Cátedra de Microbiología General- FaCENA-UNNE

Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS MICROBIOLOGIA GENERAL CARRERA: BIOQUÍMICA CÁTEDRA: MICROBIOLOGÍA GENERAL AUTORES:

LAURA MARÍA MARÍA MARÍA

IRENE PICCOLI VIVIANA BOJANICH DE LOS ANGELES LÓPEZ DE LOS ANGELES SOSA

AÑO: 2010

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BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Un accidente ocurre por múltiples causas, pero casi siempre se debe a errores humanos, con excepción de las grandes catástrofes debidas a fenómenos atmosféricos. Una vez ocurrido dicho accidente, su consecuencia puede ser banal, Terminal o grave. Por lo tanto, resulta de vital importancia que dicho accidente no ocurra y para ello es necesario conocer los hábitos de trabajo en el laboratorio de microbiología así como también los peligros potenciales que encierra el manejo de material biológico y reactivos químicos de diferente naturaleza, y aquellos altamente tóxicos y/o cancerígenos. Resulta de fundamental importancia considerar en todo momento que, cuando se manejan agentes infecciosos, existe siempre una posibilidad de infección, tanto para el operador como para otras personas, en caso de negligencia o descuido. A continuación se enumeran una serie de precauciones que deben ser consideradas para reducir el riesgo de adquirir infecciones y permitir el adecuado trabajo en el laboratorio: 1. Los ojos, la boca, la nariz, las pequeñas abrasiones presentes en nuestras manos constituyen sitios efectivos de entrada para los microorganismos. En consecuencia, se recomienda no comer, beber, fumar ni tocarse la cara durante la realización del trabajo práctico, así como también el lavado de manos previo y posterior una vez finalizado el mismo. 2. El uso de guardapolvo será imprescindible para la protección del operador. El mismo deberá ser higienizado periódicamente y además deberá evitar el contacto con ropa de calle. 3. Mientras se maneja material estéril, es conveniente no hablar ni circular por el laboratorio, de manera tal de evitar las corrientes de aire y por ende disminuir el riesgo de contaminación. 4. Con el fin de reducir la contaminación de material estéril, las mesadas deberán ser limpiadas con un trapo o papel embebidos en una solución desinfectante (por ejemplo, lavandina o etanol 70%) antes y después de trabajar. 5. El material contaminado será descartado en recipientes provistos para tal efecto. Nunca se volcarán cultivos de microorganismos en las piletas. 6. Los cultivos deberán ser rotulados con nombre o número identificatorio, nombre del material y fecha. La incubación de los mismos es responsabilidad del operador. 7. Los microscopios ópticos serán limpiados y guardados adecuadamente. Los reactivos se ubicarán en una zona del laboratorio destinada para tal fin. Se deberá revisar si los mecheros quedaron correctamente apagados una vez finalizado el trabajo. Cuando por razones ajenas a la voluntad de los operadores ocurre un accidente, es obligatorio saber las conductas a seguir dado que el devenir de la salud de las personas involucradas depende del tiempo en que se pone en práctica el auxilio correcto. En particular, si un cultivo es volcado o roto su envase, o si alguien resultara herido en tal episodio, se deberá informar de inmediato a la persona responsable a cargo del trabajo en el laboratorio. Deseamos transmitir que todas las medidas de bioseguridad no son per se prohibitivas o represivas, se trata de preservar la salud e integridad de los operadores interesados en aprender correctamente el manejo de microorganismos.

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Trabajo Práctico Nº : PREPARACIÓN DE MATERIALES Y ESTERILIZACIÓN Objetivos:   

Que el alumno conozca los diferentes materiales con los que se desarrollan los prácticos de Microbiología General que el alumno se familiarice con los métodos que existen para la esterilización de los materiales en el laboratorio de bacteriología. que aprenda a decidir cual es el método o procedimiento de esterilización mas adecuado según el material que desea esterilizar.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS. Esterilización: Concepto y métodos. La esterilización es un proceso a través del cual un objeto o sustancia queda libre de todo organismo viviente, en términos de viabilidad, la capacidad que ese organismo posee para dividirse. Existen varios métodos prácticos para esterilizar: la elección depende, fundamentalmente, de la naturaleza de los materiales a esterilizar y de la conveniencia. Asimismo, se pueden emplear distintos métodos de desinfección mediante agentes que sólo disminuyen el riesgo de contaminación sin garantizar la eliminación de todo organismo viviente, fundamentalmente por la eliminación de los micoorganismos patógenos. Es decir, la desinfección elimina el potencial infectivo de un material. A su vez, un antiséptico se opone a la sepsis o a la putrefacción, ya sea por acción letal de los microorganismos o impidiendo su desarrollo. Este término se emplea con frecuencia para aquellos agentes que se aplican en forma tópica sobre los tejidos vivos. La elección de un procedimiento o agente apropiado está determinada por la situación específica y por el hecho de que sea necesario destruir a todos los microorganismos (m.o.) o sólo a ciertas especies. La destrucción completa de todos los m.o. presentes sobre cualquier material o dentro de él, es indispensable en los procedimientos quirúrgicos, en la preparación de medios de cultivo y material de vidrio utilizado en el laboratorio de Microbiología, y en el envasado de alimentos, por ejemplo. En el cuidado de personas con enfermedades transmisibles, la destrucción del patógeno es necesaria para prevenir la diseminación de la infección a personas susceptibles. Con este propósito, una desinfección resulta adecuada y, en general, se la emplea en el procedimiento de limpieza. La esterilización o desinfección pueden llevarse a cabo según dos métodos: 1- Métodos físicos: Agentes Calor húmedo Calor seco Radiación ultravioleta Radiaciones ionizantes (γ, x) Filtración

Aplicación Esterilización Esterilización Desinfección o Esterilización Esterilización Esterilización

2- Métodos químicos: Agentes Oxido de etileno Formaldehído Alcoholes (alifáticos y aromáticos) Oxidantes: halógenos, KMnO4, H2O2 Tensioactivos catiónicos y aniónicos Metales pesados Soluciones de ácidos o álcalis Alquilantes

Aplicación Esterilización Desinfección o Esterilización Desinfección Desinfección o antisepsia Desinfección Desinfección o antisepsia Desinfección

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METODOS FISICOS 1- Esterilización por calor. a) Calor Húmedo. Es proporcionado por autoclaves, aparatos especiales capaces de generar vapor bajo presión. El principio esterilizante del autoclave se basa en la acumulación de vapor y no en la presión desarrollada en su interior. El vapor se condensa en los objetos más fríos y los calienta instantáneamente cediéndoles su calor latente. La esterilización en autoclave se lleva a cabo desde 15 a 30 min a 121 ºC, condiciones que corresponden a una presión aproximada de 1,1 Kg/cm 2 . El tiempo es necesario para que el vapor penetre y caliente los materiales hasta la temperatura esterilizante que causa coagulación y desnaturalización de las estructuras proteicas y enzimáticas. Aún cuando dicha temperatura es alcanzada, las esporas y células vegetativas no mueren todas instantáneamente; en general se requiere alrededor de 12 min a 121ºC para matar endosporas. Precauciones: 1- el vapor debe estar libre de impurezas e idealmente proporcionado a partir de agua destilada. 2- La carga debe estar acomodada de manera tal que el vapor pueda circular libremente. 3- Aquellos artículos que se encuentren cerrados herméticamente no estarán estériles al finalizar la operación (hay que permitir un intercambio gaseoso eficiente para garantizar una esterilización adecuada). 4- Los frascos con medios líquidos no deben llenarse más de las 2/3 partes de su contenido, ya que el líquido se volcará durante el proceso. 5- Transcurrido el tiempo, la presión debe disminuir lentamente para evitar la ebullición violenta de las soluciones.  En autoclave se esterilizan soluciones salinas, ropa, guantes, materiales de cirugía, tapones, gomas. Para la esterilización de ciertos medios de cultivo líquidos que contienen hidratos de carbono, huevo o suero, o materiales semisólidos que son destruidos con facilidad por el calor, se recurre a un método de esterilización fraccionada. Este procedimiento denominado tindalización, consiste en el calentamiento del material a 80ºC o 100ºC durante 30 min, en 3 días consecutivos. El fundamento de esta metodología es que las células vegetativas y algunas esporas resultan destruidas durante el primer calentamiento y las esporas más resistentes germinan luego y son destruidas durante el segundo o tercer ciclo de calentamiento. La mayor parte de las bacterias en sus formas vegetativas pueden ser destruidas por exposiciones breves de 60 a 65ºC. La aplicación más importante de este rango de temperatura se relaciona con la pasteurización de leche y preparación de vacunas. La pasteurización de la leche consiste en el calentamiento a una temperatura de 72ºC durante 1 o 2 min, seguido de un enfriamiento rápido. Esto no esteriliza la leche, pero sí destruye todas las bacterias productoras de enfermedades que son transmitidas por la leche. b) Calor Seco. Los generadores de calor seco son hornos, y la esterilización se produce cuando los objetos fríos absorben el calor del aire caliente que los rodea. Esta absorción es lenta, por lo que se requiere mayor tiempo para asegurar el proceso (30 min a 121ºC en autoclave corresponden a 2 horas a 160ºC en horno). El calor seco destruye los microorganismos por oxidación de sus constituyentes esenciales. Precauciones: 1- Debe dejarse suficiente espacio entre los materiales ubicados en el interior del horno para que el calor se distribuya uniformemente.

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2- El tiempo mínimo es de 2 horas a 160-165ºC, pero en general se deja más tiempo ya que resulta muy difícil lograr la distribución uniforme del calor, en especial si la cantidad de material cargada en el horno es muy grande. 3- Una vez terminado el tiempo, es necesario permitir que los materiales se enfríen antes de abrir las puertas del horno para evitar bruscas contracciones que pudieran provocar la ruptura de los materiales.  A través de este método se esteriliza la mayor parte del material de vidrio (frascos, pipetas, tubos) así como ceras de parafina, aceites y polvos de talco. Incineración por llama. Este método se usa para esterilizar la boca de los frascos y tubos, ansas, tijeras, pinzas, etc. Las pinzas y tijeras deben sumergirse previamente en alcohol 96% sosteniéndolas hacia abajo para evitar que el alcohol impregne los dedos y se incendie al flamear. Este tipo de rutina se utiliza cuando se trabaja cerca del mechero en microbiología, evitando cualquier contaminación accidental. Incineración: procedimiento de esterilización ideal de todos aquellos productos contaminados en la cual no interesa su destrucción. Se usa para la esterilización y posterior eliminación de material biológico potencialmente infeccioso 2- Radiaciones. a) Radiación ultravioleta. Su efectividad como agente letal y mutágeno depende de la longitud de onda. La longitud de onda más efectiva como bactericida se encuentra en el espectro de 240 a 280 nm, con un óptimo a 260 nm, que corresponde con la máxima absorción del DNA. La radiación UV conduce a la formación de uniones covalentes entre residuos de pirimidina adyacentes entre sí ubicados en la misma hebra, dando lugar a la formación de dímeros de pirimidina. Éstos interfieren en el apareamiento normal de las bases y el resultado final es la inhibición de la síntesis del DNA. La radiación UV es efectiva contra m.o. Gram positivos y Gram negativos. Este tipo de radiación presenta algunos inconvenientes para ser usada como agente esterilizante. Su energía es baja y su capacidad de penetración es escasa. Por lo tanto su aplicación principal consiste en el control de infecciones transmitidas por el aire, donde se la emplea para la desinfección de áreas cerradas como las salas de hospitales, quirófanos y laboratorios. b) Radiaciones ionizantes. Es tipo de radiación es de alta penetración e incluye rayos x y γ. Su acción letal se produce en forma indirecta. A medida que las radiaciones ionizantes atraviesan el H2O provocan la ionización de sus moléculas: H2 O → H 2 O+ + e+ H 2 O + H2 O → H3 O+ + OHH2 O + e- → OH- + H+ El OH- es un agente oxidante fuerte y el radical H es un poderoso agente reductor. El OH - es altamente reactivo con macromoléculas, en especial de DNA, al que rompe produciendo una fractura en las cadenas consecutivas. A su vez, la presencia de O2 con los radicales libres hace que los mismos formen parte de una cadena de reacciones autooxidativas destructivas. 

Las radiaciones ionizantes son adecuadas para la esterilización de material quirúrgico, médico y de laboratorio descartable y en general en procesos de esterilización en gran escala.

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3- Filtración.  Es el principal método para esterilizar líquidos que contienen componentes sensibles al calor, tales como vitaminas, proteínas séricas, antibióticos y soluciones salinas definidas. Consiste en hacer pasar líquidos por un material que posee poros más pequeños que las bacterias e incluso más pequeños que los virus, con lo cual aquellos quedan libres de microorganismos, según el tamaño de dichos poros. Los filtros más usados son:  Filtros de porcelana micro porosa  Filtros de asbesto  Filtros de vidrio molido  Filtros de acetato de celulosa Para cualquier tipo de filtro, hay dos sistemas de filtración: 1- al vacío por succión o 2mediante presión positiva. En general, no se debe filtrar demasiado material a través de un filtro en un tiempo determinado, o continuar el proceso durante tiempo prolongado. Si el volumen a filtrar es grande o la tasa de filtración es lenta, es preferible usar vario filtros.

METODOS QUIMICOS La reducción de la cantidad de m.o. se obtiene a través del empleo de germicidas o desinfectantes que resultan muy tóxicos para todos los tipos de células. Algunos de los agentes de naturaleza química más usados: Compuestos inorgánicos: suelen tener efectos sobre las bacterias por disolución de sus iones o por su efecto oxidante. Ej: Ácidos y álcalis, agua oxigenada, permanganato de potasio, etc.  Oxidantes. Los halógenos, como el yodo en forma de tintura de yodo (0,2% de I 2 en 70% de etanol), que se combina con proteínas que tienen residuos de tirosina, es un antiséptico por su baja toxicidad. El cloro (hipoclorito de Na) es un agente altamente corrosivo; su actividad se neutraliza con materia orgánica. Compuestos orgánicos: son muy variados los compuestos orgánicos que tienen efectos sobre las bacterias, entre los mas importantes están: alcoholes, fenoles, detergentes, colorantes, aldehídos etc. 

Agentes alquilantes.

Oxido de etileno (CH2 –O --CH 2): es un agente alquilante sobre los grupos –NH2 de las proteínas, por lo que resulta de alta toxicidad. Se emplea en forma gaseosa para esterilizar superficies expuestas, materiales porosos, instrumentos, materiales plásticos, filtros. Aldehídos: aformaldehído (líquido o gaseoso) (HCHO): disponible como solución al 37% (formol), empleado como solución acuosa al 2%. Es un agente alquilante que se combina con grupos –NH 2, -COOH y –SH en los ácidos nucleicos y proteínas. b- Glutaraldehído: se emplea en solución acuosa al 2% y presenta una toxicidad menor a la del formaldehído.

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

Alcoholes alifáticos (etanol, isopropanol): Son más activos cuando están diluidos en agua (50-70% de alcohol en agua). Son solventes de lípidos y desnaturalizan proteínas. Su poder desinfectante, y por lo tanto su toxicidad, aumenta con su peso molecular, limitándose su acción a aquellos alcoholes solubles en agua.



Alcoholes aromáticos: los fenoles se utilizan como desinfectantes de superficies fundamentalmente, debido a su alta acción tóxica.



Tensioactivos catiónicos: actúan afectando las membranas celulares mediante interacciones de carga con los fosfolípidos. Se utilizan para limpieza de material contaminado y superficies de trabajo.



Tensioactivos aniónicos: su acción se manifiesta a través de una eliminación mecánica de los m.o., por lo tanto su acción no es desinfectante. Se utilizan para el lavado del material ya decontaminado. Metales pesados: sales de Hg, Cu, Ag y otros metales suelen utilizarse como antisépticos.



PARTE EXPERIMENTAL La limpieza y esterilización del material de laboratorio de Microbiología consta de tres pasos: 1) Esterilización previa La esterilización previa consiste en autoclavar durante 30 minutos a 121ºC (1 atm) el material contaminado con muestras, cultivos, o sustancias potencialmente infecciosas. Ej. Placa de petri, tubos, frascos, etc. 2) Limpieza del material Se debe realizar una correcta limpieza del material, siguiendo los siguientes pasos:    

Dejar el material durante por los menos 10 min en agua con detergente Cepillar individualmente cada una de las piezas Enjuagar con abundante agua presión Una vez lavado el material dejar secar a temperatura ambiente proceder a la preparación del material a esterilizar.

3) Esterilización final El material debe prepararse previo a la esterilización en autoclave o en estufa.

Temperaturas y tiempos Autoclave:

20 minutos 121ºC

Estufa:

1 hora 170ºC 2 horas 160ºC

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Preparación del material: o

Material de vidrio  Placas de petri: se envuelven individualmente con papel (Estufa).  Tubos con o sin tapón de algodón: se arman grupos de 10 tubos, y se envuelven en papel (Estufa).  Pipetas: en la parte superior de la misma se coloca un tapón de algodón y luego se envuelven con papel bien ajustado en forma individual (Estufa).  Frascos vacíos con tapa a rosca de plástico: Se colocan tapados con la tapa semi enroscada, con un capuchón de papel de aluminio o envueltos en papel madera (Autoclave).

o

Materiales metálicos: tijeras, espátulas, pinzas, etc. Se envuelven individualmente, se colocan en cajas metálicas que cierren herméticamente. (Estufa) Tips, tapones de goma, pipetas pasteur de vidrio, hisopos: Se colocan en frascos de vidrio que en el fondo contengan un trozo de algodón, se cierra el frasco dejando la tapa media floja. (Autoclave) Aceites, vaselina, talco: se colocan en frascos individuales con tapón de algodón y capuchón de papel. (Estufa) Medios de cultivos soluciones: se colocan en frascos individuales con tapón de algodón y capuchón de papel. (Autoclave) Material textil: Se dobla y se empaqueta en papel (Autoclave)

o o o o

NOTA: todo el material a esterilizar debe estar correctamente rotulado. En el rotulo se debe indicar el tipo de material y la fecha de esterilización. El material que se ha esterilizado en autoclave se lleva a estufa de 37ºC hasta que esté completamente seco. Una vez que ha finalizado el proceso de esterilización, el material deberá ser guardado correctamente (cajones, armarios, heladeras, etc.) a fin de evitar contaminaciones y asegurar la duración del proceso de esterilización. El tiempo promedio que dura la esterilización es de 1 -3 meses, paso dicho tiempo el material deberá ser re esterilizado por más que no haya sido utilizado.

Actividades a realizar por el alumno: 1) Envoltura y preparación de material de vidrio limpio para esterilización 2) Manejo de estufa de esterilización

Bibliografía: Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiología en práctica. Manual de técnicas de laboratorio para la enseñanza de la microbiología básica y aplicada. Ed. Atlante. 2000. Cap. 2, 3-12.

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Trabajo Practico Nº : PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Objetivos Que el alumno aprenda a: - Conocer, diferenciar, clasificar y preparar (pesada, preparación esterilización y conservación) los diferentes medios de cultivo utilizados en el laboratorio de microbiología. FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Medios de Cultivo Gran parte de la microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto sólo es posible si se dispone de los medios de cultivo adecuados. Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes, en los que crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas, proceder a su identificación y llevar a cabo estudios complementarios. Los medios especiales son imprescindibles para aislar e identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibióticos, analizar agua y alimentos, en microbiología industrial y otras actividades. Aunque todos los microorganismos necesitan fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y varios minerales, la composición precisa de un medio adecuado dependerá de la especie que se quiere cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. El conocimiento del hábitat normal de un microorganismo es a menudo útil para elegir un medio de cultivo apropiado, porque sus necesidades de nutrientes reflejan su ambiente natural. Un medio se utiliza frecuentemente para seleccionar y cultivar microorganismos específicos o para facilitar la identificación de una especie en particular. En estos casos, la función del medio estará también determinada por su composición.

Agentes gelificantes. El agar es un polímero sulfatado de azúcares, obtenido de algas marinas, compuesto principalmente por D-galactosa, 3,6-anhidro-L-galactosa y ácido D-glucurónico. Es un buen agente solidificador porque, una vez que se funde en agua hirviendo, puede enfriarse hasta una temperatura de 40 a 42º c, sin endurecerse, y no fundirá de nuevo hasta que no se alcance una temperatura de 80 a 90ºC. Es también excelente porque la mayoría de los microorganismos no pueden degradarlo. Puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce se utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos. La gelatina es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licua a temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la temperatura óptima de crecimiento para muchos microorganismos.

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Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en: Consistencia

Composición

Utilización o función

Líquidos Sólidos Semisólido Complejos Sintéticos Semisintéticos Enriquecimiento o Multiplicación Selectivos o Inhibidores Enriquecidos Diferenciales Identificación Transporte

1. Según su consistencia Medios Líquidos. Son los que se presentan en este estado, denominándose por ello caldos. Contienen los nutrientes antes citados, con adición de algún tampón, capaz de mantener el pH adecuado. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración. Ejemplos: caldo nutritivo, caldo tioglicolato, agua peptonada, etc. Medios Sólidos. Se prepara añadiendo un agente gelificante a un medio líquido determinado. Los más usados son gelatina y agar. Este conjunto, convenientemente esterilizado, se vierte en una placa de Petri o en tubos. Las exigencias nutritivas y las condiciones físico-químicas son similares a las de los medios líquidos. Pero, a diferencia de ellos, presentan la posibilidad de obtener colonias aisladas, siempre que la cantidad de inóculo esté suficientemente diluida. En este caso se puede observar la existencia de colonias separadas unas de otras, y cada una constituye un clon (conjunto de bacterias que provienen de una célula madre, con el mismo patrimonio hereditario y las mismas características fisiológicas). Ej.: agar nutritivo, agar EMB, CLDE y todos los medios de aislamiento primario y de identificación. Medios Semisólidos. Se preparan a partir de medios líquidos, agregando un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias. Ej.: agar cepa, SIM, medios base para utilización de aminoácidos. 2. Según su composición. Medios complejos. Son aquellos que contienen ingredientes cuya composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Además, no se conoce exactamente la proporción de cada uno de sus componentes. Esto tiene ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproducibilidad no podrá ser exacta. En la práctica estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados. Ejemplo: caldo nutritivo.

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Medios Sintéticos Son aquellos que poseen exclusivamente componentes químicos definidos (se conocen todos los componentes) disueltos en agua destilada, donde la proporción de cada uno de sus componentes es conocida exactamente. Entre ellos se encuentran los medios mínimos, pues en ellos se intenta comprobar el crecimiento de una bacteria determinada, con muy pocos nutrientes. Los medios definidos son ampliamente usados en investigación, pues a menudo se quiere conocer qué está metabolizando el microorganismo experimental. Ejemplos: medio basal de sales y una fuente de carbono determinada. Medios Semisintéticos. Cuando alguno de sus componentes no tiene composición definida. En estos casos, se añaden factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo, extracto de levaduras, peptona cono fuente de nitrógeno, glucosa como fuente de carbono.

3. Según su utilización o función. Medios de Enriquecimiento. Se basan en la libre competencia por los sustratos. Son siempre líquidos que favorecen o permiten la multiplicación de unas bacterias, inhibiendo parcialmente la de otras. Pueden ser: de enriquecimiento propiamente dichos, que se basan en las propiedades metabólicas del microorganismo, o de enriquecimiento selectivo, en cuyo caso se agrega un agente de selección que puede ser, un colorante, un antibiótico, etc. Este agente de selección no favorece el desarrollo del microorganismo a enriquecer, sino que inhibe a la flora acompañante. Ejemplos:  agua peptonada alcalina, se utiliza para V cholera (donde el pH alcalino inhibe a todas las enterobacterias menos al Vibrio)  caldo selenito, actúa inhibiendo el desarrollo de casi todas las enterobacterias menos de Salmonella y Shigella.  caldo tioglicolato  caldo infusión cerebro corazón (BHI) Medios Selectivos (o Inhibidores) Pueden ser sólidos o líquidos, a los que se les agrega uno o más agentes de selección. Favorecen el crecimiento de microorganismos particulares, en los que la “selectividad” se consigue alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo compuestos químicos, que sean nocivos para las bacterias cuyo crecimiento no interesa. Los medios inhibidores pueden considerarse una variante más restrictiva de los medios selectivos. Las posibilidades de selección son infinitas y existen decenas de medios selectivos especiales disponibles. Ejemplos: - Agar Endo, eosina azul de metileno (EMB o Levine), agar MacConkey. (Las sales biliares o colorantes como la fucsina básica y el cristal violeta, componentes de estos medios, favorecen el crecimiento de bacterias gramnegativas, al inhibir el crecimiento de bacterias grampositivas). - Agar salmonella-shigella (SS): medio selectivo para recuperar Salmonella spp y Shigella spp. (Las sales biliares, el citrato de sodio y el verde brillante son inhibidores de los grampositivos y de algunos gramnegativos. Las posibles colonias de Shigella aparecen amarillas y las posibles de Salmonella aparecen negras). - Agar Tayer Martin: el medio base es agar chocolate con agregado de antibióticos para inhibir el desarrollo de bacterias contaminantes: - trimetroprima para inhibir Proteus spp y otros gramnegativos, - vancomicina para inhibir grampositivos y - nistatina para inhibir levaduras.

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Medios Diferenciales. Son siempre sólidos y se utilizan para diferenciar colonias. Son medios que diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificación tentativa según las características biológicas del microorganismo. A estos medios se les agrega, por ejemplo, un indicador de pH que permite diferenciar a microorganismos que fermentan un determinado hidrato de carbono. Ejemplos: - Eosina azul de metileno (EMB- Levine): permite diferenciar bacilos gram negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Las bacterias no fermentadoras dan colonias transparentes y las fermentadoras rosa o rojas, y E coli da colonias con brillo verde metálico. Estas coloraciones son producidas por la presencia del indicador de pH eosina amarilla y del colorante azul de metileno (éste inhibe el desarrollo de la mayoría de los gram positivos y junto a la eosina sirve como indicador de fermentación ya que a pH ácido los colorantes precipitan). - El agar MacConkey es tanto diferencial como selectivo, contiene lactosa y colorante rojo neutro, las colonias fermentadoras de lactosa aparecen de color rosa a rojo y son fácilmente distinguibles de las no fermentadoras. - Agar MacConkey-sorbitol. Es un medio diferencial que permite sospechar en 24 hs la presencia de E coli O157 en materia fecal, dado que esta especie no fermenta el sorbitol. - El agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) sirve para diferenciar patógenos entéricos. La mayoría de los no patógenos fermentan lactosa, sacarosa o xilosa y producen colonias amarillas. Shigella spp. no fermenta estos azúcares y da colonias rojas. Salmonella spp y Edwarsiella spp fermentan xilosa pero producen lisina decarboxilasa produciendo cadaverina que neutraliza los ácidos de la fermentación y dan colonias rojas con centros oscuros porque producen ácido sulfúrico. Agar cisteína lactosa deficiente en electrolitos (CLDE), contiene lactosa y permite diferenciar las bacterias fermentadoras de lactosa (colonias amarillas) de las no fermentadoras (colonias incoloras). Medios Enriquecidos. Son medios a los que se le agrega un nutriente extra (además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes). Pueden ser líquidos o sólidos. En estos medios no crece un determinado grupo de bacterias sino todas. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, líquido ascítico, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo, por ejemplo Polivitex, Isovitalex, etc. Ejemplos: agar sangre, agar chocolate, caldo infusión cerebro-corazón, caldo tristonasoya. Medios de Identificación. Son los medios destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabilozado y el indicador que nos muestre el resultado. Ejemplos.: agar citrato de Simons, agar sulfhídrico-indol-movilidad (SIM), agar manitol salado, agar DNAsa, agar triple azúcar hierro (TSI), y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un elemento diferencial, son medios utilizados para identificación. Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios específicos de identificación para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultáneamente identificar los gérmenes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilización de sustratos cromogénicos específicos.

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Medios de Transporte. Se usan para transporte de aquellas muestras que no van a procesarse de inmediato o que deban ser trasladadas de un laboratorio a otro, y que puedan contener microorganismos “fastidiosos” para su desarrollo por lo que se debe impedir el sobrecrecimiento de bacterias que colonizan con frecuencia piel y mucosas. Estos medios son generalmente semisólidos, tamponados y sin sustancias nutritivas. Ejemplos: Stuart-Amies, Cary-Blair, etc.

PARTE EXPERIMENTAL La preparación de un buen medio de cultivo es fundamental para un buen diagnóstico bacteriológico. El éxito de la preparación está influenciado por una serie de factores como:      

Exactitud de la pesada y perfecta medición del volumen de agua Control de pH Correcta disolución del medio de cultivo Correcta esterilización Correcta conservación del medio de cultivo Correcto fraccionamiento.

Para la preparación de medios se parte de mezclas deshidratadas de los compuestos que la integran. Habitualmente sólo es necesario añadir agua y esterilizar en autoclave, pero en algunas ocasiones es necesario añadir después de la esterilización algún componente termolábil que no hubiera resistido el calor. Los medios deshidratados presentan ventajas: - son muy estables, - su utilización es muy simple, pudiendo prepararse poco tiempo antes de su utilización, - una pequeña cantidad del producto permite la preparación de una importante cantidad de medio, no necesitando un gran volumen de almacenamiento, - son económicos. ACTIVIDADES A REALIZAR POR EL ALUMNO. Los alumnos separados por comisiones se encargaran de la preparación de los medios de cultivos asignados por el jefe de trabajos prácticos. Para la preparación de los medios de cultivos se deberán tener en cuenta las indicaciones del fabricante. Procedimiento general:    

pesar la cantidad de medio de cultivo indicada por el fabricante. colocar las cantidades pesadas en un frasco adecuado (previamente limpio y rotulado) que será el recipiente en el cual se va a esterilizar el medio de cultivo. disolver el medio de cultivo agregando agua destilada hasta completar el volumen total y calentar a baño maría hasta disolución total del medio. Verificar rápidamente el pH y ajustarlo, si es necesario, al valor indicado por el fabricante. Es indispensable efectuar esta verificación, pues el pH del agua destilada puede variar según las condiciones de obtención y almacenamiento. El ajuste debe hacerse a temperatura ambiente.

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    

Una vez preparados los medios deben esterilizarse. La mayoría de los medios de cultivo se esterilizan en autoclave, durante 15 minutos, a 121ºC. Los medios sólidos se reparten cuando todavía están fundidos y se dejan solidificar en su envase definitivo (placa o tubo). Si los medios de cultivos no son fraccionados en el momento, deberán conservarse a 4ºC (heladera) por periodos variables. Deben ser etiquetados y se debe aclarar la fecha de su esterilización. Si hay que añadir sustancias de enriquecimiento termolábiles, se hace después de la esterilización, y con el medio más frío pero aún fundido. La adición debe ser aséptica y lenta, para conseguir homogeneidad. Los medios solidificados en placa deben ser puestos a temperatura ambiente y despojados de la humedad que pudiesen tener antes de su utilización.

Los medios deshidratados son muy higroscópicos, es indispensable que los frascos permanezcan abiertos solo el tiempo necesario para la obtención del producto. Su conservación debe hacerse en lugar fresco y seco y no deben utilizarse los medios hidratados ambientalmente. Los medios deben someterse a un control de calidad que abarcará los siguientes aspectos: o Control de esterilidad: se efectúa incubando algunas placas del lote escogidas al azar y verificando la ausencia de crecimiento bacteriano. o Control de composición: se realiza para comprobar que el medio posee los componentes que lo caracterizan de manera que permita el crecimiento de determinados gérmenes. o Control de caducidad: se realiza para utilizar las placas durante el tiempo que garantice su correcta utilización. Por término medio las placas preparadas pueden conservarse entre 15 días y dos meses.

Bibliografía. 1. Microbiología Clínica. Módulo 1. Taxonomía y Fisiología Microbiana. Recolección y transporte de muestras para el diagnóstico de infecciones. AAM- Colegio de Bioquímicos de la Provincia de Entre Ríos- Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas Universidad Nacional del Litoral. 1997. 2. Microbiología Clínica. Módulo 2. Procesamiento inicial de las muestras para el diagnóstico mocrobiológico. AAM- Colegio de Bioquímicos de la Provincia de Entre RíosFacultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas Universidad Nacional del Litoral. 1997 3. Prescott L, Harley J, Klein D. Microbiología. Cuarta Edición. 1999. 4. Fumarola A, Rodríguez-Torres A, García-Rodríguez JA, Piedrota-Angulo G. Microbiología y Parasitología Médica. Segunda Edición. 1987. 5. Díaz Martín GA. Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Medios de cultivo. Apuntes. Segundo curso: Laboratorio de Diagnóstico Clínico Unidad Temática 14-1, Bloque temático III. 2004-2005. 6. Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiología en práctica. Manual de técnicas de laboratorio para la enseñanza de la microbiología básica y aplicada. Ed. Atlante. 2000. Cap. 7, 47-50.

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Trabajo Practico Nº : MANEJO DE MICROSCOPIO – COLORACIONES

Objetivos.  Conocer el manejo del microscopio óptico, sus partes y utilidad en el laboratorio de microbiología.  Realizar coloraciones más utilizadas en el laboratorio de microbiología a partir de materiales biológicos y explicar sus fundamentos.  Reconocer a través de la observación microscópica la existencia de microorganismos en diversos materiales biológicos.  Aprender el manejo del ansa y las distintas técnicas de cultivo en medios sólidos en placa y medios de identificación en tubo. Contenidos previos que el alumno deberá conocer:  Microscopía: tipos de microscopio.  Morfología y estructura bacteriana.  Fundamento de las coloraciones de Gram y Ziehl-Neelsen.  Conocer la clasificación y utilidad de los diferentes medios de cultivo.

FUNDAMENTOS TEORICOS Tamaño y formas bacterianas. Existen tres formas básicas de bacterias:  Esféricas (cocos)  Bastoncitos o cilíndricas (bacilos)  Helicoidales (espirilos) Según el plano de división de la célula, los cocos pueden aparecer: de a pares (diplococos), en cadena (estreptococos), en tétradas y racimos (estafilococos). Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o tener una longitud de 2 a 10 veces su diámetro. Sus extremos pueden ser redondeados, cuadrados o agudizados. Los bastones bacterianos curvos pueden ser pequeños microorganismos en forma de coma (vibrios) o levemente helicoidales en una sola curvatura, o espiroquetas largas y sinuosas. La mayor parte de las bacterias tienen una longitud media de 1 a 5 µm. La longitud de una bacteria puede variar considerablemente según el estadio de crecimiento y el medio de cultivo utilizado. Técnicas de tinción. La morfología bacteriana se puede observar de dos maneras:  En estado vivo  Muertas y coloreadas. Las bacterias en estado vivo son, en general, incoloras y carentes de suficiente contraste con el agua en la que se encuentran en suspensión como para ser claramente vistas. Por lo tanto se hace necesario el uso de sustancias químicas coloreadas, llamadas colorantes, que poseen afinidad por algún componente celular, dando su color a las células. Al teñir el microorganismo con los colorantes se aumenta el contraste y se hacen más visibles, En bacteriología, la mayoría de los colorantes son sales en las que uno de los iones es coloreado. Los colorantes se clasifican en:

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

Básicos o catiónicos: el ión coloreado es el positivo (catión). Estos colorantes se combinan con los constituyentes celulares cargados negativamente (ácidos nucleicos, polisacáridos). Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina.  Ácidos o aniónicos: el ión coloreado es el negativo (anión). Estos colorantes se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente (proteínas). Ejemplos: eosina, fucsina ácida, rojo Congo.  Sustancias liposolubles: estos colorantes se combinan con los materiales lipídicos de la célula, se usan para revelar la localización de gotas o depósitos de grasa. Ejemplo: negro Sudán. Algunos colorantes tiñen mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí misma. Esta sustancia se denomina mordiente. Ejemplo: ácido tánico. Clasificación de las tinciones. Existen dos tipos de tinciones: 1. Positivas: Cuando lo que se colorea es el microorganismo a observar. A su vez pueden ser:  Simples: cuando se utiliza un único colorante para incrementar el contraste de las células para la microscopía. Ejemplo: azul de metileno, especialmente útil para detectar bacterias en muestras naturales, ya que la mayor parte del material no celular no se tiñe.  Diferenciales: cundo se utilizan dos o más colorantes y sirve para diferenciar a las bacterias entre sí por alguna propiedad particular, es decir no todas las células se tiñen igual. Ejemplo: tinción de Gram. tinción de Acido-alcohol resistencia.  Estructurales: cuando se utilizan dos o más colorantes para poner de manifiesto una determinada estructura de la bacteria. Ejemplo: cápsulas, esporas, flagelos. 2. Negativas: Cuando lo que se colorea es el fondo y queda el microorganismo sin teñir. Se observa el perfil de la célula. La sustancia utilizada es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, ejemplo la tinta china (suspensión de carbono coloidal).En el microscopio aparecen las células (bacterias, hongos) transparentes y perfiladas sobre fondo oscuro. La ventaja de este tipo de tinción, es que la célula no recibe tratamiento físico o químico. Es muy apropiada para organismos capsulados. La fijación del extendido antes del teñido y la subsiguiente exposición a una serie de reactivos, como en las tinciones positivas, ocasiona alguna deformación en la célula, lo que es menos probable que ocurra en una tinción negativa. Fijación. Las células generalmente son tratadas para coagular el citoplasma antes de teñirlas (fijación). Para bacterias la fijación por calor es lo más corriente, aunque también pueden fijarse con sustancias químicas como formaldehído, ácidos y alcoholes.

ACTIVIDADES A REALIZAR POR EL ALUMNO 1. Observación microscópica:   

Reconocimiento de las partes del Microscopio óptico (MO). Manejo del MO utilizando una muestra sin colorear. Manejo del MO utilizando una muestra previa coloración.

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2. Técnica de examen microscópico directo de muestra sin colorear (en fresco). Utilidad: Se realiza para la observación de bacterias, hongos y parásitos (morfología y movilidad) y células (epiteliales, leucocitos y hematíes), de manera de evaluar la calidad de la muestra. Técnica: Sobre un portaobjetos suspender, en una gota de solución salina, una pequeña cantidad de la muestra. Colocar un cubreobjetos y examinar al MO con objetivos de 10x y 40x. 3. Coloración de Gram: Utilidad: Es una tinción diferencial usada para demostrar las propiedades tintoriales de las bacterias, lo cual depende de la naturaleza química de la pared celular. Tiene importancia taxonómica. El análisis de los extendidos coloreados revela al mismo tiempo morfología y la reacción al Gram de las bacterias. Colorantes: Cristal violeta Yodo de Gram: cristales de yodo-yoduro de potasio Decolorante: Acetona-Alcohol etílico Safranina. Técnica: *Se hace un frotis delgado del material a estudiar y se deja secar al aire. *Se fija el material en el portaobjeto pasándolo 3 o 4 veces a través de la llama de un mechero, de modo que el material no sea lavado durante el procedimiento de tinción. *Se coloca el frotis sobre un soporte para tinción y se cubre la superficie con solución de cristal violeta. *Después de un minuto de exposición al cristal violeta, se lava totalmente con agua destilada. *Se cubre el frotis con solución de yodo de gram durante un minuto. Se lava nuevamente con agua. *Se sostiene el frotis entre los dedos pulgar e índice y se cubre la superficie con unas gotas de decolorante de alcohol y acetona hasta que no se desprenda más color violeta. Habitualmente esto tarda 10 segundos más o menos. *Se lava con agua corriente y se coloca otra vez el preparado sobre el soporte para tinción. Se cubre la superficie con la safranina durante un minuto. Se lava con agua corriente. *Se deja secar al aire en posición vertical. * Se examina el frotis teñido con aceite de inmersión con objetivo de 100x del MO. Las bacterias grampositivas se tiñen de color azul oscuro y las gramnegativas se ven de color rojorosado. 4. Coloración de Ziehl-Neelsen. Utilidad: esta coloración se usa para colorear a las bacterias llamadas ácido-alcohol resistentes, ya que por la naturaleza química de su pared necesitan de calor o detergentes para que el primer colorante penetre, como así también resisten la decoloración con solventes orgánicos fuertes. Colorantes: Carbolfucsina: cristales de fenol, alcohol, fucsina básica. Decolorante: alcohol-ácido (HCl cc+ alcohol) Azul de metileno. Técnica: * Cubrir un frotis seco, fijado por calor, con un pequeño rectángulo de papel de filtro. *Aplicar 5-7 gotas de carbolfucsina para mojar completamente el papel de filtro. *Calentar el portaobjeto cubierto con la coloración hasta que se evapore, pero sin dejar secar. Puede calentarse con un mechero o un hisopo de algodón embebido en alcohol.

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*Quitar el papel con una pinza, enjuagar y dejar secar. *Decolorar con ácido-alcohol hasta que no aparezca colorante en el lavado (Aproximadamente 2 minutos). *Agregar el azul de metileno (1 a 2 minutos). *Enjuagar, escurrir y secar al aire. * Examinar con objetivo de inmersióm en aceite de 100x en MO. Los bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) se tiñen de rojo y el fondo de celeste. Existen también otras coloraciones para los BAAR que las mencionaremos, ellas son: la técnica en frío de Kinyoun y la del fluorocromo. Otras tinciones usadas en bacteriología son:  Azul de metileno: positiva simple  Giemsa  tinción de endosporas: positiva estructural  tinción de cápsulas: negativa

Bibliografía:  

Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiología en práctica. Manual de técnicas de laboratorio para la enseñanza de la microbiología básica y aplicada. Ed. Atlante. 2000. Cap. 5, 25-32. Koneman y col. Diagnóstico microbiologíco. Ed. Panamericana

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Trabajo Practico Nº : TÉCNICAS DE SIEMBRA PARA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN. Objetivo Que el alumno pueda - Aislar colonias a partir de un material con una población mixta de bacterias. - Observar las características macroscópicas de las colonias aisladas. FUNDAMENTOS TEÓRICOS En la naturaleza los microorganismos existen como poblaciones mixtas de varios tipos diferentes. Al igual que otras formas de vida, los microorganismos necesitan nutrientes adecuados y ambientes favorables. Todos los estudios de laboratorio requieren de cultivos puros, constituidos, en nuestro caso, por una única especie de bacterias, razón por la cual es necesario esterilizar los medios de cultivo y mantenerlos en condiciones estériles, de manera tal de poder utilizarlos para sembrar un inóculo de cultivo puro evitando la contaminación ambiental. Para iniciar un cultivo bacteriano, un número de células (inóculo) es transferido (inoculado) a un medio estéril. Luego, dicho medio es incubado a la temperatura adecuada para su crecimiento, lo que significa, el desarrollo de una población de células a partir de una o pocas células. La masa de células hijas se hace visible como turbidez en medio líquido o como una población aislada (colonia) en medio sólido. Cuando se inocula un medio de cultivo sólido, las células hijas no se dispersan a medida que se dividen como ocurre en un medio líquido, sino que establecen una colonia fija. Si las bacterias inoculadas están lo suficientemente separadas en la superficie del agar, cada una desarrollará una colonia separada. Este hecho es de suma importancia ya que constituye el paso inicial para poder identificar un microorganismo determinado. Siembra para aislamiento primario. La siembra para aislamiento puede hacerse en un medio especial y su elección está orientada por el Gram o por el tipo de muestra, o bien, puede usarse un medio general. Las técnicas son múltiples, todos tienen por objeto diseminar en la mayor superficie posible los microorganismos presentes en la muestra, de modo que cada uno de los tipos presentes pueda desarrollarse en colonias aisladas. Tener siempre presente que los medios de cultivo para aislamiento son sólidos. 

Técnicas de inoculación:

EN PLACA DE PETRI La inoculación de las muestras en medios de agar en placas de Petri puede realizarse por varios métodos. La inoculación primaria puede hacerse con ansa, hisopo u otros dispositivos adecuados. Luego del inóculo primario, debe diseminarse el material por los 4 cuadrantes de la placa usando ansa en aro o recta. Entre los métodos más usados podemos mencionar:  Estría: el inóculo se disemina con un movimiento hacia atrás y hacia adelamte en cada cuadrante, girando la placa 90º. El ansa debe quemarse (esterilizarse a llama directa al rojo vivo) entre cada diseminación hacia un cuadrante. El propósito de esta técnica consiste en diluir el inóculo en forma suficiente para que sea posible obtener colonias aisladas, y así las mismas puedan ser estudiadas en los medios diferenciales.

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 

Agotamiento: el inóculo se "estría" con ansa hasta el otro extremo de la placa con movimientos seguidos de un lado al otro. Esta forma de estriar se usa generalmente para material en el que se sospecha no hay mezcla de bacterias o flora normal agregada. Inoculación para recuento semicuantitativo de colonias: Deben usarse ansas calibradas para contener 0,01- 0,001 ml de líquido, se sumergen en la muestra de orina no centrifugada. Luego se lleva todo el volumen a la superficie del agar haciendo una sola estría a través del centro de la placa. Después, el inóculo se disemina en ángulos rectos respecto de la estría primaria, luego la placa se gira 90º y se disemina el inóculo hasta cubrir toda la superficie.

EN TUBOS PARA IDENTIFICACIÓN. Los medios en tubos pueden ser líquidos, semisólidos o sólidos.  El agar semisólido es adecuado para pruebas de movilidad, y se siembra con ansa en punta por punción. Es importante que el ansa de inoculación sea retirada por el mismo camino que se usó para atravesar el medio, y evitar errores de interpretación posteriores.  Los medios líquidos deben inocularse inclinando el tobo aproximadamente 30º y con el ansa de inoculación se toca la superficie interna del vidrio por encima del punto donde la superficie del medio forma un ángulo agudo. Cuando el tubo se vuelve a colocar en posición recta, el área de inoculación queda sumergida en el medio.  Los agares sólidos son puestos a solidificar inclinados para formar el "pico de flauta". Estos se inoculan primero atravesando el fondo del agar y luego se retira y se estría a través del agar en la superficie (el pico de flauta). Observación macroscópica de los microorganismos. Luego de una incubación de las placas preparadas con medio de cultivo e inoculadas, durante un tiempo que por lo general oscila desde 24 hs en adelante, a la temperatura adecuada, aparecen varias aglomeraciones de millones de microorganismos cada una. Estos acúmulos reciben el nombre de colonias. Las colonias correspondientes a distintos tipos de bacterias difieren microscópicamente en su forma, tamaño, textura y color; por lo tanto, el fenotipo de una colonia determinada es un aspecto a considerar en el proceso de identificación del microorganismo en cuestión. Bibliografía:   

Koneman y col. Diagnóstico microbiologíco. Ed. Panamericana. Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiología en práctica. Manual de técnicas de laboratorio para la enseñanza de la microbiología básica y aplicada. Ed. Atlante. 2000. Cap. 3, 13-18 Basualdo,JA y col. Microbiología Biomédica. Ed. Atlante.

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Trabajo Practico Nº : COCOS GRAM POSITIVOS Objetivos: Que el alumno sea capaz de 1. aprender el procesamiento básico de las muestras que pueden contener cocos G(+) 2. llegar a la tipificación de un coco G (+) aplicando sus conocimientos sobre características morfológicas, nutricionales y fisiológicas que permiten diferenciarlos por familias, géneros y especies. Fundamentos Teóricos: Las bacterias gram positivas tienen en su pared un alto contenido de peptidoglicano, debido a esto, éstos microorganismos retienen el colorante cristal violeta y se los ve como esferas azul oscuro o violetas en las preparaciones con tinción de gram. Los cocos Gram (+) aerobios y anaerobios facultativos son los microorganismos que con mayor frecuencia se asocian con infecciones humanas, pueden ser recuperados de casi todas las muestras clínicas que contengan una población mixta de bacterias. Se pueden aislar en medios no selectivos, especialmente en agar sangre, no desarrollan en medios selectivos como EMB, Mac Conkey, etc que contienen cristal violeta, colorante que inhibe a estos microorganismos, por lo tanto la presencia de colonias en agar sangre con ausencia de colonias en el EMB, constituye un dato inicial de que el microorganismo en cuestión es Gram (+). Los cocos gram (+) aerobios o anaerobios facultativos pertenecen a dos grandes familias: 

Flia Micrococcaceae: compuesta por varios géneros (Staphylococcus, Micrococcus, Stomatococcus, Planococcus y Macrococcus) de los cuales el más patógeno y de importancia clínica es el género Staphylococcus.



Género Streptococcus: compuesto por una serie de grupos y/o géneros (grupo A, B, C, D, G, F, Enterococcus y S. pneumoniae), todos causantes de diversas patologías.

TRABAJO DE MESADA Procedimiento para la preparación de AS AL 5%: Al agar base (agar base columbia o tripteína soya, preparado según instrucciones del fabricante) se lo disuelve a baño maría y una vez que su temperatura desciende hasta aproximadamente los 50 ºC, se adicionan 5 ml de sangre estéril desfribinada (humana o de carnero), se homogeniza, se plaquea y se deja solidificar. Recordemos, a partir de las muestras se realiza un fresco, coloración de Gram, y siembra de las mismas en el medio de cultivo correspondiente. PROCEDIMIENTO BÁSICO DE TRABAJO Muestra

Fresco

Gram

cultivo para aislamiento primario ( medios enriquecidos y/o selectivos)

24-48 hs 37º- atmósfera con 5% de CO2 (lata con vela)

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Gram de colonia y estudio de colonias Identificación de Género y especie 24 hs 37º atmósfera con 5% CO2 y/o aerobia Antibiograma Informe de Laboratorio A partir de las placas de cultivo provenientes de diversos materiales clínicos los alumnos realizaran las pruebas necesarias para poder llegar a la tipificación de los microorganismos en cuestión haciendo uso de los siguientes algoritmos: CG (+)

Catalasa prueba rápida de identificación (+) Flia Micrococcaceae

(-) Género Streptococcus

Dentro de la Flia Micrococcaceae los géneros pueden separarse mediante las siguientes pruebas: T.S.I No fermentadores de glucosa Género Micrococus

Fermentadores de glucosa Género Staphilococcus

Con las colonias pertenecientes al género Staphylococcus se seguirán los siguientes pasos: Staphylococcus spp (coco G+ catalasa + fermentador de Glu) Prueba de la coagulasa/DNASA ( -) Negativo Staphylococcus coagulasa (-)

(+) positivo Staphylococcus aureus

Sensibilidad a la Novobiocina

Sensible Staphylococcus spp.

Resistente Staphylococcus saprophyticus

Existen dos pruebas importantes para identificar Staphylococcus aureus aparte de la prueba de la coagulasa, una es la prueba de Chapman o manitol salado (fermentación de manitol) y la otra es la prueba de la DNAsa.

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GÉNERO STREPTOCOCCUS Su identificación, además de las características tintoriales y crecimiento en medios líquidos, puede hacerse en base a: tipo de hemólisis, reacción serológica frente al carbohidrato C y las pruebas bioquímicas. CG (+)

Catalasa (-) (Prueba rápida de identificación)

Hemólisis (en placa de agar sangre)

BETA S grupo A S grupo B S grupo C,G y F Enterococcus

ALFA S pneumoniae S grupo D S grupo B Enterococcus S. viridans

GAMA S grupo B S grupo D Enterococcus S. viridans

CG (+) CATALASA (-) B HEMOLITICAS

PYR (prueba rápida de identificación) (+) Bacitracina/ Bilis esculina

S/(-)

S pyogenes

(-) CAMP/Hidrólisis del Hipurato

R/(+)

(+)

Enterococcus

(-)

S agalactiae

VP

(+) S grupo milleri

(-) S grupo C y G

CG (+) CATALASA (-) ALFA O GAMA HEMOLÍTICA Optoquina / Solub en Bilis S/ (+)

R/ (-)

S pneumoniae

BE (-)

(+)

PYR (-) S viridans S agalactiae

PYR (+) Abiothrophia

(+) Enterococo

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ANEXO Prueba de la catalasa: Sobre una colonia se colocan unas gotas de peróxido de hidrógeno al 3%. La aparición de rápida efervescencia indica la producción de oxígeno molecular. Tener cuidado al realizar la prueba sobre colonias en agar sangre por la presencia de peroxidasa en los eritrocitos. Prueba de la coagulasa en portaobjeto (“clumpling factor”): Se coloca una colonia sospechosa de pertenecer a una especie de Staphylococcus, y se emulsifica en una gota de plasma de conejo. El “arracimamiento” bacteriano en 1 minuto indica la presencia de coagulasa y significa un resultado positivo. Si el resultado es negativo ensayar la producción de coagulasa en tubo. Prueba de la coagulasa en tubo: Utilizar plasma con EDTA y no citratado, ya que organismos capaces de metabolizar el citrato (Enterococcus spp.) pueden dar resultados falsos positivos. Inocular el plasma con la cepa a estudiar. Las pruebas negativas luego de 4 hs de incubación a 35ºC, dejar a temperatura ambiente y leer luego de 18-24 hs a fin de evitar la fibrinólisis que producen algunas cepas al ser incubadas en forma prolongada a 35ºC. Prueba de la susceptibilidad a la Novobiocina En agar Mueller Hinton según técnica de Kirby-Bauer, utilizando discos de Novobiocina (5 µg). Sensible: inhibición del desarrollo con un diámetro mayor o igual a 16 mm. Fermentación del manitol (Chapman): El medio es agar manitol salado, contiene manitol (1%), cloruro de sodio (7,5 %), rojo de fenol y peptonas. La alta concentración de sal inhibe otros microorganismos excepto enterococos (por lo tanto usar la placa para identificación, no para aislamiento).La placa original es de color rosado y cuando se fermenta el manitol el medio se vuelve amarillo. Staphylococus aureus puede ser identificado por la presencia de un halo amarillo alrededor de las colonias aisladas, lo que indica la producción de ácido a partir de manitol. Prueba de la DNAsa: La producción de DNAsa puede determinarse incorporando ácido desoxirribonucleico (DNA) en agar nutritivo. Se inocula el microorganismo en el agar y después de 18 a 24 hs de incubación , se detecta la producción de DNAsa bañando la placa con ácido clohidrico diluído al 1%, que precipita el DNA nativo del medio. Así, las colonias que producen DNAsa estarán rodeadas por una zona clara donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado. Prueba de la bilis-esculina: Se utilizan medios de cultivo comerciales. La hidrólisis de esculina se observa como un oscurecimiento del medio (color negro) en 24 hs de incubación a 35ºC, raramente se requieren 48 hs de incubación hasta que la hidrólisis sea aparente. Es importante que el medio contenga 40% de bilis, ya que algunos productos contienen menos cantidad lo que lleva a confundir algunos estreptococos viridans con enterococos. Caldo enterococo: Se utilizan medios de cultivo comerciales y permite determinar la capacidad de un organismo de crecer en un medio inhibidor y fermentar un carbohidrato(s) produciendo un cambio de color relacionado con el pH. Prueba del PYR: Para esta prueba que detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se utiliza como sustrato el reactivo Lpirrolidonil- beta-naftilamida (PYR), para la identificación rápida de enterococos. Algunas especies de Staphylococcus y los estreptococos del grupo A dan, también, una prueba positiva. Utilizar un alto inóculo (2 MacFarland) para el ensayo y seguir estrictamente las indicaciones del fabricante.

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Prueba de la Bacitracina: En placas de agar sangre con discos de Bacitracina (0,04 U). La siembra se realiza según la técnica de difusión en agar y la incubación se realiza con CO2 durante 18-24 hs. Cualquier zona de inhibición alrededor del disco es considerada positiva. Recordar que el uso de discos de Bacitracina en forma directa en las placas primarias de cultivo puede dar como resultado un 40% a 50% de falsos negativos. Prueba de CAMP: Se realiza utilizando una cepa ß-hemolítica de S. aureus (ATCC 25923). Los estreptococos grupo B secretan el factor CAMP que interactúa con la ß-hemolisina secretada por S. aureus lo que causa un acrecentamiento o sinergismo de la hemólisis. En placa de agar sangre sembrar una estría de la cepa de S. aureus y perpendicularmente a ésta (lo más cerca posible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa de estreptococo en estudio. Incubar 24 hs a 35ºC en aerobiosis (en CO 2 aumentan los falsos positivos). El sinergismo se observa como un área de ß-hemólisis en forma de “punta de flecha” en la zona de desarrollo más cercana a ambas estrías. Prueba de la hidrólisis de hipurato: La producción de hipuricasa resulta en la hidrólisis del hipurato de sodio con la formación de benzoato de sodio y glicina. Se puede utilizar la prueba estándar para benzoato usando 7% de tricloruro férrico o la prueba rápida para glicina usando reactivo de ninhidrina. Prueba del Voges-Proskauer (VP): Usar un cultivo de 24 hs para inocular 2 ml de caldo VP. Incubar 6 hs a 35ºC. Agregar los reactivos correspondientes, agitar e incubar por 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción (formación de anillo rojo) se mejora con un leve calentamiento (30 minutos a 37ºC) Prueba de la optoquina: Utilizar agar sangre y discos de optoquina de origen comercial. La siembra se realiza según la técnica de difusión en agar y la incubación se realiza con CO2 durante 18-24 hs. Los halos de inhibición deben medirse. Para un disco de 6 mm conteniendo 5 µg de optoquina una zona de inhibición del crecimiento de 14 mm o más indica susceptibilidad a la optoquina. Si este diámetro es menor, se debe realizar la prueba de solubilidad en bilis porque algunos estreptococos viridans y aerococos pueden dar pequeñas zonas de inhibición. Aunque muy raras, algunas cepas de S. pneumoniae pueden ser resistentes a la optoquina. Prueba de la solubilidad en la bilis: Puede desarrollarse usando tanto el “método del tubo” o el “método de la placa.” Método del tubo: Se requieren dos tubos para la prueba de solubilidad en bilis por cada cepa sospechosa de S. pneumoniae. Tome un ansa de la cepa sospechosa de un crecimiento fresco y prepare una suspensión de células bacterianas en 0,5 ml de salina estéril con una turbidez de 0,5 ó 1,0 de McFarland. Divida la suspensión en dos cantidades iguales (0,25 ml por tubo). Añada 0,25 ml de salina a uno de los tubos y 0,25 ml de desoxicolato de sodio (sales biliares) al 2% en agua al otro. Agite los tubos suavemente e incúbelos a 35°C– 37°C durante 2 horas. Examine los tubos periódicamente para detectar lisis de las células en el tubo que contiene sales biliares. Si el tubo se aclara o pierde turbidez, el resultado es positivo. Método en placa: Se colocan unas gotas de solución de desoxicolato de sodio (2%) sobre las colonias sospechosas de ser S. pneumoniae, las que se lisan de inmediato y desaparecen por completo en 30 minutos. Tener cuidado al usar agar sangre, porque aparece una zona de hemólisis alrededor de la gota de reactivo, reacción que no debe confundirse con la lisis de las colonias.

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Trabajo Practico Nº :

Bacilos Gram Negativos Objetivos: Que el alumno sea capaz de: 3. aprender el procesamiento básico de las muestras que pueden contener bacilos G (-) 4. llegar a la tipificación aplicando sus conocimientos sobre características morfológicas, nutricionales y tintoriales que permiten diferenciarlos por familias, géneros y especies. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: Los bacilos Gram negativos están comprendidos en gran número de familias, algunas de ellas son: Familia Vibrionaceae, Familia Enterobacteriaceae, Familia Pseudomonadaceae, etc. A fines prácticos se dividen a los bacilos gram negativos en 2 grandes grupos: o Bacilos gram negativos fermentadores de la glucosa o Bacilos gram negativos no fermentadores de la glucosa. Dentro de los bacilos G (-) fermentadores de la glucosa se encuentra la familia Enterobactereaceae. Ésta está constituida por aproximadamente 30 géneros con 115 especies, son de distribución mundial y se encuentran en la tierra, el agua, las plantas de todo tipo, animales y en el hombre; en éste último se pueden hallar como colonizantes habituales del tracto gastrointestinal o bien ser causantes patogenicidad. Las características típicas de la familia son:  Bacilos gram negativos aerobios o anaerobios facultativos  Pueden ser móviles con flagelos perítricos o inmóviles  No esporulados  La mayoría crece bien a 37ºC  Fermentan la glucosa formación de ácido con o sin gas  Son oxidasa negativos  Reducen los nitratos a nitritos Siendo las tres últimas las que realmente definen a la familia. Principales géneros y especies tipo de la familia Enterobariaceae: GENERO ESCHERICHIA: Escherichia coli GENERO SHIGELLA: Shigella dysenteriae, Shigella sonney GENERO SALMONELLA: Salmonella. enterica GENERO CITROBACTER: Citrobacter freundii GENERO KLEBSIELLA: Klebsiella pneumoniae GENERO ENTEROBACTER: Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes GENERO SERRATIA: Serratia marcescens GENERO PROTEUS: Proteus mirabilis GENERO YERSINIA. Yersinia enterocoliticas, Yersinia pestis GENERO MORGANELLA: Morganella morganii GENERO PROVIDENCIA: Providencia rettgeri, Providencia stuartii Otros géneros de interés: GENERO VIBRIO: Vibrio cholerae GENERO AEROMONAS: Aeromona hydrophila GENERO HAEMOPHILUS: Haemophilus influenzae GENERO PLESIOMONAS

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Dentro de los bacilos G (-) no fermentadores podemos mencionar un gran número de organismos como son: la familia Pseudomonadaceae, y los organismos llamados del grupo de la Burkholderia, de las Stenotrophomonas, del Acinetobacter (coco gram negativo), etc. Son un grupo de microorganismos aerobios. No son exigentes y desarrollan fácilmente en los medios de cultivo de uso ordinario en el laboratorio como EMB. Sus características son:  No esporulados,  No fermentan la glucosa  La mayoría son oxidasa positivos  En algunos casos se puede percibir olor frutal intenso característico de Pseudomona aureginosa u olor amoniacal característico de S. maltophilia.  Algunos de estos microorganismos son móviles por flagelos, que de acuerdo a su ubicación en la bacteria ayudan a su clasificación: polares en Pseudomonas, peritricos en Alcalígenes, inmóviles en Acinetobacter y Moraxella. TRABAJO DE MESADA: Recordemos, a partir de las muestras se realiza un fresco, coloración de Gram, y siembra de las mismas en el medio de cultivo correspondiente. Medios diferenciales: Levine o EMB (Azul de metileno eosina). Contiene: Lactosa (indicador de la fuente de carbono que utiliza el microorganismo), eosina (inhibe los cocos Gram positivos y es indicador) y Azul de metileno (indicador) Mc Conkey: Contiene: Lactosa (indicador de la fuente de carbono que utiliza el microorganismo), sales biliares (inhibe los cocos Gram positivos), cristal violeta y rojo neutro como indicadores CLDE (Citrato lactosa deficiente en electrolitos): Se utiliza para urocultivo porque permite el crecimiento tanto de cocos como de bacilos, es un medio que posee lactosa y es deficiente en electrolitos que impide el swarming del proteus. Las colonias lactosas (+) toman un color amarillo y las colonias lactosa (-) presentan el color original del medio de cultivo que es azul verdoso. Medios selectivos: SS (Samonella-Shigella): Contiene: rojo neutro (indicador), lactosa (fuente de hidratos de carbono), sulfato ferroso (para evidenciar a los productores de SH2), verde brillante (actúa como antiséptico) y sales biliares (que favorece el desarrollo de Salmonella y Shigella) TCBS (agar tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa) Es un medio de cultivo que es selectivo para Vibrio cholerae y tiene como único hidrato de carbono la sacarosa. Medios de enriquecimiento: Caldo Peptonado: se utiliza para V. cholerae Caldo Selenito: se utiliza para el enriquecimiento de Salmonella y Shigella Caldo Tetrationato: se usa para Salmonella CULTIVO: Se debe realizar según la muestra: A) Cultivar en caldo de enriquecimiento: de acuerdo a lo que se sospeche, si es materia fecal sembrar en caldo selenito (sospecha de Salmonella o Shigella) o si se sospecha Vibrio cholerae sembrar en caldo peptonado. En ambos casos la temperatura de incubación es de 37ºC y entre 18 y 24 horas se debe hacer el repique a medios sólidos de aislamiento primario. B) Cultivar en medio de aislamiento primario: se deben sembrar por estrías los distintos medios, teniendo en cuenta el material a sembrar y si se sospecha la presencia de un microorganismo en especial. Ej. Si en una muestra se sospecha la presencia de Salmonella entonces sembrar un E.M.B. y un S.S. Luego de 24hs. de sembrada la placa de aislamiento primario, se debe observar la placa para realizar lo que se conoce como ESTUDIO DE COLONIAS:

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- Se mira si creció un solo tipo de microorganismos, o al contrario, si crecieron varios; y de acuerdo a la experiencia se seleccionan las colonias que parezcan representativas para realizar las pruebas de identificación. También se observa la formación de pigmentos, si las colonias son mucosas, o si se percibe algún olor particular como olor a frutas u olor amoniacal. - Color de las colonias en las placas: como las placas de E.M.B. y de S.S. tienen lactosa y un indicador, el color de la colonia permite diferenciar las que son lactosa (+) de las lactosas (-) Placa de Levine (E.M.B.) - Colonias fermentadoras de la lactosa: - Con brillo metálico: E. coli, Citrobacter freundii - Colonias opacas mucosas y de color rosado: Enterobacter sp., Citrobacter sp., Klebsiella sp. -

Colonias no fermentadoras de la lactosa: - Son trasparentes: Proteus, Providencia, Morganella, Serratia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella. Inclusive la E. coli podría aparecer transparente porque existe un porcentaje que es lactosa (-)

Placa de S.S. - Colonias fermentadoras de la lactosa: podrían aparecer colonias rosadas o rosadas con centro negro, por la producción de SH2. -

Colonias no fermentadoras de la lactosa: - Incoloras: Shigella, Pseudomonas, Providencia, Yersinia. - Incoloras con centro negro: Salmonella, Edwarsiella, Proteus.

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA: Se realizan a partir de la placa de aislamiento primario y sobre colonias aisladas las siguientes pruebas:  Prueba de O-F  Oxidasa (prueba rápida de identificación)  Fermentación de los azucares: T.S.I.  Producción de ureasa.  Utilización de citrato  S.I.M: evidencia la formación de SH2, indol y movilidad.  O.N.P.G.  Aminoácidos: Lisina, Arginina, Ornitina  Voges Proskauer (VP)  Rojo de metilo (RM)  Fenilalanina (Phe)  Prueba de oxidación-fermentación (O-F) Se realizan utilizando un ansa en punta, con ella se toca una colonia y se siembra por punción y/o estría de acuerdo a lo que corresponda para cada medio. Luego de 12 a 24hs, de acuerdo al tiempo que necesite cada prueba para desarrollar, observar los medios ya sembrados e interpretar las diferentes pruebas como negativo o positivo. Luego con la ayuda de las tablas se procede a identificación de la bacteria. PROCEDIMIENTO BÁSICO DE TRABAJO Recepción de la muestra

Coloración de Gram Fresco Cultivo para aislamiento primario

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(medios selectivos y/o diferenciales, medios enriquecidos) caldos de enriquecimiento (si hiciera falta) 24hs-37º- atmósfera aerobia Gram de colonia y Estudio de colonias Pruebas de identificación 12-24hs.-37º-atmósfera aerobia Interpretación de las pruebas identificación del microorganismo con el uso de las tablas de identificación Si correspondiere se realiza antibiograma SEGUIMIENTO BÁSICO PARA BACILOS GRAM (-) Lo primero que se observa es el OF OF Fermentadores (ambos tubos viran al amarillo) Bacilos Gram (-) fermentadores de la glu Enterobacterias Vibrio Aeromonas



Oxidativo o Inertes (vira solamente el tubo expuesto al 02, o no vira ninguno, respectivamente) Bacilos Gram (-) no fermentadores de la glu Pseudomonas Acinetobacter Moraxella Alcalígenes Burkholderia Stenotrophomonas

BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES DE LA GLUCOSA:

Una vez realizada la prueba de O-F y haber obtenido un perfil fermentativo, sabemos que estamos ante la presencia de un bacilo Gram (-) fermentador de la glucosa, entonces lo primero que se hace es la prueba de oxidasa Oxidasa (-) (+) Enterobacterias Vibrio Aeromonas Luego, una vez que sabemos que es una enterobacteria, con la placa de aislamiento primario, y de acuerdo a si la bacteria es lactosa (+) o (-), se van separando los diferentes géneros. Levine (E.M.B.) Lactosa (+) Colonias rosadas Lactosa (-) Colonias transparentes E.coli Proteus Enterobacter Providencia Citrobacter Morganella Klebsiella Serratia (E.coli) A partir de acá lo que se hace es mirar el TSI y de los resultados obtenidos en él, se hacen las diferentes pruebas de identificación para llegar al género que corresponde al microorganismo en estudio.

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TSI: acido/acido (completamente amarillo) Los géneros que presentan este TSI son:

Citrato + +

ESCHERICHIA SPP. Enterobacter spp. KLEBSIELLA SPP.

Urea +d

Sulfhídrico -

Indol + v

Movilidad + + -

Phe -

Indol -

Movilidad V

Phe -

Indol +/-

Movilidad + +

Phe +

Indol V -

Movilidad +

Phe -

TSI: ácido/ácido (SH2) (medio amarillo) con precipitado negro en la base del tubo Los géneros que presentan este TSI son:

CITROBACTER SPP.

Citrato +

Urea -

Sulfhídrico +

TSI: alcalino/acido (SH2) (pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro en la base del tubo) Los géneros que presentan este TSI son:

Salmonella spp. Proteus spp

Citrato + +

Urea +

Sulfhídrico + +

TSI: alcalino/ácido (pico rojo, fondo amarillo)

Los géneros que presentan este TSI son:

SHIGELLA SPP.

Citrato +

Urea -

Sulfhídrico -

SERRATIA SPP.

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Si se quiere llegar hasta la tipificación total (especie) del microorganismo se deben hacer otras pruebas y con los resultados de éstas se van a la tabla anexa al final de la guía y se llega hasta la especie



BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES DE LA GLUCOSA:

Para un bacilo Gram (-) no fermentador de la glucosa tenemos dos opciones:

OF OXIDATIVO (Tubo con vaselina sin cambio y tubo sin vaselina amarillo) Oxidasa (-) (+) Acinetobacter baumannii Pseudomona aeruginosa Stenotrophomonas Pseudomona fluorescens Pseudomona putida Burkholderia cepacia

INACTIVO (Ambos tubos sin cambios) Oxidasa (-) Acinetobacter calcoaceticus

(+) Alcaligenes

Luego se realizan las pruebas de:  SIM: sulfuro – indol – movilidad  Urea  DNAsa  Aminoácidos: lisina – Ornitina – Arginina  ONPG  También se puede sembrar en medios fluorescentes y de pigmentados: son medios de cultivo que permite ver fluorescencia con luz UV (se usa para Pseudomona aeruginosa) y la producción de pigmentos por parte del microorganismo.  Reducción de nitratos a nitritos. Y se interpretan con las tablas correspondientes a bacilos Gram (-) no fermentadores

ANEXO o

PRUEBA DE OXIDACIÓN FERMENTACIÓN (O-F)

Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilización. Se usa el medio O-F de Hugh y Leifson que contiene 0,2% de peptonas 1% de hidratos de carbono, de modo que la relación entre peptonas e hidratos de carbono es de 1:5. Al ser menor la concentración de peptonas del medio, hay menor producción de productos de oxidación a partir de los aminoácidos que tienden a elevar el pH del medio y pueden neutralizar los ácidos débiles producidos por los microorganismos no fermentadores. El color del medio originalmente es verde Se utilizan 2 tubos con el medio O-F para ésta prueba, se hace la siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno de los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con vaselina estéril. Microorganismos oxidativo: producen ácido solo en el tubo abierto, expuesto al O 2 atmosférico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosférico cambia su color original a amarillo. Microorganismos fermentadores: producen ácido en los 2 tubos. O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo. Bacterias sacarolíticas: son inertes a este medio que conserva su pH alcalino después de la incubación, conservando su color original.

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o

CITOCROMOOXIDADA O PRUEBA DE LA OXIDASA:

El sistema citocromooxidasa, se halla en microorganismo aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos. En la práctica se hace una suspensión del microorganismo con solución fisiológica (inóculo) en un tubo de vidrio, se le agrega un disco (disco comercial de papel impregnado de tetrametil-para-difenilamina) se agita y antes de los 2 minutos se debe observar un cambio de color del disco a rosado o violeta. Si no hay cambio de color el microorganismo es oxidasa negativo. Esta prueba no puede realizarse con colonias que provengan de medios de cultivo que contenga hidratos de carbono ni indicadores, por lo que si se la va a realizar se debe incubar los microorganismos en un placa de AS o bien un TSA (tripteina-soya-agar) o

TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO AGAR)

El medio se fracciona en picos de flauta con una capa basal profunda (2 cm. por lo menos). Con el ansa en punta se siembra por punción y estría. El medio no inoculado es anaranjado-rojizo o rojo pálido. Esta prueba se debe leer o interpretar a las 24hs. de la siembra, siendo muy importante respetar este tiempo. Contiene: glucosa al 0.1%, lactosa 1%, sacarosa al 1% y peptonas; también tiene un indicador rojo de fenol y sulfato de hierro para evidenciar la formación de SH2. El color del medio, originalmente rojo pálido, puede virar totalmente al amarillo, tanto el pico como el fondo, por acidificación del medio. Entonces decimos que es ac/ac (pico ácido y fondo ácido) O puede suceder que se intensifique el color rojo, entonces decimos que es alc/alc También puede pasar que se forme un pico rojo con fondo amarillo (alc/ac)

pico

fondo

Además se puede visualizar en el tubo la producción de gas por parte del microorganismo, entonces en el medio se observan burbujas, resquebrajamiento, o si no todo el medio de cultivo aparece levantado. También puede detectar a formación de SH2 que se pone de manifiesto por una precipitación de color negro en la base del tubo. UTILIZACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO 1) Fermentación de la glucosa solamente (alcalino/ácido) Primero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa, produciendo ácidos y virando totalmente el medio a color amarillo. Como solamente utilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando la glucosa que se halla en baja concentración se consume (antes de las 24hs) los microorganismos comienzan a utilizar la peptonas con producción de amoníaco que alcaliniza el medio dando un color rojo, pero solamente en el pico, quedando el fondo ácido. 2) Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa (ácido/ácido) Como la lactosa y sacarosa están en una proporción 10 veces mayor que la glucosa, en un período de 24hs., la lactosa y sacarosa, aún no se consumen quedando ácido el medio o sea totalmente amarillo. 3) No fermentación de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino). Un microorganismo incapaz de obtener sus nutrientes de los hidratos de carbono, lo obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son degradadas libran amoníaco y alcalinizan el medio. Produciéndose entonces intensificación del color. Es importante respetar el tiempo de lectura, porque si el caso 1 se lee antes de las 24hs. se va a interpretar como ac/ac y no lo es. Si el 2 se lee después de las 24hs, los microorganismo ya se quedan sin hidratos de carbono, entonces comienzan a utilizar las peptonas y se alcaliniza el medio. Con respecto al sulfhídrico pueden presentarse distintas modalidades: Pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro y formación de gas, esto se puede dar en Salmonellas, se lee: alc/ac (SH2) (gas)

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También se puede ver totalmente amarillo y el fondo negro: se lee: ac/ac (SH 2). Y de esta forma se interpreta el TSI. O

SIM (SULFHÍDRICO – INDOL – MOVILIDAD)

Es un medio semi-sólido de color amarillo transparente. Contiene: Triptófano: entonces si el microorganismo contiene la enzima triptofanasa, se produce indol, que se pone de manifiesto con el reactivo de Erlich o el reactivo de Kovac por la formación de un complejo de color rojo entre el indol y el p-dimetilaminobenzaldehido (que se encuentran en éstos reactivos). Citrato de hierro y amonio: por lo tanto los microorganismos productores de SH2 ennegrecen el medio de cultivo Si los microorganismos son móviles, al ser éste un medio semi-sólido se produce enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en la punción. Procedimiento: se inocula el microorganismo por punción con ansa de punta. Se deja incubar a 35ºC durante 24hs. y luego de este tiempo se agregan unas gotas del reactivo de Erlich o Kovac dejándolo resbalar por las paredes del tubo. Interpretación: Se debe observar la interfase del reactivo y el caldo después de haber agregado el reactivo, la aparición de un color rojo fucsia brillante es indicativa de la presencia de indol y constituye una prueba indol positiva. También se debe observar el medio para ver si el microorganismo produce SH2 y si es móvil o inmóvil. Si el microorganismo es móvil y no produce SH2 solo se produce enturbiamiento del medio, sin embargo si es móvil y produce SH2 se ennegrece todo el medio. Si el microorganismo es inmóvil y no produce SH2 se observa crecimiento solamente en la estría, sin embargo si el microorganismo es inmóvil y si produce SH2 se observa precipitado negro alrededor de la estría (pero no ennegreciendo de todo el medio). o

ROJO DE METILO – VOGES PROSKAUER:

Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos pruebas (2ml), se hace la inoculación del microorganismo, y se lleva a incubar a 35ºC durante como mínimo 24-72hs.. Luego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y otra para la de VP.  Rojo de metilo: se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la superficie del medio de cultivo aparece un color rojo intenso es RM (+), esto pone de manifiesto todos aquellos microorganismos que utilizan la glucosa fermentándola hasta llegar a un pH menor a 4,4.  VP: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacude suavemente y luego se deja quieto de 10 a 15 minutos. Una prueba positiva está representada por la aparición de color rojo 15 minutos después del agregado de los reactivos, lo que indica la presencia de acetil-metil-carbinol. o

ONPG (O-NITROFENIL-β-GALACTOPIRANÓSIDO)

Lo microorganismos lactosa (+) tienen β-galactosidasa y poseen permeasa, dos enzimas necesarias para la formación de ácidos a partir de la lactosa La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa ingrese en la célula bacteriana. Hay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por carecer de permeasa, pero sí tienen βgalactosidasa, en realidad son lactosas (+). Entonces esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa (-) El test se hace con discos de papel comerciales. Se hace un inóculo del microorganismo en solución fisiológica estéril, se agrega un disco de papel. Se lleva a incubar a 37ºC durante 24hs. Un color amarillo intenso nos indica que el microorganismo es productor de βgalactosidasa. o

CITRATO:

Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismos que utilizan el citrato como única fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol.

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El color original del medio es verde, y se encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembra se hace por estría, se incuba 24-72hs a 35ºC. Si el microorganismo utiliza citrato, se produce alcalinización del medio de cultivo pasando éste a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para el citrato. o

UREA:

Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismos que poseen la enzima ureasa. El medio, fraccionado en pico de flauta contiene urea y rojo de fenol como indicador, el color original del medio es amarillo (o sea ácido) La siembra se realiza con ansa de punta tanto en profundidad como en la superficie. Se deja incubar. Si el microorganismo es productor de ureasa, desdobla la urea produciendo amoníaco, consecuentemente produce alcalinidad que se manifiesta porque el medio toma un color fucsia. o

FENIL-ALANINA-DESAMINASA:

El medio se prepara con un pico de flauta largo, pues la lectura se hace sobre la superficie del medio de cultivo. Se siembra sobre la superficie del medio solamente. El color original es amarillo, si el microorganismo es productor de la enzima, al agregar sobre el medio cloruro férrico, ésta se pone de manifiesto, dando a la superficie un color verde intenso. O

AMINOÁCIDOS: DESCARBOXILASAS:

Las descarboxilasas son enzimas sustrato-específicas (presentes o no en los microorganismos) capaces de reaccionar con la porción carboxilo (COOH) de aminoácidos formando aminas de reacción alcalina. Esta reacción, conocida como descarboxilación, forma C02 como producto secundario. Cada descarboxilasa es específica para un aminoácido. Lisina, arginina y ornitina son los aminoácidos evaluados de rutina en la identificación de enterobacterias. El medio Moeller es la base (semi-sólida) que se emplea con más frecuencia. El aminoácido se agrega a la base. El color original es lila. Se inocula el microorganismo por punción en cada uno de los tubos conteniendo los diferentes aminoácidos. Se incuba en forma anaerobia cubriéndolos con aceite mineral. Si el aminoácido es descarboxilado, se forman aminas alcalinas y el medio pasa a violeta más intenso. o

PRUEBA DE LA DNASA:

La producción de DNAsa puede determinarse incorporando ácido desoxirribonucleico (DNA) en el agar nutritivo. Se inocula el microorganismo en el agar y después de 18 a 24hs de incubación se detecta la producción de DNAsa bañando la placa con ácido clorhídrico diluido al 1%, que precipita el DNA nativo del medio. Así, las colonias que producen DNAsa estarán rodeadas por una zona clara donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado.

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Escherichia coli +/-

Enterobacter cloacae +

Enterobacter aerogenes +

Citrobacter

Klebsiella

Salmonella

Shigella

Serratia

Proteus

+d o-

+

-

-

+/-

-

Lactosa -

-

-

+

-

+

-

-

+/-

-

+/-

-

+d

+d

-

-

-d

+/-

+ +/-

+

+

+/+

+/-

+ +

+/-

+

+ +/+

-

+

+

+

+

+d

-

+

+/-

+

+ -

+ +

+d -

+

+ +

+d -

+ +

-

+

+

-

+

-

-

-

-

+

-

-

+

-

+

+

+

+

+/-

-

-

-

-

-

-

-

+

Prod. de SH2 Ureasa SIM Sulfuro Indol Mov.

Citrato O L A

VP RM ONPG Phe

Tabla resumida con las enterobacterias más comunes y las pruebas más frecuentemente utilizadas (+d= positivo débil)

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Trabajo Practico Nº : MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA OBJETIVOS 

Enumerar las indicaciones para la realización de una prueba de susceptibilidad antimicrobiana.



Definir antibiograma por difusión con discos.



Indicar los elementos necesarios para la realización de la prueba.



Describir el procedimiento para la realización y lectura de un antibiograma.



Explicar las limitaciones del método de difusión por discos.

Principios generales: Las pruebas de sensibilidad evalúan la capacidad de un antimicrobiano para inhibir in vitro el desarrollo bacteriano. Si bien algunas bacterias poseen sensibilidades o resistencias predecibles, en otras es necesario estudiar la susceptibilidad antibacteriana desde el laboratorio. Para ello se cuenta con diferentes metodologías: 1. Técnicas cualitativas: Antibiograma por difusión en agar o técnica de Kirby-Bauer. 2. Técnicas cuantitativas: CIM- CBM (macrodilución en tubo) 3. Pruebas especiales: incluyen, entre otras, la detección de betalactamasas, estudio del poder bactericida del suero (PBS) y otros ensayos para la detección de resistencia a los antimicrobianos (producción de enzimas inactivantes, alteraciones en el sitio de acción y modificaciones en el ingreso o el eflujo de las drogas).

MÉTODO DE DIFUSIÓN EN AGAR Fundamento: Esta técnica consiste en enfrentar a la bacteria a discos de papel impregnados con el antibiótico y leyendo los halos de inhibición del crecimiento luego de 18 a 24hs de incubación. El diámetro obtenido dependerá no solo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino también del espesor de la capa del agar, su pH y composición, de la capacidad de difusión de la droga en ese medio, la temperatura, la velocidad de duplicación bacteriana y el tamaño y fase de crecimiento del inóculo. Para realizar pruebas de sensibilidad e identificación se debe partir de un cultivo primario en medio sólido, no se deben realizar pruebas sobre mezclas de diferentes tipos de microorganismos, ni sobre el material clínico sin procesar. Antibiótico: Se deberán probar los antibióticos útiles, teniendo en cuenta el germen aislado y la patología correspondiente a la muestra que se estudia. Los antibióticos deberán ser referidos por su nombre genérico. Discos: Para evitar su deterioro se deben conservar entre –20°C y 4º C. Los discos que contengan drogas fácilmente degradables (por ejemplo Beta lactámicos) deben conservarse a -20° C para mantener su potencia, conservando en refrigerador solamente los discos que se utilizan en la semana. Los discos deben ser sacados del refrigerador o freezer 1 o 2 hs antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la temperatura antes de ser abiertos los frascos. Este proceso evita la condensación que podría ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los frascos fríos. Debe respetarse estrictamente la fecha de vencimiento de los discos y guardarlos en recipiente con una sustancia desecante. Medio de cultivo: El CLSI recomienda Müller Hinton agar pH 7.2-7.4 que debe ser controlado a temperatura ambiente y luego de solidificado. Este medio muestra buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad, contiene bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetroprima y tetraciclina, es adecuado para el desarrollo de la mayoría de las bacterias patógenas. Para cepas que no crecen bien se debe agregar sangre ovina al 5%. Para evaluar el contenido de timidina debe probarse cada lote de medio de cultivo con Enterococcus faecalis ATCC 29212, ya que el exceso de la misma hace variar los halos de sulfamidas y trimetoprina, lo que puede dar como resultado una falsa resistencia.

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Hay que evaluar también el contenido de cationes divalentes (Ca2+ y Mg2+), ya que en exceso reducirá la zona de inhibición mientras que las bajas concentraciones producirán el efecto contrario. Preparación de las placas: Se preparan placas de 9-10 cm de diámetro con 25 a 30 ml de agar Mulller Hinton, las cuales alcanzan un espesor aproximado de 4 mm. Estas placas se pueden conservar hasta 7 días en heladera (2-82 c.) y antes de usarlas se deben secar colocando la placa a 35º C 30 min. PROCEDIMIENTO: Inóculo: para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez (0,5 de la escala de Mc Farland). 1.

Método de crecimiento previo: Tomar 4 ó 5 colonias bien aisladas de igual morfología. Preparar una suspensión en 4 o 5 ml de caldo tripteína soja, e incubar a 35° C hasta igualar la turbidez del estándar (2 a 6 hs). El ajuste es por comparación visual, mirando los tubos contra fondo blanco con una línea negra como contraste.

2.

Método de suspensión directa: A partir de un cultivo de 18-24 hs, tomar varias colonias y ajustar el inóculo a una turbidez equivalente al 0,5 de Mc Farland en solución fisiológica.

Inoculación de las placas: Dentro de los 15 min. de ajustada la turbidez, sembrar las placas de MH con hisopo estéril, sumergiendo el mismo en el tubo que contiene el inóculo. Luego, presionar el hisopo contra las paredes del tubo a fin de escurrir el exceso de inóculo. Hisopar las placas rotando en tres direcciones y pasándola por último por la periferia del agar para asegurar una distribución uniforme. Dejar que el inóculo se absorba a la superficie del medio de cultivo (3 a 5 min y no más de 15 min) antes de la aplicación de los discos. Colocación de los discos: Colocar los discos en forma aséptica presionando para asegurar un correcto contacto con el agar. Se deben colocar de manera que se encuentren a una distancia de 15 mm del borde de la placa y a una distancia de 24 mm de un centro al otro. Colocar no más de 6 discos por placa. Invertir las placas, e incubar 16 - 18 hs. a 35º C. Lectura: Si la distribución fue correcta las zonas de inhibición son circulares y el desarrollo confluente. Medir el diámetro de los halos de inhibición con calibre o regla. Interpretar el tamaño de la zona de inhibición de acuerdo a las Tablas y recomendaciones del CLSI, y los organismos se informaran como sensibles, intermedios y resistentes frente al antibiótico ensayado. Cepas control: Cada vez que se ensaya un nuevo lote de Müller Hinton o de discos se efectuarán controles con las siguientes cepas: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli

ATCC 25922

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Enterococcus faecalis ATCC 29212

Suspensión bacteriana

Fig. 7: Esquema de la técnica de antibiograma por difusión en agar

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MÉTODO POR DILUCIÓN EN MEDIO LÍQUIDO. MÉTODO POR MACRODILUCIÓN EN TUBO (CIM-CBM)

Fundamento: Permiten determinar la mínima concentración del antimicrobiano que inhibe el desarrollo bacteriano (CIM) o mata a las bacterias (CBM). Se realiza enfrentando una suspensión bacteriana con diferentes concentraciones del antibiótico en caldo de cultivo. Luego de la incubación se observa la presencia o ausencia de inhibición del crecimiento. Se considera CIM a la mínima concentración de antimicrobiano en la cual no se observa turbidez. La técnica de macrodilución en caldo sirve como método de referencia. Medio de cultivo: Caldo Müller Hinton pH 7.2-7.4. Antimicrobiano: Debe utilizarse droga pura con potencia biológica conocida (potencia valorada) respetando la fecha de vencimiento. Los antibióticos deberán conservarse a –20°C con desecador. La cantidad a pesar se calcula de a cuerdo a la siguiente fórmula: Pesada (mg) = Volumen (ml) x Concentración ATM (g/ml) Potencia (g/mg) Las soluciones de antibióticos deben conservarse a –20º C, los tiempos de conservación varían de acuerdo al antibiótico. Preparación del Inóculo: Se usa como inoculo un cultivo fresco, generalmente de menos de 16 hs. de incubación (fase logarítmica, variable según el germen), que se lleva a la turbidez equivalente al tubo 0.5 de la escala de Mc. Farland y equivale a 1.5 x 108 UFC/ml). Este se diluye 1/200 en caldo Müller Hinton para llevarlo aproximadamente a una concentración de 5 x 10 5 UFC/ml y debe utilizarse dentro de los 15 min de preparado. METODOLOGÍA: Se acomodan 11 tubos y se trabaja de la siguiente manera: Se preparan diluciones seriadas del antibiótico en un rango adecuado al antibiótico y cepa a estudiar. Esto es: colocar 11 tubos con 1 ml de caldo Muller-Hinton, al tubo Nº 1 se le agrega 1 ml de la dilución de ATM concentrada, homogeneizar. De éste, se toma 1 ml y se pasa al tubo Nº 2 y así sucesivamente hasta llegar al tubo Nº 9. Se agrega 1 ml del inoculo previamente preparado a cada uno de los tubos con antibiótico. El tubo N° 10 que no lleva antibiótico pero sí inóculo, es el control de desarrollo y el 11 no lleva ni ATB ni el inóculo, es el control de esterilidad del medio de cultivo. Los tubos se incuban a 35º C 16-20 horas. Al final del período de incubación los tubos se examinan visualmente controlando la turbidez. La turbidez indica que el crecimiento bacteriano no fue inhibido por la concentración de antibiótico contenida en el tubo.

CBM. Para determinar CBM se transfiere una anzada (5 ul) de los tubos límpidos a una placa que no contenga antibiótico y se incuba 24 hs. La CBM es la menor concentración que impide el desarrollo del 99,9 % de las bacterias presentes en el inoculo original (esto equivale al 0,1 % de sobrevivientes).

BIBLIOGRAFÍA 1. 2.

Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Turk M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized disk method. Am J. Clin. Pthol 1966; 45:493-496. NCCLS. Methods for determing bactericidal activity of antimicrobial agents. NCCLS document M26-P, vol 7- Nº2.

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3.

4.

5. 6.

García Rodriguez JA et al. Métodos básicos para el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Vol 11. 2000. Servicio de antimicrobianos. INEI. ANLIS Dr Carlos G Malbrán. NCCLS Document M2-A8. Enero 2003. Material facilitado en el "IV Curso Regional para el Diagnóstico de la Resistencia a los Antimicrobianos. Octubre 2005. Koneman y col. Diagnóstico microbiológico. Ed. Panamericana. Basualdo,JA y col. Microbiología Biomédica. Ed. Atlante.

Siembra Caldo + bacterias + ATB

antibiótico (ug/ml)

Lectura CIM = 4 ug/ml

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MICOLOGIA

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Trabajo Practico Nº 1:

 

GENERALIDADES

Objetivos: Aplicar los conceptos básicos fundamentales de la micología. Conocer los aspectos morfológicos y ecológicos básicos de los hongos. Características macroscópicas de las colonias

Los hongos presentan una gran diversidad de colonias que van desde aquellas similares a las bacterianas, producidas por el crecimiento de levaduras, hasta colonias muy algodonosas que cubren toda la superficie del cultivo, producidas por hongos filamentosos. La colonia de muchos hongos filamentosos puede variar considerablemente debido a la constitución nutritiva de los medios de cultivo, a la temperatura y al tiempo de incubación. Por tal motivo es fundamental conocer la composición del medio de cultivo y las condiciones de incubación del agente aislado. El agar Sabouraud es el medio de cultivo más utilizado para el aislamiento de hongos, incubándose a 37º cuando se sospecha de levaduras y a 28º cuando se buscan hongos filamentosos. El estudio de las características macromorfologicas de las colonias de los hongos junto con las características microscópicas del cultivo permiten diferenciar e identificar los diferentes géneros y especies. En la observación y análisis macroscópico de la colonia se deben considerar:  Forma: circular, irregular, filamentosa, rizoidal.  Elevación: plana y extendida, elevada y limitada, convexa o umbilicada.  Textura: algodonosa, pulverulenta, granular, vellosa, aterciopelada, mucosa, cremosa, etc.  Aspecto: brillante o húmeda, opaca o seca.  Superficie de la colonia: lisa, plegada, sectorizada, cerebriforme, con surcos radiales.  Color: blanco, canela, salmón, negro, etc.  Margen o Bordes: liso (entero o neto), regulares, irregulares (ondulado, lobado)  Pigmento: puede estar presente o no. Si está presente, se deberá definir el color, observándose el reverso de la colonia.

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ACTIVIDAD Nº 1: Observar

y describir las características macroscópicas de las

colonias fúngicas.

Colonia 1

Colonia 2

Colonia 3

Colonia 4

Tipo de Hongo

Forma

Aspecto

Textura

Elevación

Superficie

Pigmento

Margen o Borde

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ACTIVIDAD Nº 2: Observe, dibuje y señale las principales estructuras microscópicas de los hongos. Características microscópicas de los hongos

Esquema

Blastoconidio: elemento unicelular globoso a elipsoide que se origina por gemación a partir de una célula madre.

Pseudohifa: Conjunto de células levaduriformes que no se han separado después de la nueva gemación.

Hifa cenocítica o no tabicada: estructura tubular de paredes paralelas que constituyen un filamento contínuo.

Hifa septada o tabicada: estructura tubular de paredes paralelas, dividida en compartimentos por septos. Pueden ser hialinas o dematiaceas.

Clamidoconidio o clamidospora: células globosas u ovoides, de pared doble y gruesa, que se localizan a nivel terminal e intercalar. Son estructuras de resistencia, producidas como respuesta a condiciones adversas del medio. Artroconidio (arthron: articulación, artículos): son células rectangulares de paredes gruesas que se forman por fragmentación de hifas septadas.

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Reproducción de los hongos

En los hongos podemos reconocer dos tipos de talo; el vegetativo y el reproductor, con funciones claramente definidas: El talo vegetativo se desarrolla en la superficie del sustrato y su función principal es absorber nutrientes, crecer y sustentar al talo reproductor. El talo reproductor crece proyectándose en dirección vertical, perpendicular al talo vegetativo y desarrollan las células especializadas en la reproducción de la especie. Se entiende por reproducción a la formación de nuevos individuos que tienen todas las características típicas de la especie. En hongos puede haber dos tipos de reproducción: sexual y asexual. La reproducción asexual tan bien llamada anamorfa, imperfecta o vegetativa no incluye la unión de los núcleos compatibles, células sexuales u órganos sexuales. Le reproducción sexual tan bien llamada telemorfa o perfecta, en cambio, esta caracterizada por la unión de los núcleos sexuales. Por lo tanto, los propágulos de dispersión pueden ser de tipo sexual, denominándose esporas, en tanto que a los del tipo asexual se las denomina conidias. La reproducción asexual es más importante para la propagación de la especie ya que origina la producción de numerosos individuos, particularmente porque el ciclo asexual se repite varias veces al año; en tanto el sexual, en muchos hongos se presenta una sola vez. Los conidios se forman a partir de la célula conidiógena (célula que por si misma o a partir de la cual se originan directamente los conidios) que se encuentran organizadas en estructuras de reproducción, las cuales pueden ser interna o externa.

Estructuras de reproducción ASEXUAL INTERNA esporangióforo, esporangio, columela, esporangioconidio

EXTERNA conidióforo, fiálide, conidios

Estructuras de reproducción SEXUAL INTERNA ascocarpos, ascos y ascosporas

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Trabajo Práctico Nº 2: Agentes productores de MICOSIS SUPERFICIALES OBJETIVOS: Conocer la macro y la micromorfología de las especies de hongos productores de micosis superficiales más frecuentemente aisladas en nuestro medio.

FICHA 1: DERMATOFITOS. EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO DERMATOFITOSIS: Se observan filamentos hialinos tabicados y ramificados de 6 a 10 m de diámetro, a veces artrosporados

ECTOTRIX: Las artrosporas se encuentran fuera del pelo. El género_____________ se caracteriza por presentar disposición

ENDOTRIX: Las conidias se encuentran dentro del pelo. Esta disposición es característica del género _______________.

Malassezia spp: Se observan filamentos cortos de bordes romos, tabicados de 2 a 3 m de diam. y elementos levaduriformes de 3 a 8 m en acúmulos

FICHA Nº 2: DERMATOFITOS, ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE LOS CULTIVOS:

Ejemplos

Microsporum

Trichophyton

Características macroscópicas

Características Microscópicas

Esquema

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Agentes productores de MICOSIS SUBCUTANEAS

Agentes productores de CROMOMICOSIS Agentes etiológicos: La cromomicosis puede ser producida por un extenso grupo de hongos dematiáceos. En nuestra zona los agentes más frecuentes son: Fonsecaea pedrosoi y Phialophora verrucosa.

Características microscópicas

ESPECIES

Phialophora spp

RAQUIS SIMPODIA L (acroteca)

FIALIDE fialoconidio s

CLADOSPORIO cadenas acrópetas de blastoconidias

Cladophialophora spp

Rhinocladiella aquaspersa

Fonsecaea spp

Todos estos hongos son dematiáceos (hongos negros), siendo sus colonias muy parecidas entre sí, de color gris oscuro o negro presentando un aspecto velloso aterciopelado.

FICHA 3: AGENTES PRODUCTORES DE CROMOMICOSIS Phialophora spp

CARACTER ISTICAS MICROSCO PICAS

Fonsecaea spp

Rhinocladiella aquaspersa

FASE PARASITARIA

FASE SAPROFÍTICA

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FICHA 4: Agentes Productores de eumicetoma Fusarium spp.

Madurella grisea

Características Microscópicas

Esquema

FICHA 5: Agente Productor de esporotricosis Agente etiologico

Sporothrix schenkii 28ºC

Características macroscópicas de la colonia

37ºC

Fase Parasitaria Coloración:

Características Microscópicas

Fase Saprofítica Coloración:

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FICHA 6: AGENTES ETIOLÓGICOS DE MICOSIS SISTEMICAS

Paracoccidioides brasiliensis.

Histoplasma capsulatum

Coccidioides immitis.

28ºC

Características macroscópicas 37ºC

Fase Parasitaria Coloración: Características Microscópicas

Fase Saprofitica Coloración:

Esquemas

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FICHA 7: AGENTE ETIOLÓGICO DE MICOSIS OPORTUNISTAS

Cryptococcus neoformans

Candida spp.

Esquema

Características macroscópicas

Fase Parasitaria Coloración:

Características microscópicas

FICHA 8: AGENTES ETIOLOGICO DE HIALOHIFOMICOSIS

Fase Saprofitita Coloración:

Aspergillus fumigatus

Aspergillus flavus

Aspergillus niger

Características macroscópicas de la colonia Fase Parasitaria Coloración:

Fase Saprofitita Coloración: Características Microscópicas

Esquema

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FICHA 9: AGENTES PRODUCTORES DE FEOHIFOMICOSIS

Alternaria

Curvularia

Características macroscópicas

Fase Parasitaria Coloración:

Características Microscópicas

FICHA 10: AGENTES PRODUCTORES DE CIGOMICOSIS

Fase Saprofitita Coloración:

Rhizopus

Mucor

Absidia

Características macroscópicas

Fase Parasitaria Coloración:

Características Microscópicas

Fase Saprofitita Coloración:

Esquemas

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SEMINARIOS

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ESTERILIZACION

1. Qué es ESTERILIZACION. Qué es DESINFECCION. 2. Confeccione un cuadro con los AGENTES FISICOS utilizados en la destrucción de microorganismos. 3. Acción del CALOR sobre los microorganismos. Cómo actúa el CALOR HUMEDO y cómo el CALOR SECO. 4. En qué consiste un AUTOCLAVE. Cuál es el principio de su funcionamiento y para qué se emplea. 5. Qué es una ESTUFA DE ESTERILIZACION y cuál es su utilidad. 6. Mencione los tiempos y temperaturas para autoclave y estufa con material contaminado y material limpio respectivamente. 7. Qué efectos tienen las RADIACIONES UV sobre los microorganismos y cuál es su aplicación. Cuáles son las RADIACIONES IONIZANTES y cuál es su modo de acción. 8. Cómo se logra la esterilización a través de la FILTRACION. 9. Diferencia entre BACTERICIDA y BACTERIOSTATICO. 10. Defina DESINFECTANTE y ANTISEPTICO 11. Confeccione un cuadro con los AGENTES QUIMICOS, mecanismo de acción y empleo. 12. Que es el óxido de etileno y para que se emplea. Como se lo utiliza 13. Cuáles son los métodos seguros de esterilización. 14. Explique cuáles son los CONTROLES DE ESTERILIZACION y cuál es el más efectivo.

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BIOSEGURIDAD

1. Concepto de bioseguridad. 2. Clasifique los residuos de laboratorio. Como se eliminan los residuos patogénicos. 3. Como se limpia el material no descartable. 4. Concentración de hipoclorito de sodio usada para limpieza de pisos y mesadas y para descartar material contaminado. 5. Como se debe proceder en caso de derrame de material biológico. 6. Como proceder ante un accidente corto-punzante. 7. Explique brevemente como se realiza el transporte de material biológico. 8. Control de fuego, tipos de matafuegos y utilización. 9. Describa los pasos para el correcto lavado de manos 10. Cuantos y cuales son los niveles de bioseguridad para los laboratorios. 11. Haga un listado de las 10 recomendaciones generales de bioseguridad que considere las más importantes en el laboratorio.

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RELACIÓN HUÉSPED-BACTERIA

1. Según sus condiciones de vida, existen dos grandes grupos de agentes bacterianos, ¿cuáles? Defina cada uno. 2. ¿Cuáles son los modelos de relación huésped-bacteria? 3. Describa la flora microbiana normal de piel, oido externo, conjuntiva, vías respiratorias, boca, tubo digestivo y tracto genitourinario. 4. Importancia de la flora microbiana normal. 5. Defina Infección, colonización, Infección inaparente y enfermedad infecciosa. 6. Defina los postulados de Koch. Poder patógeno. Virulencia. 7. Agentes Patógenos y oportunistas. Parásito extracelular e intracelular (facultativo y obligado). Importancia. 8. Factores determinantes de la acción patógena. Describa brevemente. 9. Colonización y Adherencia. Describa brevemente. 10. Según las modalidades de infección y según la capacidad de penetración, ¿cómo se clasifican las bacterias? 11. Penetración, multiplicación e invasión. 12. Factores que interfieren en las defensas del huésped en las fases de adherencia, de digestión intracelular e invasión. 13. Patogenia. Vías de difusión (contigüidad, vía linfática, sanguínea y nerviosa) 14. ¿Qué son las toxinas? Tipos. 15. Modelos de infección. Tipos. 16. Mecanismos de defensa inespecíficos y específicos. 17. Defensas externas. Factores mecánicos y físico-químicos. 18. Defensas internas. Factores celulares. Inflamación y fagocitosis. 19. Fases de la fagocitosis. Describa brevemente. 20. Defensas internas. Factores humorales.

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MECANISMOS DE PATOGENICIDAD

1. Enumere los factores más relevantes determinantes de patogenicidad bacteriana. 2. Cuál es el rol de las fimbrias, que tipos de fimbrias conoce, qué son las adhesinas? 3. Cual es el rol del hierro y los sideróforos? 4. Defina EXOTOXINA 5. Defina ENDOTOXINA y esquematice su estructura. 6. Establezca las similitudes y diferencias entre endo y exotoxinas. 7. Toxinas. Confeccione un cuadro consignando Tipo, Estructura, Mecanismo de acción, tejido blanco, y microorganismo que la produce, para cada una de las toxinas que conoce. 8. Que mecanismos emplean las bacterias para evadir la respuesta inmune del huésped? 9. Importancia de la cápsula. 10. Que es la variación antigénica.

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MICOTOXINAS 1. Qué son las micotoxinas. 2. Cómo y por qué se forman. 3. Cuáles son los factores que determinan la contaminación. Comentar cada uno. 4. Cuáles son los principales géneros productores de micotoxinas 5. Defina: “Hongos del campo” y “Hongos de almacenamiento”. De ejemplos de los principales géneros. 6. Aflatoxinas. Cuál es el principal hongo productor. Cuáles son sus principales derivados. Estabilidad. Actividad biológica. 7. Zearalenona. Cuáles son los principales hongos productores. Cuáles son sus principales sustratos. Actividad biológica 8. Tricotecenos. Cuales son sus principales sustratos. Actividad biológica (ATA). 9. Ochratoxinas. Cuales son sus principales sustratos. Actividad biológica 10. Fumonisinas. Cuales son sus principales sustratos. Actividad biológica 11. Métodos de detoxificación 12. Cuales son las técnicas de laboratorio que se utilizan para la determinación de micotoxinas 13. Reglamentación y Prevención.

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FICHA DE ESTUDIO DE MICROORGANISMOS

1. CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS, TINTORIALES Y CULTURALES MORFOLOGIA (forma, tamaño, agrupación) GRAM REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES CONDICIONES DE CULTIVO: - MEDIO - ATMOSFERA - TEMPERATURA - TIEMPO 2. METABOLISMO 3. HABITAT 4. A) B) C) D) E)

FACTORES DE PATOGENICIDAD: ENZIMAS TOXINAS ADESINAS CAPSULA ETC.

5. PATOGENIA 6. RESPUESTA INMUNE 7. DIAGNOSTICO A) DIRECTO B) CULTIVO C) INDIRECTO (RESPUESTA INMUNE ) 8. EVASION DE LA RESPUESTA INMUNE.

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