. Seleccionar la 4º opción de la lista (para este caso es apropiado, porque sabemos que corresponde a la enzima que estamos buscando).

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3. Buscar en la página SodN

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4. Seleccionar gene

5. Copiar la secuencia resaltada y pegarla en un archivo de texto. >SodN Atgctttcccgcctgtttgcccccaaggtcacggtcagcgcccactgcgacctgccctgcggcgtgtacgaccctgcccag gcccgcatcgaggcggagtcggtgaaggccgtccaggagaagatggccggcaacgacgacccgcacttccagacgcg cgccacggtcatcaaggagcagcgcgccgagctcgcgaagcaccacgtctccgtgctgtggagcgactacttcaagccc ccgcacttcgagaagtacccggagctgcaccagctggtcaacgacaccctgaaggccctgtcggccgccaagggctcg aaggacccggcgaccggccagaaggccctggactacatcgcccagatcgacaagatcttctgggagaccaagaaggc ctga

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6. Seleccionar BLAST y pegar la secuencia. Correr el BLAST.

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7. Seleccionar y copiar las secuencias de ADN de: a. Streptomyces avermitilis MA-4680 b. Streptomyces acidiscabies strain E13 c. Streptomyces flavogriseus ATCC 33331 d. Streptomyces peucetius ATCC 27952 >S. coelicolor A3(2) atgctttcccgcctgtttgcccccaaggtcacggtcagcgcccactgcgacctgccctgcggcgtgtacgaccctgcccag gcccgcatcgaggcggagtcggtgaaggccgtccaggagaagatggccggcaacgacgacccgcacttccagacgcg cgccacggtcatcaaggagcagcgcgccgagctcgcgaagcaccacgtctccgtgctgtggagcgactacttcaagccc ccgcacttcgagaagtacccggagctgcaccagctggtcaacgacaccctgaaggccctgtcggccgccaagggctcg aaggacccggcgaccggccagaaggccctggactacatcgcccagatcgacaagatcttctgggagaccaagaaggc ctga >S. avermitilis MA-4680 atgctctcccgcctgtttgcccccaaggtcaaggtcagcgcgcactgcgacctgccctgcggtgtgtacgacccggccca ggcccgcatcgaggcggagtcggtgaaggccgtccaggaaaagatggccggcaacgacgacccgcacttccaggctc gcgccacggtcatcaaggagcagcgcgccgagctcgccaagcaccacgtgtcggtgctctggagcgactacttcaagcc cccgcacttcgagaagtacccggagctgcaccagctggtcaacgacaccctgaaggccctctcggccgccaaggcgtcc acggacccggccacgggccagaaggcgctggactacatcgcccagatcgacaagatcttctgggagaccaagaaggc ctgactttcccgcctgtttgcccccaaggtcaaggtcagcgcgcactgcgacctgccctgcggtgtgtacgacccggccca ggcccgcatcgaggcggagtcggtgaaggccgtgcaggacaagatggccgccaacgacgaccctcacttccaggctcg cgcgaccgtcatcaaggagcagcgcgccgagctcgccaagcaccacgtctcggtgctgtggagcgactacttcaagcct ccgcacttcgagaagtacccggagctgcaccagctggtcaacgacgccctgaaggccctctcggccgccaaggcgtcca ccgacccggcgacgggccagaaggcgctggactacatcgcccagatcgacaagatcttctgggagaccaagaaggcct - 19 -

Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012ga >S. acidiscabies E13 atgctctcccgcctgtttgcccccaaggtgaaggtcagcgcgcactgcgacctgccctgcggcgtgtacg acccggcccaggcccgcatcgaggcggagtcggtgaaggccgtccaggaaaagatggccggaaacgacga ccctcggttccagacgcgcgccgtcgtcatcaaggagcagcgcgccgagctcgccaagcaccacgtgtcg gtgctctggagcgactacttcacgcccccgcacttcgagaagtacccggagctgcaccagctggtcaacg acaccctgaaggccctctcggccgccaaggcgtccgccgacccggcgaccggccagaaggccctcgacta catcgcccagatcgacaagatcttctgggagaccaagcaggcttga >S. flavogriseus atgctttcccgcctgtttgcccccaaggtgaaggtcagcgcccactgcgacctgccctgcggcgtgtacgacccggccca ggcccgcatcgaggccgagtccgtcaaggccgtccaggagaagtaccaggccaatgaggacgcggacttccgcaccc gcgccgttctgatcaaggaacagcgtgccgagctcgcgaagcaccacgtctcggtgctctggagcgactacttcaagccc ccgcacttcgagaagtacccggagctgcaccagctggtcaacgacaccctgaaggcgctctccgcggccaagggctcg aacgacccggccacgggccagaaggctctggacctgatcgcccagatcgacacgatcttctgggagaccaagaaggcc tga >S .peucetius ATCC27952 atgctctcccgcctgtttgcccccaaggtgaaggtcagcgcccactgcgacctgccttgcggtgtgtacgacccggcccag gcccgcatcgaggcggagtcggtcaaggccgtccaggagaagtaccaggccaacgaggacccgcacttccgcgcccg cgccacggtcatcaaggagcagcgcgcggagctcgccaagcaccacgtctcggtgctgtggagcgactacttcaagccc ccgcacttcgagaagtacccggagctgcaccagctcatcaacgacacgctcaaggcgctctcggccgccaagggctcga cggacccggcgaccggccagaaggccctggactacatcgcccagatcgacaagatcttctgggagaccaagaaggcct ga 8. Abrir el programa DNAMAN y cargar todas las secuencias. 9. Realizar el alineamiento de las 5 secuencias. Seleccionar el ícono alineamiento y luego presionar Channel y seleccionar las 5 secuencias.

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10. Analizar el alineamiento. Ir a Output/Sequence File/ DNAMAN 2

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -201211. Copiar la secuencia consenso y pegarla en el canal 6.

12. Ir a Primer/Design PCR Primers for DNA y seguir los pasos indicados en las pantallas siguientes:

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13. Evaluar las características de los pares de primers generados por el programa. a. Copiar la secuencia del primer cebador, ir a Primer/Load primer/ From input y pegar la secuencia. b. Ir a Primer/Self complementary. Analizar. c. Ir a Primer/Two primer complentarity/Second primer from input y pegar el segundo primer. Analizar. d. Para este primer repetir el punto b e. Repetir para todos los pares de primers obtenidos. f. Seleccionar el par de primer más adecuado.

3.5.

PCR in silico.

Para saber si los oligos diseñados permiten amplificar la secuencia de interés, tienes que realizar una PCR in silico (virtual, utilizando herramientas bioinformáticas) utilizando el genoma disponible del organismo similar al modelo que tienes. Para ello, debes ingresar en http://insilico.ehu.es/PCR/ De la lista de genomas que se te despliega debes elegir “Streptomyces” y luego ingresas a una página donde debes pegar la secuencia de los primers que diseñaste anteriormente.

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Luego de apretar el botón “Amplify” te aparecerá una nueva ventana, contesta las siguientes preguntas:

a- ¿Cuántas bandas se amplifican? b- ¿Qué tamaño tienen? c- Si haces un BLAST de esas secuencias, ¿a qué genes corresponden?

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Trabajo Práctico N°4 TAXONOMÍA MOLECULAR Dra. Virginia H. Albarracín-Dra. Marta A. Polti 1- Objetivos • Que el alumno conozca las técnicas moleculares que se utilizan en taxonomía molecular. • Que el alumno comprenda la importancia de las técnicas de biología molecular en el desarrollo de la taxonomía moderna. • Que el alumno conozca las enzimas de restricción y sus aplicaciones. • Que el alumno sea capaz de manejar bases de datos de marcadores moleculares disponibles on line. • Que el alumno sea capaz de utilizar programas bioinformáticos para realizar digestiones in silico. 2- Introducción TAXONOMÍA Y SISTEMÁTICA Los términos taxonomía y sistemática marcan en su significado matices diferenciales claros. La taxonomía estudia los principios de clasificación de los organismos según las semejanzas y diferencias de sus caracteres. La sistemática trata de los resultados que se obtienen al aplicar tales principios. Uno de los objetivos de la taxonomía es descubrir un orden en el aparente caos de diversidad de formas vivas. Así, el taxonomista intenta preparar un esquema conveniente de clasificación para los organismos. Las unidades sistemáticas de cualquier categoría se designan con el nombre de taxones o estirpes. De todas ellas la Especie es la categoría taxonómica más importante. Se reúnen en una especie todos los individuos particulares, incluyendo sus antepasados y descendientes (filogenia), que concuerdan entre sí en numerosos caracteres y en especial en todos los esenciales. Las especies que poseen una serie de caracteres comunes se agrupan en Géneros, éstos de forma análoga en Familias; las familias en Órdenes, éstos en Clases y las clases en Divisiones. Dentro de las especies suelen distinguirse Subespecies, Variedades, Líneas y Clones o Cepas. Estas últimas para designar la población de células genéticamente idénticas, procedentes de una sola. Todas ellas constituyen las diferentes categorías taxonómicas. Conviene distinguir también entre Taxonomía y Nomenclatura. Esta última trata, evidentemente, de la denominación o descripción detallada de cada especie de microorganismo. El nominar una especie es una práctica conveniente que expresa a modo de taquigrafía las propiedades colectivas de un organismo. El método usado actualmente para designar científicamente una especie microbiana es la de la nomenclatura binomial.

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012TAXONOMÍA MICROBIANA En la taxonomía microbiana existen varias formas de abordar los estudios. La primera de ellas es la taxonomía clásica; aplicada durante más de un siglo, su metodología consiste en determinar varios caracteres de diferentes microorganismos y, para usarlos después en la separación de grupos. Los primeros caracteres determinados suelen ser los morfológicos y estructurales; después los funcionales. La importancia del carácter morfológico se debe, por una parte, a la mayor facilidad en su determinación por técnicas microscópicas y, por otra, a su mayor estabilidad genética. Además de la morfología, suelen utilizarse numerosas pruebas de carácter estructural, fisiológico, reproductivo y ecológico. Otra forma de abordar el procedimiento taxonómico es la taxonomía numérica, en la cual se da la misma importancia a todos los caracteres determinados; un ordenador analiza los datos determinados para un gran número de microorganismos reconociendo las diferencias y analogías entre ellos. Las primeras separaciones se hacen también atendiendo a caracteres morfológicos y estructurales, realizando a continuación un gran número de pruebas de naturaleza variada, anotando los resultados de las mismas con un signo positivo o negativo; los datos se recogen en tablas y son codificados; hay que calcular un coeficiente de confianza para las cepas en estudio; éste será mayor cuanto más semejante sean los microorganismos analizados. Los caracteres negativos comunes a las cepas no se toman en consideración a la hora de calcular dicho coeficiente, ya que la ausencia común de un carácter no implica necesariamente un parentesco. La taxonomía numérica, al analizar muchos caracteres, obtiene resultados poco equívocos y determina categorías taxonómicas estables; sin embargo, la correlación entre taxonomía clásica y numérica no es siempre muy satisfactoria. La tercera forma de abordar el estudio para la clasificación de microorganismos es la taxonomía molecular y genética, que parte de la idea de que cuanto más parecidos son dos organismos, mayores su semejanza genética, tratando de demostrar que las secuencias de bases del DNA de dos células son parecidas o exactamente iguales. Para estudios de este tipo pueden utilizarse varias alternativas:

Estudio de la composición de bases del ADN Aunque no se conozcan las secuencias de bases púnicas y pirimídicas, sí pueden determinarse las proporciones de las mismas en el DNA total. Se ha calculado que si dos organismos difieren en el contenido de Guanina-Citosina en más del 10% tienen pocas secuencias de bases en común. Por tanto, no se considerarán estrechamente relacionadas, al no ser descendientes de un antepasado común. Sin embargo, puede ocurrir a veces que dos células con proporciones de bases idénticas no estén relacionadas, ya que en ácidos nucleicos de la misma composición de bases son posibles muchas secuencias diferentes.

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Estudios de hibridación y homología de los ácidos nucleicos Cuando se calienta una preparación de DNA, las dos cadenas que lo forman se separan, siendo una complementaria de la otra. Cuando la mezcla se enfría lentamente, las dos cadenas complementarias se vuelven a asociar, formándose otra vez la doble hélice. Como la nueva asociación requiere que las secuencias de bases sean complementarias, la presencia de secuencias iguales de dos microorganismos diferentes puede detectarse midiendo el grado en que sus ácidos nucleicos son capaces de interaccionar específicamente. El grado de hibridación de los ácidos nucleicos es menor cuando los microorganismos no están estrechamente relacionados, aunque la composición conjunta de bases púnicas y pirimídicas sea la misma.

Estudios de marcadores moleculares La aplicación de marcadores moleculares en la resolución de problemas genéticos es un campo en auge permanente que se ha desarrollado y acelerado en los últimos años gracias a la tecnología de PCR. Los marcadores moleculares permiten analizar y medir la diversidad de individuos, poblaciones y especies, evaluando directamente la variación genética que se produce a nivel de ADN. Los ácidos nucleicos y las proteínas, macromoléculas comunes a todos los seres vivos, cambian con el tiempo. Por ello, pueden considerarse como cronómetros moleculares o documentos de la historia evolutiva. Asumiendo que los cambios se producen al azar y que aumentan con el tiempo de manera lineal, las diferencias en la secuencia de los monómeros (nucleótidos o aminoácidos) que integran macromoléculas homólogas, presentes en dos formas de vida, reflejan la distancia evolutiva existente entre ellas. Esta idea, introducida por Zuckerkandl y Pauling, se ha venido utilizando durante décadas para establecer las relaciones filogenéticas entre los seres vivos, creando un marco apropiado para su clasificación e identificación. El ARN ribosómico (ARNr) 16S es la macromolécula más ampliamente utilizada en estudios de filogenia y taxonomía bacterianas. Su aplicación como cronómetro molecular fue propuesta por Carl Woese (Universidad de Illinois) a principios de la década de 1970. Los estudios de Woese originaron la división de los procariotas en dos grupos o reinos: Eubacteria y Archaeobacteria, cuya divergencia es tan profunda como la encontrada entre ellos y los eucariotas. Además, permitieron establecer las divisiones mayoritarias y subdivisiones dentro de ambos reinos. Posteriormente, Woese introdujo el término Dominio para sustituir al reino como categoría taxonómica de rango superior, y distribuyó a los organismos celulares en tres dominios : Bacteria, Archea y Eukarya, el último de los cuales engloba a todos los seres eucariotas. Desde entonces, el análisis de los ARNr 16S se ha utilizando ampliamente para establecer las relaciones filogenéticas dentro del mundo procariota, causando un profundo impacto en nuestra visión de la evolución y, como consecuencia, en la clasificación e identificación bacteriana. De hecho, las ediciones vigentes de los dos tratados fundamentales de bacteriología, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (http://www.springer-ny.com/bergeysoutline/main.htm) y The Prokaryotes (http://www.prokaryotes.com), basan su estructuración del mundo procariota en las relaciones filogenéticas establecidas con esta macromolécula.

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012Los ARNr 16S pueden actualmente mediante amplificación por PCR y posterior secuenciación por método enzimático. LOS RIBOSOMAS, LOS OPERONES RIBOSÓMICOS Y EL ARNR 16S

Ribosomas Son orgánulos complejos, altamente especializados, que utilizan los organismos para el complicado proceso de síntesis de proteínas. El ribosoma bacteriano tiene un coeficiente de sedimentación de 70S (expresado en unidades Svedberg), y puede disociarse en dos subunidades, la subunidad grande (50S) y la subunidad pequeña (30S). Cada subunidad es un complejo ribonucleoproteico constituido por proteínas ribosómicas y moléculas de ARNr específicas. La subunidad 30S contiene el ARNr 16S y 21 proteínas diferentes (numeradas desde S1S21, donde S procede de small l), mientras que la subunidad 50S contiene los ARNr 5S y 23S junto con unas 34 proteínas (L1-L34; L: large). En bacterias, los genes que codifican los ARN ribosomales están organizados en operones (conjunto de genes que se transcriben a partir de la misma región promotora). Cada operón ribosómico incluye genes para los ARNr 23S (rrl), 16S (rrs) y 5S (rrf), separados por regiones espaciadoras o intergénicas (IG), y contiene además genes para uno o más ARN de transferencia (ARNt). El producto de la transcripción del operón a partir de dos promotores, P1 y P2, situados en la región anterior a rrs, será procesado por el enzima ARNasa III mediante cortes en sitios específicos que separan las tres clases de ARNr, el/los ARNt y las dos IG.

ARNr 16S Es un polirribonucleótido de aproximadamente 1.500 nt, codificado por el gen rrs, también denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), a partir de cuya secuencia se puede obtener información filogenética y taxonómica. Como cualquier secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, el ARNr 16S se pliega en una estructura secundaria, caracterizada por la presencia de segmentos de doble cadena, alternando con regiones de cadena sencilla. En eucariotas, el ARNr 18S es la macromolécula equivalente. Dado que los ARNr 16S y 18S proceden de las subunidades pequeñas de los ribosomas, el acrónimo ARNr SSU (del inglés, small subunit) se utiliza para ambos. Los ARNr SSU se encuentran altamente conservados, presentando regiones comunes a todos los organismos, pero contienen además variaciones que se concentran en zonas específicas. El análisis de la secuencia de los ARNr 16S de distintos grupos filogenéticos reveló un hecho adicional de gran importancia práctica: la presencia de una o más secuencias características que se denominan oligonucleótidos firma. Se trata de secuencias específicas cortas que aparecen en todos (o en la mayor parte de) los miembros de un determinado grupo filogenético, y nunca (o sólo raramente) están presentes en otros grupos, incluidos los más próximos. Por ello, los oligonucleótidos firma pueden utilizarse para ubicar a cada bacteria dentro de su propio grupo. El número de copias del operón ribosómico por genoma bacteriano varía considerablemente, de 1 a 15, siendo relativamente constante a nivel de especie, género e incluso familia. Entre las copias de los ARNr 16S codificadas por un mismo genoma se ha detectado un cierto grado de heterogeneidad (denominada microheterogeneidad).

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012Aunque existen cronómetros moleculares alternativos al ARNr 16S, hasta el momento ninguno ha conseguido desplazarlo. De hecho, esta macromolécula presenta una serie de características, en base a las cuales fue considerado por Woese como cronómetro molecular definitivo: 1. Se trata de una molécula muy antigua, presente en todas las bacterias actuales. Constituye, por tanto, una diana universal para la identificación. 2. Su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo muy prolongado, de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios. 3. Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta, como para aportar información acerca de todos los procariotas y, junto con las variaciones en los ARNr 18S, a lo largo de toda la escala evolutiva. Los ARNr SSU contienen, sin embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no sólo los organismos más alejados, sino también los más próximos. 4. El tamaño relativamente largo de los ARNr 16S (1.500 nt) minimiza las fluctuaciones estadísticas. 5. La conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las comparaciones, aportando una base para el alineamiento preciso. 6. Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los ADNr 16S existen bases de datos amplias, en continuo crecimiento. Una vez determinada la secuencia de nucleótidos y establecidas las comparaciones, el grado de similitud entre las secuencias de los ADNr 16S de dos bacterias será lo que indique su relación evolutiva. Además, el análisis comparativo de secuencias permite construir árboles filogenéticos, que reflejan gráficamente la genealogía molecular de la bacteria, mostrando su posición evolutiva en el contexto de los organismos comparados. Hay que tener en cuenta, no obstante, que es la comparación de genomas completos, y no la comparación de los ADNr 16S, la que aporta una indicación exacta de las relaciones evolutivas. En su ausencia, la especie bacteriana se define, en taxonomía, como el conjunto de cepas que comparten una similitud del 70% o más, en experimentos de reasociación ADN-ADN. Stackebrandt y Goebel demostraron que cepas con este nivel de relación presentan típicamente una identidad del 97% o más entre sus genes ARNr 16S. Así, cepas con menos del 97% de identidad en las secuencias de sus ADNr 16S es improbable que lleguen a estar relacionadas a nivel de especie. Sin embargo, existen cepas que comparten una similitud inferior al 50% en experimentos de reasociación, y son por tanto clasificadas en especies diferentes, pero presentan una identidad del 99100% a nivel de ADNr 16S. Por ello, en taxonomía, actualmente se recomienda la identificación polifásica, que utiliza criterios fenotípicos junto con datos de secuenciación.

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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Definición y origen Las enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen una secuencia de ADN doble cadena de entre 4 y 8 pb. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restricción, y la enzima rompe un enlace fosfodiester en cada hebra. Las secuencias de reconocimiento son repeticiones invertidas perfectamente simétricas conocidas como palíndromos. Las enzimas de restricción se encuentran en muchas especies de bacterias. Las bacterias desarrollaron las enzimas de restricción como una defensa frente a la infección por fagos (virus bacterianos). Se denominan de restricción porque estas enzimas restringen la invasión del ADN exógeno cortándolo en pedazos. En cambio, el ADN propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, ya que puede protegerse del corte por metilación específica de la secuencia mediante una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas). Los sitios de reconocimiento de las metiltransferasas corresponden a los de las endonucleasas. Este sistema es análogo a un sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre su ADN y el ADN exógeno. Estás enzimas son aprovechadas para la tecnología del ADN recombinante. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño en un ADN receptor por enzimas denominadas ligasas. Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular. La tecnología del ADN recombinante permite el desarrollo de plantas y animales transgénicos así como microorganismos modificados genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la

insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales. Tipos de enzimas de restricción Las endonucleasas de restricción se clasifican en tres categorías: Tipo I: es una enzima formada por 3 subunidades que reconoce el sitio de ADN. Esta enzima metila y corta. La restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento. Tipo II: dos enzimas diferentes realizan la restricción y la metilación. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento. Estas enzimas son las utilizadas en ingeniería genética debido a que permiten romper el ADN en sitios específicos. Tipo III: es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas, y rompen el ADN 25-27 pb, más allá del sitio de reconocimiento.

Endonucleasas de restricción tipo II Se han identificado más de 2300 endonucleasas de restricción de tipo II. Se denominan isoesquizómeros a aquellas enzimas que han sido obtenidas de diferentes especies de bacterias, pero que reconocen la misma secuencia de ADN. - 32 -

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Las enzimas tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos de cortes: A.Cortes pegajosos, dejando productos con extremos cohesivos (sticky) Ej: Eco RI y Pst I B.Cortes simétricos, dejando productos con extremos romos (blunt). Ej: Pvu II En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción que corta la molécula de ADN en forma escalonada, quedando bordes pegajosos (cohesivos) por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente.

En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción que corta la molécula de ADN justo en el centro de la secuencia, quedando bordes romos (blunt).

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos (con extremos romos y con extremos cohesivos), en ingeniería genética se prefieren aquellos con extremos cohesivos, puesto que permiten la unión espontánea del gen a clonar con el vector. Si las moléculas a utilizar presentan extremos romos, hay que conferirles extremos cohesivos, por ejemplo utilizando la enzima transferasa terminal. La nomenclatura utilizada para designar las enzimas de restricción es la siguiente: Eco RI E = Escherichia, género co = coli, especie R = factor R, variedad I = orden de aparición En las siguientes tablas se pueden observar las enzimas más comúnmente usadas en biología molecular, nomenclatura, fuentes y sitios de corte.

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Isoesquizómeros y las familias de enzimas Los isoesquizómeros son enzimas que reconocen un mismo sitio, pero que no lo cortan en el mismo lugar, como Asp 718 y Kpn1. Las familias de enzimas comprenden enzimas que no reconocen necesariamente los mismos sitios, pero producen extremos adhesivos iguales. Hay familias por ejemplo que producen extremos adhesivos GATC ó CTAG. GATC: Sau3AI, BglI, BamHI, BclI et XhoII CTAG: MaeI, SpeI, NheI, AvrI et XhaI En la figura se muestra cómo Sau3AI y BamH1 producen los mismos extremos:

Mapa de restricción. Patrón de restricción.

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012Un mapa de restricción es una secuencia lineal de los sitios de restricción contenidos en una secuencia de ADN. Un patrón de restricción es el patrón o perfil de ADN generado mediante electroforésis que se obtiene después de cortar con una enzima de restricción. Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos. Según donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes. Para obtener un patrón de restricción se podría emplear el siguiente procedimiento: 1. Utilizar muestras de ADN bicatenario con concentración de 0,1 µg/µL y longitud de 10.000 bp.

2. Poner 10 µl de ADN en los tubos de microcentrífuga, 7 µl de agua, 1 µl de enzima de restricción EcoRI (por ej.) y 2 µl del buffer 10X para enzimas de restricción EcoRI.

3. Mezclar y centrifugar. 4. Poner a baño María (37°C) durante 1 hora. 5. Con la ayuda de una pipeta, pasar los hidrolizados a un pocillo de electroforesis en gel de agarosa En uno de los tubos adyacentes, depositar una muestra de ADN no

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012hidrolizado y en otros dos, una mezcla de moléculas de ADN de tamaño conocido (marcadores), que servirán para calcular las tallas de los fragmentos obtenidos. 6. Realizar la electroforesis y revelar 7. Usar un transiluminador UV para visualizar las moléculas de ADN. El marcador de peso molecular permite analizar que la EcoRI cortó la molécula original de 10.000 bp en dos fragmentos, de 7.500 y 2.500 bp respectivamente.

Tamaño de los fragmentos de restricción Si los sitios de restrición fueran distribuidos al azar en la longitud de una molécula de ADN, una enzima que reconocería una secuencia de 4 nucleótidos, cortaría 1/256 nucleótidos (es decir, hallaría 1 sito de corte cada 256 nucleótidos), mientras que una enzima que reconocería 6 nucleótidos cortaría en promedio 1/4.096 nucleótidos. La digestión por EcoRI (secuencia de reconocimiento de 6 nucleótidos) de una molécula de ADN bacteriano de 4 millones de pares de bases producirá alrededor 103 fragmentos diferentes, mientras que la digestión total de ADN de un mamífero va a producir alrededor de 106 fragmentos.

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012Es por esto que la frecuencia de aparición de un sitio depende de su secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, la enzima NotI que reconoce un sitio de 8 nucleótidos 5'GCØGGCCGC-3' realiza sólo 3 cortes en el ADN de mamíferos: produce fragmentos de talla media de 1 a 1,5 millones de pares de bases. Esta enzima se utiliza en los trabajos de cartografía física del ADN. RFLP: RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP): POLIMORFISMO DE LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN: El análisis del patrón de restricción del ADN es una de las técnicas más utilizadas para la identificación y agrupación de bacterias. Esta técnica puede ser usada para separar especies pertenecientes al mismo género, o para distinguir cepas bacterianas que presenten gran similitud dentro de la misma especie o subespecie. Los fragmentos resultantes de la digestión del ADN total por la acción de las enzimas de restricción pueden ser separados por electroforesis generando un patrón de bandas, el cual es la huella dactilar de la cepa, ya que el número y localización de los sitios de restricción es específico para cada genoma.

ARDRA: AMPLIFIED RIBOSOMAL DNA RESTRICTION ANALYSES: ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN DEL ADN RIBOSOMAL AMPLIFICADO El análisis de restricción del ADN ribosomal amplificado es una técnica muy útil para la identificación y clasificación de bacterias, incluso a nivel de especie, además permite la clasificación de aislamientos y clones de manera simple, rápida y económica

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C (Extraído con permiso Albarracín, 2007-Tesis Doctoral) Patrones de restricción de los fragmentos de ADN que codifican para el ARNr 16S. A. Calles: 1. Marcador 1Kb (Promega). 2, 3 y 4. ADNr 16S del aislamiento AB0, digerido con Kpn I, Pst I y Sau3AI, respectivamente. 6, 7 y 8. ADNr 16S del aislamiento AB2C, digerido con Kpn I, Pst I y Sau3AI, respectivamente. B. Calles: 1. Marcador 1Kb (Promega). 3 y 5. ADNr 16S digerido con Sau3AI de los aislamientos AB2A y AB3, respectivamente. 7 y 8. ADNr 16S digerido con Kpn I de los aislamientos AB3 y AB5F, respectivamente. C. Calles: 1. Marcador 1Kb (Promega). ADNr 16S amplificado a partir de ADN del aislamiento AB0 y digerido con: 2. Sal I. 3. Sau3A

El poder resolutorio del ARDRA depende de la/s enzima/s utilizada/s. Primero se debe realizar una PCR para amplificar el ADNr 16s y luego se cortan los amplicones con enzimas de restricción. Los amplicones digeridos se separan por electroforesis. El método se basa en la variación en la posición de sitios de restricción entre las secuencias y en la determinación de la longitud de fragmentos de restricción. Los patrones obtenidos se pueden comparar con los ARDRA de bacterias conocidas, usando las secuencias de ADNr presentes en bases de datos, empleando la digestión in silico. La digestión in silico permite realizar una selección adecuada de las enzimas a utilizar. La digestión in silico involucra la utilización de programas de computación para simular la actividad de las enzimas de restricción sobre secuencias disponibles en bases de datos. Las secuencias de ADNr son importadas desde las bases a datos a la computadora y con ayuda de programas apropiados (por ej. DNAMAN) se simula la restricción y se analizan los fragmentos obtenidos. De esta manera se pueden seleccionar las enzimas más apropiadas para el análisis del género o especie en estudio. 3- Actividades prácticas Amplificación de genes de ADNr 16s in silico y posterior restricción con enzimas.

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012Se realizará la digestión in silico del ADNr de 3 cepas pertenecientes al género Mycoplasma, para poder diferenciar las especies, teniendo en cuenta los ARDRA obtenidos a partir de especies conocidas. De acuerdo a Stakenborg y col. (2005), todas las especies de Mycoplasma pueden diferenciarse de acuerdo a los ARDRA obtenidos usando en forma secuencial las enzimas de restricción AluI, BfaI y HpyF10VI. 1) Secuencias de ADNr de 9 cepas de Mycoplasma de referencia en formato FASTA, que pueden ser diferenciadas usando la enzima AluI: >gi|3413492|emb|AJ002269.1| Mycoplasma hominis 16S rRNA, rrnB operon, strain 7488 TTTTTTATAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCTGTGTGCCTAATACATGCAT GTCGAGCGAGGTTAGCAATAACCTAGCGGCGAATGGGTGAGTAACACGTGCTTAATCTAC CTTTTAGATTGGAATACCCATTGGAAACAATGGCTAATGCTGGATACGCATGGAACCGCAT GGTTCCGTTGTGAAAGGCGCTGTAAGGCGCCACTAAAAGATGAGGGTGCGGAACATTAGT TAGTTGGTGAGGTAATGGCCCACCAAGACTATGATGTTTAGCCGGGTCGAGAGACTGAAC GGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATATT CCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCGACACAGCGTGCACGATGAAGGTCTTCGGATTG TAAAGTGCTGTTATAAGGGAAGAACATTTGCAATAGGAAATGATTGCAGACTGACGGTACC TTGTCAGAAAGCGATGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGTCGCAAGC GTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTTCGTAGGCTGTTTGTTAAGTCTGGAGTTAAAT CCCGGGGCTCAACCCCGGCTCGCTTTGGATACTAGCAAACTAGAGTTAGATAGAGGTAAG CGGAATTCCATGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAAAGGCGAAGG CAGCTTACTGGGTCTATACTGACGCTGAGGGACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG ATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATCATTAGTCGGTGGAGAATCACTGACGCA GCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTATGCTCGCAAGAGTGAAACTTAAAGGAATT GACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTTGAAGATACACGGAAAACCT TACCCACTCTTGACATCCTTCGCAAAGCTATAGAGATATAGTGGAGGTTATCGGAGTGACA GATGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTTGGTCAAGTCCTGCAACGAGC GCAACCCCTATCTTTAGTTACTAACATTAAGTTGAGGACTCTAGAGATACTGCCTGGGTAA CTGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCTCTTACGAGTGGGGCCACACAC GTGCTACAATGGTCGGTACAAAGAGAAGCAATATGGCGACATGGAGCAAATCTCAAAAAG CCGATCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAATTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAAT CGCAGATCAGCTATGCTGCGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACA CCATGGGAGCTGGTAATACCCAAAGTCGGTTTGCTAACCTCGGAGGCGACCGCCTAAGGT AGGACTGGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTATCCCTACGAGAACGTGGGGATGGAT CACCTCC >gi|6066195|gb|AF132740.1| Mycoplasma pneumoniae strain ATCC 15531 16S ribosomal RNA gene and 16S-23S rRNA intergenic spacer, complete sequence TTAACGCTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGATCGAAAGTAGTAATACTTTAGAGGC GAACGGGTGAGTAACACGTATCCAATCTACCTTATAATGGGGGATAACTAGTTGAAAGACT AGCTAATACCGCATAAGAACTTTGGTTCGCATGAATCAAAGTTGAAAGGACCTGCAAGGGT TCGTTATTTGATGAGGGTGCGCCATATCAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGC AATGACGTGTAGCTATGCTGAGAAGTAGAATAGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCAT ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCAA TGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTTAAGATTGTAAAGTTCTTTTATTTGGGAAGAATGACTT

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012TAGCAGGTAATGGCTAGAGTTTGACTGTACCATTTTGAATAAGTGACGACTAACTATGTGC CAGCAGTCGCGGTAATACATAGGTCGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCAA GCGCAGGCGGATTGAAAAGTCTGGTGTTAAAGGCAGCTGCTTAACAGTTGTATGCATTGG AAACTATTAATCTAGAGTGTGGTAGGGAGTTTTGGAATTTCATGTGGAGCGGTGAAATGCG TAGATATATGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGAAAACTTAGGCCATTACTGACGCTTAG GCTTGAAAGTGTGGGGAGCAAATAGGATTAGATACCCTAGTAGTCCACACCGTAAACGAT AGATACTAGCTGTCGGGGCGATCCCCTCGGTAGTGAAGTTAACACATTAAGTATCTCGCCT GGGTAGTACATTCGCAAGAATGAAACTCAAACGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGTGGT GGAGCATGTTGCTTAATTCGACGGTACACGAAAAACCTTACCTAGACTTGACATCCTTGGC AAAGTTATGGAAACATAATGGAGGTTAACCGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAG CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCGTTAGTTACA TTGTCTAGCGAGACTGCTAATGCAAATTGGAGGAAGGAAGGGATGACGTCAAATCATCAT GCCCCTTATGTCTAGGGCTGCAAACGTGCTACAATGGCCAATACAAACAGTCGCCAGCTT GTAAAAGTGAGCAAATCTGTAAAGTTGGTCTCAGTTCGGATTGAGGGCTGCAATTCGTCCT CATGAAGTCGGAATCACTAGTAATCGCGAATCAGCTATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGG TCTTGTACACACCGCCCGTCAAACTATGAAAGCTGGTAATATTTAAAAACGTGTTGCTAACC ATTAGGAAGCGCATGTCAAGGATAGCACCGGTGATTGGAGTTAAGTCGTAACAAGGTACC CCTACGAGAACG >gi|12698861|gb|AF332744.1| Mycoplasma agalactiae strain 847.121 16S ribosomal RNA gene, partial sequence CTGGCTGTGTGCCTAATACATGCATGTCGAGCGATGATAGCAATATCATAGCGGCGAATG GGTGAGTAACACGTACTCAACGTACCTTTTAGATTGGGATAGCGGATGGAAACATCCGATA ATACCGAATACTTATTATTTTTGCATGAAAGTAATATAAAAGGAAGCGTTTGCTTCGCTAGA AGATCGGAGTGCGCAACATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAGGCGATGATGT TTAGCGGGGTTGAGAGATTGATCCGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTAC GGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCGACACAGCG TGCAGGATGAAGGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTGTGGTTAGGGAAGAAAAAGTAGCGTA GGAAATGACGCTACCTTGACGGTACCTGATTAGAAAGCAACGGCTAACTATGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACATAGGTTGCAAGCGTTATCCGAAATTATTGGGCGTAAAGCGTCTGTAG GTTGTTTGTTAAGTCTGGCGTTAAATTTTGGGGCTCAACCCCAAAACGCGTTGGATACTGG CAGACTAGAGTTATGTAGAGGTTAGCGGAATTCCTTGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATAT AAGGAAGAACATCAATATGGCGAAGGCAGCTAACTGGGCATACACTGACACTGAGAGACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATCA TTAGTTGATGGGGAACTCATCGACGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTACG TTCGCAAGAATAAAACTTAAAGGAATTGACGGGGATCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTTGAAGATACGCGTAGAACCTTACCCACTCTTGACATCTTCTGCAAAGCTATGGAG ACATAGTGGAGGTTAACAGAATGACAGATGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GATGTTCGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTACTACCATTTAGTTGA GCACTCTAAGGAGACTGCCCGAGTAATCGGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATC ATGCCTCTTACGAGTGGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGAAGCGAAG TGGTGACATGGAGCAAACCTCAAAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGA CTTCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCTACGCTACGGTGAATACGTTCTC GGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGAAGTCGGTTTAT TAAGAAACTGCCTAAGGCAGGACTGGTGACTGGGGTTAAGTCGTAACAAGGTATCCCTAC GAGAAC >gi|175468|gb|M24289.1|MYCRRNAF M.fermentans ribosomal RNA small subunit

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012NNTTTTTCGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCTGTGTGCCTAATACATGCA TGTCGAGCGAAGGTAGCAATACCTTAGCGGCGAATGGGTGAGTAACACGTGCTCAACGTA CCCTTCAGTTTGGCATAGCGACTGGAAACAGTCGATAATTTCAAATACTCGTAGTTTTCGCA TGAAGATTACGGAAAAGAAGCNTTTCTTCGCTGGAGGAGCGGGGTGCGTAACATTAGCTA GTTGGTGAGGTAACGGCCCACNAAGGCGATAATGTTTNGCGGGGTTGAGAGACTGAACC GCCACACTGGGACTGAGATACGGCCNNGACTCCTACGGGAGGCNGCNGTAGGGAATNTT CCACNATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCGACACAGCGTGAAGGATGAAGGTCCTATGGAT TGTAAACTTCTGTGGTAAGGGAAGAAAAGACAGAATAGGAAATGATTTTGTTTTGACGGTA CCTNATTNGAAAGCAACGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGTTGCNA GCGTTATCCGGAATTNTTGGGCGTAAAGCGTCTGTAGGTTGTTTGTTAAGTCTGGCGTTAA ATTTTGGGGCTCAACCCCAAAACGCGTTGGATACTGGCAGGCTAGAGTTGTGTNGAGGTT AGCGGAATTCCTTGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATAAGGAAGAACACCAAGATGGCG AAGGCAGCTAACTGGACATATACTGACACTGAGAGACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATCATTAGCTGATGGGGAACTCATCG GCGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTACGTTCGCAAGAATAAAACTTAAAG GAATTGACGGGGATCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTTGAAGATACGCGTAG AACCTTACCCACTCTTGACATCTTCTGCAAAGCTATGGAGACATAGTGGAGGTTAACAGAA TGACAGATGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTTGGTTAAGTCCTGCAA CGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTACTACCATTTAGTTGAGGACTCTAAGGAGACTGCCCG AGTAATCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCTCTTACGAGTGGGGCAA CACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGAAGCGAAGTGGTGACATGGAGCAAACCTCA AAAAACCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGTCGGAATCGCTA GTAATCGTAGATCNCGTACGCTACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGT CAAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGAAGTCGGTTTATNAACAAATCGCCTAAGGCAGGA CTGGTGACTGGGG >gi|862689|gb|U26047.1|MCU26047 Mycoplasma capricolum capricolum E570 16S ribosomal RNA (rrnA) gene, partial sequence CTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGGGGGTGCTTGCACCTCAGTGGCGAACG GGTGAGTAACACGTATCTAACCTACCTTATAGCGGGGGATAACTTTTGGAAACGAAAGATA ATACCGCATGTAGATCTTATTATCGCATGAGAAAAGATCAAAAGAACCGTTTGGTTCACTAT GAGATGGGGATGCGGCGTATTAGCTAGTAGGTGAGATAATAGCCCACCTAGGCGATGATA CGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGGACGAAAGTCTGATGAAGCAATGCCGCG TGAGTGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTTGTAAGGGAAGAAAAAATAAAGTAG GAAATGACTTTATCTTGACAGTACCTTACCAGAAAGCCACGGCTAACTATGTGCCAGCAGC CGCGGTAATACATAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTATAGGGTGCGTAGG CGGTTTTGCAAGTTTGAGGTTAAAGTCCGGAGCTCAACTCCGGTTCGCCTTGAAAACTGTT TTACTAGAATGCAAGAGAGGTAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATA TGGAAGAACACCTGTGGCGAAAGCGGCTTACTGGCTTGTTATTGACGCTGAGGCACGAAA GCGTGGGGAGCAAATAGGATTAGATACCCTAGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTA AGTGTTGGGGTAACTCAGCGCTGCAGCTAACGCATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTATGCT CGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGTGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGAAGCAACACGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCAGTGCAAAGCTATAGAG ATATAGTAGAGGTTAACATTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGTTCGTGCCGTGAG GTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAACGCAACCCTTGTCGTTAGTTACTAACATTAAGTTGA GAACTCTAACGAGACTGCTAGTGTAAGCTAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCA TGCCCCTTATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCTGGTACAAAGAGTTGCAATCCT

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012GTGAAGGGGAGCTAATCTCAAAAAACCAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACT TCATGAAGCCGGAATCACTAGTAATCGCGAATCAGCTATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGG GTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGGTAATACCAGAAGTAGGTAGCTTAA CCATTTGGAGAGCGCTTCCCAAGGTAGGACTAGCGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA TCCGTACGGGAAC >gi|4883887|gb|AF125586.1| Mycoplasma buccale strain CH20247(T) 16S ribosomal RNA gene, partial sequence CTGGCTGTGTGCCTAATACATGCATGTCGAGCGGAAGTAGCAATACTTTAGCGGCGAATG GGTGAGTAACACGTGCTTAATCTACCTTTTAGATTGGAATACCCAATGGAAACATTGGTTAA TGCCGGATACGCATAGAATCGCATGATTCTGTTGTGAAAGAAGCGTTTGCTTCACTAAGAG ATGAGGGTGCGGAACATTAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCCCACCAAGGCTATGATGTTTA GCCGGGTCGAGAGACTGAACGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAAACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATATTCCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCGACACAGCGTG CATGATGACGGTCTTCGGATTGTAAAGTGCTGTTATAAGGGAAGAACACTTAGTTGAGGAA ATGCTTCTAAGCTGACGGTACCTTATTAGAAAGCGATGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACATAGGTCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTTCGTAGGCTGT TTATTAAGTCTGAAGTCAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGTTCGCTTTGGATACTGGTAAAC TAGAGTTGGATAGAGGTAAGCGGAATTCCATGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATATATG GAAGAACACCAAAGGCGAAGGCAGCTTACTGGGTCTATACTGACGCTGAGGGACGAAAG CGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATCATTAG TCGGTGGAGAATCACTGACGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTATGCTCG CAAGAGTGAAACTTAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA ATTTGAAGATACACGGAGAACCTTACCCACTCTTGACATCCTTCGCAATACTATAGAGATAT AGTGGAGGTTAACGGAGTGACAGATGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATG TTTGGTCAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTTAGTTACTAACGAGTCATGTCGAG GACTCTAGAGATACTGCCTGGGTAACTGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCAT GCCTCTTACGAGTGGGGCAACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGAGAAGCAATATG GCGACATGGAGCAAATCTCAAAAAGCCGATCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAATTCGACT TCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCTATGCTGCGGTGAATACGTTCTCGG GTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCTGGTAATACCCAAAGTCGGTTTGCTAA CCTCGGAGGCGACTGCCTAAGGTAGGACTGGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTATC CCTACGAGAAC >gi|18151396|dbj|AB069815.1| Mycoplasma lipophilum gene for 16S rRNA, partial sequence ATTTTGGGGCTCAACCCCAACTCGCGTTGGATACTGGCAAGCTAGAGTTATGTAGAGGTTA GCGGAATTCCATGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAAGATGGCGA AGGCAGCTAACTGGACATACACTGACACTGAGAGACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATCATTAGTTGATGGGAGACTCATCGA CGCAGCT >gi|7008158|gb|AF221111.1| Mycoplasma caviae isolate G122(T) 16S ribosomal RNA gene, partial sequence CTGGCTGTGTGCCTAATACATGCATGTCGAGCGAAGGTAGCAATACCTTAGCGGCGAATG GGTGAGTAACACGTGCTCAACGTACCCTTCAGTTTGGCATAGCGACTGGAAACAGTCGAT AATTCCAAATACTCGTAATTTTCGCATGAAGATTACGTAAAAGARGCGTTTGCTTCGCTGRA GGATCGGGGTGCGTAACATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAGGCGATGATGT

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012TTAGCGGGGTTGAGAGACTGAACCGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTAC GGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCGACACAGCG TGAAGGATGAAGGTCCTATGGATTGTAAACTTCTGTGGTGAGGGAAGAAAAGACAGAATA GGAAATGATTTTGTTTTGACGGTACCTTATTAGAAAGCAACGGCTAACTATGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACATAGGTTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCTGTAGG TTGTTTGTTAAGTCTGGCGTTAAATTTTGGGGCTCAACCCCAAAACGCGTTGGATACTGGC AGACTAGAGTTGTGTAGAGGTTAGCGGAATTCCTTGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATA AGGAAGAACACCAATATGGCGAAGGCAGCTAACTGGACATATACTGACACTGAGAGACGA AAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATCAT TAGCTGATGGGGAACTCATCGGCGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTACG TTCGCAAGAATAAAACTTAAAGGAATTGACGGGGATCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTTGAAGATACGCGTAGAACCTTACCCACTCTTGACATCTTCTGCAAAGCTATGGAG ACATAGTGGAGGTTAACAGAATGACAGATGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GATGTTCGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTACTACCATTTAGTTGA GGACTCTAAGGAGACTGCCCGAGTAATCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATC ATGCCTCTTACGAGTGGGGCAACACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGAAGCGAAG TGGTGACATGGAGCAAACCTCAAAAAACCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGA CTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCTACGCTACGGTGAATACGTTCTC GGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGAAGTCGGTTTAT AAACAAACTGCCTAAGGCAGGACTGGTGACTGGGGTTAAGTCGTAACAAGGTATCCCTAC GAGAAC >gi|3294488|gb|U67946.1|MYU67946 Mycoplasma yeatsii strain GIH 16S ribosomal RNA (rrn) gene, partial sequence CTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGGGGGTGCTTGCACCCCAGTGGCGAAC GGGTGAGTAACACGTATCTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTTTTGGAAACGAAAGAT AATACCGCATGTGAATCTTATTATCGCATGAGAAAAGATTGAAAGGACCGTTTGGTTCACT ATGAGATGGGGATGCGGCGTATTAGCTAGTAGGTGAKGTAATGGCTCACCTAGGCGATGA TACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCC TACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGGACGAAAGTCTGATGAAGCAATGCCG CGTGAGTGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTTGTAAGGGAAGAAAAAATAGAGT AGGAAATGCCTCTATATTGACGGTACCTTACCAGAAAGCCACGGCTAACTATGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACATAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTATAGGGTGCGTA GGCGGTTTTGCAAGTTTGAGGTTAAAGCCCGGAGCTCAACTCCGGTTCGCCTTGAAAACTG CATTACTAGAATGCAAGAGAGGTAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAT ATATGGAAGAACACCTGTGGCGAAAGCGGCTTACTGGCTTGTTATTGACGCTGAGGCACG AAAGCGTGGGGAGCAAATAGGATTAGATACCCTAGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTA CTAGGTGTTGGGGTCATCTCAGCGCCGCAGCTAACGCATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGT ATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGTGGTGGAGCAT GTGGTTTAATTCGAAGCAACACGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCAGTGCAAAGCTA TAGAGATATAGTGGAGGTTAACATTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGTTCGTGCC GTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAACGCAACCCTTGTCGTTAGTTACTAACATTAA GTTGAGGACTCTAACGAGACTGCTAGTGTAAGCTAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAAT CATCATGCCCCTTATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCTGGTACAAAGAGTCGCA ATCTCGCGAGGGGGAGCTAATCTCAAAAAGCCAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAAC TCGACTTCATGAAGCCGGAATCACTAGTAATCGCGAATCAGCTATGTCGCGGTGAATACGT TCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGGTAATACCAGAAGTGGGT

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012AGCTTAACCGCAAGGAGAGCGCCTCCCAAGGTAGGACTGGCGATTGGGGTGAAGTCGTA ACAAGGTATCCGTACGGGAAC >gi|409968|gb|U02968.1|U02968 Mycoplasma bovis 16S ribosomal RNA (rrnA) gene, complete sequence CAATTTTTCGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCTGTGTGCCTAATACATGC ATGTCGAGCGATGATAGCAATATCATAGCGGCGAATGGGTGAGTAACACGTACTCAACGT ACCTTTTAGATTGGGATAGCGGATGGAAACATCCGATAATACCGAATACTTATTATTTTTGC ATGAAAGTAATATAAAAGGAAGCGTTTGCTTCGCTAAAAGATCGGAGTGCGCAACATTAGC TAGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAGGCGATGATGTTTAGCGGGGTTGAGAGATTGATC CGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATAT TCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCGACACAGCGTGCAGGATGAAGGCCCTATGGGT TGTAAACTGCTGTGGTTAGGGAAGAAAAAGTAGCATAGGAAATGATGCTACCTTGACGGTA CCTGATTAGAAAGCAACGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGTTGCAA GCGTTATCCGAAATTATTGGGCGTAAAGCGTCTGTAGGTTGTTTGTTAAGTCTGGCGTTAA ATTTTGGGGCTCAACCCCAAAACGCGTTGGATACTGGCAGACTAGAGTTATGTAGAGGTTA GCGGAATTCCTTGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATAAGGAAGAACATCAATATGGCGA AGGCAGCTAACTGGGCATACACTGACACTGAGAGACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATCATTAGTTGATGGGGAACTCATCGA CGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTACGTTCGCAAGAATAAAACTTAAAGG AATTGACGGGGATCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTTGAAGATACGCGTAGA ACCTTACCCACTCTTGACATCTTCTGCAAAGCTATAGAGACATAGTGGAGGTTAACAGAAT GACAGATGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCTGCAAC GAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTACTACCATTTAGTTGAGCACTCTAAGGAGACTGCCCGA GTAATCGGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCTCTTACGAGTGGGGCTAC ACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGAAGCGAAGTGGTGACATGGAGCAAACCTCAA AAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTCGGAATCGCTAG TAATCGTAGATCAGCTACGCTACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTC AAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGAAGTCGGTTTATAAAGAAACTGCCTAAGGCAGGAC TGGTGACTGGGGTTAAGTCGTAACAAGGTATCCCTACGAGAACGTGGGGATGGATTACCT CCTTTCT 2) Secuencias de ADNr de 3 cepas de Mycoplasma en formato FASTA: >Secuencia 1 CTGGCTGTGTGGCTAATACATGCATGTCGAGCGAAGGTAGCAATACCTTAGCGGCGAATG GGTGAGTAACACGTGCTCAACGTACCCTTCAGTTTGGCATAGCGACTGGAAACAGTCGAT AATTCCAAATACTCGTAATTTTCGCATGAAGATTACGTAAAAGAGGCGTTTGCTTCGCTGRA GGATCGGGGTGCGTAACATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAGGCGATGATGT TTAGCGGGGTTGAGAGACTGAACGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTAC GGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCGACACAGCG TGAAGGATGAAGGTCCTATGGATTGTAAACTTCTGTGGTGAGGGAAGAAAAGACAGAATA GGAAATGATTTTGTTTTGACGGTACCTTATTAGAAAGCAACGGCTAACTATGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACATAGGTTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCTGTAGG TTGTTTGTTAAGTCTGGCGTTAAATTTTGGGGCTCAACCCCAAAACGCGTTGGATACTGGC AGACTAGAGTTGTGTAGAGGTTAGCGGAATTCCTTGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATA AGGAAGAACACCAATATGGCGAAGGCAGCTAACTGGACATATACTGACACTGAGAGACGA AAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATCAT

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012TAGCTGATGGGGAACTCATCGGCGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTACG TTCGCAAGAATAAAACTTAAAGGAATTGACGGGGATCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTTGAAGATACGCGTAGAACCTTACCCACTCTTGACATCTTCTGCAAAGCTATGGAG ACATAGTGGAGGTTAACAGAATGACAGATGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GATGTTCGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTACTACCATTTAGTTGA GGACTCTAAGGAGACTGCCCGAGTAATCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATC ATGCCTCTTACGAGTGGGGCAACACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGAAGCGAAG TGGTGACATGGAGCAAACCTCAAAAAACCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGA CTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCTACGCTACGGTGAATACGTTCTC GGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGAAGTCGGTTTAT AAACAAACTGCCTAAGGCAGGACTGGTGACTGGGGTTAAGTCGTAACAAGGTATCCCTAC GAGAAG >Secuencia 2 CTGGCTGTGTGCCTAATACATGCATGTCGAGCGATGATAGCAATATCATAGCGGCGAATG GGTGAGTAACACGTACTCAACGTACCTTTTAGATTGGGATAGCGGATGGAAACATCCGATA ATACCGAATACTTATTATTTTTGCATGAAAGTAATATAAAAGGAAGCGCTTGCTTCGCTAGA AGATCGGAGTGCGCAACATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAGGCGATGATGT TTAGCGGGGTTGAGAGATTGATCCGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTAC GGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCGACACAGCG TGCAGGATGAATGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTGTGGTTAGGGAAGAAAAAGTAGCGTA GGAAATGACGCTACCTTGACGGTACCTGATTAGAAAGCAACGGCTAACTATGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACATAGGTTGCAAGCGTTATGCGAAATTATTGGGCGTAAAGCGTCTGTAG GTTGTTTGTTAAGTCTGGCGTTAAATTTTGGGGCTCAACCCCAAAACGCGTTGGATACTGG CAGACTAGAGTTATGTAGAGGTTAGCGGAATTCCTTGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATAT AAGGAAGAACATCAATATGGCGAAGGCAGCTAACTGGGCATACACTGACACTGAGAGACG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATCA TTAGTTGATGGGGAACTCATCGAGGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTACG TTCGCAAGAATAAAACTTAAAGGAATTGACGGGGATCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTTGAAGATACGCGTAGAACCTTACCCACTCTTGACATCTTCTGCAAAGCTATGGAG ACATAGTGGAGGTTAACAGAATGACAGATGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GACGTTCGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTACTACCATTTAGTTGA GCACTCTAAGGAGACTGCCCGAGTAATCGGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATC ATGCCTCTTACGAGTGGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGAAGCGAAG TGGTGACATGGAGCAAACCTCAAGAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGA CTTCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCTACGCTACGGTGAATACGTTCTC GGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGAAGTCGGTTTAT TAAGAAACTGCCTAAGGCAGGACTGGTGACTGGGGTTAAGTCGTAACAAGGTATCCCTAC GAGAAC >Secuencia 3 CTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGGGGGTGCTTGCACCTCAGTGGCGAACG GGTGAGTAACACGTATCTAACCTACCTTATAGCGGGGGATAACTTTTGGAAACGAAAGATA ATACCGCATGTAGATCTTATTATCGCATGAGAAAAGATCAAAAGAACCGTTTGGTTCACTAT GAGATGGGGATGCGGCGTATTAGCTAGTAGGTGAGATAATAGCCCACCTAGGCGATGATA CGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGGACGAAAGTCTGATGAAGCAATGCCGCG TGAGTGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTTGTAAGGGAAGAAAAAATAAAGTAG

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -2012GAAATGACTTTATCTTGACAGTACCTTACCAGAAAGCCACGGCTAACTATGTGCCAGCAGC CGCGGTAATACATAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTATAGGGTGCGTAGG CGGTTTTGCAAGTTTGAGGTTAAAGTCCGGAGCTCAACTCCGGTTCGCCTTGAAAACTGTT TTACTAGAATGCAAGAGAGGTAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATA TGGAAGAACACCTGTGGCGAAAGCGGCTTACTGGCTTGTTATTGACGCTGAGGCACGAAA GCGTGGGGAGCAAATAGGATTAGATACCCTAGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTA AGTGTTGGGGTAACTCAGCGCTGCAGCTAACGCATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTATGCT CGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGTGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGAAGCAACACGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCAGTGCAAAGCTATAGAG ATATAGTAGAGGTTAACATTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGTTCGTGCCGTGAG GTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAACGCAACCCTTGTCGTTAGTTACTAACATTAAGTTGA GAACTCTAACGAGACTGCTAGTGTAAGCTAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCA TGCCCCTTATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCTGGTACAAAGAGTTGCAATCCT GTGAAGGGGAGCTAATCTCAAAAAACCAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACT TCATGAAGCCGGAATCACTAGTAATCGCGAATCAGCTATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGG GTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGGTAATACCAGAAGTAGGTAGCTTAA CCATTTGGAGAGCGCTTCCCAAGGTAGGACTAGCGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA TCCGTACGGGAAC 3) Con ayuda del programa DNAMAN, realizar la digestión in silico de las 13 secuencias: 1. Al abrir el programa se verá la siguiente pantalla:

2. Agregar las secuencias: seleccionar el canal y pegar la secuencia en la parte inferior

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3. Abrir Sequence/Current channel/Analysis definition. En Name reemplazar Unknown por el nombre de la cepa 4. Cargar las 13 cepas, una en cada canal

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Cátedra Biología Molecular Facultad de Ciencias Naturales e IML -20125. Para realizar el corte con la enzima AluI, ir a Restriction/Restriction Analysis y seleccionar Restriction pattern in graphic window (presenta un esquema con el patrón de restricción en gel de agarosa) y All DNA in sequence channe (realiza el corte para todas secuencias agregadas). Seleccionar Siguiente

6. Seleccionar

Cutter: All (número de pares de bases que reconoce la enzima) End: All (tipo de corte que realiza)

De la lista de la izquierda seleccionar (con doble clic) la enzima AluI Seleccionar siguiente

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7. Comparar el perfil de restricción obtenido para las secuencias desconocidas con el perfil de las cepas de referencia y determinar a qué especies pertenecen la Secuencia 1, la Secuencia 2 y la Secuencia 3.

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